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Dokumentenidentifikation DE3620915A1 07.01.1988
Titel Methode zur Aufbereitung von biologisch hergestelltem Indigo
Anmelder Sandoz-Patent-GmbH, 7850 Lörrach, DE
Erfinder Koch, Werner, Dr., Oberwil, CH
DE-Anmeldedatum 23.06.1986
DE-Aktenzeichen 3620915
Offenlegungstag 07.01.1988
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.01.1988
IPC-Hauptklasse C09B 67/54
IPC-Nebenklasse C09B 61/00   C09B 7/00   D06P 1/22   D06P 3/02   D06P 3/58   

Beschreibung[de]

Gegenstand der Erfindung ist eine einfache Methode zur Aufbereitung von biologisch mittels Pflanzenzellen, Säugetierzellen oder Mikroorganismen hergestelltem Indigo. Insbesondere betrifft die Erfindung die Aufbereitung von Mikroorganismen produziertem Indigo, wodurch eine gewerbliche Nutzung des auf mikrobiellem Wege hergestellten Indigos (als Konkurrenzverfahren zur Gewinnung von Indigo als Pflanzenextrakt oder zur heute am wichtigsten chemischen Totalsynthese) erst ermöglicht wird. Die Methode gemäß vorliegender Erfindung besteht darin, daß man die Biomasse aus dem Fermenter gegebenfalls nach Durchführung eines Trennungsschrittes fest/flüssig lysiert und den so erhaltenen Indigo nach einfacher Trocknung gegebenenfalls in Anwesenheit eines Stellmittels dem Färbeprozeß unterwirft.

Die vorliegende Erfindung beinhaltet des weiteren den Färbevorgang unter Verwendung des biologisch, insbesondere mikrobiell hergestellten Indigos an sich sowie die auf diese Weise gefärbten Textilmaterialien.

Es ist bekannt, beispielsweise aus der europäischen Patentanmeldung Publ. Nr. 109 583 wie auch aus einem dementsprechenden Übersichtsartikel in Science Bd. 222, 1983, Seiten 167-169, Indigo auf mikrobiologischem Wege herzustellen, wofür folgendes Reaktionsschema postuliert wird:





Für die Biosynthese dieses bedeutenden Textilfarbstoffes werden in dem oben zitierten Fall klonierte rekombinante Escherichia coli Bakterien in einem spezifischen Nährmedium eingesetzt. Durch Einwirkung bestimmter Plasmide, z. B. pE 317, das eine DNA-Sequenz von Pseudomonas putida-Ursprung enthält, erfahren die zur Produktion und Anreicherung von Indol befähigten E. coli Zellen eine genetische Veränderung, die ihnen die Fähigkeit vermittelt, aromatisches Dioxygenase-Enzym zu produzieren. Ihre Züchtung in einem geeigneten Nährmedium fördert die durch Dioxygenase katalysierte oxidative Umwandlung des Indols.

Einzelheiten über Beschaffenheit und Züchung der für die mikrobielle Indigo-Produktion befähigten klonierten E. coli Stämme sind in der europäischen Patentanmeldung Publ. Nr. 109 583 angeführt; auf deren Inhalt wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hingewiesen.

Eine weitere Arbeit, erschienen in BIO/TECHNOLOGY Bd. 4, April 1986, Seiten 321-324, beschäftigt sich mit der mikrobiellen Produktion von Indigo, wozu Zellen von Escherichia coli K-12, die das TOL Plasmid pWWO von Pseudomonas putida-Ursprung enthalten, eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit der gewerblichen Nutzung insbesondere von durch Mikroorganismen jeglicher Art produziertem Indigo, die abhängig ist von der Möglichkeit, eine einfach zu realisierende Methode der Aufbereitung zu finden. Die durch Stammoptimierung im Fermenter entsprechender Dimension erhaltene Indigo-Biomasse muß zur weiteren Verwertung aufbereitet werden. Normalerweise muß dafür die Fermenterbrühe, für welche mit relativ geringen Produktkonzentrationen gerechnet werden muß, in mühsamer, arbeitsintensiver und sehr aufwendiger Weise, die vier Verfahrensschritte der Aufarbeitung umfaßt, behandelt werden. Für jeden dieser Verfahrensschritte ist dabei in Abhängigkeit von der zu reinigenden Biomasse sowie der Beschaffenheit des gewünschten Endproduktes die optimale Lösung zu suchen und durch Aneinanderreihen der einzelnen Operationen ein stets funktionierendes Aufarbeitungssystem zu entwickeln. Erschwerend kommt hinzu, daß die ständige Optimierung des Bioprozesses in der Produktion eine Veränderung der Erntechargen hervorruft, was wesentliche Auswirkungen auf die Aufbereitung haben kann und folglich bei Entwicklung und Planung des Aufarbeitungsprozesses Berücksichtigung finden muß. Welche verfahrenstechnischen Operationen im einzelnen günstigerweise zur Anwendung gelangen können, hängt nämlich zumindest in der Anfangsphase sehr stark von den Produktkonzentrationen ab, die bei Bioprozessen um ein Vielfaches geringer sind als bei chemischen Syntheseprozessen.

