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Dokumentenidentifikation DE3713705A1 19.11.1987
Titel Kationenaustauschermaterial und Verfahren zur Herstellung
Anmelder Purdue Research Foundation, West Lafayette, Ind., US
Erfinder Regnier, Frederick E., West Lafayette, Ind., US;
Kopaciewicz, William, Ipswich, Mass., US
Vertreter Frhr. von Uexküll, J., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Graf zu Stolberg-Wernigerode, U., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Suchantke, J., Dipl.-Ing.; Huber, A., Dipl.-Ing.; von Kameke, A., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Voelker, I., Dipl.-Biol., Pat.-Anw., 2000 Hamburg
DE-Anmeldedatum 24.04.1987
DE-Aktenzeichen 3713705
Offenlegungstag 19.11.1987
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.11.1987
IPC-Hauptklasse B01J 39/16
IPC-Nebenklasse C07K 3/20   B01D 15/08   C08J 5/20   
IPC additional class // C07K 15/22  

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Kationenaustauschermaterialien und Verfahren zum Herstellen derselben, vor allem Kationenaustauscherträgermaterialien mit besonderer Eignung als Füllkörper zur Flüssigchromatographie.

Die Hochleistungsanionen- und -kationenaustauscherchromatographie hat sich zu einem leistungsfähigen Instrument zur Analyse und Isolierung biologischer Moleküle entwickelt. Kationenaustauscherschichten für Medien zur Hochleistungs- Flüssigchromatographie hat man auf verschiedenen Wegen hergestellt. Der einfachste Weg ist die Silylierung einer Kieselsäureoberfläche mit einem anionischen Organosilan. Derartige Reaktionen sind jedoch reversibel und können restliche Silanole hinterlassen, welche Protein irreversibel zu binden vermögen. Obgleich man dieses Problem umgehen kann, indem man eine hydrophile organische Polymerenschicht auf der Kieselsäureoberfläche bindet, ergibt dieses Verfahren nicht die erforderliche Reproduktionsfähigkeit. Ein anderer Weg zur Synthese einer Kationenaustauscherschicht beginnt mit einer Organosilanreaktion, um auf einer Kieselsäureoberfläche eine reaktive Funktion anzubringen. Die funktionalisierte Kieselsäure wird dann mit einem vorgeformtem Polymeren umgesetzt, wobei man eine kovalent gebundene polymere stationäre Phase erhält. Die letzte Stufe modifiziert das verankerte Polymer derart weiter, daß es anionisch ist. Zwar ist die hergestellte Kationenaustauscherschicht beständig und von großer Bindekapazität, doch ist dieses Verfahren zum Herstellen von Kationenaustauscherschichten ziemlich langwierig.

Frühere Arbeiten von Alpert und Regnier, die sich mit der Chemie von adsorbiertem Polyethylenimin befaßten, wie in US-PS 42 45 005 beschrieben, deren Kenntnis hier vorausgesetzt wird, haben dessen äußert vielseitige Verwendbarkeit zur Herstellung von stationären Anionenaustauscherphasen gezeigt. Unter Anwendung der vorhandenen Adsorptionstechnologie (für die Alpert und Regnier zur Synthese adsorbierter polymerer Anionenaustauschermedien Pionierarbeit geleistet haben), wurden gemäß Erfindung Kationenaustauschermaterialen hergestellt.

Die europäische Patentanmeldung 01 43 423 schlägt Kationenaustauschermaterialien vor, die aus Polyethylenimin hergestellt sind, doch sieht diese Patentanmeldung eine poröse Kieselsäure vor, an welche ein nicht-vernetztes Polyethyleniminopropylsilan kovalent gebunden statt adsorbiert ist. Gemäß dieser Patentanmeldung wird teilchenförmiges Siliciumdioxidgel mit Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan umgesetzt und die nicht-vernetzte kovalent gebundene Polyethyleniminopropylsilylkieselsäure kann in an sich bekannter Weise, beispielsweise mit einem geeigneten zweibasischen Säureanhydrid in einem inerten organischen Lösungsmittel in eine schwach saure carboxylierte Form übergeführt werden.

Gegenstand der Erfindung sind Kationenaustauschermaterialien und Verfahren zum Herstellen derselben. Die Kationenaustauschermaterialien der Erfindung eignen sich in hervorragender Weise als Füllkörper oder Packungsmaterialien zur Trennung von Proteinen und biologischen Polymeren in der Hochleistungsflüssigchromatographie.

