PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE2849563C2 07.06.1990
Titel Gegenstand und Verfahren zum Festlegen biologisch aktiver Proteine
Anmelder Minnesota Mining & Mfg. Co., Saint Paul, Minn., US
Erfinder Silver, Spencer F., St. Paul, Minn., US
Vertreter Ruschke, O., Dipl.-Ing., 1000 Berlin; Ruschke, H., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 8000 München
DE-Anmeldedatum 13.11.1978
DE-Aktenzeichen 2849563
Offenlegungstag 17.05.1979
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 07.06.1990
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.06.1990
IPC-Hauptklasse C07K 17/02

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen 1 bis 12 angegebenen Gegenstand zum Festlegen biologisch aktiver Proteine, sowie das im Anspruch 13 angegebene Verfahren zum Festlegen eines Proteins auf einem polaren Festkörperträger.

Durch Festlegen des Enzyms auf einen Festkörperträger oder einer Trägersubstanz kann das Enzym leicht von dem Reaktionsgemisch getrennt und wiederverwendet werden. Weiterhin sind festgelegte Enzyme im allgemeinen weniger anfällig als freie Enzyme in bezug auf eine Denaturierung, d. h. in bezug auf einen Verlust an Reaktionsfähigkeit durch chemische Einwirkung, in bezug auf pH-Wert- und Temperaturänderungen usw.

In ähnlicher Weise ist es häufig erwünscht, immunologisch aktive Proteine, d. h. Antigene und Antikörperchen, festzulegen, um die immunologischen Versuchsverfahren zu verbessern. In vielen Fällen ist das Vorhandensein einer Komplexbildung in einer Flüssigkeitsprobe nicht erkennbar, es sei denn, eines der reagierenden immunologischen aktiven Proteine ist an einem besonderen Trägermaterial, wie z. B. an Polystyrollatex, gebunden. Die meisten immunologischen Versuche basieren auf einer Komplexbildung zwischen einem Antigen und seinem entsprechenden Antikörper. Bislang sind eine Anzahl Verfahren zum Einsatz gekommen, um Proteine einzufangen, die sich jeweils in bestimmter Hinsicht als nachteilig erweisen. Bei einem herkömmlichen Verfahren werden Proteine durch unmittelbare physikalische Adsorption auf einem inerten Trägermaterial, wie z. B. auf Glasperlen, Aktivkohle oder auf anderen Flächen hoher Energie, eingefangen. Im allgemeinen ist das Protein an diesen Trägermaterialien durch starke Bindungen befestigt, die dazu neigen, die Proteine zu denaturieren und zu deaktivieren.

Ein weiteres Verfahren, mit dem Proteine, insbesondere Enzyme, festgelegt werden, besteht im physikalischen Einfangen der Enzyme in einer polymeren Matrix, wie z. B. in einem vernetzten Polyacrylamid-Gel. Dieses Verfahren erweist sich hauptsächlich durch die Unzugänglichkeit großer Moleküle zu dem Enzym und durch ein Entweichen des Enzyms aus der polymeren Matrix als nachteilig.

Um die Stabilität der Zusammensetzung aus Trägermaterial und Protein zu vergrößern, sind Verfahren zur ionischen und konvalenten Bindung des Proteins an dem Trägermaterial entwickelt worden. Die bekannten Verfahren erfordern im allgemeinen chemische Reaktionen zwischen dem Protein und der Oberfläche des Trägermaterials, um eine feste Bindung zu erreichen und die Stabilität der Zusammensetzung zu erhöhen. Derartige chemische Reaktionen sind unerwünscht, da sie die biologische Reaktionsfähigkeit des Proteins vermindern können und mit ihnen eine gleichmäßige Beschichtung mit Protein nicht erzielbar ist.

Aus der US-PS 37 40 414 sind wasserlösliche Polymere mit sich wiederholenden beta-Hydroxyalkylenamin-Einheiten bekannt, die dazu verwendet werden, hydrophobe Oberflächen hydrophil zu machen. Dazu wird eine relativ hochkonzentrierte alkoholische Lösung des Polymeren auf die betreffende Oberfläche aufgebracht und Eintrocknen gelassen.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Gegenstand und ein Verfahren zum Festlegen biologisch aktiver Proteine bereitzustellen, bei dem die Proteine auf einer Vielzahl von Trägermaterialien in einfacher Weise irreversibel ohne die Notwendigkeit chemischer Reaktionen und ohne Beeinträchtigung ihrer biologischen Reaktionsfähigkeit gebunden werden.

