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Dokumentenidentifikation DE3586705T2 11.03.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0175925
Titel Verfahren und Vorrichtung für eine optimale Trennung von einer unbekannten Probe mittels Flüssigkeitschromatographie.
Anmelder The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Conn., US
Erfinder Poile, Anthony F., Ridgefield Connecticut 06877, US;
Conlon, Ralph D., Wilton Connecticut 06897, US
Vertreter Grünecker, A., Dipl.-Ing.; Kinkeldey, H., Dipl.-Ing. Dr.-Ing.; Stockmair, W., Dipl.-Ing. Dr.-Ing. Ae.E. Cal Tech; Schumann, K., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Jakob, P., Dipl.-Ing.; Bezold, G., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Meister, W., Dipl.-Ing.; Hilgers, H., Dipl.-Ing.; Meyer-Plath, H., Dipl.-Ing. Dr.-Ing.; Ehnold, A., Dipl.-Ing.; Schuster, T., Dipl.-Phys.; Goldbach, K., Dipl.-Ing.Dr.-Ing.; Aufenanger, M., Dipl.-Ing.; Klitzsch, G., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 8000 München
DE-Aktenzeichen 3586705
Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, LI, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 21.08.1985
EP-Aktenzeichen 851105130
EP-Offenlegungsdatum 02.04.1986
EP date of grant 30.09.1992
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.03.1993
IPC-Hauptklasse G01N 30/34
IPC-Nebenklasse G01N 30/86   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Optimieren der Trennung einer unbekannten Probe durch Flüssigchromatographie gemäß dem Oberbegriff des Anspruches 1 bzw. 6. Die Absicht der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, mit deren Hilfe aus vielen Chromatogrammen jene schnell ausgewählt werden können, die für eine nachfolgende Analyse am aussagekräftigsten sind.

Ein Verfahren und eine Vorrichtung, wie es in dem Oberbegriff des Anspruches 1 oder 6 angegebenen ist, ist bereits bekannt aus US-A-4,468,331. Gemäß diesem Stand der Technik sind drei Hauptfaktoren, die zu der Auflösung in einer Chromatographiesäule beitragen, von Bedeutung, nämlich die Retention, das Trennvermögen und der Säulenwirkungsgrad. Diese genannten drei Faktoren sind durch eine Gleichung mit der Auflösung verknüpft. Gemäß dem genannten, bekannten Verfahren wird das Chromatogramm mit mehreren, unterschiedlich vermischten Lösungsmitteln aufgezeichnet und für jeden geprüften Standard in einem Durchgang mit unterschiedlichen Mischungen der genannten Lösungsmitteln kann die relative Retention berechnet werden, und aus der genannten relativen Retention kann ein sogenannter Trennfaktor zwischen irgendzwei Spitzen eines gemessenen Chromatogramms berechnet werden. Der unterste Wert des Trennfaktors begrenzt die Qualität der Chromatographie. Der genannte Wert wird deshalb der kritische Auflösungsfaktor benannt. Für jedes Chromatogramm wird deshalb der kritische Auflösungsfaktor gespeichert. Die genannten kritischen Auflösungsfaktoren fallen in einem endlichen Bereich und der genannte Bereich wird zwischen dem gemessenen maximalen und minimalen Auflösungsfaktor begrenzt. Den kritischen Auflösungswerten, die in einen gewissen Teil dieses genannten kritischen Auflösungsbereiches fallen, werden besondere Zeichen zugeordnet und alle die genannten Zeichen werden in einer Koordinatendarstellung wiedergegeben.

Auf dem weiten Gebiet analytischer Instrumente sind Chromatographen verwendet worden, die Konzentration der Bestandteile komplexer Mischungen zu trennen und zu messen. Bei der Flüssigchromatographie wird eine unbekannte Probe in eine Säule eingespritzt, in der sich eine aus einem oder mehreren flüssigen Lösungsmitteln bestehende Flüssigkeit befindet. Eine Erfassungseinrichtung an dem Säulenfuß erfaßt das Vorhandensein der Bestandteile, wie sie erscheinen oder von dem Boden der Säule eluieren. Eine als Chromatogramm bekannte graphische Aufzeichnung des Ausgangs der Erfassungseinrichtung als Funktion der Zeit wird von dem Chromatograph-Benutzer bei seiner Analyse der unbekannten Probe verwendet.

Beispielsweise mag es erwünscht sein, die Konzentration einer gegebenen Medikation in dem Blutstrom eines Patienten zu kennen. Ein bekanntes Blutvolumen würde in eine Chromatographiesäule eingegeben und die Bestandteile, die den Medikamentanteil einschließen, würden dann abgetrennt und erfaßt. Das Chromatogramm würde die Konzentration von jedem Bestandteil anzeigen. Wenn bekannt ist, wann sich das Medikament sich abtrennen sollte, kann die therapeutische Medikamentmenge der Medikation bestimmt werden. Daraus kann der Prozentanteil der Medikation in dem Blut berechnet werden.

