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Dokumentenidentifikation DE3485823T2 11.03.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0124048
Titel Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan durch Gärung.
Anmelder Ajinomoto Co., Inc., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Miwa, Kiyoshi, Matsudo-shi Chiba-ken, JP;
Nakamori, Shigeru, Yokohama-shi Kanagawa-ken, JP;
Sano, Konosuke, Shibuya-ku Tokyo, JP
Vertreter Strehl, P., Dipl.-Ing. Dipl.-Wirtsch.-Ing.; Schübel-Hopf, U., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Groening, H., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 8000 München
DE-Aktenzeichen 3485823
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 19.04.1984
EP-Aktenzeichen 841044985
EP-Offenlegungsdatum 07.11.1984
EP date of grant 22.07.1992
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.03.1993
IPC-Hauptklasse C12P 13/22
IPC-Nebenklasse C12N 15/00   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Plasmid, das die Fähigkeit zur L-Tryptophan-Produktivität vermittelt, Mikroorganismen, die dieses Plasmid enthalten und ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan mittels Fermentierung unter Verwendung von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien, die durch eine Gen-Rekombinationstechnik hergestellt wurden.

Beschreibung des Standes der Technik

Wenn L-Tryptophan mittels Fermentierung hergestellt werden soll, wurden, da Wildtypen kaum L-Tryptophan sekretieren, diese künstlich mutiert, um ihnen die Fähigkeit zur Produktion von L- Tryptophan zu verleihen.

Wie bereits bekannt, können als Mutanten, die die Fähigkeit zur L-Tryptophan-Herstellung besitzen, genannt werden: Mutanten der Gattung Brevibakterium, Microbakterium oder Corynebakterium, die gegen 5-Methyl-tryptophan resistent sind (US Patent Nr. 3 700 539), Mutanten der Gattung Corynebakterium, die zum Wachstum Tyrosin und Phenylalanin benötigen und gegen Phenylalanin-Antagonisten resistent sind (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 19037/1976), Mutanten der Gattung Bacillus, die gegen 5-Fluortryptophan resistent sind (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 85289/1974) und Mutanten der Gattung Brevibakterium, die gegen 5-Methyltryptophan und m-Fluortryptophan (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 42091/1975) resistent sind.

Andererseits wurde kürzlich über Versuche berichtet, L- Tryptophan produzierende Bakterien unter Verwendung einer Gen- Rekombinationstechnik, die sich von der oben erwähnten künstlichen Mutationstechnik unterscheidet, herzustellen. Beispielsweise wurde in Appl. Environ. Microbiol. 38, (2), 181-190 (1979) berichtet, daß die spezifischen Mutanten von Escherichia coli, die ein Plasmid enthalten, das die trp E 472 Gene von Escherichia coli enthält, etwa 1,3 g/l L-Tryptophan produzieren. Zusätzlich wurde in Proceedings of 1980 Annual Meeting of the Society of Fermentation Technology, Japan Seite 170 ebenfalls erwähnt, daß Mutanten von Escherichia coli, die ein Plasmid mit den Tryptophan-Operons von Escherichia coli enthalten, 360 mg/l L-Tryptophan produzierten.

Weiterhin offenbart EP-A-0 136 359 (ein Dokument nach Art. 54(3)) die Herstellung von Aminosäuren, z. B. L-Tryptophan durch Einbringen eines Gens, das in der Biosynthese dieser Aminosäuren eine Rolle spielt, in Mikroorganismen der Gattung Corynebakterium oder Brevibakterium.

Obwohl unter den oben genannten Mutanten von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien mehrere bekannt sind, die große Mengen an Tryptophan herstellen, wurde bis jetzt unter Verwendung derartiger coryneformer Bakterien wie oben kein nennenswerter Versuch unternommen, Tryptophan-Erzeuger zu konstruieren, die eine hohe potentielle Fähigkeit zur Produktion von L-Tryptophan besitzen.

Daher bleibt das Bedürfnis nach einem effizienteren Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan mittels Fermentierung bestehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Plasmid, das die Fähigkeit zur L-Tryptophan-Produktivität vermittelt, Mikroorganismen, die dieses Plasmid enthalten, und ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan durch Fermentierung unter Verwendung coryneformer Bakterien, die mittels Gen-Rekombinationstechnik konstruiert wurden, zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß wird ein rekombinantes Plasmid zugänglich gemacht, welches Anthranilsäure-Phosphoribosyltransferase-Gen von Brevibakterium lactofermentum, das die genetische Information für die Biosynthese von L-Tryptophan hat und aus Plasmiden erhältlich ist, die in B. lactofermentum FERM-BP-275 oder FERM- BP-276 vorhanden sind, insertiert in ein Vektorplasmid, das zur Selbstreplikation in Zellen von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien befähigt ist, enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein zur Produktion von L-Tryptophan befähigter Mikroorganismenstamm, der durch Einbringen des oben definierten rekombinanten Plasmids in einen Rezipienten, der den coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien, die gegen Tryptophan-Antagonisten resistent sind angehört, erhältlich ist.

Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan durch Züchten eines zur Herstellung von L-Tryptophan befähigten Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Gewinnen des in dem Kulturmedium angereicherten L-Tryptophans geliefert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein oben definierter Mikroorganismus verwendet wird.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pAM 330.

Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pAM 286.

Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pAM 1519.

Fig. 4 zeigt eine Restriktionskarte des zusammengesetzten Plasmids pAJ 655.

Fig. 5 zeigt eine Restriktionskarte des zusammengesetzten Plasmids pAJ 611.

Fig. 6 zeigt eine Restriktionskarte des zusammengesetzten Plasmids pAJ 1844.

Fig. 7 zeigt eine Restriktionskarte des zusammengesetzten Plasmids pAJ 440.

Fig. 8 zeigt eine Restriktionskarte des zusammengesetzten Plasmids pAJ 3148.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

In dem erfindungsgemäßen Verfahren enthält das rekombinante Plasmid wenigstens ein DNS-Fragment, das das Anthranilsäure- Phosphoribosyltransferase-Gen enthält, das, wenn es in Mutanten von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien, die wenigstens L-Tryptophan benötigen, eingebracht wird, deren L- Tryptophan-Abhängigkeit aufheben kann. Dieses Gen wird im folgenden als "Tryptophan-Biosynthesegen" bezeichnet.

Die das Tryptophan-Biosynthesegen enthaltenden DNS-Fragmente können aus der chromosomalen DNS coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien erhalten werden (Bakterien, aus denen das Tryptophan-Biosynthesegen enthaltende DNS Fragmente erhältlich sind, werden DNS-Donoren genannt).

Coryneforme Bakterien sind aerobe grampositive, nicht säureresistente Stäbchen und werden in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 599 (1974) beschrieben. Als Beispiele von Exemplaren von Wildtypstämmen von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können die folgenden angeführt werden:

Brevibakterium Divaricatum ATCC 14020

Brevibakterium saccharolyticum ATCC 14066

Brevibakterium immaliophilum ATCC 14068

Brevibakterium lactofermentum ATCC 13869

Brevibakterium roseum ATCC 13825

Brevibakterium flavum ATCC 19240

Corynebakterium acetoacidfilum ATCC 15806

Corynebakterium callunae ATCC 15991

Corynebakterium glutamium ATCC 13032, 13060

Corynebakterium lilium ATCC 15990

Corynebakterium melassecola ATCC 17965

Microbakterium ammoniaphilum ATCC 15354

Für die vorliegende Erfindung geeignete coryneforme Glutaminsäure produzierende Bakterien schließen ebenso Mutanten der Wildtypen von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien ein, die die Fähigkeit verloren haben Glutaminsäure herzustellen, sowie verschiedene Mutanten, die Aminosäuren wie Lysin und Arginin, Purin-Nukleoside wie Inosin, Purin-Nukleotide wie Inosin-5'-monophosphat oder andere Produkte herstellen.

Als Beispiele für Tryptophan-Antagonisten können 4-Fluortryptophan (im folgenden mit 4-FT abgekürzt), 5-Fluortryptophan (im folgenden mit 5-FT abgekürzt), 6-Fluortryptophan, 7- Fluortryptophan, 4-Methyltryptophan, 5-Methyltryptophan, 6- Methyltryptophan, 7-Methyltryptophan, Naphthylalanin, Indolacrylsäure, Naphthylacrylsäure, β-(2-Benzothienyl)-alanin, Styrolessigsäure, Indol und Tryptozan genannt werden. Vorläufer von Tryptophan sind 3-Dehydroxy-D-arabino-hepturonsäure-7- phosphat, 3-Dehydrochinasäure, 3-Dehydroshikimisäure, Shikimisäure, Shikimisäure-3-phosphat, 5-Enolpyruvyl-shikimisäure-3- phophat, Chorisminsäure, Anthranilsäure, N-o-Carboxyphenyl-D- ribosylamin-5'-phosphat, 1-(o-Carboxyphenyl-amino)-1-desoxyribulose-5'-phosphat, und Indol-3-glycerinphosphat.

Als Beispiele von Mutanten können Mutanten der Gattung Brevibakterium, Microbakterium oder Corynebakterium, die gegen 5-Methyltryptophan resistent sind (US Patent Nr. 3700539), Mutanten der Gattung Brevibakterium, die gegen 5-Methyltryptophan und gegen m-Fluortryptophan resistent sind (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 42091/1975) und dergleichen genannt werden.

Als Beispiel für Mutanten mit erhöhter biosynthetischer Aktivität für Vorläufer von Tryptophan wird in Agric. Biol. Chem., 39, 627, (1975) ein Stamm, der aufgrund des Fehlens einer Rückkoppelungshemmung durch Tryptophan eine erhöhte biosynthetische Aktivität für Anthranilsäure aufweist, beschrieben.