Dies wird erfindungsgemäß durch den im Anspruch 1 gekennzeichneten Gegenstand erreicht. In den Ansprüchen 2 bis 12 sind vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Gegenstandes wiedergegeben. Der Anspruch 13 ist auf ein bevorzugtes Verfahren zum Festlegen eines Proteins auf einem polaren Festkörperträger nach dem Anspruch 1 gerichtet.

Durch die Erfindung wird ein einfaches und effektives irreversibles Festlegen von Proteinen an polaren Festkörperträgermaterialien bei Aufrechterhalten der gesamten biologischen Reaktionsfähigkeit des Proteins ermöglicht. Derartige Trägermaterialien können in vielfältiger Gestalt vorliegen, wie z. B. als Sieb, als Stoff, als Perle, als Rohr, als gesinterte Scheibe usw. Auch können die Trägermaterialien eine Vielzahl von Eigenschaften aufweisen, d. h. sie können hart, starr oder gewebte oder vliesartige Gewebe oder dergleichen sein. Als vorteilhaft erweist sich, daß durch die erfindungsgemäße Beschichtung des Trägermaterials keine chemischen Abänderungen erforderlich sind. Weiterhin behält der erfindungsgemäße Gegenstand seine Eigenschaften über lange Zeitspannen bei und zeigt keine Instabilität durch Oxydation oder Abnahme chemisch reaktionsfähiger Gruppen, was für die meisten herkömmlichen Materialien charakteristisch ist. Proteine jeder Art, eingeschlossen Enzyme und immunologisch aktive Proteine, können auf Festkörperträgermaterialien gemäß der Erfindung festgelegt werden.

Der Begriff "polares Trägermaterial", wie er im Zusammenhang mit der Erfindung Anwendung findet, bezieht sich auf von Wasser benetzbare Oberflächen aus Metall, Metalloxyden, Glas, Keramik, Ton und/oder aus unlösbaren, hydrophilen eiweißartigen Materialien. Der Begriff "monomolekularer Film" beinhaltet eine dünne Schicht einer Dicke von ungefähr 10&supmin;&sup7; cm bis 25 · 10&supmin;&sup7; cm (10 bis 250 Angström), wobei die bevorzugte Dicke im Bereich von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup6; cm liegt.

Die praktisch verwendbaren, β-Hydroxyalkylenamin enthaltenden Polymere gemäß der Erfindung, sind wasserlöslich und enthalten die Einheit



wobei Y eine Amin-Gruppe darstellt. Das Äquivalentgewicht des auf dieser Einheit basierenden Polymers beträgt 87 bis 10 000. Die Amingruppe kann von der Polymerrückgratkonformation herabhängen, in welchem Fall die bevorzugten Einheiten durch folgende Formel darstellbar sind:



wobei R&sub1; Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 zu 8 Kohlenstoffatomen, R&sub2; ein Alkylrest mit 1 zu 8 Kohlenstoffatomen oder R&sub1; und R&sub2; zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterozyklischen Ring bilden. Alternativ kann die Amingruppe ein Teil der Rückgratkonformation des Polymers nach folgenden bevorzugten Einheiten sein:



wobei R&sub3; Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 zu 8 Kohlenstoffatomen ist.

Eine besonders bevorzugte Klasse β-Hydroxyalkylenamin enthaltener Polymere zur Verwendung gemäß der Erfindung wird synthetisch hergestellt durch Epoxidieren von Divinylpolymer, dem eine Aminierung gemäß der US-PS 37 40 414 folgt, wobei sich Polymere mit folgenden, sich wiederholenden Bausteinen ergeben:



wobei Y gleich dem in bezug auf Formel I definierten Y ist. Ungeordnete und blockartige Mischpolymerisate des Divinyls und andere mischpolymerisierbare Monomere, wie z. B. Styrol, können auch aminiert werden, um proteinfestlegende Agensien gemäß der Erfindung zu bilden. Die Amingruppen, die den Y-Teil des Polymers bilden, sind vorzugsweise abgeleitet von Piperidin, Morpholin, Dimethylamin, Diäthylamin und Diäthanolamin.