Zur Herstellung der Kationenaustauschermaterialien adsorbiert man zuerst eine dünne Schicht eines Amingruppen aufweisenden Adsorbats, vorzugsweise Polyethylenimin, an einem organischen Trägermaterial wie Kieselsäure bzw. Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder Titandioxid. Die adsorbierte Schicht wird dann gegebenenfalls mit einem Vernetzungsmittel wie Epoxyharz oder Alkylbromid vernetzt. Dann wird mindestens eine Amingruppe der adsorbierten vernetzten Schicht, vorzugsweise in Anwesenheit eines Protonenfängers oder Protonenspülmittels (proton scavenger), mit einem Agens in einer ausreichenden Menge zur Bildung mindestens einer Carboxylgruppe umgesetzt. Vorzugsweise werden viele Amingruppen der adsorbierten vernetzten Schicht mit einer ausreichenden Menge Reagenz umgesetzt, um Carboxylgruppen via die Derivatisierung von Aminen zu bilden. Wenn das angewandte Reagenz polyfunktional ist, dann enthält es vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, besonders bevorzugt ein hydrophiles polymeres Anhydrid und am meisten bevorzugt Polyacrylsäureanhydrid. Wenn das angewandte Reagenz monofunktional ist, dann enthält es vorzugsweise ein hydrophiles Monomeres, besonders bevorzugt ein hydrophiles monomeres Anhydrid.

Alternativ werden Amingruppen der nicht-vernetzten adsorbierten Beschichtung, vorzugsweise in Anwesenheit eines Protonenspülmittels, mit einer ausreichenden Menge eines polyfunktionalen Reagenz umgesetzt, um gleichzeitig die Schicht zu vernetzen und mindestens eine Carboxylgruppe zu bilden. Das polyfunktionale Agens enthält vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, besonders bevorzugt hydrophiles polymeres Anhydrid und am meisten bevorzugt Polyacrylsäureanhydrid.

Es ist daher eine Hauptaufgabe der Erfindung, ein beständiges und reproduktionsfähiges Kationenaustauschermaterial verfügbar zu machen. Eine andere Aufgabe besteht darin, ein Kationenaustauschermaterial zu schaffen, das eine hohe Belegungskapazität oder Beladungskapaziät und hervorragende chromatographische Eigenschaften aufweist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein solches Kationenaustauschermaterial durch ein einfaches und nicht teures Verfahren herzustellen.

Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung beschrieben.

Die Fig. 1A, B, C und D sind graphische Darstellungen der chromatographischen Evaluierung oder Wertung von vier ausgewählten Kationenaustauschersäulen, die auf der Trennung eines Proteingemischs von Cytochrom-c und Lysozym basieren.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Retention von Lysozym als Funktion des pH-Werts an vier ausgewählten Kationenaustauschersäulen.

Fig. 3 (A, B) und (C, D) ist eine graphische Darstellung der chromatographischen Evaluierung bzw. Wertung von zwei ausgewählten Kationenaustauschersäulen eines A. flos-aquae (algae) Extrakts mit einem Gehalt an Cytochrom c533.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von Kationenaustauschermaterialien, die vor allem als Packungsmaterial zur Trennung von Proteinen und biologischen Polymeren in der Flüssigchromatographie geeignet sind.

Zur Herstellung der Kationenaustauschermaterialien gemäß US-PS 42 45 005 wird die Oberfläche eines Trägermaterials, das eine Affinität für ein Adsorbat besitzt, mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart in Kontakt gebracht, daß eine membranartige Schicht das Adsorbats auf der Oberfläche durch elektrostatische Kräfte adsorbiert wird. Das Adsorbat ist vorzugsweise in einem Lösungsmittel enthalten und die Adsorption kann teilweise durch Steuerung der Polarität dieses Lösungsmittels erfolgen. Je weniger polar das Lösungsmittel ist, desto stärker ist die Adsorption. Ein geeignetes Lösungsmittel für diesen Zweck ist Methanol. Das Adsorbat weist mindestens zwei funktionale Gruppen auf, von denen eine unter Adsorption desselben mit der Oberfläche des Trägermaterials in Wechselwirkung tritt, während die andere zum Vernetzen gebraucht wird. Polyethylenimin ist das bevorzugte Adsorbat, andere geeignete Adsorbate sind 1,3-Diamino- 2-hydroxypropan, Tetraethylenpentamin und Ethylendiamin.

Das Trägermaterial ist vorzugsweise ein anorganisches Trägermaterial wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid, wobei Siliciumdioxid das bevorzugte Trägermaterial ist. Spezielle Beispiele geeigneter anorganischer Trägermaterialien sind LiChrospher Si 500 (Teilchendurchmesser 10 Mikron), LiChrosorb Si 100 (Teilchendurchmesser 10 Mikron), LiChrospher Si 100 (Teilchendurchmesser 10 Mikron), Chromosorb LC-6, Partisil 10, Vydac TPB, kontrolliertes Porenglas (Teilchendurchmesser 5-10 Mikron; Porendurchmesser 100 Å), Spherisorb Aluminiumoxid (Teilchendurchmesser 10 Mikron; Porendurchmesser 150 Å), Bio-Rad basisches Aluminiumoxid, Aktivität I (Teilchendurchmesser 40 Mikron), Bio-Rad saures Aluminiumoxid, Aktivität I (Teilchendurchmesser 40 Mikron), Corning Titandioxid (40/60 Maschen; Porendurchmesser = 400 Å) Amicon Matrex Kieselsäuregele, zirconylplattiertes Siliciumdioxid (eine Zirkonschicht auf Vydac TPB Siliciumdioxid), und Magnesiumoxid.

