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Dokumentenidentifikation DE3685519T2 21.01.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0205098
Titel Influenzaimpfstoff.
Anmelder National Institute of Health;
Daiichi Seiyaku Co. Ltd., Tokio/Tokyo, JP;
Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, Kumamoto, JP
Erfinder Oya, Akira, Meguro-ku Tokyo, JP;
Ohkuma, Kunio, Kumamoto-shi Kumamoto-ken, JP;
Nerome, Kuniaki;
Inoue, Atsuo, Funabashi-shi Chiba-ken, JP
Vertreter Vossius, V., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Tauchner, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Heunemann, D., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Rauh, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Hermann, G., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Schmidt, J., Dipl.-Ing.; Jaenichen, H., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte; Tremmel, H., Rechtsanw., 8000 München
DE-Aktenzeichen 3685519
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 05.06.1986
EP-Aktenzeichen 861076313
EP-Offenlegungsdatum 17.12.1986
EP date of grant 03.06.1992
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.01.1993
IPC-Hauptklasse A61K 39/145

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Influenza- Impfstoff, insbesondere einen Influenza-Impfstoff. Der Impfstoff besteht aus künstlichen vesikelähnlichen Partikeln eines Komplexes aus von einem Influenzavirus abstammenden und als aktive Komponente des Impfstoffes bekanntern HANA- Antigen besteht und einem Muramyldipeptid-Derivat (hier als MDP-Derivate bezeichnet), das bekanntlich ein synthetisches Adjuvans ist. Die künstlichen Partikel ähneln den natürlich vorkornrnenden Influenzaviruspartikeln in Größe und Form. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des neuen Impfstoffes.

Da die Impfwirkung der gegenwärtig verwendeten Influenza-HA- Impfstoffe infolge von auf dem HA (Hämagglutinin)-Molekül des vorherrschenden Virus auftretenden Mutationen Schwankungen aufweist, ist es erwünscht, wirksamere als die herkömmlichen Impfstoffe zu entwickeln.

Einer der neueren Lösungsansätze bei der Entwicklung von Influenza-Impfstoff richtet sich auf einen aus den Hauptbestandteilen HA und NA (Neuraminidase) bestehenden Kornponentenimpfstoff, nämlich den Influenza-HANA-Impfstoff. Der resultierende gereinigtes HA und NA enthaltende Impfstoff wird als idealer Impfstoff bezüglich Sicherheit und Wirkung betrachtet und ist in England bereits zur praktischen Anwendung gebracht worden. Die Wirkung des Impfstoffes ist jedoch immer noch unzureichend.

Ein anderer Lösungsansatz betrifft die Verwendung von Adjuvantien. Diese Arbeiten haben zur Entwicklung von Muramyldipeptid (MDP) sowie durch geeignete chemische Modifikationen zu vielen Arten von MDP-Derivaten als neue Adjuvantien geführt. Sie wiesen verbesserte Immunopotentierung auf. Im Hinblick auf diese MDP-Derivate wurde beispielsweise von Kotani et al., YAKUGAKU ZASSHI 103(1) (1983), Seiten 1-27 berichtet, daß Meerschweinchen 6-0- (2-Tetradecylhexadecanoyl)-MDP zusammen mit hochgereinigtes HA und NA als Hauptbestandteile enthaltenden Influenzaimpfstoff (z.B. HANA Impfstoff) verabreicht und ein wirksamer Adjuvanseffekt erzielt wurde. HANA-Impfstoffe jedoch, die durch einfache Zugabe dieser MDP-Derivate als ein Adjuvans zu dem Impfstoff erhalten wurden, führen nicht zu einem Impfstoff mit ausreichender Wirkung.

Dementsprechend liegt die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines neuen Influenza-Impfstoffes mit einer im Vergleich zu herkömmlichem Impfstoff verbesserten Immunogenität.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Influenza-Impfstoffes, der künstliche vesikelähnliche Partikel eines HANA-Antigen-MDP-Derivat-Komplexes mit annähernd der gleichen Partikelgröße und -form wie bei den natürlichen Viruspartikeln umfaßt.

Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die nachstehende Beschreibung verdeutlicht.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Influenza-Impfstoff bereit, der künstliche vesikelähnliche Partikel eines Komplexes aus HANA-Antigen und wenigstens einem MDP-Derivat umfaßt, wobei das MDP-Derivat eine Membran des Partikels bildet (entsprechend der Lipidmembran des natürlichen Influenzavirus), auf deren Oberfläche sich das an das MDP- Derivat gebundene HANA-Antigen befindet. Der so gebildete Impfstoff unterscheidet sich folglich von dem Impfstoff, der durch einfaches Mischen von Impfstoff und Adjuvans erhalten wird. Dementsprechend haben die erfindungsgemäß erhaltenen künstlichen vesikelähnlichen Partikel eines Komplexes aus HANA-Antigen und MDP-Derivat annähernd die gleiche Partikelgröße und die gleiche Form wie die natürlichen Viruspartikel.

Fig. 1 und 2 sind elektronenmikroskopische Aufnahmen (x 150.000) der Probe Impfstoff Nr. 1 und der Probe Impfstoff Nr. 2 der vorliegenden Erfindung;

Fig. 3 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme (x 200.000) der Probe Nr. 4 der vorliegenden Erfindung; und

Fig. 4 stellt einen Vergleich der durch die Saccharose-Dichtegradientenzentrifugationsmethode erhaltenen Banden dar, zum Nachweis der Bildung des erfindungsgemäßen Komplexes.

Der neue Influenza-Impfstoff kann durch das nachstehende spezielle Verfahren hergestellt werden.

Zunächst wird ein Influenza-HANA-Antigen und ein MDP-Derivat in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 bis 1:300 in einer geeigneten Pufferlösung, z.B. phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, gemischt. Anschließend wird das gebildete Gemisch durch Zugabe einer wirksamen Menge (0,1 - 10 G/V%) eines grenzflächenaktiven Mittels gelöst. Dann wird daraus das grenzflächenaktive Mittel durch Dialyse entfernt. Man erhält einen neuen HANA-Antigen-MDP-Derivat-Komplex. In diesem Zusammenhang ist die Verwendung eines grenz-flächenaktiven Mittels wichtig, das durch Dialyse entfernt werden kann. Beispiele für solche grenzflächenaktiven Mittel sind Octylglukosid, Natriumcholat und ähnliches. Bezugnehmend auf die Fig. 1 bis 3 bildet der so erhaltene HANA-Antigen-MDP- Derivat-Komplex ein sogenanntes Virosom, in welchem das MDP- Derivat selbst die Bildung von künstlichen vesikelähnlichen Partikeln ermöglicht und die HANA-Antigene auf deren Oberfläche mittels ihrer schmalen Endstücke so angeordnet sind, daß sie die gleiche Orientierung wie auf den natürlichen Viruspartikeln aufweisen.

Nach einem anderen Aspekt der Erfindung können XDP-Derivate zusammen mit (i) Cholesterin (ii) Lecithin und Dicetylphosphat oder (iii) einem Gemisch von (i) und (ii), etc., verwendet werden, welche die Fähigkeit von MDP-Derivaten zur Bildung künstlicher vesikelähnlicher Partikel fördern. In diesem Fall ist vorzugsweise nachstehendes Gewichtsverhältnis anzuwenden:

Bei Verwendung von Cholesterin: ein MDP-Derivat/Cholesterin = 1:0 bis 1:5, insbesondere 1:0,5 bis 1:2; bei Verwendung von Lecithin: ein MDP-Derivat/Lecithin = 1:0 bis 1:50, insbesondere 1:1 bis 1:20 bei Verwendung von Dicetylphosphat: Lecithin/Dicetylphosphat = 1:0,05 bis 1:2, insbesondere 1:0,5 bis 1:1.

Zusätzlich ist in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung die Verwendung des grenzflächenaktiven Mittels und das Durchführen einer Dialyse nicht notwendigerweise erforderlich. Folglich hat dieser Aspekt den Vorteil, daß vesikelähnlichen MDP-Derivatpartikel durch beispielsweise herkömmliche Schallbehandlung (die Ultraschallmethode), Mikroinjektion, Gegenphasenverdampfung oder ähnliches gebildet werden können.