Eine andere Klasse bevorzugter Polymere für eine Verwendung gemäß der Erfindung wird hergestellt durch Polymerisieren von Epichlorhydrin und Methylamin gemäß der US-PS 37 32 173 und enthält die sich wiederholende Einheit



wobei R&sub3; wie oben in Formel III definiert ist.

Aminierte Glycidyl-Polyacrylsäureester und Glycidyl-Polymethacrylsäureester werden auch verwendet und weisen die sich wiederholende Einheit



auf, wobei R&sub4; Wasserstoff oder Methyl ist und R&sub1; und R&sub2; wie oben in Formel II definiert sind.

Besonders bevorzugte Polymere zur praktischen Anwendung der Erfindung werden gebildet aus:

  • (1) dem Dimethylaminaddukt des epoxidierten Poly-Cis-1,4-Divinyls;
  • (2) dem Dimethylaminaddukt des epoxidierten Styrol-b-Divinyls;
  • (3) dem Dimethylaminaddukt des Polyglycidyl-Methacrylsäureesters;
  • (4) dem Piperidinaddukt des epoxidierten Styrol-b-Divinyls;
  • (5) dem Piperidinaddukt des Poly-Cis-1,4-Divinyls; und
  • (6) dem Kondensat des Epichlorhydrins und Methylamins.


Die β-Hydroxyalkylenamin enthaltenen Polymere haben ein Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis einige Millionen. Das bevorzugte Molekulargewicht liegt jedoch im Bereich von 10 000 bis 250 000. Wenn das Molekulargewicht über 250 000 steigt, bringen die aminierten Polymere Herstellungsprobleme mit sich.

Die optimale Höhe der b-Hydroxyalkylenamin-Anteile in dem Polymer steht in gewisser Weise mit dem Molekulargewicht in Beziehung. Eine ausreichende Menge des Anteils muß vorhanden sein, um das Polymer wasserlöslich zu machen. Polymere mit niedrigem Molekulargewicht machen geringere Anteile von β-Hydroxyalkylamin erforderlich, um die Wasserlöslichkeit zu gewährleisten. Vorzugsweise werden mindestens 30% der sich wiederholenden Einheiten des Polymers den Anteil enthalten.

Das Polymer wird auf das polare Trägermaterial aus einer verdünnten wäßrigen Lösung abgeschieden. Im allgemeinen werden Lösungen verwendet, die 0,03 bis 0,05% Polymer (G/G) enthalten.

Für eine Verwendung gemäß der Erfindung geeignete polare Trägermaterialien umfassen siliziumhaltige Materialien, wie Sand, Glas oder Quarz; Metalle wie Aluminium, Stahl und Silber; Keramik; anorganische Pulver, wie Oxyde und Bariumferrite; Proteine; Polymere, die Säureester enthalten, und dergleichen. Das Trägermaterial kann jede beliebige Form aufweisen, aus Einzelteilen oder aus fasrigen Stoffen bestehen.

Das β-Hydroxyalkylenamin enthaltene Polymer wird als monomolekularer Film auf der Oberfläche der Trägersubstanz durch Eintauchen letzterer in eine verdünnte wäßrige Lösung des Polymers während einer Zeitspanne von 30 Sekunden bis zu 24 Stunden abgesetzt, worauf der so behandelte Träger mittels Wasser gewaschen wird. Das Trägermaterial kann getrocknet und gelagert oder unmittelbar verwendet werden, um es mit einer wäßrigen Lösung des Proteins in Berührung zu bringen, das festgelegt werden soll. Die Ablagerung des Proteins auf der Zusammensetzung aus Polymer und Trägermaterial wird vorzugsweise durch Eintauchen des Trägermaterials in die Proteinlösung ausgeführt. Die optimale Konzentration der Proteinlösung wird in Abhängigkeit von dem festgelegten Protein variieren. Im allgemeinen werden Proteinlösungen im Bereich von 5 bis 100 mg/l verwendet. Im Anschluß an eine Abgleichperiode von einigen Sekunden bis zu 24 Stunden wird das Trägermaterial aus der Proteinlösung entfernt und mit Wasser gewaschen.

Das mit Polymer grundierte Trägermaterial vermag eine Vielfalt an Proteinen im wesentlichen in irreversibler Weise festzulegen. Obgleich der genaue Vorgang, durch den das Protein an der Polymeroberfläche des Trägermaterials befestigt wird, nicht bekannt ist, wird angenommen, daß die Befestigung aus abgestimmten kovalenten Bindungen zwischen den Amin-Hydroxy-Funktionen des Polymers und dem Protein resultiert.

