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Vorrichtung zur Detektion von zur Photonenemission anregbaren Stoffen - Dokument DE3618605A1
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE3618605A1 10.12.1987
Titel Vorrichtung zur Detektion von zur Photonenemission anregbaren Stoffen
Anmelder Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL), 6900 Heidelberg, DE
Erfinder Ansorge, Wilhelm, Dr., 6901 Gaiberg, DE;
Schwager, Christian, 6800 Mannheim, DE;
Stegemann, Josef, 6900 Heidelberg, DE
Vertreter Weickmann, H., Dipl.-Ing.; Fincke, K., Dipl.-Phys. Dr.; Weickmann, F., Dipl.-Ing.; Huber, B., Dipl.-Chem.; Liska, H., Dipl.-Ing. Dr.-Ing.; Prechtel, J., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 8000 München
DE-Anmeldedatum 03.06.1986
DE-Aktenzeichen 3618605
Offenlegungstag 10.12.1987
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.12.1987
IPC-Hauptklasse G01N 30/90
IPC-Nebenklasse G01N 30/95   G01N 27/28   
IPC additional class // C12N 15/00  

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Bei einer Vielzahl von Untersuchungsverfahren wird so vorgegangen, daß man die Probe, deren Zusammensetzung zu ermitteln ist, längs einer Bahn sich bewegen läßt (aufgrund beispielsweise elektrischer oder magnetischer Kräfte, Kapillarkräfte, angelegten Gas- oder Flüssigkeitsdrucks oder dergl.), wobei sich bei dieser Bahnbewegung eine räumliche Aufteilung der Probe ergibt aufgrund unterschiedlicher Wanderungsgeschwindigkeit der die Probe bildenden unterschiedlichen Stoffe. Gleiche Stoffe haben gleiche Wanderungsgeschwindigkeit und bilden daher entlang der Bahn wandernde Banden, die detektiert werden können. Bei Verwendung angefärbter Stoffe ausreichender hoher Konzentration in den Banden, können diese visuell beobachtet werden oder, ggf. automatisch, mit Hilfe optischer Abtasteinrichtungen (Scanner, Fotodioden oder dergl.). Bei geringer Konzentration der Stoffe innerhalb der Banden ist eine Beobachtung häufig nicht mehr möglich. In diesem Falle kann man so vorgehen, daß man die Stoffe radioaktiv markiert und eine Momentaufnahme der sich nach einer gewissen Laufzeit ausgebildeten Bandenstruktur der Bahn durch Anlegen eines Photofilms an den Träger anfertigt. Dieses, insbesondere bei der Gel-Elektrophorese angewandte Verfahren hat eine Reihe von Nachteilen, insbesondere der große erforderliche Aufwand (Handhabung radioaktiver Stoffe mit beschränkter Lebensdauer (Halbwertszeit)), zeitaufwendige, nur durch geschultes Personal durchführbare Auswertung der Aufnahmen, die auch bei optischer Abtastung der Aufnahme und nachfolgender Rechnerauswertung (Zeitschrift Nucleic Acids Res. 14, 417 bis 424, 1986) aufgrund der oft schlechten Auflösung benachbarter Banden nicht wesentlich verbessert wird. Ein weiteres Beispiel für ein Anwendungsgebiet der Vorrichtung der eingangs genannten Art liegt in der Chromatographie, bei welcher ebenfalls die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit der zu untersuchenden Stoffe zu deren Analyse ausgenutzt wird. Die Erfindung liegt jedoch bevorzugt, wenn auch nicht ausschließlich, auf dem Gebiete der Elektrophorese, insbesondere Dünnschicht-Elektrophorese.

Aus der Zeitschrift BIO/TECHNOLOGY 3, Mai 1985, Seiten 395, 396 ist eine Vorrichtung der eingangs genannten Art bekannt, bei der bei der Gel-Elektrophorese zur Sequenzierung von DNA so vorgegangen wird, daß man den "Primer" der nach der Didesoxy-Methode gewonnen DNA- Fragmente markiert, und zwar jeweils mit anders farbigem Fluoreszenzfarbstoff für die vier Ansätze entsprechend den vier Didesoxy-Nukleotiden (s. auch Zeitschrift Nachr. chem.tech.Lab. 34, 5, Seiten 430, 431, 1986). Eines dieser Farbstoffe ist Rhodamin-isothiocyanat (Emissionswellenlänge 580 mm). Die DNA-Bruchstücke können dann in einer einzigen Spur eines Polyacrylamid-Gels getrennt und mit einem Laser photometrisch vermessen werden. Das Gel befindet sich hierbei in einem dünnen Rohr. An demjenigen Ende des Gels, zu welchem die Banden laufen, ist der Laser angeordnet, der jedes Band beleuchtet, sobald es an ihm vorbeiläuft. Die daraufhin von den Fluoreszenzstoffen mit der entsprechenden Wellenlänge abgegebenen Emissionsphotonen werden von der Detektoranordnung aufgenommen und registriert mit Zuordnung zu einer der vier Wellenlängen. Aus der Abfolge der den vier Desoxynucleotiden zugeordneten Emissionsmaxima läßt sich im Prinzip unmittelbar die DNA-Sequenz ablesen. In der Praxis ergeben sich doch schwerwiegende Meßprobleme, insbesondere Auflösungsprobleme, da die Konzentration der Fluoreszenzstoffe in den Banden äußerst gering ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei einer Vorrichtung der eingangs genannten Art die Meßempfindlichkeit zu erhöhen.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs gelöst.