Nachdem eine membranartige Schicht eines Amingruppen aufweisenden Adsorbats auf die Oberfläche des Trägermaterials adsorbiert ist, kann die adsorbierte Schicht vernetzt werden, indem man die Oberfläche einem Vernetzer wie Epoxyharz oder Alkylbromid aussetzt, wobei das bevorzugte Vernetzungsmittel bzw. der bevorzugte Vernetzer ein polyfunktionales Epoxyharz ist. Geeignete Epoxyharzvernetzer umfassen 1,2-Ethandioldiglycidylether, 1,4-Butanoldioldiglycidylether und 1,3-Diglycidylglycerin. Zur Herstellung eines Kationenaustauschermaterials läßt man dann mindestens eine und vorzugsweise viele Aminogruppen der vernetzten adsorbierten Schicht, vorzugsweise in Anwesenheit eines Protonenfängers und vorzugsweise in einem trockenen protonenfreien Lösungsmittel wie Dimethylformamid, mit einer ausreichenden Menge eines Reagenz reagieren, um mindestens eine und vorzugsweise mehr als eine Carboxylgruppe via Derivatisierung der Oberflächenamine zu bilden. Das Protonenspülmittel enthält vorzugsweise ein tertiäres Amin, besonders bevorzugt Diisopropylethylamin. Das Agens, das mit den Amingruppen der vernetzten adsorbierten Schicht unter Bildung von Carboxylgruppen reagiert, kann monofunktional oder polyfunktional sein. Wenn das angewandte Agens monofunktional ist, enthält es vorzugsweise ein hydrophiles Monomeres, besonders bevorzugt ein hydrophiles monomeres Anhydrid und am meisten bevorzugt ein hydrophiles monomeres cyclisches Anhydrid. Beispiele für geeignete monomere Anhydride sind Glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Diglykolsäureanhydrid und Tetranhydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid. Wenn das angewandte Reagenz polyfunktional ist, dann enthält es vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, besonders bevorzugt ein hydrophiles polymeres Anhydrid und am meisten bevorzugt Polyacrylsäureanhydrid.

Alternativ dazu läßt man, nachdem eine membranartige Schicht eines Amingruppen aufweisenden Adsorbats an die Oberfläche des Trägermaterials adsorbiert ist, Amingruppen der nicht- vernetzten adsorbierten Schicht, vorzugsweise in Anwesenheit eines Protonenspülmittels, mit einer ausreichenden Menge eines polyfunktionalen Agens reagieren, um die Beschichtung zu vernetzen und mindestens eine und vorzugsweise mehr als eine Carboxylgruppe via Derivatisierung der Oberflächenamine zu bilden. Auch hier enthält das Protonenspülmittel vorzugweise ein tertiäres Amin und besonders bevorzugt Diisopropylethylamin. Das polyfunktionale Reagenz ist vorzugsweise ein hydrophiles Polymer, besonders bevorzugt ein hydrophiles polymeres Anhydrid und am meisten bevorzugt Polyacrylsäureanhydrid. Wenn das angewandte polyfunktionale Agens ein Anhydrid ist, wird eine vollständige Hydrolyse jeglicher nicht-umgesetzter Anhydride durch Behandlung mit verdünnter Säure sichergestellt.

Beispiel 1

Ein Gramm Vydac 101 TPB Siliciumdioxid (5,5 µm, kugelförmig, 330 Å) wurde in 10 ml einer Polyethylenimin-18 (durchschnittliches Molekulargewicht 1800) in einer Konzentration (Gewicht/Volumen) von 1% in Methanol enthaltenden Lösung suspendiert. Die adsorbierte Schicht wurde dann unter Anwendung von 10 ml einer Diglycidylglycerin in einer Konzentration von 5% (Volumen/Volumen) enthaltenden methanolischen Lösung vernetzt. 0,7 g der beschichteten und vernetzten Kieselsäure wurden 30 Minuten bei 110°C in einen Ofen gegeben. Dann wurde das trockene Siliciumdioxid in einer Lösung suspendiert, die aus 4 ml trockenem Dimethylformamid, 250 µl (trockenem, redestilliertem) Diisopropylethylamin (DIEA) und 200 mg Bernsteinsäureanhydrid (SUC) bestand.