Enzyme, die auf mit β-Hydroxyalkylenamin beschichteten Trägern festgelegt sind, die, wie oben dargelegt worden ist, aus Einzelteilen oder Fasern bestehen können, sind in herkömmlicher Weise in enzymatischen, chemischen Bearbeitungsverfahren brauchbar.

Hierbei handelt es sich z. B. um die Verwendung von Glukose- Isomerase bei der Umwandlung von Glukose in Fruchtzucker und um die Verwendung von Laktase bei der Abtrennung von Laktose während der Abtrennung der Proteine aus Käsewasser.

Weitere Beispiele von Enzymen, die fest an den β -Hydroxyalkylenamin aufweisenden Polymeren befestigt sein können, sind Urease, Glukose-Oxydase, Invertase, Katalase, Papain, Lipase, Cellulase, Dextranase, Amylase, Ribonuklease, Carboxypeptidase und Urokinase. Immunologisch aktive Proteine, wie Antigene und Antikörper, können leicht an Trägermaterialien gemäß der Erfindung befestigt werden und in herkömmlicher Weise für immunologische Versuche verwendet werden. Trägermaterialien, an denen diese Materialien befestigt sein können, sind Glas, Quarz, Keramik, Metalloxyde und Proteine. Ein besonders bevorzugter Träger ist ein piezoelektrischer Oszillator, wie z. B. ein Quarzoszillator.

Beispiele immunologisch aktiver Proteine, die gemäß der Erfindung festgelegt werden können, sind Gamma-Globulin, Haptoglobulin, α&sub1;-Antitrypsin-Hemmstoff, Serumalbumin-Transferrin, Kompliment und α-Globulin.

Nachfolgende Ausbildungsbeispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, wobei die Beispiele 1 bis 6 die Herstellung der Polymere nach Formel II erläutern.

Beispiel 1

In einem Rundkolben mit einem Volumen von 250 ml, mit einem Rührwerk und mit einem Rückflußkühler wurden 100 g einer 7,36%igen Lösung von einem epoxidierten Styrol (45 M)/Butadien (105 M)-Blockpolymerisats (Epoxy- Äquivalent 106) in Dioxan gegeben. 25 g Piperidin wurden zugesetzt und die Lösung wurde unter Rückfluß bei Umrühren während der Nacht gehalten. Der größte Teil des Dioxans (ungefähr 80%) wurde durch Destillation im Vakuum abgetrennt, und 500 ml Methanol wurden zugesetzt. Die Lösung wurde im Vakuum bis zu einem halbwegs trockenen Zustand konzentriert, und der Rückstand wurde in Methanol gelöst, um eine 1%ige Lösung zu erhalten.

% N&sub2;: errechnet 6,32%; ermittelt 4,2%.

Beispiele 2 bis 6

Entsprechend dem allgemeinen Verfahren nach Beispiel 1 wurden nachfolgend aufgeführte, von β-Hydroxyalkylenamin abgeleitete Polymere der Formel I hergestellt:



Die Beispiele 7 bis 9 stellen die Herstellung von Polymeren der Formel IV dar, wobei die β-Hydroxyalkylenamin-Gruppe das Gegenstück zu der Polymerrückgratkonformation darstellt.

Beispiel 7

Zu einer Dioxan-Lösung, die 5 g des Poly(Glycidyl-Methacrylsäureesters) enthält, werden 5,0 ml (großer Überschuß) von destillierten Piperidin zugesetzt. Durch Umrühren während der Nacht wurde für einen Rückfluß der Mischung gesorgt, die dann mit 500 ml Methanol verdünnt wurde. Das Volumen wurde auf ungefähr 100 ml im Vakuum vermindert. Dieser Vorgang wurde mit 500 ml Methanol wiederholt, und ausreichend Methanol wurde dem Rückstand zugesetzt, um eine 5%ige Lösung zu erhalten.

% N: errechnet 6,16%; ermittelt 6,2%.