Das obenbeschriebene Instrument und das Arbeitsverfahren sind sehr zweckmäßig, wenn die Bestandteile der Probe bekannt sind. Wenn jedoch die Probe unbekannt ist, ist es schwieriger das erzeugte Chromatogramm zu interpretieren. Zusätzlich hat die Forschung gezeigt, daß die Trennung von Unbekanntem in seine bildenden Teile in einem Flüssigchromatographen mit einer gegebenen Mehrfachlösungsmittelsäulenlösung nicht immer möglich ist. Als Ergebnis hiervon müssen die Forscher die Konzentration der Bestandteile der Säulenlösung ändern, und sie haben Säulenlösungen mit drei oder selbst vier unterschiedlichen Bestandteilen verwendet. Dies hat das Vermögen des Benutzers von Chromatographen erhöht, mehr Arten Unbekannter in ihre Bestandteile zu zerlegen, wenn eine geeignete Säulenlösung ausgewählt werden kann. Wenn jedoch eine ungeeignete Säulenlösung verwendet wird, können zwei oder mehrere Komponenten zusammen eluieren, wodurch ein Chromatogramm mit unzureichender Auflösung erzeugt wird. So verbleibt der Chromatograph mit der Schwierigkeit, in zufälliger Weise mit den Bestandteilen der Säulenlösung zu experimentieren und das Chromatogramm für jeden solchen Versuch zu bewerten, um zu bestimmen, welches das Beste ist.

Es ist die letztgenannte Aufgabe, die sehr schwierig ist. Typischerweise kann ein Chromatograph eine große Anzahl Versuche an einer unbekannten Probe durchführen, wobei jeder Versuch mit einer unterschiedlichen Lösungsmischung in der Säule durchgeführt wird. Der Chromatograph erzeugt für jeden Versuch ein Chromatogramm. Für eine typische Unbekannte kann der Chromatograph viele Versuche durchführen, bevor er einen Satz von Bedingungen entdeckt, der annehmbar, wenn auch nicht ideal, für diesen Zweck ist. Einige Chromatogramme werden ohne weiteres als unverwendbar ausgesondert, jedoch ist es sehr schwierig, die verbleibenden Chromatogramme dahingehend auszuwerten, welches das brauchbarste ist. Diese Aufgabe wird schwieriger, wenn die Anzahl von Versuchen zunimmt, die erforderlich sind, wenn drei oder vier Lösungsmittel in der Säule verwendet werden. Ohne System und Protokoll wird es äußerst unwahrscheinlich, daß eine optimale Trennung durch Versuch und Fehler erhalten wird.

Es ist deshalb die hauptsächliche Zielsetzung der vorliegenden Erfindung, einen Weg zu schaffen, um dem Chromatograph- Benutzer bei der Auswahl der Flüssigsäulenlösungsmittel zu unterstützen, die ein Chromatogramm mit guter Auflösung für eine gegebene, unbekannte Probe liefern, die in die Säule eingespritzt worden ist.

Es ist noch eine andere Zielsetzung der vorliegenden Erfindung, einen Weg zu schaffen, um den Chromatograph-Benutzer bei der Auswahl des besten Chromatogramms aus einer Mehrzahl von Chromatogrammen zur Verwendung oder weiteren Auswertung zu unterstützen.

Die obengenannten und andere Zielsetzungen der Erfindung werden mit einem Flüssigchromatographsystem, wie es in dem kennzeichnenden Teil des Anspruches 1 beansprucht ist, und dem Verfahren nach der Erfindung erreicht, wie es in dem kennzeichnenden Teil des Anspruches 6 beansprucht ist.

Das System schließt eine elektrisch gesteuerte Pumpe ein, die die Bestandteilmischung für eine Mehrzahl von flüssigen Lösungsmitteln steuert, die in der Flüssigchromatographsäule verwendet werden. Eine Probeneinspritzeinrichtung ist vorgesehen, um ein bekanntes Volumen einer Probenlösung in die Säule einzuspritzen und eine Erfassungseinrichtung wird verwendet, um die Bestandteile der unbekannten Probe zu erfassen, wenn sie von der Säule entmischt werden. Die Erfassungseinrichtung erzeugt ein Chromatogramm, das für die anschließende Betrachtung gespeichert wird. Dann wird die Säulenlösungsmittelmischung gemäß einem vorgegebenen Versuchszeitplan geändert und dann wird dieselbe unbekannte Probe automatisch in die Säule eingebracht. Eine bestimmte Anzahl Versuche wird mit unterschiedlichen Lösungsmittelmischungen in der Säule durchgeführt, und eine Probe des Unbekannten wird zu Beginn eines jeden Versuchs in die Säule eingebracht.

Sobald ein Versuch abgeschlossen ist, wird das Chromatogramm für diesen Versuch analysiert. Eine Bewertung wird jedem Chromatogramm in Abhängigkeit von der Spitzenauflösung gegeben, und wenn erforderlich, werden frühere Ergebnisse aktualisiert. Wenn alle die Versuche abgeschlossen sind, werden die Spitzenauflösungsbewertungen auf einem graphischen Farbschirm aufgetragen. Die Farbe an einem gewissen Punkt gibt dem Chromatograph-Benutzer das Auflösungsmaß der Probe für die Lösungsmittelanteile an, die an dieser Stelle in der Anzeige dargestellt sind.

Die vorgenannte und andere Zielsetzungen, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden weiter unten in Verbindung mit den Zeichnungen beschrieben, die einen Teil der Offenbarung darstellen, in denen:

Fig. 1 die Systemkomponenten der vorliegenden Erfindung zeigt.