Als das Tryptophan-Biosynthesegen wird das Anthranilsäure- Phosphoribosyltransferase-Gen verwendet.

Wenn dieses Gen in ein Vektorplasmid, das sich in Wirtszellen selbst replizieren kann, insertiert wird, und das rekombinante Plasmid anschließend in einen DNS-Rezipienten der Gattung coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien eingebracht wird, können Stämme mit erhöhter Fähigkeit zur Tryptophan-Herstellung erhalten werden.

Als zur Gattung coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien gehörende DNS-Rezipienten können verschiedene Stämme Verwendet werden. Wenn Stämme, die Tryptophan zum Wachstum benötigen als Rezipienten verwendet werden, können mit Tryptophan-Biosynthesegenen transformierte Stämme leicht aufgrund des Verschwindens der Tryptophan-Abhängigkeit selektiert werden. Wenn gegen Tryptophan-Antagonisten sensitive Stämme als DNS-Rezipienten verwendet werden, und Tryptohan-Biosyntesegene, die Resistenz gegen Tryptohan-Antagonisten vermitteln in die Rezipienten eingebracht werden, können die transformierten Stämme leicht als gegen die Tryptophan-Antagonisten resistent gewordene Stämme selektiert werden. Um transformierte Stämme mit verbesserter Fähigkeit der Tryptophan-Herstellung zu erhalten, werden bevorzugt Mutanten, die aufgrund von Mutationen wie Resistenz gegen Tryptophan-Antagonisten oder Ernährungserfordernissen eine erhöhte biosynthetische Aktivität für Tryptophan oder dessen Vorläufer besitzen, als Rezipienten verwendet. Mutanten mit gesteigerter Permeabilität für Tryptophan, Mutanten mit vermindertem Tryptophan-Abbau und Mutanten oder Stämme die rekombinante Gene besitzen, welche erhöhte biosynthetische Fähigkeit für Metaboliten wie Serin, Glutaminsäure und Pyruvat, die die Ausgangsmaterialien für die Tryptophansynthese darstellen, aufweisen, können gute Resultate erbringen, wenn sie als Rezipient verwendet werden.

Als erfindungsgemäßer Vektor können beliebige Plasmide verwendet werden, die befähigt sind, sich in coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien zu replizieren.

Als Beispiele der Vektoren können die folgenden angeführt werden:

(1) pAM 330:

(a) Isolierung aus: Brevibakterium lactofermentum ATCC 13896

(b) Molekulargewicht: 3,0 Megadalton (berechnet aus der Wanderungsstrecke nach Elektrophorese in Agarosegel und der Kettenlänge der DNS unter einem Elektronenmikroskop)

(c) Schnittstellen mit Restriktionsenzymen: siehe Tabelle 1

(d) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 1

(e) andere Eigenschaften: Cryptisches Plasmid.

Tabelle 1
Restriktionsenzyme Zahl der Restriktionsschnittstellen Alu I Arthrobacter lutus Ava I Anabena variabilis Bcl I Bacillus caldolyticus BamH I Bacillus amyroliquefaciens H Bgl II Bacillus globigii BstE II Bacillus stearothermophilus ET EcoR I Escherichia coli RI&spplus; Hae II Haemophilus eagyptius HgiA I Herpetosiphon gyganteus Hind II Hemophilus influenzae Hind III Hemophilus influenzae Hpa II Hemophilus parainfluenzae Kpn I Klebsiella pneumoniae Pvu II Proteus vulgaris Sac I Streptomyces achromogenes Sal I Streptomyces albus Sau 3a Staphylococcus aureus Sma I Seratia marcescens Sst I Streptomyces stanford Xba I Xanthomonas badrii Xho I Xanthomonas holicola Xma I Xanthomonas marvacearum Xor II Xanthomonas oryzae

(2) pAM 286

(a) Isolierung aus: Corynebakterium glutamicum AJ 11560 (FERM-P5485)

(b) Molekulargewicht: 3,0 Megadalton (berechnet aus der Wanderungsstrecke nach Elektrophorese in Agarosegel und der Kettenlänge der DNS unter einem Elektronenmikroskop)

(c) Schnittstellen mit Restriktionsenzymen: siehe Tabelle 2

(d) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 2

(e) andere Eigenschaften: Cryptisches Plasmid.

Tabelle 2

Restriktionsenzyme Zahl der Restriktionsschnittstellen

Alu I ≥4

Ava I ≥2

BamH I 0

Bcl I 1

Bgl II 0

BstE II≥4

EcoR I 0

Hae II 1

HgiA I ≥4

Hind II ≥4

Hind III 1

Hpa II ≥4

Kpn I 0

Pvu II 0

Sac I 0

Sal I 0

Sau 3a ≥4

Sma I 1

Sst I 0

Xba I 1

Xho I 1

Xma I 1

Xor II 0

(3) pHM 1519:

(a) Isolierung aus: Corynebakterium glutamicum ATCC 13058

(b) Molekulargewicht: 1,8 Megadalton

(c) Schnittstellen mit Restriktionsenzymen: siehe Tabelle 3

(d) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 3

(e) andere Eigenschaften: Cryptisches Plasmid.