Gemäß dem allgemeinen Verfahren nach Beispiel 7 wurden folgende Polymere synthetisch hergestellt:

Beispiel 10

Hier wird die Herstellung eines Trägermaterials verdeutlicht. Ein sauberes Glasdia eines Mikroskops wurde teilweise ungefähr 10 Sekunden in eine 0,5%ige wäßrige Lösung des Dimethylamin- Addukts des epoxidierten Polybutadien (Beispiel 5B) eingetaucht und unterm Wasserhahn vollkommen mit kaltem Wasser gespült. Ein auf der behandelten Oberfläche angeordneter Wassertropfen weist einen Berührungswinkel von 54° auf. Das Dia war an den unbehandelten Flächen vollständig mit Wasser benetzbar, was darauf hinweist, daß das Polymer auf den behandelten Flächen adsorbiert worden ist.

Beispiel 11

Hier wird die Adsorption von Protein auf einer präparierten Oberfläche erläutert.

Qualitativ wurde die Adsorption des Proteins durch Inberührungbringen eines Teils eines präparierten Dias gemäß Beispiel 10 mit einer 10 mg/ml Lösung des Serumalbumins vom Ring in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert 7 während ungefähr 10 Minuten dargestellt. Hierauf wurde eine vollkommene Spülung mit Wasser vorgenommen. Drei verschiedene Flächen konnten festgestellt und jeweils durch das Verhalten eines Wassertropfens charakterisiert werden. In dem Bereich, der das gebundene Protein enthält, breitete sich der Wassertropfen aus. In dem Bereich, der das befestigte Polymer enthält, perlt der Wassertropfen auf. In dem Bereich, in dem das Glas unbehandelt war, breitete sich der Wassertropfen aus.

Beispiel 12

Hier wird die Adsorption eines Enzyms auf einer präparierten Oberfläche erläutert.

Saubere, fehlerfreie Pyrex-Glasperlen (2 mm; 69,8 g) wurden mit einer ausreichenden 0,1%igen wäßrigen Lösung des Dimethylamin- Addukts des epoxidierten Polybutadien bearbeitet, um die Perlen zu überziehen. Die Glasperlen wurden 15 Minuten in der Lösung belassen. Die Flüssigkeit wurde abgegossen und die Perlen wurden zehnmal mit 50 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.

Die Perlen wurden dann in einer Bürette eines Volumens von 50 ml angeordnet und eine Lösung von Katalase 1 : 25 verdünnt mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert 7 wurde zugesetzt, um die Perlen zu bedecken. Nach einer Standzeit von 5 Minuten wurde die Säule entleert und mit dem Phosphatpuffer mit pH-Wert 7 gespült.

Die Substratlösung wurde aus 0,6 ml 30%igen H&sub2;O&sub2; plus 100 ml Phosphatpuffer mit pH-Wert 7 hergestellt. Wenn die Substratlösung durch die Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von ungefähr 6 ml/min. geschickt wurde, konnte kein Wasserstoffperoxyd in dem Eluat beim Jodstärketest festgestellt werden. Stürmische Blasenbildung (O&sub2;) wurde ebenfalls in der Säule beobachtet, was die Aufrechterhaltung der enzymatischen Reaktionsfähigkeit anzeigt.

Beispiel 13

Hier werden die Herstellung eines Quarzmehladsorbens sowie die Adsorption des menschlichen Serumalbumins erläutert.

Quarzmehl (50,0 g; 1,2 m²/g spezifische Oberfläche) wird mit 500 ml einer 318 µg/ml-Lösung des Polymers nach Beispiel 1 in Wasser zusammengefügt. Die Aufschlämmung wird auf einem Flachrütteltisch 18 Stunden bei Zimmertemperatur bewegt. Das Quarzmehl wurde durch Filtern wiedergewonnen und fünfmal durch Wiederaufschlämmen in 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die endgültige Spüllösung hat sich als neutral in bezug auf eine Phenol-Rot- Anzeigeeinrichtung (0,005%) erwiesen. Das Quarzmehl wurde im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.