Fig. 2 eine typische, Farbdreiecksanzeige darstellt, die die Ergebnisse vieler Versuche zeigt, wobei die Vorrichtung der Fig. 1 verwendet wurde.

Fig. 2A darstellt, wie eine Mehrzahl von Versuchen durchgeführt werden kann, um Bereiche festzustellen, wo andere Versuche durchgeführt werden sollten.

Fig. 3 und 4 Flußdiagramme sind, die die Art zeigen, in der die Systemelemente der Fig. 1 in einer zeitlichen Abfolge arbeiten, um eine Mehrzahl von Versuchen durchzuführen und eine sichtbare Anzeige der Ergebnisse von jedem Versuch zu erzeugen.

Fig. 5 darstellt, wie die Spitzenauflösungsmessung durchgeführt wird.

Beschreibung im Einzelnen

Fig. 1 stellt die Systemkomponenten der vorliegenden Erfindung dar. Das System schließt einen automatischen Probennehmer 10, der einen Perkin-Elmer ISS-100 oder ähnliches zum Entfernen von Proben aus Glasfläschchen umfaßt, die eine unbekannte Lösung enthalten. Dieser Probennehmer kann Proben aus einer Mehrzahl von Probenglasfläschchen entnehmen, und die Proben zum Einbringen in eine Chromatographiesäule bereitstellen. Die Säule selbst ist vor dem Erfassungsmodul 12 angeordnet, die bei der bevorzugten Ausgestaltung ein Perkin-Elmer Modell LC-95 oder ähnliches umfaßt. Bei jedem mit diesem System durchgeführten Versuch liefert der automatische Probennehmer 10 an die Säule und die Erfassungseinrichtung eine Probe der zu überprüfenden Lösung.

Das. System schließt ferner eine von einem Mikroprozessor gesteuerte Pumpe 14 ein, die bei der bevorzugten Ausführungsform eine Perkin-Elmer Serie 4 Pumpenanordnung umfaßt, die einen Säulenofen einschließt. Die von dem Mikroprozessor gesteuerte Pumpe 14 kann betrieben werden, um genau die Lösungsmittelmischung zu steuern, die sich in der Säule befindet und die zum Trennen der Bestandteile der in sie eingeführten Probe verwendet wird.

Das System der Fig. 1 schließt zusätzlich einen Computermodul 16 ein, der bei der bevorzugten Ausführungsform ein Perkin-Elmer Modell 7500 professioneller Computer oder ähnliches umfaßt. Der Computermodul 16 ist durch eine Datenschnittstelle (nicht gezeigt) mit dem automatischen Probennehmer 10, der Erfassungseinrichtung 12 und der von dem Mikroprozessor gesteuerten Pumpe 14 verbunden. Bei der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt diese Schnittstelle eine Perkin-Elmer Modell 316 Datenschnittstelle, die nur als eine Übertragungsanpassung zwischen dem Computermodul 16 und der Erfassungseinrichtung dient, die sich in der Pumpenanordnung 14 befindet.

Der Computermodul 16 kann aufgrund der in ihn eingegebenen Programme den Betrieb des automatischen Samplers 10, des Erfassungsmoduls 12 und der von dem Mikroprozessor gesteuerten Pumpe 14 überwachen. Es ist tatsächlich aufgrund der Überwachung, die durch den Computermodul 16 geliefert wird, daß die Bedienungsperson die Systemelemente steuern kann, um einen erwünschten Satz von Versuchen bei den unbekannten Proben in der Probenhalterung des automatischen Samplers 10 durchzuführen. Ferner liefert der Schirm 18 des Computermoduls 16 eine Einrichtung zum Anzeigen der Versuchsergebnisse, die an den Proben in dem automatischen Probennehmer 10 durchgeführt worden sind. Der Schirm 18 dient auch als eine Einrichtung, um den Systemzustand anzuzeigen.

Fig. 2 zeigt eine typische dreieckförmige Wiedergabe, die die Ergebnisse vieler Versuche zeigt, die die Vorrichtung der Fig. 1 verwendeten. Diese Wiedergabe würde typischerweise auf dem Schirm 18 des Computers 16 erscheinen und kann unmittelbar von dem Chromatograph-Benutzer in einer unten erläuterten Weise verwendet werden, um die besten Chromatogramme für die unbekannte Probe auszuwählen, die mit der Vorrichtung der Fig. 1 untersucht worden ist. Die besten Chromatogramme besitzen ein hohes Maß an Spitzenauflösung und deshalb sind diese Chromatogramme zweckmäßiger für den Chromatograph-Benutzer, um die Bestandteile der untersuchten Probe zu bestimmen.