Für die vorliegende Erfindung brauchbare MDP-Derivate schließen viele Arten geeigneter chemischer Modifikation des MDP ein. Derartige MDP-Derivate sind beispielsweise in der japanischen Offenlegungsschrift (KOKAI) Nr. 52-46020, 52- 156812, 54-73729, 54-130517, 55-19236, 55-28932, 55-28933, 56-18996, 56-49396 und 60-78997 beschrieben.

Vorzugsweise wird ein höherer MDP-Fettsäureester folgender Formel verwendet:

in der Q ein synthetischer höherer Fettsäurerest mit insgesamt 20 bis 60 Kohlenstoffatomen ist;

A L-Alanin, L-Serin oder Glycin; und iso Gln ist Isoglutamin ist.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung des als B30-MDP bezeichneten 6-0-(2-Tetradecylhexadecanoyl)-MDPs. Diese Fettsäureester sind in der japanischen Offenlegungsschrift (KOKAI) Nr. 54-130517 beschrieben.

Ebenfalls ist die Verwendung des MDP-Derivates folgender Formel bevorzugt:

in der X eine Aminosäure, wie beispielsweise L-Alanin, L- Serin, L-Valin oder Glyin ist;

Y die Gruppen -NH-A oder -NHCH(CH&sub2;)n-NHCO-A ist, in der R&sub1; ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe, eine Carboxamidogruppe oder eine Carboxylgruppe ist; n einen Wert von 1 bis 6 hat und A ein gesättigter oder ungesättigter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 30 verzweigten oder unverzweigten Kohlenstoffatomen ist. Ein besonders bevorzugtes Beispiel derartiger Derivate umfaßt das als MDP- Lys (L18) bezeichnete Nα-(N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl)-Nε-stearoyl-L-lysin.

Weiterhin ist die Verwendung des als MDP (MeAla)-Lys (18) bezeichneten und in der japanischen Offenlegungsschrift No. 60-78997 beschriebenen Nα- (N-Acetyl-muramyl-N-methyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl)-Nε-stearoyl-L-lysin bevorzugt.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete HANA-Antigen kann erhalten werden durch folgende Schritte: Reinigen eines Influenzavirus durch Ultrazentrifugation oder durch chemische Behandlung von aus Influenzavirus infizierten Eiern gewonnener Allantoinflüssigkeit, Lösen des aufgereinigten Virus mittels eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels, wie Triton X-100 oder NP-40 oder mittels eines anionischen grenzflächenaktiven Mittels, wie Natriumdesoxychlolat oder Natriumcholat oder mittels eines kationischen grenzflächenaktiven Mittels, wie Cetyltrimethylammonium, oder Zerlegen des aufgereinigten Virus mittels eines organischen Lösungsmittels, Ether und weiteres Reinigen des entstandenen Produkts durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Affinitätschromatographie oder ähnlichem.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung eines Influenza HANA-Antigens

Das Influenza A/Bangkok/1/79 (H&sub3;N&sub2;)-Virus wurde in bebrüteten Hühnereiern gezüchtet und anschließend durch Ultrazentrifugation (23.000 Umdrehungen pro Minute, 90 Minuten), durch Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit (6000 Umdrehungen pro Minute, 60 Minuten) und durch Saccharose- Dichtegradientenzentrifugation (30.000 Upm, 3 Stunden) gereinigt. Dann wurde zu der erhaltenen Viruslösung Triton X-100 bis einer Endkonzentration von 1 % zugegeben. Das Virusmaterial wurde durch heftiges Schütteln gelöst. Anschließend wurde gereinigte HANA-Antigenlösung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation erhalten.