Anbringung des Serumalbumins

Drei Milliliter von Lösungen des menschlichen Serumalbumins (siehe unten) in 0,02 M Phosphatpuffers mit einem pH-Wert 7 wurden zu 2,0 g des oben erwähnten, bearbeiteten Quarzmehls gegeben und die Aufschlämmung wurde langsam während der Nacht bei Zimmertemperatur bewegt. Der Brei wurde mittels einer 0,2 µm Filtermembran gefiltert, wie sie im Handel unter der Bezeichnung "Millipore" zu haben ist, um die Feststoffe zu beseitigen und das Filtrat auf Protein unter Verwendung des Biuret-Verfahrens (S. Chaykin, "Biochemistry Laboratory Techniques", Wiley, N. Y., Seite 17) zu analysieren. Auf diese Weise kann die Menge des pro Gramm des Quarzmehls (oder pro Einheit der spezifischen Oberfläche) adsorbierten Proteins bestimmt werden. Die Ergebnisse für einen Konzentrationsbereich des menschlichen Serumalbumins sind nachfolgend aufgeführt:

Beispiel 14

Hier wird die Adsorption eines Enzyms erläutert: Eine Lösung von 1,000 g Urease (3400 Einheiten/g, 7,9% Stickstoff) in 50,0 ml eines 0,02 M Phosphat-Puffers mit einem pH-Wert 6,9 wurde hergestellt und durch ein Bett Diatomeenerde gefiltert, um die ungelösten Feststoffe zu entfernen. 3,0 ml des Filtrats wurden dann 24 2,0 g des nach Beispiel 7, Absatz 1 hergestellten Quarzmehls gegeben und der Brei wurde mäßig 6 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerüttelt. Das Quarzmehl wurde durch Filtration wiedergewonnen und vollständig mit 0,02 M Phosphat und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Stickstoffanalyse des Quarzmehls nach Kjeldahl zeigt 0,24% Gesamtprotein oder 2,4 g Urease als Gesamtprotein pro g Quarzmehl an. Die Reaktionsfähigkeit der festgelegten Urease wurde unter Verwendung genormter Kontrollverfahren bestimmt ("Worthington Enzyme Manual" Seite 146, Worthington Biochemical Co., Freehold, N. Y., 1972). Es stellte sich heraus, daß das festgelegte Enzym ungefähr 90% der Reaktionsfähigkeit einer äquivalenten Menge an Ureasepulver behalten hatte.

Beispiel 15

Hier werden die Adsorption eines Antigens und die immunologische Einwirkung darauf erläutert. Dieses Beispiel gibt die Anbringung immunologisch aktiver Proteine (IgG) an piezoelektrischen Quarzkristalloszillatoren wieder.

Herstellung der Oszillatoren

10 MHz (Grundschwingung) dämpfungsgliedartig zugeschnittene (AT) Quarzkristalloszillatoren mit einem Durchmesser von 0,3 cm, die in Haltern gelagert sind, wurden oberflächenmäßig durch Eintauchen in eine 0,06%ige wäßrige Lösung von Poly-(2-Hydroxy-3-Dimethylamino-1,4-Butan) (Beispiel 5B) durch Umrühren während der Nacht bei Zimmertemperatur behandelt. Das überschüssige Polymer wurde durch Spülen mit einer großen Menge entmineralisierten Wassers von den Kristallen gewaschen, die anschließend in einem Stickstoffstrom getrocknet wurden. Nach Abgleichung bei ungefähr 50% relativer Feuchtigkeit wurde die Grundfrequenz der Kristalle bestimmt.

Das verwendete immunologisch aktive Protein (Antigen) war menschliches Gamma Globulin (IgG, Cohn Fraction II³). Eine 10 mg/ml Lösung dieses Materials in 0,02 M gepufferten Phosphatsalz (PBS pH 7,0) wurde hergestellt. Die Lösung stand während der Nacht bei 4°C. Die klare, oben schwimmende Schicht wurde abgegossen und unmittelbar durch Whatman Nr. 1 Filterpapier gefiltert. Die mit Polymer behandelten Oszillatoren wurden in der IgG-Lösung bei Zimmertemperatur vier Stunden lang inkubiert. Die Lösung wurde dann mit PBS überflutet und darauf mit ausreichend entmineralisiertem Wasser gespült, so daß keine adsorbierbaren Substanzen in dem Behandlungsbad für die Oszillatoren verblieben. Nach dem Trocknen in einem Stickstoffstrom und der Abgleichung bei 50% relativer Feuchtigkeit wurde die resultierende Frequenz jedes Oszillators bestimmt. Die zusammengesetzten IgG-Kristalle enthielten sehr gleichmäßige Mengen an Protein, was in diesem Fall einer Frequenzänderung von 580 ± 63 Hz entspricht.

Diese Kristalle reagieren mit dem löslichen Antikörper zu IgG und weisen eine Frequenzänderung oder eine Gewichtszunahme auf, die unmittelbar der Konzentration des Antikörpers in der Testlösung proportional ist.