Fig. 2 dient auch dazu, die Komplexität des Problems darzustellen, der die Chromatograph-Benutzer heutzutage gegenüberstehen, wenn Flüssigchromatographen mit Säulenlösungen mit Mehrfachkomponenten verwendet werden. Tatsächlich ist in der Vergangenheit vom Chromatograph-Benutzern darauf hingewiesen worden, daß es bei einer solchen experimentellen Umgebung einfach keinen festen Weg gibt, vorauszusagen, ob ein gegebener Versuch ein Chromatogramm mit aussagekräftigen Ergebnissen gibt. Demgemäß sind Chromatograph-Benutzer in der Vergangenheit gezwungen gewesen, eine Mehrzahl von Versuchen an einer gegebenen Probe durchzuführen, um anschließend die hierdurch erzeugten Chromatogramme auszuwerten, um zu bestimmen welches, wenn überhaupt eines, für den Chromatograph-Benutzer zur Bestimmung der Bestandteile der Probe nützlich ist. Die Schwierigkeit bei der Auswahl des besten Chromatogramms, wie man leicht einsieht, nimmt mit der Zunahme der Anzahl von Versuchen zu, die bei der Probe durchgeführt werden. Tatsächlich hatten die Erfinder selbst die Schwierigkeit, zu entscheiden, welche Chromatogramme in einem Umgebungsfeld nützlich sind, wo so viele wie 20 Versuche durchgeführt worden sind. Wo eine größere Anzahl Versuche durchgeführt worden ist, wird diese Schwierigkeit gravierender.

Die Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung jedoch kann eine Anzeige auf dem Schirm 18 erzeugen, wie es in Fig. 2 dargestellt ist. Diese Anzeige ist für Chromatograph-Benutzer äußerst nützlich, da sie Bereiche mit Chromatogrammen festlegt, in denen alle Komponenten vollständig aufgelöst worden sind, und demgemäß sind diese Chromtogramme von höchstem Nutzen für den Chromatograph-Benutzer. Die in Mol-%2 dargestellte Anzeige kann dem Chromatograph-Benutzer gewisse Hilfe aufgrund der Tatsache liefern, daß die schattierten Bereiche innerhalb der dreieckförmigen Fläche auf dem Schirm unterschiedliche Farben aufweisen. Die Farben wiederum stehen mit einem Qualitätswert in Beziehung, der in dem Schlüssel angegeben ist, der links von der Dreieckfläche angeordnet ist. Gemäß diesem Schlüssel besitzen diejenigen Flächen auf dem Schirm innerhalb der Dreiecksfläche, die rot sind, eine Spitzenauflösung, die zwischen 0,9 und 1,0 liegt, obgleich andere Bereiche wahlweise ausgewählt werden können. Demgemäß liefern Chromatogramme, die von Versuchen mit Lösungsmittelmischungen erzeugt worden sind, die innerhalb der roten Bereiche auftreten, die größte Auflösung und sind damit für den Chromatograph-Benutzer am nützlichsten.

Das innerhalb der dreieckförmigen Fläche der Fig. 2 gezeigte Muster wurde durch die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung entwickelt, indem eine Mehrzahl von Versuchen an einer gegebenen Probe durchgeführt worden sind, wobei das Lösungsmittel in der Säule aus Wasser, MEOH und THF bestand. Das für die Probe für jede Lösungsmischung in der Säule erzeugte Chromatogramm wurde einzeln numerisch analysiert, um seine Auflösung zu bestimmen. Dann wurde gemäß dem Auflösungsschlüssel der Fig. 2 der Bereich innerhalb der dreieckförmigen Fläche der Fig. 2 der der besonderen Lösungsmittelmischung entspricht, in Übereinstimmung mit dessen Auflösung gefärbt, wie es in dem Auflösungsschlüssel festgelegt ist. Demgemäß kann der Chromatograph sehr einfach die Chromatogramme aus wörtlich gesagt hunderten von Chromatogrammen auswählen, die eine hohe Auflösung zwischen den Spitzen des Chromatogramms für die untersuchte Probe liefern. Bei dem ausgewählten Beispiel muß der Chromatograph-Benutzer nur Chromatogramme für Versuche auswählen, die Lösungsmittelmischungen in Bereichen besitzen, die innerhalb der dreieckförmigen Fläche der Fig. 2 rot sind.

Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß die dreieckförmige Fläche, die in Fig. 2 dargestellt ist, durch die Ausführung von vielen hunderten Versuchen entwickelt worden ist, die, obgleich Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographietechniken verwendet worden sind, viel Zeit beansprucht. Um die Zeit zu verringern, die zum Auffinden von Lösungsmittelmischungen erforderlich ist, die eine gute Auflösung liefern, kann eine Vielzahl von Versuchen in einer Weise, wie es in Fig. 2A dargestellt ist, durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein Experiment bei einer Lösungsmittelmischung durchgeführt werden, die an dem Punkt 20 angegeben ist und beispielsweise ein Säulenlösungsmittel aus 10% Lösungsmittel A, 80% Lösungsmittel B und 10% Lösungsmittel C sein kann. Daraufhin wird eine Mehrzahl Versuche durchgeführt, bei denen der Prozentsatz des Lösungsmittel A bei 10% gehalten wird, während der Prozentsatz der Lösungsmittel B und C beispielsweise um etwa 10% geändert wird. Dann würde eine Mehrzahl Experimente durchgeführt werden, bei denen der Prozentsatz des Lösungsmittels A auf ungefähr 20% erhöht worden wäre. Ein solcher Versuch ist ungefähr der Punkt 22, bei dem das Lösungsmittel A ungefähr 20% ist, das Lösungsmittel B ungefähr 5% ist und das Lösungsmittel C ungefähr 75% ist. Die Versuche werden fortgesetzt, bis eine ausreichende Anzahl Versuche durchgeführt worden ist, so daß Punkte, die für die Versuchsbedingungen repräsentativ sind, im wesentlichen die Dreieckfläche der Fig. 2A füllen. Daraufhin werden die für jeden Versuch entwickelten Chromatogramme untersucht, um die dadurch erreichte Spitzenauflösung zu bestimmen. Dann werden in Übereinstimmung mit später in dieser Schrift angegebenen Techniken die Bereiche innerhalb der Dreiecksfläche der Fig. 2A mit Farben koloriert, die für die Auflösung repräsentativ sind, die während des Versuches erreicht wurde, der mit dem in der Mitte des kolorierten Bereiches dargestellten Lösungsmittel durchgeführt wurde. Auf diese Weise kann der Chromatograph-Benutzer grob Bereiche innerhalb der Dreiecksfläche der Fig. 2A bestimmen, die zu einer guten Auflösung für die Chromatogramme führen, ohne hunderte von Versuchen durchzuführen, die zum Liefern des Auflösungsmaßes notwendig sind, wie es in Fig. 2 dargestellt ist. Dann kann der Chromatograph-Benutzer die Vorrichtung der Fig. 1 einstellen, eine Mehrzahl von Versuchen in den einzelnen Bereichen innerhalb der Dreiecksfläche der Fig. 2A durchzuführen, die versprechend erscheinen, das heißt, an Stellen nahe jenen, die die beste Spitzenauflösung besitzen. Auf diese Weise wird die zum Erzeugen von Chromatogrammen mit guter Auflösung erforderliche Zeit gegenüber der verringert, die erforderlich ist, die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zu erzeugen. Auch wird die Zuverlässigkeit aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, stark gegenüber dem Verfahren "Treffen und Verfehlen" der manuellen Versuchsauswahl erhöht.

Es sollte auch bemerkt werden, daß die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in einer Weise arbeitet, die Ausgleichszeit (Stabilisierungszeit) zwischen Versuchen zu minimieren. Wenn der Chromatograph die maximale und minimale Lösungsmittelkonzentration und die Änderungsgröße von einem Versuch zu dem nächsten festlegt, muß die Vorrichtung dann bestimmen, welcher Versuch als erster durchzuführen ist. Es hat sich herausgestellt, daß die Gleichgewichtszeit minimiert wird, wenn die Versuchsfolge so aufgestellt wird, daß die Versuche mit den stärksten Lösungsmittelmischungen zuerst durchgeführt werden, denen die Versuche mit zunehmend schwächeren Lösungsmittelmischungen folgen.

Es wird nun auf die Fig. 3 Bezug genommen, in der ein Flußdiagramm gezeigt ist, das die Art darstellt, in der die Vorrichtung gemäß der Erfindung 1 arbeitet, um die Zielsetzungen der vorliegenden Erfindung zu erreichen. Wie es in dem Kasten 30 angegeben ist, wird der erste Verfahrensschritt gemäß der vorliegenden Erfindung von dem Chromatograph-Benutzer durchgeführt, der die Grenzen und die Schrittgröße für eine Vielzahl von durchzuführenden Versuchen festlegt, und die Festlegung dieser Bedingungen wird in den Computer 16 eingegeben. Sobald die Grenzen und die Schrittweite für die Versuche festgelegt worden sind, übernimmt der Computer 16 die Steuerung der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung und betätigt die durch den Mikroprozessor gesteuerte Pumpe 14, um die Säule mit der für den ersten Versuch erwünschten Lösungsmittelmischung ins Gleichgewicht zu bringen. Dann wird der automatische Probennehmer 10 angewiesen, eine Probe abzuziehen und sie in die Säule einzuführen, und die Erfassungseinrichtung 12 wird angewiesen die Eluierung der verschiedenen Bestandteile für die in die Säule eingespritzte Probe zu erfassen. Der Ausgang des Erfassungsmoduls 12 umfaßt ein Chromatogramm, das dann in dem Speicher des Computers 16 zusammen mit den Lösungsmittelmischungsdaten für dieses Chromatogramm gespeichert wird. Dieser Arbeitsabschnitt der Vorrichtung Fig. 1 ist durch die Beschreibung innerhalb des rechteckigen Blocks 32 des Flußdiagramms der Fig. 3 dargestellt.

Sobald ein besonderer Versuch beendet wird, untersucht der Computer 16, ob alle Versuche abgeschlossen worden sind. Diese Abfrage wird durch den rautenförmigen Kasten 34 der Fig. 3 dargestellt. Wenn der letzte Versuch nicht durchgeführt worden ist, spricht der Computer 16 den automatischen Probennehmer 10, den Erfassungsmodul 12 und die mikroprozessorgesteuerte Pumpe 14 an, um den nächsten Versuch in Übereinstimmung mit der neuen Lösungsmittelmischung durchzuführen, wie sie vorher durch den Chromatograph-Benutzer festgelegt worden war.