Herstellung eines Impfstoffes und Immuntest

Unter Verwendung der vorstehend erhaltenen gereinigten HANA- Antigenlösung wurden vier Arten von Impfstoffproben wie folgt hergestellt, deren Zusammensetzung in Tabelle I gezeigt sind:

Die entsprechenden Bestandteile wurden gemischt und anschließend wurde Octylglucosid bis zu einer Endkonzentration von 3 Gew. -% dazugegeben. Nachdem die Bestandteile gelöst worden waren, wurde nach der herkömmlichen Methode eine Dialyse in phosphatgepufferter Kochsalzlösung durchgeführt. Die HANA-Antigen-Konzentration jeder so erhaltenen Probe wurde auf 0,8 ug N/ml eingestellt und anschließend in einer Dosis von 0,5 ml/Maus in das Peritoneum (Bauchfell) jeder Maus aus einer Gruppe von 15 DDY-Mäusen (4 Wochen alt, weiblich) geimpft. Anschließend wurden die Mäuse in drei Gruppen aus jeweils 5 Mäusen aufgeteilt und aus den Mäusen der entsprechenden Gruppen wurde nach 1 Woche, nach 2 Wochen und nach 3 Wochen Blut entnommen. Ein Hämagglutinations- Inhibitionstest wurde nach dem WHO-Verfahren zur Bestimmung Antikörper-bildender Fähigkeit durchgeführt.

DDY-Mäuse wurden ebenfalls mit den vorgenannten entsprechenden Proben nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren immunisiert. 2 Wochen später wurden die Mäuse mit Viren des Stammes infiziert, der für die Herstellung des Impfstoffes verwendet worden war. Die Lungen der Mäuse wurden vier Tage später reseziert. Zur Bestimmung des Virustiters in der Lunge wurde der Plaque-bildende Test mittels MDCK-Zellen durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I
Gegenstand Zusammensetzung Antikörper-bilende Fähigkeit (HI-Wert) Infektions-Schutztest Ergebnis Woche Wochen Anwesenheit von Pneumonia Virustiter (Nr./ml) (Vergleichbeispiele) HANA Cholesterin Lecithin Dicetylphosphat nein vorhanden

Es ist aus den in Tabelle I aufgeführten Ergebnissen ersichtlich, daß alle erfindungsgemäßen Impfstoffe gegenüber den nur aus HANA bestehenden Vergleichsbeispielen überlegene Antikörper-bildende Fähigkeit aufweisen.

Das Untersuchen der Form der Impfstoffe der Proben Nr. 1, 2 und 4 mittels eines Elektronenmikroskops stellte sicher, daß die künstlichen vesikelähnlichen MDP-Derivate die gleiche Größe und Form wie die natürlichen Viruspartikel aufwiesen und daß auf deren Oberfläche die HANA-Antigene zu den MDP- Derivaten gebunden waren, so daß sich ein Komplex bildet wie in Fig. 1-3 gezeigt.

Um festzustellen, ob die vorstehend hergestellte Probe Nr. 1 einen Komplex bildet, wurden die Dichten des HANA-Antigens, des gesamten Virus und der Probe Nr. 1 durch Saccharose- Dichtegradientenzentrifugation bestimmt. Es ist aus den in Fig. 4 gezeigten Ergebnissen ersichtlich, daß die Probe Nr. 1 als Bande an einer anderen Position als die des HANA-Antigens und des gesamten Virus auftrat. Folglich kann der Schluß gezogen werden, daß die Probe Nr. 1 einen Komplex bildet, der sich vom HANA-Antigen und vom gesamten Virus unterscheidet.

Beispiel 2

HANA-Antigen wurde nach der gleichen Methode hergestellt wie in Beispiel 1 erläutert, jedoch wurde der Influenza-Stamm A/Philippin/2/82 (H&sub3;N&sub2;) verwendet. Das HANA-Antigen wurde mit den in Tabelle II aufgeführten Bestandteilen gemischt. Anschließend wurde das Gemisch mittels eines mit einem "Cup Horn" (Bereich 2,5) (Heat System-Ultrasonics., Inc.) ausgerüsteten "Heat Systems W375 Sonicator" für 8 min mit Ultraschall behandelt. Die Antikörper-bildende Fähigkeit jeder so erhaltenen Probe wurde nach dem in Beispiel 1 erläuterten Verfahren bestimmt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Sie zeigen, daß die erfindungsgemäßen Impfstoffe gute Antikörper-bildende Fähigkeit aufweisen.