Es wurde erkannt, daß bei der bekannten Anordnung mit Gel-Elektrophorese innerhalb eines dünnen Glasröhrchens der Laserstrahl beim zweimaligen Durchqueren der Röhrchenwand beim Eintritt bzw. Austritt aus dem Glasröhrchen eine relativ hohe Untergrund-Strahlung (insbesondere Lichtstreuung) erzeugt, die von der auf den Innenraum des Röhrchen fokussierten Detektoranordnung praktisch nicht ausgeblendet werden kann. Auch wurde erkannt, daß der Laserstrahl lediglich ein geringes Teilvolumen des Gels erfaßt. Würde man den Laserstrahl etwa entsprechend dem Innendurchmesser des Röhrchens aufweiten, so würde dies dementsprechend die vom Glas in die Detektoranordnung gestreute Laserlicht-Intensität unzumutbar erhöhen. Bei der Erfindung dagegen wird durch den zwischen den beiden langen Rechteckseiten des Querschnitts verlaufenden, zu diesen Seiten lediglich geringfügigen Abstand aufweisenden Laserstrahl praktisch der gesamte Querschnitt erfaßt. Die zu überwachende Bahn bzw. Bahnen innerhalb des Querschnitts können so weit weg von dem Einlaßteil und dem Auslaßteil verlaufen, daß sämtliche im Bereich von Einlaßteil und Auslaßteil erzeugte Streustrahlung zuverlässig von der Detektoranordnung ausgeblendet werden kann.

Es sei darauf hingewiesen, daß der Anregungsstrahl besonders bevorzugt ein Laserstrahl ist, aufgrund der erzielbaren hohen Intensitäten, wenn auch ein von einer inkohärenten Strahlenquelle abgegebener Anregungsstrahl in Frage kommt. Entsprechend der Vielzahl möglicher Anregungsmechanismen (Chemoluminiszenz; Thermoluminiszenz oder dergl.) kommen auch andere Arten von Anregungsstrahlen in Frage, beispielsweise Röntgenstrahlen; auch muß die Wellenlänge der Emissionsphotonen nicht im sichtbaren Bereich liegen.

Um möglichst verlustfrei den Anregungsstrahl in den Querschnitt eintreten zu lassen und auch wieder austreten zu lassen, werden die Maßnahmen des Anspruchs 2 vorgeschlagen. Das Ein- und Auskoppeln des Anregungsstrahls aus Einlaßteil bzw. Auslaßteil wird durch die Maßnahmen des Anspruchs 3 noch weiter verbessert.

Die Weiterbildung gemäß Anspruch 4 bringt den Vorteil minimaler Streustrahlung des Anregungsstrahls in dem Abbremsmedium, insbesondere Gel, da dann die Intensität der Raman-Streuung und Raleigh- Streuung minimal ist.

Um diese Polarisationsrichtung auch bei herkömmlichen Lasern mit vertikaler Polarisation zu erhalten, werden die Maßnahmen des Anspruchs 5 vorgeschlagen.

Um mit baulich einfachen Mitteln eine genaue Justierung des Strahlengangs des Anregungsstrahls durch den Innenraum des Gehäuses zu ermöglichen, werden die Maßnahmen des Anspruchs 6 vorgeschlagen.

Besonders bevorzugt ist die Anordnung gemäß Anspruch 7. Mit einem einzigen Anregungsstrahl können auf diese Weise mehrere Bahnen im one-line-Betrieb überwacht werden. Bei der DNA-Sequenzierung werden sowohl bei dem Verfahren nach Maxam und Gilbert sowie nach Sanger vier, den vier Nukleotidbasen G, A, T, C entsprechende Ansätze der zu untersuchenden DNA zubereitet und einer Elektrophorese mit je einer Bahn für jeden Ansatz unterzogen. Mit der erfindungsgemäßen Anordnung lassen sich diese vier Bahnen durch einen einzigen Laserstrahl überwachen. Da jeder Bahn eine Detektoranordnung zugeordnet ist, kann für sämtliche Ansätze derselbe Farbstoff, insbesondere Fluorenszenzfarbstoff eingesetzt werden. Dieser ist besonders bevorzugt ein an den Primer angehefteter Fluoro-Farbstoff, insbesondere Tetramethyl-Rhodamin. Dieser zeichnet sich durch hohe Absorption und damit große Wirksamkeit aus sowie durch geringe Bandbreite (52 nm Linienbreite bei halber Maximalintensität) aus bei einer Absorbtionswellenlänge von 560 nm und einer Emissionswellenlänge von 575 nm. Durch diese one- line-Vermessung der vier getrennten Bahnen mit jeweils optimalem Fluoreszenzfarbstoff in jeder Bahn und getrennter Registrierung der Emission jeder Bahn ergibt sich eine außerordentlich gute Trennung der einzelnen Emissionspeaks unmittelbar aufeinanderfolgender Banden sowohl innerhalb einer einzigen Bahn als von zu Bahn.