Dieses schrittweise Durchlaufen der Betriebsvorgänge bei dem ein Versuch durchgeführt wird, ein Chromatogramm erzeugt und aufgehoben wird und die Lösungsmittelmischung für dieses aufgehobene Chromatogramm identifiziert wird, wird fortgesetzt, bis alle Versuche durchgeführt worden sind. Dann bestimmt, wie es in dem rechteckförmigen Bereich 36 dargestellt ist, der Computer einen Qualitätswert für jeden durchgeführten Versuch. Die Art, wie der Qualitätswert bestimmt wird, wird in größerer Einzelheit unten in Verbindung mit der Fig. 4 beschrieben. Sobald alle Qualitätswerte für jedes gespeicherte Chromatogramm bestimmt worden sind, erzeugt der Computer 16 dann eine Anzeige des Qualitätswert der mit jedem durchgeführten Experiment verbunden ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird, wenn ein Säulenlösungsmittel aus drei unterschiedlichen Komponenten zusammengesetzt ist, eine dreieckförmige Fläche von der in Fig. 2 dargestellten Art erzeugt. Der Durchschnittsfachmann erkennt, daß die Grundgedanken der vorliegenden Erfindung ebenso auf Versuche mit vier Lösungsmitteln in der Säule zutreffen. Die Anzeige der Versuchsergebnisse mit vier Lösungsmitteln ist eine Pyramide, die nicht ohne weiteres auf dem Schirm angezeigt werden kann. Um die Versuchsergebnisse, die vier Lösungsmittel beinhalten, anzuzeigen, muß eine Mehrzahl von dreieckförmigen Flächen von der in Fig. 2 dargestellten Art entwickelt werden, wobei jede dreieckförmige Fläche einen festen Prozentsatz von einem Lösungsmittel aufweist und die übrigen Lösungsmittel werden in einer Weise bestimmt, die für den Flüssigchromatograph-Benutzer aus der dreieckförmigen Fläche selbstverständlich ist.

Die Weise, in der der Qualitätswert für jedes Chromatogramm bestimmt wird, ist in dem Flußdiagramm der Fig. 4 dargestellt. Das Flußdiagramm gibt in dem rechteckigen Kasten 40 an, daß der erste, durchzuführende Schritt darin besteht, die Spitzentrennmessung bei allen benachbarten Spitzen für das während eines Versuchs erzeugte Chromatogramm durchzuführen. Wenn die Spitzentrennmessung gemäß dem später in Verbindung mit Fig. 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt wird, umfaßt die Spitzentrennmessung einer Zahl, die von 0 beim Minimum bis zu einem Maximum von 1 reicht.

Sobald die Spitzentrennmessung bei allen benachbarten Spitzen für einen gegebenen Versuch durchgeführt worden ist, wird die kleinste Spitzentrennmessung für dieses besondere Chromatogramm (Auflösungswert) aufgehoben, wie es in dem rechteckigen Kasten 42 dargestellt ist.

Sobald die Spitzentrennmessung abgeschlossen worden ist, wird die Anzahl der Spitzen für dieses Chromatogramm gezählt, wie es in dem rechteckigen Bereich 44 dargestellt ist. Wenn dies erfolgte wird das Ergebnis des letzten Spitzenzählvorgangs mit denen aller vorhergehenden Vorgänge verglichen. Wenn, wie es durch den rautenförmigen Bereich 46 angegeben worden ist, die Anzahl der gezählten Spitzen in dem zuletzt analysierten Chromatogramm die Anzahl von Spitzen in irgendeinem vorhergehend untersuchten Chromatogramm übersteigt, dann wird die Spitzentrennmessung für alle vorhergehenden Chromatogramme auf 0 gesetzt, wie es in dem rechteckigen Kasten 48 angegeben ist, da zumindest ein Paar Spitzen eine Auflösung von 0 besitzt. Wenn die Anzahl der gezählten Spitzen beim Schritt 44 kleiner als die größte Anzahl der vorhergehenden Spitzen für ein gegebenes Chromatogramm ist, dann bewirkt der Entscheidungsvorgang, der in dem rautenförmigen Bereich 50 dargestellt ist, daß die Spitzentrennmessung für das letzte Experiment auf 0 gesetzt wird, wie es durch die rechteckförmige Fläche 52 dargestellt ist. Wenn die Entscheidung, die durch den rautenförmigen Block 50 dargestellt ist, jedoch zu keiner Antwort führt, ist keine Änderung bei der Spitzentrennmessung notwendig und das Verfahren muß dann nur bestimmen, ob alle Chromatogramme untersucht worden sind. Diese Aufgabe wird in dem rautenförmigen Bereich 54 durchgeführt. Wenn die Verarbeitung der Daten für alle Versuche nicht abgeschlossen ist, kehrt das Verfahren zurück, um die Spitzentrennmessung an allen benachbarten Spitzen für den nächsten Versuch durchzuführen, wie es durch den rechteckförmigen Kasten 40 dargestellt ist. Das obenbeschriebene Verfahren wird fortgesetzt, bis die Spitzentrennmessung für alle Versuche vorgenommen worden ist. Wenn dies auftritt, wird der rautenförmige Bereich 54 verlassen, und der verbleibende Schritt ist, die Qualitätswerte für alle Versuche anzuzeigen, wie es im Kasten 38 der Fig. 3 gefunden wurde.