Im allgemeinen umfaßt die Aufarbeitung im Anschluß an den Bioprozeß die folgenden Einzelschritte:

  • (1) Trennung (fest/flüssig)

    (2) Isolierung

    (3) Reinigung

    (4) Konzentrierung.


Die Wahl einer geeigneten und effizienten Trennungsmethode, in Betracht kommen dafür Filtration, Zentrifugation, Sedimentation, Mikro- und Ultrafiltration, muß nach der Beschaffenheit der erhaltenen Kulturbrühe ausgerichtet werden. In manchen Fällen kann es auch zweckmäßig sein, von einem Trennungsschritt (1) abzusehen und direkt zu isolieren. Vor dem Schritt der Isolierung (2), für welchen als Methode u. a. Extraktion, Zentrifugation, Fällung, Ultrafiltration, Adsorption und/oder Ionenaustausch vorzusehen sind und auf Tauglichkeit geprüft werden müssen, muß das Zellkonzentrat lysiert werden; erst nach diesem Zellaufschluß kann der Wirkstoff quantitativ isoliert werden. Zweck der Isolierung ist es, die zu gewinnenden Produkte in ein einphasiges System überzuführen. Gleichzeitig ist dabei eine Aufkonzentrierung mit Volumenreduzierung sowie eine wesentliche Verringerung des Anteils an begleitenden Nebenprodukten anzustreben.

Durch den Schritt der Reinigung (3), für den alle Arten von verfahrenstechnischen Grundoperationen zur Anwendung gelangen können, wie z. B. Extraktion, Fällung/Kristallisation, Diafiltration, Chromatographie, Adsorption, Ionenaustausch oder Kombinationen davon, soll eine Reinlösung gewonnen werden, die den gewünschten Reinheitsanforderungen entspricht.

Im Schritt der Konzentrierung (4), für welche beispielsweise die Einheitsoperationen Fällung/Kristallisation, Filtration, Ultrafiltration, Hyperfiltration, Verdampfung, Trocknung oder Kombinationen davon in Betracht kommen, soll die gereinigte Produktlösung in ihre Endform gebracht werden, wie sie der weiteren Verwendung, z. B. Konfektionierung, zugeführt werden kann.

Aus dieser rohen Aufzählung ist ersichtlich, wie schwierig, verfahrenstechnisch aufwendig und kostenintensiv bis zum Ende durchgeführter Reinigungsprozeß für ein mikrobiologisch hergestelltes Rohprodukt verlaufen kann, wobei vor allem ins Gewicht fällt, daß die Gestaltung des Aufarbeitungsprozesses in mühsamen und oft erfolglosen Vorversuchen festgelegt werden muß. Derartig aufwendige Aufbereitungsoperationen können für die Gewinnung eines Farbstoffes höchstens forschungsmäßiges Interesse wecken, sie rücken jedoch schlußendlich die Kommerzialisierung des Farbstoffes in einen absolut unrealistischen Bereich.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß für die Gewinnung von kommerziell nutzbarem Indigo, hergestellt auf biologischem, insbesondere mikrobiellem Wege, eine aufwendige Reinigungsprozedur unnötig ist. Der gegebenenfalls abgetrennte Bio-Indigo kann nämlich nach erfolgtem Zellaufschluß und lediglich anschließender Trocknung direkt in den Färbeprozeß eingeführt werden. Die erhaltenen Färbungen sind an Reinheit, Echtheit und Stärke durchaus den mit synthetisch hergestelltem Indigo erhaltenen Färbungen ebenbürtig.