Die Weiterbildung der Erfindung gemäß Anspruch 8 dient der weiteren Unterdrückung des Signal-Untergrunds durch Ausblenden von Störstrahlung. Hierzu trägt auch die Weiterbildung der Erfindung gemäß Anspruch 9 und 10 bei.

Die erfindungsgemäße Anordnung läßt sich zwar mit besonderem Vorteil für die DNA-Sequenzierung mit Aufteilung in vier Bahnen anwenden, wie vorstehend beschrieben worden ist. Aufgrund der erfindungsgemäß erzielten wesentlichen Verbesserung des Signal-Rauschverhältnisses kann die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch auch mit Erfolg für die eingangs beschriebene bekannte Vierfarben-Methode mit einer einzigen Bahn eingesetzt werden. Hierbei ist es auch möglich, mehrere Proben gleichzeitig in nebeneinanderliegenden Bahnen jeweils mit Vierfarben-Mischung durch die erfindungsgemäße Vorrichtung zu analysieren. Die jeweilige Detektoranordnung jeder Bahn weist dann der Anzahl der unterschiedlichen Emissions-Photonenwellenlängen entsprechend mehrere Sensoren auf. Durch entsprechende Strahl-Filterung können den Sensoren jeweils die Photonen der zugeordneten Wellenlänge zugeleitet werden. Man kann jedoch auch gemäß Anspruch 12 den Strahl richtungsmäßig aufspalten (durch Prisma, Strichgitter, Fresnel&min;sche Zonenplatte) in Teilstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge. Die Sensoren können dann gemäß Anspruch 13 positionsempfindliche Detektoren sein,vorzugsweise in Form einer CCD-Zeile, einer Photodioden-Zeile oder eines Photomultipliers mit unterteilten Positionsbereichen.

Um einen schnellen Wechsel des das Abbremsmedium für die zu untersuchenden Stoffe, insbesondere Gel-Schicht enthaltenden Gehäuses zur schnellen Vorbereitung der nächsten Messung durchführen zu können ohne aufwendige Justierarbeiten, werden die Maßnahmen des Anspruchs 14 vorgeschlagen. Der Träger für das Gehäuse kann mit der Halterung für die Strahlquelle über eine optische Bank, einen optischen Tisch oder dergl. verbunden sein.

Bevorzugt für die Gel-Elektrophorese ist das als Gel- Träger dienende Gehäuse gemäß den Merkmalen des Anspruchs 15 ausgebildet. Die Gel-Schicht kann gemäß DE-OS 30 24 288 hergestellt worden sein; die von der Detektoranordnung entferntere der beiden zueinander parallelen Platten kann auf eine thermostatische Platte gemäß dem deutschen Patent 30 46 729 aufgelegt sein oder selbst eine Wand dieser thermostatischen Platte bilden. Die Ausbildung des Trägers als das Gel einschließendes Gehäuse ist besonders bevorzugt, wenn auch die Erfindung anwendbar ist auf nicht abgedeckte Gel-Schichten auf einem Träger. Derartige Gel-Schichten haben zwar im allgemeinen keine völlig konstante Dicke entlang der jeweiligen Bahn; da es bei dem erfindungsgemäßen one-line-Verfahren jedoch nur auf die relative Abfolge der Banden ankommt, kann diese ungleichmäßige Dicke in Kauf genommen werden.

Gemäß den Ansprüchen 16-18 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung bevorzugt zur Gel-Elektrophorese und Fluoreszenzanregung durch Laserstrahl ausgebildet.

Die erfindungsgemäß Vorrichtung eignet sich besonders bevorzugt zur DNA-Sequenzierung, wenn auch andere Anwendungen in Frage kommen. Erfindungsgemäß kann die DNA-Sequenzierung im one-line-Betrieb mit automatischer Auswertung vorgenommen werden, wobei die hohe Sensitivität besonders hervorzuheben ist. Gemäß Anspruch 19 kann jedoch bedarfsweise eine "Momentaufnahme" der Banden auf dem Träger angefertigt werden, indem entweder der Anregungsstrahl in Wanderungsrichtung gegenüber dem Träger verlagert wird oder umgekehrt zur entsprechenden Abtastung des Bandenmusters.