Tabelle 3

Restriktionsenzyme Zahl der Restriktionsschnittstellen

Ava I ≥4

BamH I 0

Bcl I 1

Bgl I 1

HcoR I 1

Hae II ≥7

HgiA I ≥4

Hind III 2

Kpn I 0

Sma I 0

Sac I 2

Xba I 0

Xho I 0

Xma I 0

(4) pAJ 655

(a) Wirtsbakterium: Escherichia coli AJ 11882 (FERM-P6517=FERM-BP136, etc.)

(b) Molekulargewicht: 6,6 Megadalton

(c) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 4

(d) Eigenschaft: zusammengesetztes Plasmid aus pAM 330 und pBR 325 (GENE, 4, 121 (1978)). Es vermittelt Resistenz gegen Chloramphenicol.

(5) pAJ 611

(a) Wirtsbakterium: Escherichia coli AJ 11884 (FERM-P6519=FERM-BP138, etc.)

(b) Molekulargewicht: 6,6 Megadalton

(c) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 5

(d) Eigenschaft: zusammengesetztes Plasmid aus pAM 281 und pBR 325. Es vermittelt Resistenz gegen Chloramphenicol.

(6) pAJ 440

(a) Wirtsbakterium: Bacillus subtilis AJ 111901 (FERM-BP-140=ATCC 39139, etc.)

(b) Molekulargewicht: 6,0 Megadalton

(c) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 6

(d) Eigenschaft: zusammengesetztes Plasmid aus pAM 330 und pUB 110 (J. Bacteriol., 134, 318 (1978)). Es vermittelt Resistenz gegen Kanamycin.

(7) pAJ 1844

(a) Wirtsbakterium: Escherichia Coli AJ 11883 (FERM-P6519=FERM-BP137, etc.)

(b) Molekulargewicht: 5,4 Megadalton

(c) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 7

(d) Eigenschaft: zusammengesetztes Plasmid aus pHM 1519 und pBR 325. Es vermittelt Resistenz gegen Chlorampheni col.

(8) pAJ 3148

(a) Wirtsbakterium: Corynebakterium glutamicum SR 8203 (ATCC 39137, etc.)

(b) Molekulargewicht: 6,6 Megadalton

(c) Restriktionskarte mit Restriktionsenzymen: siehe Fig. 8

(d) Eigenschaft: zusammengesetztes Plasmid aus pHM 1519 und pUB 110. Es vermittelt Resistenz gegen Kanamycin.

Andere Beispiele derartiger zur Selbstreplikation in coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien befähigten Plasmiden sind pCG 1 (Japanisches Patent, offengelegt unter der Nr. 134500/1982), pCG 2 (Japanisches Patent, Offenlegungsschrift Nr. 35197/1983) und pCG4 und pCG 11 (Japanisches Patent, Offenlegungsschrift Nr. 183799/1982), die alle verwendbar sind.

Die chromosomale- und die Vektor-DNS können nach einer herkömmlichen Methode erhalten werden. Die chromosomale- und die Vektor-DNS werden beide mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Die Spaltung der Vektor-DNS wird durch Schneiden mit einem Restriktionsenzym, das die Vektor DNS an einer einzigen Stelle schneidet, oder durch partielle Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das die Vektor DNS an mehreren Stellen schneidet, erreicht. Wenn die Reaktionsbedingungen so kontrolliert werden, daß eine partielle Spaltung mit einem Restriktionsenzym möglich ist, können viele Arten von Restriktionsenzymen für die chromosomale DNS verwendet werden.

Zur Ligation des so erhaltenen chromosomalen DNS-Fragments mit der so geschnittenen Vektor-DNS kann ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung einer Ligase angewendet werden. Andererseits kann auch ein Verfahren verwendet werden, bei dem Desoxyadenylsäure und Desoxythymidylsäure oder Desoxyguanylsäure und Desoxycytidylsäure zu dem chromosomalen DNS-Fragment bzw. dem geschnittenen Vektor unter Verwendung terminaler Transferase zugesetzt wird, und bei dem die so behandelte chromosomale DNS-Fraktion mit dem so behandelten geschnittenen Vektor gemischt und dann aneinandergebracht wird, um beide miteinander zu ligieren.