Diese Acylierungsreaktion erzeugt Carbonsäuren über die Derivatisierung von Oberflächenaminen. DIEA wurde als Protonenspülmittel zugegeben, da bei der Reaktion des Anhydrids und der Kieselsäure mit aufgebrachtem und vernetztem Amin eine Säure gebildet wird, die benachbarte Amine "titrieren" (unreaktiv machen) könnte. Diese Reaktion wurde dreimal unter Anwendung verschiedener Anhydride, Diglykolsäureanhydrid (DGA), Glutarsäureanhydrid (GLU) und Tetrahydrofuran- 2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid (TETRA) anstelle von Bernsteinsäureanhydrid wiederholt. Man ließ die Reaktionen über Nacht bei 60°C weitergehen. Dann wurde jedes Produkt auf einem Trichter aus Sinterglas isoliert und sukzessive mit Methanol, Wasser, Triethylamin und Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurden diese Materialien in einem Exsikkator aufbewahrt. Je 50 mg der erhaltenen Kationenaustauschermaterialien wurden auf ihre Kapazität, Pikrinsäure zu binden, geprüft. Pikrinsäure "paart" sich mit zugänglichen (nicht-ionisierten) Aminen, jedoch nicht mit Amiden. Deshalb kann der Acylierungsgrad bzw. das Ausmaß der Acylierung bestimmt werden als der prozentuale Verlust an zur Ionenpaarbildung befähigten Aminen nach der Derivatisierung.

Zur Messung der Pikrinsäurekonzentrationen wurde ein Perkin- Elmer Modell 55 Spektrophotometer verwendet. Die Ergebnisse der Pikrinsäureprüfung sind in Tabelle I angegeben.



Tabelle I Evaluierung von stationären Phasen: Adsorbierte Kationenaustauscher, synthetisiert aus monomeren cyclischen Anhydriden


Der Ausdruck % SUB ist die prozentuale Substitution, die aus den Versuchen zur Bestimmung der Pikrinsäure-Ionenpaarungskapazität sowohl vor wie auch nach der Derivatisierung ermittelt wurde:



Im allgemeinen konnten etwa 70% der Oberflächenamine acyliert werden (Tabelle I). Geringfügige Abweichungen von dieser Zahl (in Abhängigkeit von dem Anhydrid) ergaben sich entweder aus Meßungenauigkeiten (±5%) oder Reaktivitätsvariationen. Da Pikrinsäure an alle obigen Schichten adsorbiert wurde, waren Amine vorhanden, die mit Carboxylresten vermischt bzw. durchsetzt waren. Diese Kationenaustauschermaterialien banden jedoch Hämoglobin bei pH 8 nicht (bei diesem pH ist Hämoglobin negativ geladen), was anzeigt, daß diese Amine für große Moleküle wie Protein nicht zugänglich sind, sondern nur für kleine Moleküle wie Pikrinsäure.

Dann wurden je 50 mg der Kationenaustauschermaterialien auf ihre Kapazität geprüft, Makromoleküle zu binden (rohes Ringerhämoglobin vom Typ II bei pH 5,5, wobei das Protein positiv geladen ist). Zum Messen der Hämoglobinkonzentrationen wurde ein Perkin-Elmer Modell 55 Spektrophotometer eingesetzt. Die mit Glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid und Tetrahydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid synthetisierten Kationenaustauschermaterialien banden alle etwa 40 mg Hämoglobin je Gramm beschichtetem Trägermaterial. Das Diglykolsäureanhydrid-Kationenaustauschermaterial band etwas mehr Hämoglobin, möglicherweise aufgrund erhöhter Derivatisierung (Tabelle I). Die Fähigkeit dieser Materialien zur Bindung von Hämoglobin bei pH 5,5 wurde benützt, um die Kationenaustauscher-Bindekapazität für Protein (Hbcec) zu demonstrieren.

Anschließend wurden je 0,5 g der mit Bernsteinsäureanhydrid (SUC), Glutarsäureanhydrid (GLU), Diglykolsäureanhydrid (DGA), und Tetrahydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid (TETRA) erhaltenen Kationenaustauschermaterialien in einzelne 0,41 × 5 cm ID Säulen zur chromatographischen Bestimmung (siehe Tabelle I und Fig. 1A, B, C) gefüllt. Die Chromatographie erfolgte (mit einem LDC Constametric I und IIIG System mit Gradient Master, Laboratory Data Control, Riviera Beach, Florida) unter Anwendung von 0,01 m NaOac (pH 5,5) bis 0,5 m NaCl in 0,01 m NaOac (ph 5,5) als Eluiermittel mit linearem Gradienten während 20 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. Die analytische Testprobe (20 µl) bestand aus 3 mg/ml Cytochrom c (Pferdeherzcytochrom c, pI = 9,2) und 5 mg/ml Lysozym (Eiweißlysozym, pI = 11) zusammen mit einer Spur Ascorbinsäure zur Verhinderung der Oxidation. Die Bestimmung (detection) erfolgte bei A254, was mit einem Altex UV-Detektor, Modell 153 (Anspec, Ann Arbor, Michigan) überwacht wurde. Die Retentionszeiten (tR) der CYTc und LYZ Peaks sind in Tabelle I angegeben und graphisch in Fig. 1 dargestellt. Die Auflösung (Rs in Tabelle I und Fig. 1) von CYTc und LYZ wurde nach der Gleichung

Rs = 2 (tR - tR)/(ΔtR + ΔtR)

berechnet. Die Symbole tR und tR sind die Retentionszeiten jedes Peaks, während ΔtR und ΔtR die Peakbreiten sind. Die Indizes 1 und 2 beziehen sich auf den ersten und zweiten aus der Säule eluierten Peak. Der höchste Rs-Wert wurde an der SUC-Säule erhalten. Dies war mehr das Resultat der einzigartigen Selektivität als der verringerten Peakbreite. Obwohl Lysozym stark zurückgehalten wurde, wurde Cytochrom früh eluiert (Fig. 1C). Die Leistungsfähigkeit des Bernsteinsäureanhydridmaterials war auch aus wirtschaftlichen Gründen bemerkenswert, d. h. es ist das billigste der Anhydride.