Die Erfindung wird im folgenden an bevorzugten Ausführungsbeispielen an Hand der Zeichnung erläutert:

Es zeigt:

Fig. 1 eine Schemaansicht des Gesamtsystems;

Fig. 2 eine teilweise geschnittene Detailansicht der Anordnung in Fig. 1 im Bereich des Gel-Trägers;

Fig. 3 eine perspektivische, teilweise abgebrochene vereinfachte Darstellung einer Halterung für den Gel-Träger und

Fig. 4 eine perspektivische Teilansicht einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit spektraler Detektions-Aufteilung.

Der generelle Aufbau einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Fig. 1 zu entnehmen. Man erkennt einen mit 10 bezeichneten Laser (Argon-Laser, Spectra-Physics, Modell 166, Wellenlänge 514,5 nm), der einen Anregungsstrahl 12 abgibt mit vertikaler Polarisation, angedeutet durch einen Richtungspfeil A&min;. Ein 90°-Polarisator 14 im Strahlengang zwischen Laser 10 und einem Elektrophorese-Gel-Träger 16 bewirkt eine Drehung der Polarisationsrichtung in die horizontale (Pfeil B&min;). Es folgt ein Fokussier-System 18, welches den Strahlquerschnitt von 2 mm Durchmesser auf 0,3 bis 0,4 mm reduziert. Die Laser-Ausgangsleistung liegt im Bereich zwischen 50 bis 800 mW. Die Teile 10, 14 und 18 bilden eine Strahlquelle 20. Sie sind in üblicher Weise auf einem nicht näher dargestellten Träger, insbesondere optischer Tisch bzw. optische Bank, montiert, auf welchem die Platte 16 ebenfalls starr montiert ist, insbesondere unter Verwendung der in Fig. 3 dargestellten Halterung 21. Diese besteht aus einer mit dem Träger starr verbundenen, insbesondere über die Befestigungslöcher 22 in nicht dargestellter Weise befestigten Grundplatte 24, an welcher ein im Horizontal-Querschnitt im wesentlichen U-förmiger Anlagekörper 26 starr befestigt. An vertikalen Stirnflächen 28 der Seitenschenkel 30 der U-Form wird die jeweilige Platte 16 angelegt und an den Seitenschenkeln 30 starr befestigt, beispielsweise mit Hilfe von Federelementen, die einerseits an die vom Körper 26 abgewandte Deckplatte 32 des Trägers 16 angreifen und andererseits in Befestigungsausnehmungen 34 der Seitenschenkel 30 eingreifen. Die unteren Enden der beiden Seitenschenkel 30 sind jeweils mit einer Ausnehmung 36 versehen, in welche ein nicht dargestellter Trog einschiebbar ist, welcher das untere Ende der Platte 16 in üblicher Weise aufnimmt und welcher mit der unteren Elektrode zur Erzeugung des elektrischen Feldes für die Elektrophorese versehen ist.

Wie Fig. 2 zeigt, kann im Strahlengang zwischen Laser 10 und Träger 16 ferner ein Glasplättchen 38 mit vertikaler Drehachse 40 parallel zu den planparallelen Plättchenseiten 42 vorgesehen sein, um eine Parallelverschiebung des Anregungsstrahls 12 in horizontaler Richtung entsprechend dem Drehwinkel des Plättchen 38 zu ermöglichen. Der Strahl 12 wird in bekannter Weise beim Durchtritt durch die beiden Seitenflächen 42 zweifach abgelenkt jeweils um den gleichen Winkel, jedoch in entgegengesetzten Richtungen, so daß sich die gewünschte parallele Verschiebung in horizontaler Ebene ergibt. Eine genaue Justiermöglichkeit des Anregungsstrahls 12 ist deshalb von Vorteil, weil der Strahlquerschnitt mit einem Durchmesser von beispielsweise 0,3 bis 0,4 mm angenähert der Gel-Schicht-Dicke a in etwa 0,5 mm entspricht.

Die Gel-Schicht-Dicke wird durch die entsprechend dicke, in den Fig. 1 und 2 angedeutete, zur Wanderungsrichtung W parallele Abstandsstreifen 46 festgelegt, die an den vertikalen Längsrändern zweier gleichformatiger zueinander paralleler Platten 48 und 50 angeordnet sind und diese im Abstand a voneinander halten. Wenigstens eine der beiden Platten 50, nämlich die einer Detektor- Anordnung 52 zugewandte Platte 50, besteht aus wenig fluoreszentem, farblosem Glas mit hochgenau planparallelen Seitenflächen (z.B. B 270, Firma DESAG, BRD). Die Gel- Herstellung kann gemäß der DE-OS 30 24 288 erfolgen. Die von der Detektoranordnung 52 abgewandte Platte 48 kann mit Hilfe einer thermostatischen Platte beispielsweise gemäß der DE-OS 30 46 729 thermostatisiert sein, ggf. eine Frontplatte dieser thermostatischen Platte selbst bilden. Als Gel kommt ein Polyacrylamid-Gel in Frage mit einer (horizontalen) Breite von 100 mm und einer Länge von 400 mm. Auch kürzere Gele (200 mm) kommen in Frage. Der Einstrahlpunkt des Anregungsstrahls 12 liegt beispielsweise etwa 100 mm vor dem unteren Ende der Platten 48, 50.