Das Einbringen des so erhaltenen rekombinanten Produkts aus der chromosomalen DNS und dem Vektorplasmid in zu coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien gehörenden Rezipienten, kann durch Behandlung der Zellen mit Calciumchlorid durchgeführt werden, um die Permeabilität für DNS, wie es im Zusammenhang mit Escherichia coli K12 (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, (1970)) berichtet wird, oder durch Einbringen in einem bestimmten Wachstumsstadium, wenn die Zellen zur Aufnahme von DNS (kompetente Zellen), wie im Zusammenhang mit Bacillus subtilis berichtet wird (Duncan, C. H., Wilson, G. A. und Young, F. E., GENE 1, 153 (1977)), befähigt sind. Zusätzlich ist es auch möglich, Plasmide in DNS-Rezipienten durch Bildung von Protoplasten oder Sphäroblasten der DNS-Rezipienten, die leicht Plasmid-DNS aufnehmen, einzubringen, wie im Falle von Bacillus subtilis, Actinomyceten, Bakterien und Hefen bekannt ist (Chang, S. und Cohen, S.N., Molec. Gen. Genet. 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J.M. und Hopwood, Q. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. und Finck, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)).

Obwohl sogar mit dem oben erwähnten Verfahren eine hohe Transformationsrate von Bacillus subtilis erzielt werden kann, kann, um die hohen Transformationsraten zu erhalten, ebenso ein Verfahren verwendet werden, bei dem DNS in Protoplasten von Mikroorganismen der Gattung Coryneformbakterium oder Brevibakterium, wie in dem Japanischen Patent, Offenlegungsschrift Nr. 183799/1982, beschrieben, in Gegenwart von Polyethylenglycol oder Polyvinylalkohol und von zweiwertigen Metallionen eingeführt wird. Mit einem Verfahren zur Beschleunigung der Aufnahme der DNS durch Zugabe von Carboxymethylcellulose, Dextran, "Ficoll" oder "Pluronic" F68 (Selva Co.) anstelle von Polyethylenglycol oder Polyvinylalkohol können die gleichen Resultate erhalten werden.

Die Selektion der Transformanten, die erhalten wurden durch Ligation von Tryptophan-Biosynthesegenen mit einem Vektorplasmid und nachfolgendem Einbringen der rekombinanten DNS in DNS- Rezipienten, kann bei Verwendung von Stämmen als DNS-Rezipienten, die Tryptophan benötigen leicht durch Selektion auf Stämme, welche die Tryptophan-Nährstoffabhängigkeit verloren haben oder durch Selektion auf Stämme, die, wenn Tryptophan-Biosynthesegene, die Resistenz gegen Tryptophan-Antagonisten vermitteln in den gegen Tryptophan-Antagonisten sensitiven Rezipienten eingebracht werden, gegen Tryptophan-Antagonisten resistent geworden sind, erfolgen. Weiterhin kann die Selektion von Transformanten ebenso unter Ausnutzung der erhöhten Produktivität von Tryptophan als Marker durchgeführt werden. Wenn vererbbare Marker wie Arzneimitteltoleranz in den Vektoren vorhanden sind, kann diese Toleranz zur einfacheren Selektion transformierter Stämme zusammen mit den oben erwähnten Selektionsverfahren verwendet werden.

Das Verfahren zum Züchten der so erhaltenen L-Tryptophan produzierenden Bakterien unterscheidet sich nicht speziell von dem zur Züchtung herkömmlicher L-Tryptophan produzierender Bakterien. In diesem Verfahren verwendete Kulturmedien sind gewöhnlich solche, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und zusätzlich, wenn nötig, organische Spurennährstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine enthalten. Als Kohlenstoffquellen werden Glucose, Saccharose, Lactose und dergleichen verwendet, und zusätzlich solche, die hydrolysierte Stärkeflüssigkeit, Molke und Melasse enthalten. Als Stickstoffquellen können Ammoniakgas, Ammoniakwasser, Ammoniumsalze und andere verwendet werden.

Das Züchten wird unter Kontrolle der Temperatur und des pH's des Kulturmediums unter aeroben Bedingungen durchgeführt, bis die Produktion und Anreicherung von L-Tryptophan zum Stillstand kommt.

Demzufolge wird eine große Menge an L-Tryptophan gebildet und im Kulturmedium angereichert, und ein herkömmliches Verfahren kann zur Gewinnung von L-Tryptophan aus der Kulturflüssigkeit angewendet werden.

BEISPIEL (1) Herstellung chromosomaler, das Anthranilsäure-Phosphoribosyltransferase-Gen enthaltender DNS

Brevibakterium lactofermentum ATCC 13869 wurde in ein CMG- Medium (enthaltend 1 g/dl Pepton, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Glucose und 0,5 g/dl NaCl bei einem auf 7,2 eingestellten pH) eingeimpft, und bei 30ºC für etwa 3 Stunden unter Schütteln gezüchtet, wobei die Bakterienzellen in der logarithmischen Phase des Bakterienwachstums gewonnen wurden. Nach Lysieren der Bakterienzellen mit Lysozyin-SDS, wurde die chromosomale DNS extrahiert und nach einem herkömmlichen Phenol-Behandlungsverfahren gereinigt, wobei schließlich 3,5 mg der DNS erhalten wurden.

(2) Isolierung der Vektor-DNS

Als Vektor wurde pAJ 1844 (MG 5,4 Megadalton) verwendet, und die DNS von pAJ 1844 nach folgendem Verfahren isoliert.