Wie es in Fig. 2 dargestellt ist, werden die Qualitätswerte für gegebene Bereiche der Dreiecksflächen in Fig. 3 für Versuche bereitgestellt, die Spitzentrennmessungen im Bereich der bei dem Auflösungsschlüssel angegebenen Werte aufweisen. Der Chromatograph-Benutzer muß nur die Farbe des Bereiches kennen, der die beste zur Verfügung stehende Auflösung ergibt, um dadurch Chromatogramme auszuwählen, die für seine Untersuchung am nützlichsten sind.

Wie bereits erwähnt wurde, besitzt die Spitzentrennmessung, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einen Wert, der von 0 bis zu einem Maximum von 1 reicht. Die Spitzentrennmessung wird in einer Weise durchgeführt, wie sie in Fig. 5 dargestellt ist. Die Chromatogrammspur 40 für zwei benachbarte Spitzen wird in dem Computer 16 analysiert und der Boden des Tals zwischen zwei benachbarten Spitzen 62 wird festgestellt. Dann wird eine Linie 64 gezogen, die die Scheitelpunkte der zwei Spitzen der Chromatogrammspur 60 verbindet, so daß die Linie 64 mit Stellen der Spur 60 an jeder Spitze verbunden ist. Dann wird der senkrechte Abstand f zwischen dem Talpunkt 62 und der Linie 64 bestimmt. Zusätzlich wird auch der Abstand zwischen dem Schnittpunkt der senkrechten Linie f mit der Linie 64 oberhalb der Basislinie 66 (g) bestimmt. Die Spitzentrennmessung P wird dann durch die Formel P = f/g berechnet. Der Durchschnittsfachmann erkennt ohne weiteres, daß dieses Verfahren zur Bestimmung der Spitzentrennmessung Zahlen erzeugt, die zwischen einem Wert von 0 und 1 liegen. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß irgendeine andere Spitzentrennmessungsannäherung auch in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Andere Spitzentrennmessungstechniken jedoch sind nicht so nützlich, wenn die dadurch erzeugte Zahl nicht innerhalb von 0 und 1 liegt oder irgendeinem anderen endlichen Bereich, da es mit einem solchen Meßschema schwieriger ist, zu bestimmen, welches Chromatogramm in einer Mehrzahl von Chromatogrammen das beste ist.

Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß das Flußdiagramm der Fig. 3 die Bestimmung von Qualitätswerten für jedes Chromatogramm verlangt, nachdem alle Versuche durchgeführt worden sind. Jedoch könnte die Qualitätswertbestimmung für jedes Chromatogramm bei Beendigung des Versuchs und vor dem Beginn des nächsten Versuchs durchgeführt werden.

Die vorstehende Beschreibung wurde mit besonderer Unterstreichung der bevorzugten Ausführungsform gemacht. Jedoch ist es offensichtlich für den Durchschnittsfachmann, daß eine andere Ausrüstung zur Abänderung geeignet ist, um in derselben Weise zu arbeiten. Es ist auch klar, daß Abwandlungen in der Abfolge der Arbeitsvorgänge durchgeführt werden können.


Anspruch[de]

1. Eine Vorrichtung zum Optimieren der Trennung einer unbekannten Probe durch Flüssigchromatographie, wobei die Vorrichtung umfaßt:

eine Einrichtung zum Ansetzen einer Vielzahl von Flüssigchromatographieversuchen, wobei jeder Versuch mit einer unterschiedlichen Mischung aus der Vielzahl von Lösungsmitteln in einer Flüssigchromatographiesäule durchgeführt wird;

eine Einrichtung zum Einführen eines bekannten Volumens der unbekannten Probe in die Chromatographiesäule für jeden Versuch;

eine Einrichtung zum Erfassen der Komponenten der unbekannten Probe, wenn sie aus der Säule während jedes Versuches eluieren;

eine Einrichtung, die auf den Detektor reagiert, zum Erzeugen und Speichern eines Chromatogramms für jeden Versuch;

eine Einrichtung zum Bestimmen eines Auflösungswertes von jedem Chromatogramm,

wobei die Einrichtung zum Bestimmen eines Auflösungswertes eine Einrichtung zum Bestimmen eines Peak-Trennmaßes an je zwei benachbarten Peaks in jedem Chromatogramm enthalten, wobei das unterste Peak-Trennmaß den Auflösungswert bildet,

und wobei der Auflösungswert in einem begrenzten Bereich liegt;

eine Einrichtung, die der Einrichtung zum Bestimmen eines Peak-Trennmaßes zugeordnet ist, zum Zuweisen eines Qualitätswertes zu jedem Auflösungsweft für jedes Chromatogramm, wobei der begrenzte Bereich in verschiedene Unterbereiche unterteilt ist, welchen jeweils ein Qualitätswert zugeordnet ist, und alle Auflösungswerte, die in den gleichen Unterbereich fallen, den gleichen Qualitätswert erhalten, und

eine Einrichtung zum gleichzeitigen Anzeigen des Qualitätswerts von jedem Chromatogramm für jeden Versuch, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Bestimmen eines Auflösungswertes die Länge einer ersten senkrechten Linie mißt, welche zwischen dem untersten Punkts des Tals zwischen zwei benachbarten Peaks und dem Schnittpunkt mit einer zweiten Linie, die die Spitzen der zwei benachbarten Peaks verbindet, gezogen ist, und die Länge einer zweiten senkrechten Linie mißt, welche von der Basislinie des Chromatogramms zu dem Schnittpunkt zwischen der ersten Linie und der zweiten Linie gezogen ist, wobei das Verhältnis der Länge der ersten senkrechten Linie geteilt durch die Länge der zweiten senkrechten Linie für jeweils zwei benachbarte Peaks berechnet wird, und der Auflösungswert jedes Chromatogramms das kleinste für jedes benachbarte Paar von Peaks in dem Chromatogramm berechnete Verhältnis ist.