Um das Laserlicht möglichst verlustfrei in den Gel- Querschnitt gelangen zu lassen, ist ein Einlaß-Teil 56 in eine entsprechende Lücke des in den Fig. 1 und 2 linken Randstreifens eingesetzt mit einer der Randstreifendicke a entsprechenden Dicke und einer Breite in vertikaler Richtung von etwa 10 mm. Die Länge des Einlaß- Teils 56 (in horizontaler Richtung) beträgt beispielsweise 15 mm. Da das in Fig. 2 rechte Ende des Einlaß- Teils 56 mit der Innenlängskante 58 des Randstreifens 46 fluchtend und die Breite des Randstreifen 46 in horizontaler Richtung lediglich 10 mm beträgt, steht das Einlaß-Teil 56 über den Plattenumriß vor. Die vom Anregungsstrahl 12 durchsetzten, zu diesem senkrechten Stirnflächen 60 des Einlaß-Teils 56 sind mit optischer Qualität planparallel poliert. Gleichen Aufbau weist ein in gleicher Höhe wie das Einlaß-Teil 56 angeordnetes Auslaß-Teil 62 in einer Durchbrechung des gegenüberliegenden Randstreifens 46 auf. Das Auslaß-Teil 62 dient der verlustarmen und damit reflexionsarmen Auskopplung des Anregungsstrahls aus dem Gel-Querschnitt. Diese Anordnung stellt sicher, daß der Laserstrahl mit hoher Intensität ohne merkliche Divergenz in den Gel-Querschnitt eingekoppelt wird und diesen ohne stärkere Reflexionen oder Lichtstreueffekte wieder verläßt. Die absolut glatte Innenseite von Einlaß- und Auslaßteil 56 bzw. 62 ergibt zudem bei der Gelherstellung (mit bereits eingesetzten Teilen 56 bzw. 62) eine entsprechend glatte polymerisierte Geloberfläche mit minimaler Streuung und Reflexion des auftreffenden Laserstrahls. Man erhält daher einen vorteilhaft niedrigen Meß-Untergrund.

Die Detektor-Anordnung dient zur gleichzeitigen, gesonderten Erfassung der im Ausführungsbeispiel insgesamt vier mit A, T, G, C bezeichneten Bahnen längs derer während der Elektrophorese vier zu untersuchende Proben in Richtung W wandern unter Bildung von Banden aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der Bestandteile der Proben. Die im Ausführungsbeispiel angegebene Bezeichnung der vier Bahnen mit den Buchstaben A, T, G und C soll die Basen angeben, bei denen im jeweiligen Probenansatz die DNA-Fragmente jeweils abgebrochen sind (entsprechend den üblichen DNA-Sequenzierungsmethoden nach Maxam-Gilbert bzw. nach Sanger). Um die von den Nachfragmenten jeweils gleicher Molekül-Länge gebildeten, in Fig. 1 mit 66 bezeichneten Banden trotz ihrer äußerst geringen Konzentration ohne die Verwendung radioaktiver Markierungen in einfacher Weise detektieren zu können, sind die DNA-Fragmente mit einem Fluorophor markiert. Hierfür kommt insbesondere, wenn auch nicht ausschließlich, der an den Fragmenten belassene Primer in Frage, der mit einem Tetramethyl-Rodamin versehen ist. Dieser Farbstoff zeichnet sich durch hohe Absorption und damit große Wirksamkeit aus sowie durch relativ geringe Linienbreite (52 nm Linienbreite bei halber Maximal- Intensität). Absorptions-Wellenlänge liegt bei 560 nm, die Emissions-Wellenlänge bei 575 nm.

Die durch den Anregungsstrahl 12 des Lasers 10 induzierten Emissions-Photonen der jeweils den Laserstrahl gerade querenden Bande 66 werden von einer Sammel- und Abbildungsoptik 70 jeweils für jede Bahn A, T, G oder C gesondert erfaßt (numerische Apertur 1, 2; Brennweite 50 mm) und auf eine Ausblend-Anordnung 72 mit vier Blenden 74 abgebildet. Jede Blende wird von einem der jeweiligen Bandenlänge entsprechenden horizontalen Schlitz gebildet mit einer Schlitzhöhe in vertikaler Richtung von 0,4 mm entsprechend dem Durchmesser des Abtaststrahls 12. Auf diese werden die aus Bereichen außerhalb der jeweiligen Bande stammenden Photonen weitmöglichst ausgeblendet.