Gemäß der Erfindung umfaßt der der Färbung vorangehende Aufbereitungsprozeß der Indigo-Biomasse aus dem Fermenter lediglich

  • a) einen Trennungsschritt fest/flüssig in Form von Zentrifugieren der feuchten Fermenterpaste, Dekantieren und/oder Grobfiltration; gegebenenfalls kann dieser Trennungsschritt auch entfallen; und
  • b) den Zellaufschluß, wobei die Biomasse nach üblichen Methoden mechanischer wie auch nicht-mechanischer Art wie beispielsweise durch
    • - Säure/Base-Reaktion

      - milde Druckreaktion

      - Osmolyse

      - enzymatische Reaktion
  • lysiert wird.


Das lysierte Rohprodukt, das unabhängig vom gewählten Lysierungsprozeß noch einer Behandlung mit wäßriger Natronlauge bei alkalischem pH, vorzugsweise bei pH 12, unterworfen und anschließend mit Phosphat auf pH 7 gestellt wird, kann tel quel nach Homogenisierung und Trocknung zum Verküpen eingesetzt werden. Ein unabwendbar erscheinender, sehr aufwendiger Reinigungsprozeß, der die Schritte Isolierung, Reinigung und Konzentrierung des Bioproduktes umfaßt, entfällt damit gänzlich.

Die vor dem Trocknungsprozeß vorgenommene Homogenisierung der Bio-Indigosuspension kann auf an sich bekannte Weise erfolgen; beispielsweise durch intensives Rühren (z. B. mit einem Polythron-Rührer), durch Zerkleinern mittels Desagglomerierung mit Dissolver, oder auch durch einen Mahlprozeß, insbesondere Perlmahlung, mit oder ohne Zusatz von Dispergator, vorzugsweise eines anionaktiven Dispergators. Ein gegebenenfalls vorhandener Dispergator kann sich vorteilhaft auf die Löseeigenschaften des getrockneten Produktes im folgenden Färbeprozeß auswirken.

Die Trocknung der Bio-Indigomasse erfolgt vorzugsweise durch Zerstäubung; zu diesem Zwecke wird die zu trocknende Masse zunächst durch ein Prüfsieb bestimmter Maschengröße passiert und dann in einem üblicherweise verwendeten Zerstäuber (z. B. Büchi-Zerstäuber) zu einem Pulver getrocknet oder auch durch Verwendung eines Wirbelschichtgranulators in Granulatform übergeführt. Der Trocknungsprozeß durch Zerstäubung verläuft absolut problemlos. Gegebenenfalls kann durch Zusatz von üblichen Hilfsmitteln wie Lösungsvermittler, Stellmittel etc. die Handhabung des Bio-Indigos beim Färben weiter verbessert werden.

Der gemäß obigen Ausführungen erhaltene Indigo eignet sich zum Färben von hydroxygruppen- oder stickstoffhaltigen organischen Substraten, wie Wolle, Baumwolle oder Leinen, nach dem Tauchverfahren analog einer Indigo-Anlage mit Luftgang. Der ungereinigte Küpenfarbstoff wird dabei durch Reduktion in wasserlösliche Form gebracht, auf die Faser appliziert und durch Oxidation fixiert. Man erhält eine nuancenreine Färbung mit den für Indigofärbungen bekannten Echtheiten. Aus dem Färberesultat ist ersichtlich, daß im Verlauf der Färbung ein Reinigungsprozeß stattfindet, wobei, vergleichbar einer chromatographischen Reinigungsmethode, die sich jedoch ungleich schwieriger gestalten würde, am Substrat selbst eine klare Auftrennung in färbende Aktivsubstanz einerseits und Verunreinigungen aus der Fermentation andererseits vollzogen wird. Die Möglichkeit einer solchen Reinigungsmethode war absolut unvorhersehbar.

Im nachfolgenden soll die Erfindung durch praktische Beispiele veranschaulicht werden, ohne diese zu begrenzen. Teile bedeuten Gewichts- bzw. Volumteile, Prozente Gewichts- bzw. Volumprozente; die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1 Herstellung der Indigo-Biomasse

Der in Beispiel 1 der europäischen Patentanmeldung Publ. Nr. 109 583 beschriebene klonierte Escherichia coli HB 101 Stammn wird gegebenenfalls nach erfolgter weiterer Stammoptimierung im Fermenter unter optimalen Bedingungen (pH, Temperatur, Zusammensetzung der Nährlösung, Belüftung etc.) gezüchtet.