Zuerst wurde Brevibakterium lactofermentum AJ 12037, das pAJ 1844 als Plasmid enthielt (erhalten durch Einbringen des Plasmids pAJ 1844 in ATCC 13869 durch das in (4) beschriebene Transformationsverfahren) in 100 ml CMG Kulturmedium eingeimpft und dann bei 30ºC bis zum Ende der logarithmischen Phase des Bakterienwachstums gezüchtet. Nach Lysieren der Bakterienzellen durch Lysozym-SDS-Behandlung wurde durch 30 minütige Zentrifugation bei 30000xg ein klarer flüssiger Überstand erhalten. Nach Phenolbehandlung der Flüssigkeit wurde die DNS durch Zugabe von 2 Volumenanteilen Ethanol ausgefällt und gewonnen. Die erhaltene DNS wurde in einer kleinen Menge TEN-Puffer (der 20 mM Tris-HCL Salz, 20 mM NaCl und 1 mM EDTA bei einem pH von 8,0 enthält) gelöst, und mittels Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt. Danach wurde die DNS aus dem Gel isoliert und somit etwa 15 ug pAJ 1844 Plasmid-DNS erhalten.

(3) Insertion eines chromosomalen DNS-Fragmentes in den Vektor

20 ug in (1) erhaltener chromosomaler DNS und 10 ug in (2) erhaltener Plasmid-DNS wurden jeweils bei 37ºC für 1 Stunde mit Restriktionsendonucleasen behandelt, um sie vollständig zu schneiden. Nach einer 10 minütigen Hitzebehandlung bei 65ºC, wurden die beiden Reaktionsflüssigkeiten vermischt und die Ligationsreaktion der DNS-Ketten in der gemischten Flüssigkeit bei 10ºC für 24 Stunden mit DNS-Ligase von T&sub4; Phagen in der Gegenwart von ATP und Dithiothreitol durchgeführt. Nach einer 5 minütigen Hitzebehandlung bei 65ºC wurden der Reaktionsflüssigkeit zwei Volumenanteile Ethanol zugegeben, um nach Beendigung der Ligationsreaktion die DNS auszufällen und wiederzugewinnen.

(4) Klonieren des Anthranilsäure-Phosphoribosyltransferase-Gens (PRT)

Brevibakterium lactofermentum T-13 (NRRL B-15347), dem die PRT-Gene fehlen, wurde als DNS-Rezipient verwendet. Als Transformationsverfahren wurde Transformation von Protoplasten gewählt. Zuerst wurden die Stämme in 5 ml CMG Kulturmedium, bis zum Eintritt in die logarithmische Phase des Bakterien-Wachstums gezüchtet, und die Stämme anschließend, nach Zugabe von 0,6 Einheiten/ml Penicillin, für weitere 1 1/2 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden mittels Zentrifugation gewonnen und dann mit 0,5 ml SMMP Kulturmedium (pH 6,5), das 0,5 M Saccharose, 20 mM Maleinsäure, 20 mM Magnesiumchlorid und 3,5% "Pennassay"-Broth (Difco) enthielt, gewaschen. Nachfolgend wurden die Stämme zur Bildung von Protoplasten in SMMP Kulturmedium, das 10 mg/ml Lysozym enthielt, bei 30ºC für 20 Stunden suspendiert. Nach Abtrennung der Protoplasten mittels 10 minütiger Zentrifugation bei 6000xg wurden die Protoplasten mit SMMP gewaschen und erneut in 0,5 ml SMMP suspendiert. Die so erhaltenen Protoplasten wurden mit 10 ug der in (3) hergestellten DNS in Gegenwart von 5 mM EDTA vermischt, und der Mischung nachfolgend Polyethylenglycol bis zu einer Endkonzentration von 30% zugesetzt. Danach wurde die gemischte Flüssigkeit bei Raumtemperatur für 2 Minuten stehengelassen, damit die DNS in die Protoplasten aufgenommen werden konnte. Nach Waschen der Protoplasten mit 1 ml SMMP Kulturmedium, wurden sie in 1 ml SMMP Kulturmedium resuspendiert und bei 30ºC für 2 Stunden gezüchtet. Die Kulturflüssigkeit wurde auf ein Protoplasten-Regenerations-Kulturmedium mit einem pH von 7,0, aufgebracht. Das Protoplasten-Regenerations-Kulturmedium enthielt 12g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,5g KCl, 10 g Glucose, 8,1 g MgCl&sub2;*6H&sub2;O, 2,2 g CaCl&sub2;*2H&sub2;O, 4g Pepton, 4g pulverförmigen Hefeextrakt, 1 g "Casaminosäure" (Difco Co.), 0,2 g K&sub2;HPO&sub4;, 153 g Natriumsuccinat und 8 g Agar pro 1 l destilliertem Wasser und 3 ug/ml Chloramphenicol.

