Titel: Isolierung von Rosmarinsäure aus

Pflanzenzellkulturen Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hochreiner Rosmarinsäure = 3,4-Dihydroxy-α-[[3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-1-oxo-2-propenyl3 -oxy7-phenylpropionsäure aus Pflanzenzellkulturen unter Verwendung von Amberlite XAD-2-Adsorberharz.

Die bisher bekannten Verfahren zur Isolierung von Rosmarinsäure aus Pflanzen haben den Nachteil, daß sie viele aufwendige Verfahrensschritte benötigen (DE-OS 30 10 040 und DE-PS 32 24 312).

Bei Versuchen zur Gewinnung von Rosmarinsäure aus Pflanzenzellkulturen von Coleus blumei, deren Herstellung in der DE-OS 32 47 610 beschrieben ist, wurde nun überraschend gefunden, daß man Rosmarinsäure in hoher Reinheit und guter Ausbeute gewinnen kann, wenn für die Abtrennung von Begleitsubstanzen Amberlite XAD-2 verwendet wird.

Zur Gewinnung der Rosmarinsäure wird dabei die Coleus blumei-Zellmasse zweimal mit der 40-60-fachen Menge Wasser von pH 3 unter Rühren bei 800 C 30 Minuten extrahiert. Die Extrakte werden zentrifugiert, vereinigt und über eine mit der 14-16-fachen Menge Amberlite XAD-2 beladene Säule geleitet.

Wesentlich für den optimalen Verlauf der Chromatographie ist der pH-Wert von 3. Bei höheren pH-Werten wird Rosmarinsäure nicht vollständig gebunden bzw. zersetzt (pH> 6,5).

Nach dem Durchlauf wird die Säule mit der 160-180-fachen Menge Wasser nachgewaschen. Die Eluierung erfolgt mit der 50-fachen Menge 30%igen Methanols und der 50-fachen Menge 40%igen Methanols.Die beim Eindampfen der methanolischen Phase zurückbleibende Substanz wird aus Wasser umkristallisiert und ergibt Rosmarinsäure mit einem Reinheitsgrad von 95 %.

Die überlegenheit des neuen Verfahrens wird durch die Gegenüberstellung mit den Verfahrensschritten der bisher bekannten Verfahren verdeutlicht.

Erfindungsgernäßes Verfahren DE-OS 30 10 04 DE-PS 32 34 312 1. Extraktion Extraktion Extraktion 2. Zentrifugation Zentrifugation Filtration 3. Amb. XA3-2 Einengung Einengung Chromatographie 4. Einengung und flüssig-flüssig flüssig-flüssig Kristallisation Extraktion 3x Extraktion 3x Diisopropylether Diisopropylether 5. Einengung und Einengung 1. Kristallisation 6. 2. Kristallisa- flüssig-flüssig tion Extraktion Diisopropylether 7. Einengung und Kristallisation Ausbeute: 65 % 55 % 55 % Besonders hervorzuheben ist die höhere Ausbeute bei verringerter Zahl von Verfahrensschritten. Das neue Verfahren ermöglicht damit eine einfache, reproduzierbare, billige Isolierung von Rosmarinsäure, wobei vor allem der arbeitsintensive und teure flüssig-flüssig-Verteilungszchritt mit Diisopropylether ausgespart wird.

Beispiel Material und Methoden Zellkultur: Coleus blumei 30 1 Fermentationsansatz Die Romarinsäurebestimtriung wurde nach einer HPLC-Methode durchgeführt.

ElutionDmittel: Acetonitril: H20/H3P04 (pH 3), Gradient Wellenlänge = 254 nm, Fließgeschwindigkeit 2 ml/min Linearer ;tleßbereich: 1 pg - 20 pg Rosmarinsäure Säule: ID 4 mm, Länge 130 mm, RP-8 5 Um Extraktion Die Coleus blumei-Zellmasse (762 g Trockenmasse; 152,3 g Rosmarinsäure 2 20,08 %) wurde zweimal in je 40 1 Wasser (pH 3) bei 800 C 30 Minuten lang im Rührkessel extrahiert.

Der erste Extrakt enthielt 138,2 g Rosmarinsäure, der zweite 8,0 g Rosmarinsäure, womit mehr als 95 % der im Zellmaterial vorhandenen Rosmarinsäure extrahiert wurden. Die vereinigten waßrigen Extrakte enthielten 485,5 g Substanz, davon 146,2 g = 30,1 % Rosmarinsäure.

Prinärmetabolitenabtrennung Die vereinigten Extrakte wurden auf eine Säule (14,5 cm Innendurchmeoser; 55 cm Betthöhe) mit 12 kg Amberlite XAD-2 (Korngröße 300 p-m-1000 zur gegeben. Gewaschen wurde mit 135 1 Wasser, eluiert mit 40 1 30 %igem Methanol und 40 1 40 %igem Methanol.

Die Rosmarinsäure befand aich in der 30- und 40-%igen methanolisehen Phase, die 137,8 g Substanz enthielt, wovon ca. 117,8 g # 85,5 % auf Rosmarinsäure entfielen.

Kristallisation 137,8 g Substanz aus der methanolischen Phase wurden in 2,75 1 Wasser gelöst (Verhältni: 1 g in 20 ml H20) und bei 40 C im Kühlraum stehen gelassen. Mit einer Spatelspitze Rosmarinsäure wurde angeimpft. Die Kristallisation war über Nacht abgeschlossen. Die Rosmarinsäure wird mit einer Nutsche von der Mutterlauge abgetrennt, mit kaltem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Es kristalllsieften 103,7 g Rosmarinsäure mit einem Reinheitsgrad von 95 % (HPLC-Analyse).

Zusammenfassende Bilanzierung Zellmaterial: 762 g mit 152,3 g - 20,0 % Rosmarinsäure Wäßr. Extrakt: 485,5 g mit 146,2 g - 30,1 % Rosmarinsäure Von Primarmetaboliten befreiter Extrakt: 137,8 g mit 117,8 g t 85,5 % Rosmarinsäure Kristallisat: 103,7 g mit 98,5 g # 95,0 % Rosmarinsäure Die Rosmarinsäuregewinnung aus Coleus blumei wird durch das folgende Fließschema erläutert - Leerseite -