Aus der nach Abdekantieren der Fermenterbrühe erhaltenen feuchten Fermenterpaste wird durch Zentrifugieren weitere Flüssigkeit entfernt. Anschließend folgt der Zellaufschluß (zur Zerstörung der Zellen bzw. Durchlässigmachen der Zellwände), um die in der Zelle gebildete Aktivsubstanz quantitativ isolieren zu können. Das kann auf einfachem chemischen Wege durch eine Säure/Base-Reaktion geschehen, indem mit wäßriger Natronlauge zunächst alkalisch und dann durch Zusatz von sekundärem Natriumphosphat auf pH 7 gestellt wird.

Nach erfolgter Lysierung des Bioproduktes wird nochmals mit wäßriger Natronlauge bei pH 12 behandelt und abschließend mit sekundärem Natriumphosphat auf pH 7 gestellt. Es resultiert eine wäßrige Suspension von unangenehmen Geruch, in der sich neben Indigo als Aktivsubstanz Zellfragmente, Natriumphosphat, Fermentationsnebenprodukte sowie Reste der Nährlösung befinden.

Beispiel 2 Trocknung der Indigo-Suspension zu Pulver 2a) Vorbereitung für die Zerstäubungstrocknung

2a1) Die gemäß Beispiel 1 erhaltene wäßrige Suspension wird nach dem Homogenisieren mit einem Polythron-Rührer tel quel durch ein Prüfsieb von 0,1 mm Maschenweite passiert. Die Suspension passiert ohne Schwierigkeit, es bleibt ein nur unwesentlicher Rückstand.

2a2) Durch Desagglomerierung mittels Dissolver werden die in der Suspension verteilten Bestandteile zerkleinert.

2a3) Die Suspension wird ohne weitere Zusätze einer Perlmahlung unterzogen.

2a4) Die Suspension wird in Gegenwart eines anionaktiven Dispergiermittels einer Perlmahlung unterzogen; als Dispergiermittel eignet sich beispielsweise das Natriumsalz des Kondensationsproduktes aus β-Naphthalinsulfonsäure und Formaldehyd mit geringem Prozentsatz an Wasser.

2b) Trocknung auf Büchi-Zerstäuber

Die gemäß einem der Wege 2a1) bis 2a4) vorbereitete Indigo-Suspension wird durch eine 2-Stoffdüse in einen Heißluftstrom von 130° gesprüht und dabei intensiv verwirbelt. Die zugeführte Heißluft kühlt sich dadurch ab. Für die Abluft wird eine Temperatur von 75° gemessen. Die Zerstäubung erfolgt völlig problemlos. Es wird ein dunkles Pulver erhalten, das frei ist von unangenehm riechenden Bestandteilen.

Beispiel 3 Trocknung der Indigo-Suspension zu Granulat

Die Vorbereitung erfolgt analog wie für die einzelnen Schritte unter Beispiel 2a) vorgesehen.

Die entsprechend vorbereitete Indigo-Suspension wird in einem Wirbelschichtgranulator in üblicher Weise versprüht. Es resultieren dunkle Granulate, die ebenfalls frei von übelriechenden Bestandteilen sind.

Beispiel 4 Indigo-Färbung nach dem Tauchverfahren (simulierte Indigo-Anlage) 4a) Herstellung der Färbeflotte

Lösen des Farbstoffes nach dem Prinzip des Stammküpenverfahrens, verwendet wird ein 100 ml Ansatz. Dazu werden 100 Teile des gemäß den vorstehenden Beispielen 2 und 3 erhaltenen Farbstoffpulvers bzw. der Granulate mit einem handelsüblichen anionaktiven Dispergiermittel (in flüssiger Form), beispielsweise mit 20 Teilen Natriumsulforicinoleat (Sulfonierungsgrad 80%) sorgfältig angeteigt. Es wird mit Weichwasser von 60° übergossen und das Volumen auf 100 ml gestellt. Anschließend erfolgt die Zugabe von 0,75 ml Natronlauge 36° B} und 0,6 g Hydrosulfit konz. Die Verküpungszeit beträgt 15 Minuten bei 60°. Die erhaltene Küpe ist hellgelb gefärbt. Sie wird auf 25° abgekühlt und als solche, d. h. der Gesamtansatz, für den folgenden Färbeprozeß verwendet.