Beispiel II

Es wurde Polyacrylsäureanhydrid (PAA) hergestellt, indem man 5 g Polyacrylsäure (M.G. 2000, Kettenlänge 28) in einen 100 ml Rundkolben gab und diesen dann in ein Ölbad bei 180°C setzte. Der Kolben wurde dann mit einer Vakuumpumpe verbunden und 3 Stunden evakuiert. Der erhaltene gelbe Festkörper wurde aus dem Kolben gekratzt und in einem Exsikkator aufbewahrt. Die NMR-Analyse zeigte, daß 79% der Carboxylgruppen dehydratisiert waren, was etwa 11 Anhydridfunktionen je Polymermolekül entspricht.

0,7 g Vydac 101 TPB Siliciumdioxid (5,5 µm, kugelförmig, 330 Å) wurden in 10 ml einer 1% (Gewicht/Volumen) Polyethylenimin- 18 enthaltenden Methanollösung suspendiert und 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das adsorbierte Siliciumdioxid wurde auf einem Sinterglastrichter wieder isoliert und 30 Minuten bei 110°C in einen Ofen gegeben. Dann wurde das trockene Medium in einen 50 ml Rundkolben gegeben, der 4 ml trockenes Dimethylformamid, 250 µl trockenes redestilliertes Diisopropylethylamin und 50 mg des oben hergestellten Polyacrylsäureanhydrids (1,2% PAA) enthielt. Diese Reaktion wurde zwei weitere Male wiederholt, wobei verschiedene Mengen Polyacrylsäureanhydrid verwendet wurden, 100 mg Polyacrylsäureanhydrid (2,4% PAA) und 200 mg Polyacrylsäureanhydrid (4,7% PAA). Die Reaktionen ließ man über Nacht bei 60°C weiterlaufen. Dann wurde jedes Produkt auf einem Sinterglastrichter isoliert und sukzessive mit Methanol, Wasser, Triethylamin und Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum wurden diese Materialien in einem Exsikkator aufbewahrt. Je 50 g der mit verschiedenen Konzentrationen an Polyacrylsäureanhydrid erhaltenen Kationenaustauschermaterialien wurden auf ihre Kapazität Pikrinsäure zu binden geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.



Tabelle II Evaluierung von stationären Phasen: Adsorbierte Kationenaustauscher, synthetisiert aus Polyacrylsäureanhydrid


Interessanterweise war die prozentuale Acylierung dieser Kationenaustauschermaterialien geringer als die, die man mit den monomeren Anhydriden von Beispiel I erhalten hatte. Der Zugang des großen Polyacrylsäureanhydrids zu Aminen der stationären Phase kann aus sterischen Gründen gehindert sein. Da es zu keiner anionenaustauschenden Hämoglobinbindung kam, nahm man an, daß die Kationenaustauschermaterialien hinreichend vernetzt waren, ohne zugängliche restliche positive Ladung (charge).

Je 50 mg der mit Polyacrylsäureanhydrid synthetisierten Kationenaustauschermaterialien wurden dann auf ihre Kationenaustauscherbindekapazität für Proteine (Hbcec) geprüft, wobei Hämoglobin (roh, vom Rind, Typ II) bei einem Puffer-pH von 5,5 verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle II zusammengestellt. Die Hämoglobinbindung stieg mit der Polyacrylsäureanhydridkonzentration. Der höchste Wert wurde auf dem Material erhalten, das mit der größten Konzentration (4,7% PAA) synthetisiert war. Sowohl dieses Material als auch das mit 2,4% PAA hergestellte Material banden mehr Hämoglobin als das gemäß Beispiel I hergestellte Diglykolsäureanhydrid-Kationenaustauschermaterial. Da alle Kationenaustauschermaterialien der Beispiele I und II von einem handelsüblichen Ausgangsprodukt ausgingen (nämlich dem unvernetzten, auf Vydac Siliciumdioxid adsorbiertem Polyethylenimin), scheint die gesteigerte Hämoglobin- Bindekapazität direkt mit dem Verhältnis von Amid zu Carboxylgruppen des kovalent gebundenen PAA zusammenzuhängen.