Nach zweiwöchigem Züchten der Protoplasten auf dem Regenerations-Kulturmedium bei 30ºC zeigten sich etwa 10000 Chloramphenicol-resistente Kolonien, und diese wurden auf ein tryptophanfreies Kulturmedium (das heißt Trp-Kulturmedium, das 2% Glucose, 1% Ammoniumsulfat, 0,25% Harnstoff, 0,1% Kaliumdihydrogensulfat, 0,04% MgSO&sub4;*7H&sub2;O, 2 ppm Eisenionen, 2 ppm Manganionen, 200 Microgramm/l Thiamin/HCl Salz, 50 Microgramm/l Biotin, 0,5% "Casaminosäure" und 1,8% Agar bei einem pH von 7,0 enthält) mittels einem Replikaplattierungsverfahren überimpft. Somit wurden 22 gegen Chloramphenicol resistente Stämme, die Tryptophan nicht benötigten, erhalten.

(5) Analyse der in den transformierten Stämmen enthaltenen Plasmide

Das Lysat der transformierten Zellen wurde nach der gleichen Methode wie in (2) hergestellt, und anschließend die Plasmid- DNS von der Lösung mittels Elektrophorese auf einem Agarosegel getrennt. Als Ergebnis des Nachweises der Plasmid-DNS wurden in 3 Stämmen Plasmide gefunden, die größer als der Vektor pAJ 1844 waren.

Der repräsentative Stamm dieser Stämme wurde AJ 12029 (Ferm- BP-275) genannt. Beim Spalten des Plasmids des Stammes AJ 12029 mit dem Restriktionsenzym PstI, das zur Rekombination dieses Gens verwendet worden war, wurden DNS-Fragmente, von denen man annahm, daß sie die PRT Gene besaßen, und ein Molekulargewicht von 1,3 Megadalton aufwiesen, nachgewiesen.

(6) Retransformation

Zur Bestätigung des Vorhandenseins der PRT Gene auf dem rekombinanten Plasmid, der das in (5) gefundene 1,3 Megadalton große DNS-Fragment enthielt, wurde Brevibakterium lactofermentum T-13 (NRRL B-15347) erneut mit der Plasmid-DNS transformiert.

Aus den resultierenden, gegen Chloramphenicol resistenten Kolonien, wurden 10 Kolonien herausgenommen und auf ihre Abhängigkeit von Tryptophan untersucht. Das Ergebnis war, daß keine der Kolonien Tryptophan-Bedarf hatte, was das Vorhandensein der PRT-Gene oder des oben erwähnten rekombinanten Plasmids bestätigte.

(7) PRT Aktivität der transformierten Stämme

Die zu testenden Stämme wurden in 50 ml CMG-Kulturmedium gezüchtet, und die Zellen mittels Ultraschallbehandlung lysiert. Die Flüssigkeit wurde mittels 30 minütiger Zentrifugation bei 32000xg abgetrennt, und ein klarer flüssiger Überstand erhalten. Die PRT-Aktivität wurde unter Verwendung des klaren flüssigen Überstandes als rohe Enzympräparation und unter Verwendung einer Enzymreaktionspräparation, die 10 mM Tris-HCL (pH 7,8), 5 uM Anthranilsäure, 0,25 mM PRPP, 2 mM Magnesiumchlorid und 20% Glycerin enthielt, gemessen. Die Reaktion wurde bei 22ºC durchgeführt, und die PRT-Aktivität durch Messung der Abnahme der Anthranilsäure mit einem Fluorophotometer (Anregung bei 320 nm, Messung bei 395 nm) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4 Anthranilsäure-Phophoribosyl-Transferase-Aktivität

Anthanilsäure nmol/mg Protein/min

T-13 0,02

ATCC 13869 0,25

AJ 12029 4,25

Wie in Tabelle 4 gezeigt, war in T-13 Stämmen fast keine PRT- Aktivität zu beobachten, und es war klar, daß die T-13 Stämme das oben erwähnte Enzym nicht enthielten. Die Transformanten AJ 12029, die durch Einbringen des rekombinanten Plasmids, das die PRT-Gene enthält, in T-13 Stämme erhalten wurden, besaßen etwa 17 mal mehr PRT-Aktivität als der Wildtyp.

(8) Tryptophan-Produktivität der transformierten Stämme

Das die PRT-Gene enthaltende rekombinante Plasmid wurde aus dem oben erwähnten AJ 12029 durch das Verfahren (2) isoliert und in Brevibakterium lactofermentum Nr. 9232 mittels des in (4) erwähnten Transformationsverfahrens eingebracht. Die daraus hervorgehenden transformierten Stämme wurden unter Verwendung der Chloramphenicolresistenz als Marker selektiert.