4b) Färbeverfahren

Es wird nach dem Prinzip des Tauchverfahrens analog einer Indigo-Färbeanlage gefärbt. Substrat ist Baumwolle.

Färbevorgehen 4b1) Das abgekochte und gut netzbare Baumwollgewebe wird während 10 Sekunden in die unter 4a) hergestellte Färbeflotte eingetaucht.

4b2) Danach wird das Gewebe auf einem Zweiwalzen-Foulard abgequetscht, so daß ca. 60% Flottenaufnahme (Trockengewichtszunahme) resultieren.

4b3) Freihängend an der Luft wird die vom Gewebe aufgenommene Küpe während drei Minuten zum blauen Farbstoff oxidieren gelassen.

Die Vorgänge 4b1) bis 4b3) bedeuten auf einer Indigo-Färbeanlage einen Zug.

Im weiteren Färbeverlauf werden die Operationen 4b1) bis 4b3) noch zweimal wiederholt, so daß die Endfärbung aus total drei Zügen besteht.

4c) Fertigstellen der Färbung

Zunächst wird die Endfärbung kalt gespült, bis sie alkalifrei ist, dann wird durch Behandlung mit 1,5 ml/l Wasserstoffperoxid 40% während fünf Minuten bei 60° ausoxidiert und warm gespült. Dem schließt sich ein Seifungsprozeß an, bei welchem während fünf Minuten bei 80° mit 1 ml/l eines nichtionogen Dispergiermittels, beispielsweise eines aliphatischen Polyglykoläthers, geseift wird. Es wird nochmals warm, dann kalt gespült und in üblicher Weise getrocknet.

Man erhält eine intensive Blaufärbung von reiner Nuance, die Echtheiten entsprechen voll den an eine übliche Indigofärbung gestellten Erwartungen.


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur Aufbereitung von auf biologischem Wege mittels Pflanzenzellen, Säugetierzellen oder Mikroorganismen hergestelltem Indigo, dadurch gekennzeichnet, daß man die Biomasse aus dem Fermenter gegebenenfalls nach Durchführung eines Trennungsschrittes fest/flüssig lysiert und das aufgeschlossene Material nach einfacher Trocknung gegebenenfalls in Anwesenheit eines Stellmittels ohne weitere Reinigung dem Färbeprozeß unterwirft.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem von klonierten E. coli Bakterien produzierter Indigo eingesetzt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein allfällig durchgeführter Trennungsschritt fest/flüssig durch Zentrifugieren, Abdekantieren und/oder Grobfiltration erfolgt.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellaufschluß sowohl mechanisch als auch nicht-mechanisch durch

    1. a) Säure/Base-Reaktion
    2. b) milde Druckreaktion
    3. c) Osmolyse oder
    4. d) enzymatische Reaktion


  5. erfolgt.
  6. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lysierte Biomasse durch Zerstäubung unter Verwendung von Heißluft getrocknet wird.
  7. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trocknung der lysierten Biomasse im Wirbelschichtgranulator erfolgt.
  8. 7. Verfahren zum Färben von hydroxygruppen- oder stickstoffhaltigen organischen Substraten, dadurch gekennzeichnet, daß man dazu auf biologischem Wege mittels Pflanzenzellen, Säugetierzellen oder Mikroorganismen hergestellten Indigo in Form einer lysierten Biomasse ohne weitere Reinigung als Küpenfarbstoff einsetzt.
  9. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mikrobiell hergestellter Indigo, der nach dem Tauchverfahren analog einer Indigo-Färbeanlage mit Luftgang gefärbt wird, eingesetzt wird.
  10. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei welchem als Substrat Textilmaterial, das aus Wolle, Baumwolle oder Leinen besteht oder diese enthält, verwendet wird.
  11. 10. Die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7-9 gefärbten Materialien.
  12. 11. Küpenfarbstoff zum Färben von hydroxygruppen- oder stickstoffhaltigen organischen Substraten, bestehend aus mikrobiologisch hergestelltem Indigo in Form einer lysierten Biomasse.






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