Polyacrylsäureanhydrid ist ein lineares Polymeres. Anders als die monomeren Anhydride von Beispiel I, wo die Carboxylgruppe innerhalb von fünf Atomen von der Oberfläche sein muß, können Abschnitte oder Längen (lengths) der Polyacrylsäure (Stiele und Schleifen) in das Kieselsäureporenvolumen bzw. -innere hineinreichen. Die Existenz solcher Strukturen würde der Oberfläche eine gezähnte Topographie geben und damit den Oberflächenbereich wirksam vergrößern. Da die Bindekapazität direkt mit dem letzteren in Beziehung steht, kommt es zu einer Steigerung. Das mit 1,2% PAA vernetzte Kationenaustauschermaterial band 36 mg Hämoglobin je g beschichtetem Träger, was dem Kationenaustauschermaterial auf Basis von monomerem Anhydrid von Beispiel I vergleichbar war. Bei niedrigen Konzentrationen an Polyacrylsäureanhydrid können die Stiel- und Schleifenstrukturen nicht überwiegen, da es weniger Konkurrenz für die Oberflächenamine gibt und die Polyacrylsäureanhydridmoleküle extensiv reagieren.

Jeweils etwa 0,5 g Polyacrylsäureanhydrid-Kationenaustauschermaterialien wurden in 0,41 × 5 cm Säulen zur chromatographischen Evakuierung gepackt. Die Chromatographie wurde mit dem chromatographischen Instrumentarium und dem Detektor von Beispiel I unter Verwendung eines Elutionsmittels von 0,01 m NaOac (pH 5,5) bis 1 m NaCl in 0,01 m NaOac (pH 5,5) mit linearem Gradienten während 20 Minuten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Die analytische Testprobe (20 µl) bestand aus CYCc und LYZ zusammen mit einer Spur Ascorbinsäure wie in Beispiel I. Die Retentionszeiten (tR) der CYTc und LYZ Peaks und die Trennschärfe oder Auflösung (berechnet wie in Beispiel I) von oder zwischen CYTc und LYZ sind in Tabelle II angegeben, die Retentionszeiten der CYTc und LYZ Peaks auf dem 1,2% PAA-Material sind graphisch in Fig. 1 dargestellt. Die Retentionszeiten von CYTc und Lysozym stiegen mit der PAA-Konzentration. Tatsächlich konnte Lysozym von der 4,7% PAA-Säule mit 1 m NaCl nicht eluiert werden, und es war 0,77 m NaCl zur Desorption von der 2,4% PAA-Säule erforderlich. Diese Werte liegen wesentlich höher als jene, die mit den Säulen von Beispiel I erhalten wurden. Zwar mag die stark zurückhaltende oder retentive 4,7% Säule chromatographisch nicht praktisch sein, da sie zu retentiv ist, sie kann jedoch zur Immobilisierung von Protein von Vorteil sein. Kationische Polypeptide wie Antikörper könnten bei der Immunoaffinitätschromatographie fest an die Matrix adsorbiert werden. Bei Anwendung von 0 bis 1 m NaCl während 20 Minuten (linearer Gradient) variierte die Auflösung zwischen CYTc und LYZ von unendlich auf der 4,7% PAA-Säule bis zu einem Wert von 4,9 auf der 1,2% PAA-Säule. Die 4,7% PAA-Säule ergab eine unendliche Rs wegen der unbegrenzten Retention von LYZ. Die 1,2% PAA-Säule ergab den niedrigsten Rs-Wert unter den angegebenen Bedingungen; dieser Wert stieg jedoch auf 6,1, wenn die Gradientenneigung (gradient slope) um die Hälfte verringert wurde (siehe Fig. 1D).

Beispiel III

Etwa 20 µl einer ähnlichen Testprobe wie in Beispiel I von CYTc und LYZ, zusammen mit einer Spur Ascorbinsäure, wurden an den Glutarsäureanhydrid-, Bernsteinsäureanhydrid- und Diglykolsäureanhydridsäulen von Beispiel I und der 1,2% Polyacrylanhydridsäule von Beispiel II chromatographiert, wobei verschiedene Eluierungs-pH-Werte angewandt wurden, während die anderen Bedingungen konstant blieben. In allen Fällen stand die Retention in umgekehrtem Verhältnis zum pH (Fig. 2 zeigt nur die Retention von Lysozym). Dieses Verhalten ergibt sich aus einer Steigerung an positiver Proteinnettoladung, wenn der Eluierungs-pH unter den isoelektrischen Punkt sinkt. Eine genauere Prüfung zeigt, daß die Glutarsäureanydridsäule am meisten pH empfindlich ist. Da Glutarsäureanhydrid eine zusätzliche Methylengruppe aufweist, kann eine kooperative hydrophob-ionische Wechselwirkung verantwortlich sein. Dieser Versuch diente dazu, den allgemeinen pH-Arbeitsbereich dieser Kationenaustauschermaterialien zu bestimmen. Bei pH 5,5 bis 7,5 wurde eine Trennschärfe von 4 oder mehr zwischen CYTc und LYZ erzielt.