Die so erhaltenen Stämme AJ 12020 (FERM-BP-276) und Nr. 9232 wurden gezüchtet, um ihre Tryptophan-Produktivität zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Für die Kultur wurde ein Kulturmedium verwendet, das 100 g Glucose, 40 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4;*7H&sub2;O, 10 mg FeSO&sub4;*7H&sub2;O, 10 mg MnSO&sub4;*4H&sub2;O, 1g "Casaminosäure", 300 Microgramm/l Biotin, 200 Microgramm/l Thiamin-HCI, 5 g Serin, 5 g Anthranilsäure und 50 g CaCO&sub3; in 1 l Wasser enthielt und einen pH von 7,0 aufwies. Jeder der Stämme wurde in 3 ml des oben angeführten, in einem Teströhrchen vorliegenden Kulturmediums eingeimpft und anschließend für 70 Stunden unter Schütteln bei 30ºC inkubiert. Das nach Züchten mittels Zentrifugation aus dem Überstand der Kulturflüssigkeit erhaltene L-Tryptophan wurde durch Flüssigkeitschromatographie bestimmt.

Tabelle 5

Menge an hergestellten Tryptophan L-Tryptophan

Nr. 9232 < 5 mg/dl

AJ 12020 76 mg/dl

Die oben erwähnte Nr. 9232 ist ein Revertant eines Mutanten von Brevibakterium lactofermentum ATCC 13869 und besitzt keine Tryptophansynthetase Nr. 9232 besitzt Tryptophan-Produktivität in einer Größenordnung von 5 mg/dl und weniger, während die Tryptophan-Produktivität von ATCC 13869 in dem oben erwähnten Kulturmedium nicht nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund wurde Nr. 9232 für dieses Experiment verwendet.

Um Nr. 9232 Stämme zu erhalten ist es möglich das zusammengesetzte Plasmid aus der Wirtszelle zu entfernen, ohne diese zu schädigen. Die Wirtszelle kann das Plasmid spontan verlieren und es kann ebenso durch ein "Heilungs"-Verfahren (Bact. Rev., 36, 361-405 (1972)) entfernt werden.

Ein Beispiel des Heilungsverfahrens ist wie folgt. Eine kleine Menge des Stamms, d. h. etwa 10&sup4; Zellen pro ml werden in ein Kulturmedium eingeimpft, das zur teilweisen Inhibierung des Wachstums des Wirts Acridinorange in einer Konzentration von 2- 50 mg/ml enthält, und der Stamm wird anschließend, nach unvollständiger Inhibierung des Wachstums des Wirts über Nacht bei 27-35ºC gezüchtet (J. Bacteriol., 88, 261 (1964)). Die Kulturflüssigkeit wird auf ein Agarkulturmedium aufgebracht und über Nacht bei 27-42ºC gezüchtet. Die meisten der auf dem Kulturmedium wachsenden Kolonien besitzen mit hoher Wahrscheinlichkeit kein Plasmid.

AJ 12037 wird durch Einbringen des Plasmids pAJ 1844 in ATCC 13869 mittels eines wie in (4) aufgeführten Transformationsverfahrens erhalten.

Das als Vektor in der vorliegenden Erfindung verwendete Plasmid pAJ 1844 ist in Escherichia coli AJ 11883 eingebracht (d. h. als FERM-P6519=FERM-BP137) im Fermentations Research Institut hinterlegt. Das Plasmid pAJ1844 kann nach folgendem Verfahren isoliert und gereinigt werden. AJ 11883 wird zuerst bis zum Ende der logarithmischen Phase des bakteriellen Wachstums gezüchtet, und das Lysat der Zellen anschließend, nach Lysieren der Zellen mit Lysozym und SDS, mittels Zentrifugation bei 30000xg abgetrennt, um einen klaren flüssigen Überstand zu erhalten, dem zur Ausfällung der DNS Polyethylenglycol zugesetzt wird. Nachfolgend wird die DNS durch eine Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugation mit Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid isoliert.


Anspruch[de]

1. Rekombinantes Plasmid, enthaltend das Anthranilsäure- Phosphoribosyltransferase-Gen von Brevibacterium lactofermentum, das die genetische Information für die Biosynthese von L-Tryptophan hat und aus Plasmiden erhältlich ist, die in B. lactofermentum FERM-BP-275 oder FERM-BP-276 vorhanden sind, insertiert in ein Vektorplasmid, das zur Selbstreplikation in Zellen von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien befähigt ist.

2. Rekombinantes Plasmid, hinterlegt in FERM-BP-275 oder 276.

3. Zur Produktion von L-Tryptophan befähigter Mikroorganismenstamm, erhältlich durch Einfügen des rekombinanten Plasmids nach Anspruch 1 oder 2 in einen Rezipienten, der den coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien, die gegen einen Tryptophan-Antagonisten resistent sind, angehört.

4. Mikroorganismenstamm nach Anspruch 3, wobei das rekombinante Plasmid in einen Rezipienten eingefügt ist, der eine Mutante von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien ist, die mindestens L-Tryptophan für ihr Wachstum benötigt.

5. Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan durch Züchten eines zur Bildung von L-Tryptophan befähigten Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Gewinnen des in dem Kulturmedium angereicherten L-Tryptophans, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 3 oder 4 verwendet wird.







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