Das durch die jeweilige Blende 74 tretende Licht wird in jeweils einen Lichtleiter 76 eingespeist, die jeweils in einer Filteranordnung 78 münden. Die Filteranordnungen dienen zum Wegfiltern von Photonen mit von den Emissions- Photonen abweichender Wellenlänge. Jede Filteranordnung umfaßt einen nicht fluoreszenten Filter zum Durchlaß größerer Wellenlängen (Schott BRD Nr. KV 550) sowie einen Bandpaß- Interferenz-Filter (Schott BRD Typ AL 575) mit bei 18 Nanometern liegenden Breite bei halber Maximal-Intensität. Diese Filter halten Raman-Streu- und Raleigh-Streu-Photonen von den nachfolgenen Sensoren ab. Die Sensoren sind in einem mit 80 bezeichneten Block eingebaut und unter der Bezugsziffer 82 symbolisch angedeutet. Als Sensoren kommen bevorzugt Photomultiplier in Frage (EMI London, Typ 9954 A) mit entsprechener Versorgungselektronik. Alternativ können auch Photodioden oder andere übliche Lichtdetektoren eingesetzt werden. Die vom Detektorblock 80 abgegebenen Meßsignale werden über eine mit 84 bezeichnete Leitung einer Datensammel- und Speichereinheit 86 zugeführt, die wiederum mit einem Mikro-Computer 88 zur Datenauswertung verbunden ist. In Fig. 1 ist ein mit dem Mikro verbundener Bildschirm 90 zu erkennen sowie ein vom Mikrocomputer gesteuerter Printer 92.

Aufbau und Betrieb der Anordnung gemäß Fig. 1 ist aus dem Vorstehendem im wesentlichen bereits ersichtlich. Nach Justierung von Laser 10 und Träger 16, erleichtert durch die an Hand von Fig. 3 bereits erläuterte Halterung 20 sowie durch das Justierplättchen 38 gemäß Fig. 2 und nach Einjustierung der Detektoranordnung 52, wird die Elektrophorese in Gang gesetzt, beispielsweise bei einer an das Gel 54 angelegten Spannung von 1000 bis 1500 V, 50°C und einer Leistung von 20 W. Im dargestellten Beispiel hat eine Bande 66&min; der Bahn G als erste und einzige bereits den Abtaststrahl 12 passiert unter Erzeugung eines entsprechenden Peaks der dieser Bahn G zugeordneten Meßkurve auf dem Bildschirm 90 und im Printer 92. Hieraus ergibt, sich daß das kürzeste DNA-Fragment in einer Guanin-Base an seinem dem Primer gegenüberliegenden Ende endet. Als nächstes wird eine mit 66&min;&min; bezeichndete Bande in der Bahn T den Abtaststrahl 12 queren mit entsprechender Peakerzeugung in der zugeordneten Meßkurve T. Hieraus läßt sich unmittelbar schließen, daß auf die Guanin-Base eine Tymin -Base folgt.

Auf diese Weise läßt sich im Prinzip die gesamte Basensequenz eines zu untersuchenden DNA-Stücks unmittelbar im one-line-Betrieb ermitteln.

Die Ausführungsform gemäß Fig. 4 bezieht sich auf die Vier-Farben-Methode gemäß der Zeitschrift Bio/Technology vol. 3; Mai 1986, 395, 396, bei der die vier Ansätze A, T, G und C der DNA-Fragmente mit vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gekennzeichnet sind, beispielsweise durch entsprechend andersfarbige Markierung des Primers. Aufgrund dieser Unterscheidbarkeit der Ansätze können die vier Ansätze vermischt werden und eine aus dieser Mischung gewonnene Probe in einer einzigen Bahn M durch Gel- Elektrophorese untersucht werden. Dies ist in Fig. 4 angedeutet, wobei der Anregungsstrahl wiederum mit 12 bezeichnet ist und der Gel-Schichtträger mit 16&min;. In der Detektions-Anordnung 52&min; ist der Einfachheit halber die Sammel- und Abbildungsoptik weggelassen. Man erkennt dagegen eine Einrichtung 94 zum Aufspalten des einfallenden Detektionsstrahls 96 in Teilstrahlen 98 unterschiedlicher Wellenlänge entsprechend den unterschiedlichen Wellenlängen der Primer-Fluorophore. Die Einrichtung 94 ist durch ein Prisma symbolisiert; es kommen auch andere Bauarten in Frage, wie z.B. Strichgitter oder Dünnschicht-Filter nach entsprechender Strahlteilung.

Die Teilstrahlen 98 werden Einzeldetektoren 82&min; zugeführt unter Zwischenschaltung einer Filteranordnung 78&min; in Anpassung an die jeweilige Teilstrahl-Wellenlänge. Von den Einzeldetektoren 82&min; gehen jeweils elektrische Signal- Leitungen 84&min; aus, die in eine Datensammel- und Speicheranordnung 86 entsprechend Fig. 1 einmünden.

Bei der DNA-Sequenzierung nach der zuletzt beschriebenen Methode wird also eine einzige DNA-Fragment-Probe als Mischung der unterschiedlich markierten vier Ansätze einer Gel-Schicht-Elektrophorese unterzogen, wobei dann die beispielsweise in der Bahn M in Fig. 4 aufgrund unterschiedlicher Wandungsgeschwindigkeiten aufgespaltenen Banden von der Detektoranordnung 52&min; beim Durchqueren des Anregungsstrahls 12 im one-line-Verfahren detektiert werden. Durch die wellenlängenmäßige Aufspaltung in die Teilstrahlen 98 und Messung der jeweiligen Intensität durch die den einzelnen Teilstrahlen und somit den Basen C, G, T und A jeweils zugeordneten Einzeldetektoren 82&min; läßt sich unmittelbar der jeweilige Basentyp, der gerade detektierten Bande 66 feststellen.