Beispiel IV

Die Bernsteinsäureanhydridsäule von Beispiel I und die 1,2% Polyacrylsäureanhydridsäule von Beispiel II wurden als repräsentative Medien zur Fraktionierung eines Rohproteingemischs gewählt. Die Probe bestand aus einem Extrakt von Cyanbacteria Aphanizomenon flos-aquae, der Cytochrom c 553 (CYTc 553) enthielt. Dieses Protein hatte einen isoelektrischen Punkt von 9,3, ein Molekulargewicht von 11 000 und einzigartige Spektraleigenschaften. Im reduzierten Zustand zeigte das sichtbare Absorptionsspektrum Maxima bei 280, 410 und 553 Nanometern.

Der rohe Zellextrakt wurde teilweise durch Ultrafiltration (30 000 MG Abschlußmembran) aufbereitet. Das erhaltene Filtrat, das weniger als 0,5 mg/ml Protein enthielt, wurde gesammelt und auf pH 7 eingestellt. Jede Kationenaustauschersäule (0,41 × 5 cm) wurde dann mit einem 80 µl Aliquot dieses Gemischs beladen bzw. beschickt. Wie in Beispiel I wurde die Chromatographie unter Anwendung eines Eluierungsmittels mit linearem Gradienten von 0,01 m NaOac (pH 7) bis 0,5 m NaCl in 0,01 m NaOac (pH 7) während 20 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Mit einem HP 1040 A Detektorsystem (Hewlett Packard, Corvallis, Oregon) wurde eine zweifache Wellenlängenüberprüfung (bei 260 und 410 nm) vorgenommen. Das 260 nm Signal erfaßte alle Proteine, während das 410 nm Signal jene überwachte, die Polyporphorinringe enthielten (z. B. CYTc 553).

Die Prüfung des von der Bernsteinsäureanhydridsäule (bei 260 nm) erhaltenen Chromatogramms zeigte eine beträchtliche Anzahl an Ultraviolett adsorbierenden Materialien (Fig. 3A). Jedoch wurde der kleine, bei 8,5 Minuten eluierende Peak als CYTc553 (Fig. 3A) aufgrund seiner Spektraleigenschaften identifiziert. Das 553/280 Absorptionsverhältnis am Peakapex betrug 0,4. Da ein Wert von 1 als entsprechend einer Reinheit von 90% angesehen wird, sind noch Verunreinigungen vorhanden. Trotzdem wurde, wenn man den Peakbereich von CYTc553 relativ zu den verbleibenden Peakbereichen beurteilt, eine wesentliche Reinigung erzielt. Die Chromatographie an der 1,2% Polyacrylsäureanhydridsäule unter identischen Bedingungen ergab ähnliche Ergebnisse (Fig. 3C). Im allgemeinen hatte dieser Träger eine etwas stärkere Retention als die Bernsteinsäureanhydridsäule, war auch etwas selektiver und trennte das Gemisch in 12 getrennte Peaks gegenüber 10. Wiederum wurde CYTc553 durch seine sichtbare Absorption (absorbance) bei einer Retentionszeit von 9,4 Minuten identifiziert. Die Spektralanalyse am Peakapex (peak apex) ergab ein 553/280 Absorptionsverhältnis von etwa 0,45.

Obgleich die Erfindung anhand ihrer bevorzugten Ausbildungsweise beschrieben wurde, können andere Ausbildungsweisen zum gleichen Ergebnis führen.


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zum Herstellen eines Kationenaustauschermaterials, gekennzeichnet durch die Stufen:

    1. a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität für ein Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
    2. b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird;
    3. c) Umsetzung von Amingruppen der adsorbierten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines polyfunktionalen Agens zum Vernetzen der Schicht und zur Bildung mindestens einer, vorzugsweise vieler, Carboxylgruppen.


  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als polyfunktionales Agens ein hydrophiles Polymeres verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktion von Amin und polyfunktionalem Agens in Stufe c) ein tertiäres Amin enthaltender Protonenfänger oder Protonenspülmittel (proton scavenger) zugesetzt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägermaterial ein anorganisches Trägermaterial der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid verwendet.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Adsorbat aus der Gruppe aus Polyethylenimin, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, Tetraethylenpentaimin und Ethylendiamin verwendet.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbat in einem Lösungsmittel enthalten ist und daß man die Adsorption mindestens teilweise durch Steuerung der Polarität dieses Lösungsmittels durchführt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als hydrophiles Polymeres ein polymeres Anhydrid verwendet.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als polymeres Anhydrid Polyacrylsäureanhydrid verwendet.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kationenaustauschermaterial als Füllkörper in der Flüssigchromatographie verwendet.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das chromatographische Füllkörpermaterial zum Trennen von Proteinen oder anderen biologischen Polymeren verwendet wird.
  11. 11. Verfahren zum Herstellen eines Kationenaustauschermaterials, gekennzeichnet durch die Stufen:

    1. a) Bereitstellen eines Siliciumdioxid-Trägermaterials mit einer eine Affinität zu einem Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
    2. b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Polyethylenimin enthaltenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird; und
    3. c) Umsetzung der adsorbierten Polyethyleniminschicht in Anwesenheit eines Protonenfängers mit einer zum Vernetzen der Schicht und zur Bildung von Carboxylgruppen ausreichenden Menge an Polyacrylsäureanhydrid.