Tabelle II
Probe Nr. Zusammensetzung HI-Wert (nach Ablauf von 3 Wochen) Vergleichsbeispiel HANA Lecithin Dicetylphosphat Chloesterin

Aus den vorstehenden Beispielen 1 und 2 ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Influenza-Impfstoff gute Immunisierungsfähigkeit und verbesserte Schutzeigenschaften gegenüber einer Influenzainfektion aufweist.


Anspruch[de]

1. Influenza-Impfstoff, umfassend einen Komplex aus HANA- Antigen und einem MDP-Derivat, wobei das MDP-Derivat selbst einen künstlichen vesikelähnlichen Partikel bildet und die nachstehende Formel aufweist:

in der Q einen synthetischen höheren Fettsäurerest mit insgesamt 20 bis 60 Kohlenstoffatomen bedeutet; A L-Alanin, L-Serin oder Glycin bedeutet, und iso GIn Isoglutamin bedeutet.

2. Influenza-Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das MDP- Derivat 6-0-(2-Tetradecylhexadecanoyl)MDP ist.

3. Influenza-Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gewichtsverhältnis des Influenza HANA-Antigens zu dem MDP-Derivat zwischen 10:1 und 1:300 liegt.

4. Influenza-Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die künstlichen vesikelähnlichen Partikel des MDP- Derivats Cholesterin oder Lecithin und Dicetylphosphat oder ein Gemisch davon enthalten.

5. Influenza-Impfstoff nach Anspruch 4, wobei Cholesterin in derartiger Menge enthalten ist, daß das Gewichtsverhältnis des MDP-Derivats zu Cholesterin 1:0 5 bis 1:5 beträgt.

6. Influenza-Impfstoff nach Anspruch 4, wobei Lecithin und Dicetylphosphat in derartiger Menge enthalten sind, daß das Gewichtsverhältnis des MDP-Derivats zu Lecithin 1:0 10 bis 1:50 und das von Lecithin zu Dicetylphosphat 1:0,05 bis 1:2 beträgt.

7. Influenza-Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Influenza HANA ein Antigen ist, das durch Reinigung des Influenzavirus hergestellt ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Influenza-Impfstoffs, umfassend die Schritte: Mischen eines Influenza-HANA- Antigens und eines MDP-Derivats nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in einem geeigneten Medium, Lösen des entstandenen Gemisches mittels eines durch Dialyse entfernbaren grenzflächenaktiven Mittels, wobei das Lösen in Gegenwart oder Abwesenheit von Cholesterin, Lecithin und Dicetylphosphat oder eines Gemisches davon ausgeführt wird; und anschließendes Entfernen des grenzflächenaktiven Mittels daraus durch Dialyse, um einen Influenza-Impfstoff zu erhalten, der künstliche vesikelartige Partikel aus einem Komplex des Influenza- HANA-Antigens und eines MDP-Derivats enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Lösen in Gegenwart von Cholesterin, Lecithin und Dicetylphosphat oder eines Gemisches davon ausgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Lösen in Abwesenheit von Cholesterin, Lecithin und Dicetylphosphat oder eines Gemisches davon durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das Gewichtsverhältnis des Influenza-HANA-Antigens zu dem NDP-Derivat zwischen 10:1 und 1:300 liegt.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei Cholesterin in einer derartigen Menge enthalten ist, daß das Gewichtsverhältnis des NDP-Derivats zu Cholesterin 1:0 bis 1:5 beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei Lecithin und Dicetylphosphat in einer derartigen Menge enthalten sind, daß das Gewichtsverhältnis von MDP-Derivat zu Lecithin 1:0 bis 1:50 und das Gewichtsverhältnis von Lecithin zu Dicetylphosphat 1:0,05 bis 1:2 beträgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei das Influenza HANA-Antigen ein durch Reinigen eines Influenzavirus hergestelltes Antigen ist.







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