Anspruch[de]
  1. 1. Gegenstand zum Festlegen biologisch aktiver Proteine bei Beibehaltung ihrer biologischen Reaktionsfähigkeit mit einem polaren Festkörperträger, dessen Oberfläche ein wasserlösliches Polymer mit sich wiederholenden Einheiten aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polymer in Form eines monomolekularen Films mit einer Dicke von 10 bis 250 Å vorliegt und die wiederholende Einheit eine beta-Hydroxyalkylenamin-Einheit aufweist, wobei das Äquivalentgewicht des Polymeren, bezogen auf die beta-Hydroxyalkylenamin-Einheit, 87 bis 10 000 ist.
  2. 2. Gegenstand nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beta-Hydroxyalkylenamin-Einheit



    ist, wobei R&sub1; Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, R&sub2; ein Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterozyklischen Ring bilden; oder daß diese Einheit



    ist, wobei R&sub3; Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist.
  3. 3. Gegenstand nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beta-Hydroxyalkylenamin-Einheit



    ist, wobei R&sub1; Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, R&sub2; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, oder R&sub1; und R&sub2; zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterozyklischen Ring bilden; oder daß diese Einheit



    ist, wobei R&sub3; Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; oder daß diese Einheit



    ist, wobei R&sub1; Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, R&sub2; eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist oder R&sub1; und R&sub2; zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterozyklischen Ring bilden, und wobei R&sub4; Wasserstoff oder Methyl ist.
  4. 4. Gegenstand nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beta-Hydroxyalkylenamin-Einheit gebildet ist aus:
    1. (1) dem Dimethylaminaddukt des epoxidierten Poly-cis-1,4- Divinyls; oder
    2. (2) dem Dimethylaminaddukt des epoxidierten Styrol-b- Divinyls; oder
    3. (3) dem Dimethylaminaddukt des Polyglycidyl-Methacrylsäureesters; oder
    4. (4) dem Piperidinaddukt des epoxidierten Styrol-b- Divinyls; oder
    5. (5) dem Piperidinaddukt des Poly-cis-1,4-Divinyls; oder
    6. (6) dem Kondensat des Epichlorhydrins und Methylamins.
  5. 5. Gegenstand nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Bariumferrit, Keramik, siliziumhaltigen Materialien, Hydroxy-Apatit, Silber und Nickel gebildet ist.
  6. 6. Gegenstand nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein piezoelektrischer Oszillator ist.
  7. 7. Gegenstand nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Oszillator ein Quarzkristall ist.
  8. 8. Gegenstand nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß an der Gegenstandsoberfläche ein biologisch aktives Protein befestigt ist.
  9. 9. Gegenstand nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Protein ein Enzym ist.
  10. 10. Gegenstand nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Urease, Glukose, Oxydase, Invertase, Katalase, Papain, Lipase, Cellulase, Dextranase, Amylase, Ribonuklease, Carboxypeptidase oder Urokinase ist.
  11. 11. Gegenstand nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Protein ein immunologisch aktives Protein ist.
  12. 12. Gegenstand nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das immunologisch aktive Protein gamma-Globulin, Haptoglobulin, alpha&sub1;-Antitrypsin-Hemmstoff, Serumalbumin oder Transferrin ist.
  13. 13. Verfahren zum Festlegen eines Proteins auf einem polaren Festkörperträger nach Anspruch 1 mit den Verfahrensschritten, daß (1) auf den Träger ein wasserlösliches Polymer mit sich wiederholenden Einheiten aufgebracht wird, und daß (2) der im ersten Verfahrensschritt bearbeitete Träger mit einer wäßrigen Lösung eines biologisch aktiven Proteins in Berührung gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polymere in Form eines monomolekularen Films mit einer Dicke von 10 bis 250 Å aufgebracht wird und die wiederholende Einheit eine beta-Hydroxyalkylenamin-Einheit ist, wobei das Äquivalentgewicht des Polymeren, bezogen auf die beta-Hydroxyalkylenamin-Einheit, 87 bis 10 000 ist, und daß das β-Hydroxylalkylenamin enthaltene Polymer als monomolekularer Film auf der Oberfläche der Trägersubstanz durch Eintauchen letzterer in eine verdünnte wäßrige Lösung des Polymers abgesetzt, worauf der so behandelte Träger mittels Wasser gewaschen wird.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com