  12. 12. Verfahren zum Herstellen eines Kationenaustauschermaterials, gekennzeichnet durch die Stufen:

    1. a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität zu einem Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
    2. b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht auf der Oberfläche elektrostatisch adsorbiert wird;
    3. c) Vernetzen der auf der Oberfläche adsorbierten Schicht; und
    4. d) Umsetzen mindestens einer, und vorzugsweise vieler, Amingruppen der adsorbierten vernetzten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines Agens zur Bildung mindestens einer, und vorzugsweise vieler, Carboxylgruppen.


  13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktion von Amin und Agens in Stufe d) ein tertiäres Amin enthaltender Protonenfänger zugesetzt wird.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägermaterial ein anorganisches Trägermaterial der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid verwendet.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Adsorbat der Gruppe aus Polyethylenimin, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, Tetraethylenpentamin und Ethylendiamin verwendet.
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Agens in Stufe d) ein polyfunktionales verwendet wird.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als polyfunktionales Agens ein hydrophiles Polymeres verwendet.
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als hydrophiles Polymeres ein polymeres Anhydrid verwendet.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als polymeres Anhydrid Polyacrylsäureanhydrid verwendet.
  20. 20. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Agens in Stufe d) ein monofunktionales verwendet.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als monofunktionales Agens ein hydrophiles Monomeres verwendet.
  22. 22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als hydrophiles Monomeres ein monomeres cyclisches Anhydrid verwendet.
  23. 23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man ein monomeres Anhydrid der Gruppe aus Glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Diglykolsäureanhydrid und Tetrahydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid verwendet.
  24. 24. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierte Schicht vernetzt wird, indem man die Oberfläche einem Vernetzer der Gruppe aus Epoxyharz und Alkylbromid aussetzt.
  25. 25. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbat in einem Lösungsmittel enthalten ist und daß man die Adsorption mindestens teilweise durch Steuerung der Polarität des Lösungsmittels durchführt.
  26. 26. Kationenaustauschermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Verfahren hergestellt worden ist, das die Stufen umfaßt:

    1. a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität für ein Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
    2. b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird; und
    3. c) Umsetzung von Amingruppen der adsorbierten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines polyfunktionalen Agens zum Vernetzen der Schicht und Bildung mindestens einer, vorzugsweise viele, Carboxylgruppen.


  27. 27. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionale Agens ein hydrophiles Polymeres enthält.
  28. 28. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß ein ein tertiäres Amin enthaltender Protonenfänger der Reaktion von Amin und polyfunktionalem Agens in Stufe c) zugesetzt wird.
  29. 29. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein anorganisches Trägermaterial der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid ist.
  30. 30. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbat aus der Gruppe aus Polyethylenimin, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, Tetraethylenpentamin und Ethylendiamin ist.
  31. 31. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbat in einem Lösungsmittel enthalten ist und daß die Adsorption mindestens teilweise durch Steuerung der Polarität des Lösungsmittels durchgeführt wird.
  32. 32. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Polymere ein polymeres Anhydrid umfaßt.
  33. 33. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Anhydrid Polyacrylsäureanhydrid umfaßt.
  34. 34. Kationenaustauschermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es durch ein Verfahren hergestellt worden ist, das die folgenden Stufen umfaßt:

    1. a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität zu einem Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
    2. b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird;
    3. c) Vernetzung der auf der Oberfläche adsorbierten Schicht; und
    4. d) Umsetzung mindestens einer und vorzugsweise vieler Amingruppen der adsorbierten vernetzten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines Agens zur Bildung mindestens einer und vorzugsweise vieler Carboxylgruppen.


  35. 35. Kationanaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Agens in Stufe d) polyfunktional ist.
  36. 36. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionale Agens ein hydrophiles polymeres Anhydrid enthält.
  37. 37. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Agens in Stufe d) monofunktional ist.
  38. 38. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das monofunktionale Agens ein hydrophiles monomeres cyclisches Anhydrid enthält.
  39. 39. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein anorganisches Trägermaterial der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid ist.
  40. 40. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierte Schicht dadurch vernetzt worden ist, daß die Oberfläche einem Vernetzer der Gruppe aus Epoxyharz und Alkylbromid ausgesetzt wurde.
  41. 41. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe d) alle reaktiven Amingruppen der adsorbierten vernetzten Schicht, mit Ausnahme jener, die für große Moleküle wie Eiweiß nicht zugänglich sind, mit dem Agens zur Bildung von Carboxylgruppen umgesetzt werden.






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