In Fig. 4 ist angedeutet, daß man mit Hilfe des Anregungsstrahls 12 eine DNA-Sequenzierung in einer zur Bahn Mbenachbarten Bahn M&min; vornehmen kann, und zwar ggf. gleichzeitig mit der DNA-Sequenzierung in der Bahn M. Hierzu ist eine zweite der Bahn M&min; zugeordnete Detektoranordnung 52&min;&min; vorzusehen, von welcher jedoch lediglich das Prisma der Einrichtung 94&min;&min; zur Aufspaltung des einfallenden Detektionsstrahls 96&min;&min; in vier Teilstrahlen 98&min;&min; angedeutet ist.

Mit der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Maßnahme wird ein großer Fortschritt bei der DNA-Sequenzierung erzielt. Die DNA-Sequenz wird im one-line-Verfahren während der Elektrophorese bestimmt durch unmittelbares Einlesen in einen Rechner. Die in der am selben Tage eingereichten Anmeldung des gleichen Anmelders mit dem Titel "Verfahren zur DNA - Markierung" beschriebene Art und Weise der Markierung des Primers mit einem einzigen Fluorophor, nämlich mit Tetramethyl- Rodamin, ist zuverlässig und einfach durchzuführen und mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung besonders vorteilhaft zu kombinieren. Die Anregung der Fluoreszenz durch einen Laser-Anregungsstrahl, welcher die Gel-Schicht parallel zur Gel-Ebene über ihre gesamte Breite senkrecht zur Wanderungsrichtung durchsetzt, liefert eine bislang noch nicht erzielte außerordentlich hohe Empfindlichkeit der Messung. Hierzu trägt auch die wirksame und bauliche einfache Art der Einkopplung und Auskopplung des Laserlichts in bzw. aus der Gel-Schicht bei. Es können gleichzeitig eine Vielzahl von Bahnen durch einen einzigen Anregungsstrahl erfaßt werden. Es sind keine mechanisch bewegten Teile vorgesehen, was die Meßgenauigkeit erhöht. Der Meßuntergrund ist weitgehend reduziert, wozu auch die gewählte Polarisationsrichtung des Anregungsstrahls beiträgt. Es ergibt sich eine gute Zählstatistik, da der Anregungsstrahl ständig die zu untersuchende Bahn bzw. die zu untersuchenden Bahnen quert. Im Vergleich zu einer möglichen Anordnung, bei der der Laserstrahl mehr oder weniger rechtwinklig auf die Gel-Schicht gerichtet ist und die vier Spuren abwechselnd abtastet, ergibt sich bei der Erfindung der wesentliche Vorteil, daß der Laserstrahl ohne Unterbrechung sämtliche vier Spuren gleichzeitig detektiert. Auch ist bei der erfindungsgemäßen Anordnung der Einfluß von Unregelmäßigkeiten oder Verschmutzungen des die Gel-Schicht abdeckenden Glases beseitigt. Es bereitet nämlich keine Schwierigkeiten, das relativ kleine Einlaßteil mit optischer Qualität herzustellen. Falls man von der bevorzugten Ausführungsform abweichend einen gepulsten Laser statt eines kontinuierlich arbeitenden Lasers einsetzt, ergibt sich die Möglichkeit, die Fluoreszenz nach Beendigung des Laserimpulses zu detektieren mit dem Vorteil weiter reduzierten Untergrundes.

Mit der vorstehend beschriebenen Anordnung läßt sich ohne weiteres eine automatische DNA-Sequenzierung, beginnend mit der Base 1 durchführen, verglichen mit der Base 40 bis 50 bei der herkömmlichen Autoradiograph- Technik. Die erfindungsgemäß mögliche automatische Datenanalyse macht eine Quantifizierung der Bandenabstände sowie der relativen Bandenintensitäten möglich.

Zur Fig. 4 sei angemerkt, daß die Einzeldetektoren 82&min; von Einzel-Photodioden gebildet werden können. Es kommen jedoch auch andere Detektor-Formen, wie z.B. eine CCD-Zeile (Charge-Coupled-device) oder Photodioden-Zeile. Abweichend von der dargestellten vertikalen Anordnung des Gels, kann dieses auch anders orientiert sein, da der Stofftransport auf Grund des angelegten elektrischen Feldes erfolgt. Dies gilt auch bei Einsatz einer nicht dargestellten Anordnung für Gaschromatographie, bei der die treibende Kraft für die zu untersuchenden Stoffteilchen vom Gasdruck herrührt (bzw. Flüssigkeitsdruck im Falle der Flüssigkeits-Chromatographie). Gemeinsam ist den Anordnungen nach der Erfindung die Erfassung der Stoffteilchen durch einen den länglichen Querschnitt des Abbremsmediums in Längsrichtung durchsetzenden Anregungsstrahl.