2. Die Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Einrichtung zum Bestimmen eines Auflösungswertes einen Auflösungswert zwischen 0 und 1 erzeugt, wobei 0 keine Auflösung für wenigstens ein Paar von Peaks in dem Chromatogramm und 1 die vollständige Auflösung aller Peaks bedeutet.

3. Die Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Einrichtung zum Bestimmen eines Auflösungswertes einen Peakzähler enthält.

4. Die Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Einrichtung zum Bestimmen eines Auflösungswertes den Auflösungswert für jedes Chromatogramm mit weniger Peaks als irgendein anderes Chromatogramm für die Vielzahl der Versuche auf 0 setzt.

5. Die Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Anzeigeeinrichtung in der Lage ist, eine Vielzahl von Farben anzuzeigen, wobei jede Farbe einem Chromatogramm mit einer in einen gegebenen Bereich fallenden Auflösung entspricht.

6. Ein Verfahren zum Optimieren der Trennung einer unbekannten Probe durch Flüssigchromatographie, mit den Verfahrensschritten:

Ansetzen einer Vielzahl von Flüssigchromatographieversuchen, wobei in jedem Versuch ein bekanntes Volumen der unbekannten Probe in die Chromatographiesäule eingeführt wird und wobei jeder Versuch mit einer unterschiedlichen Mischung aus der Vielzahl von Lösungsmitteln in der Flüssigchromatographiesäule durchgeführt wird;

Erfassen der Komponenten der unbekannten Probe, wenn sie aus der Säule während jedes Versuches eluieren;

Bestimmen eines Auflösungswertes von jedem Chromatogramm, indem die Peak-Trennung von jeweils zwei benachbarten Peaks in jedem Chromatogramm gemessen wird, und indem der unterste Trennwert in jedem Chromatogramm den Auflösungswert bildet, und wobei der Auflösungswert in einem begrenzten Bereich liegt;

Unterteilen des begrenzten Bereichs in Unterbereiche, wobei ein Qualitätsweft jedem Unterbereich zugeordnet wird; und

gleichzeitiges Anzeigen des Qualitätswertes für jeden Versuch, wobei jeder Qualitätswert einem Chromatogramm mit einem Auflösungswert in einem bekannten Unterbereich entspricht, dadurch gekennzeichnet, daß der Auflösungswert bestimmt wird durch Messen der Länge einer ersten senkrechten Linie zwischen dem Tal zwischen zwei benachbarten Peaks jedes Chromatogramms und einer zweiten Linie, die zwischen den Spitzen von beiden benachbarten Peaks gezogen ist;

Messen der Länge einer zweiten senkrechten Linie zwischen dem Schnittpunkt der ersten Linie mit der zweiten Linie und der Basislinie von dem Chromatogramm, und

Bilden des Verhältnisses der Länge der ersten senkrechten Linie geteilt durch die Länge der zweiten senkrechten Linie für alle benachbarten Peaks und Speichern des kleinsten Verhältnisses für alle die benachbarten Peaks für jedes Chromatogramm als den Auflösungswert.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Auflösungswert für irgendeinen Versuch in den Bereich zwischen 0 und 1 fällt, wobei eine 0 keine Auflösung für wenigstens ein Paar von Peaks in dem Chromatogramm und 1 die vollständige Auflösung aller Peaks bedeutet.

8. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Mischung aus einer Vielzahl von Lösungsmitteln wenigstens drei Lösungsmittel umfaßt.

9. Das Verfahren nach Anspruch 6, mit den Verfahrensschritten:

Zählen der Anzahl von Peaks in jedem Chromatogramm;

Setzen jedes vorher berechneten Auflösungswertes auf 0 für jedes Chromatogramm mit weniger Peaks als bei der zuletzt berechneten Auflösung, und

Setzen des zuletzt berechneten Auflösungswertes auf 0, wenn weniger Peaks als auf irgendeinem vorher analysierten Chromatogrammen vorliegen.

10. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Versuche in einer Reihenfolge ausgeführt werden, um die für das System benötigte Zeit, um zwischen den Versuchen zu einem Gleichgewicht zu gelangen, zu minimieren.

11. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Versuche in einer Folge ausgeführt werden, wobei die verwendete Lösungsmittelmischung von einem Versuch zum nächsten fortschreitend schwächer wird.

12. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Qualitätswerte in unterschiedlichen Farben angezeigt werden, wobei jede Farbe einem Chromatogramm mit einem Auflösungswert, der in den gegebenen Unterbereich fällt, entspricht, wodurch die Lösungsmittelmischung leicht für jeden angezeigten Qualitätswert bestimmt werden kann.







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