Anspruch[de]
  1. 1. Vorrichtung zur Detektion von in einem Abbremsmedium, insbesondere Gel, wandernden, zur Photonenemission durch Energieeinstrahlung mittels eines Anregungsstrahls anregbaren Stoffen, umfassend

    1. - einen Träger für das Abbremsmedium, durch das sich die Stoffe entlang wenigstens einer Bahn bewegen,
    2. - eine Strahlquelle zur Erzeugung des die Bahn querenden Anregungsstrahls,
    3. - eine Detektoranordnung für die Emissionsphotonen,


  2. dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens im Bereich des Anregungsstrahls (12) der zur Wanderungsrichtung senkrechte Querschnitt des Abbremsmediums (54) im wesentlichen die Form eines langgestreckten Rechtecks aufweist mit einer vorzugsweise in der Größenordnung der Strahlquerschnittsabmessungen liegenden Länge der kurzen Rechteckseite,

    daß der Anregungsstrahl an einen der beiden kurzen Rechteckseiten durch ein Einlaßteil (56) in den Querschnitt eintritt, den Querschnitt in zu den beiden langen Rechteckseiten paralleler Richtung durchquert und an der anderen kurzen Rechteckseite durch ein Auslaßteil (62) verläßt, und daß die Detektoranordnung (52) die durch eine der langen Rechteckseiten tretenden Emissionsphotonen empfängt.
  3. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der Teile Einlaßteil (56), Auslaßteil (62) parallele zur Strahlachse des Anregungsstrahls (12) senkrechte Endflächen (60) aufweist.
  4. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Endflächen (60) optisch poliert sind.
  5. 4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polarisationsrichtung (B&min;) des Anregungsstrahls (12) im Abbremsmedium im wesentlichen parallel zur Beobachtungsrichtung der Detektoranordnung (52) verläuft.
  6. 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlquelle (20) einen 90°-Polarisator (14) umfaßt.
  7. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch ein um eine zur Wanderungsrichtung (W) im wesentlichen parallele Drehachse (40) drehbares Plättchen (38) mit planparallelen Seitenflächen (42) im Anregungsstrahl (12) zwischen Strahlquelle (10) und Abbremsmedium.
  8. 7. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch wenigstens zwei zueinander parallele Bahnen (A; T; G; C), welche jeweils gesondert von der Detektoranordnung (52) erfaßt werden.
  9. 8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (52) eine Sammel- und Abbildungsoptik (70) umfaßt mit je einer Blende (74) in der jeder Bahn (A; T; G; C) zugeordneten Bildebene zum Ausblenden von Störstrahlung.
  10. 9. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (52) wenigstens eine Filteranordnung (78) umfaßt zum Wegfiltern von Photonen mit von den Emissionsphotonen abweichender Wellenlänge.
  11. 10.Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Filteranordnung (78) Filter für Raleigh- oder Raman- Streulicht umfaßt.
  12. 11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (52&min;) wenigstens zwei Sensoren (82&min;) für unterschiedliche Emissionsphotonen-Wellenlängen aufweist.
  13. 12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (52&min;) eine Einrichtung zum Aufspalten des einfallenden Strahls (96) in Teilstrahlen (98) unterschiedlicher Wellenlänge umfaßt, sowie den Teilstrahlen jeweils zugeordnete Sensoren (82&min;).
  14. 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensoren (82&min;) positionsempfindliche Detektoren umfassen, vorzugsweise in Form einer CCD-Zeile, einer Photodioden- Zeile, oder eines Photomultiplier mit unterteilten Positions-Bereichen.
  15. 14.Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine mit einer Halterung für die Strahlquelle (20) starr verbundene Halterung (21) für den Träger (16).
  16. 15.Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (16) von einem das Abbremsmedium (54) einschließenden Gehäuse gebildet ist, welches zwei zueinander parallele Platten (32, 48) umfaßt, die die langen Rechteckseiten des Querschnitts definieren, sowie zur Wanderungsrichtung (W) parallele Abstandsstreifen (46), die die kurzen Rechteckseiten des Querschnitts definieren und daß das Einlaßteil (56) und das Auslaßteil (62) jeweils in einen zwischen Abstandsstreifenabschnitten gebildeten Zwischenraum eingesetzt sind.
  17. 16.Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Innenraum des Gehäuses mit einer Gelschicht (54) zur Gel-Elektrophorese versehen ist.
  18. 17.Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl (12) ein Lichtstrahl ist.
  19. 18.Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl ein Laserstrahl ist.
  20. 19.Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahl relativ zum Träger in Wanderungsrichtung verlagerbar ist.
  21. 20. Verwendung der Vorrichtung nach einem der vorigen Ansprüche zur DNA-Sequenzierung.






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