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Dokumentenidentifikation DE3780809T2 11.03.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0288554
Titel TRENNVERFAHREN FÜR LAB-KOMPONENTEN.
Anmelder Sanofi Bio-Industries, Inc., Trevose, Pa., US
Erfinder BIRSCHBACH, Peter, Waukesha, WI 53186, US
Vertreter Beetz, R., Dipl.-Ing. Dr.-Ing.; Timpe, W., Dr.-Ing.; Siegfried, J., Dipl.-Ing.; Schmitt-Fumian, W., Prof. Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte, 8000 München
DE-Aktenzeichen 3780809
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 30.09.1987
EP-Aktenzeichen 879078491
WO-Anmeldetag 30.09.1987
PCT-Aktenzeichen US8702507
WO-Veröffentlichungsnummer 8802220
WO-Veröffentlichungsdatum 07.04.1988
EP-Offenlegungsdatum 02.11.1988
EP date of grant 29.07.1992
Veröffentlichungstag der Übersetzung europäischer Ansprüche 13.07.1989
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.03.1993
IPC-Hauptklasse A23C 9/12
IPC-Nebenklasse A23C 19/02   C12N 9/64   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Abtrennen der Labbestandteile und insbesondere Verfahren zum Abtrennen von im wesentlichen reinem Chymosin aus Labextrakten minderer Qualität od. dgl. und zur Verwendung derselben zum Einstellen des Chymosingehalts von Milchgerinnungsenzym-hältigen Materialien auf eine vorbestimmte Höhe.

Lab, das von Tiergewebe, wie aus dem vierten Magen (Labmagen) von Rindern, stammt, beinhaltet zwei Milchgerinnungsenzyme, Chymosin und Rinderpepsin. Die relative Konzentration dieser beiden Enzyme variiert stark und hängt hauptsächlich vom Alter des Tiers zur Zeit der Schlachtung und/oder seiner Fütterung ab. Beispielsweise besteht Lab, das von jungen, noch nicht entwöhnten Kälbern mit einem Alter von weniger als 60 Tagen stammt, typischerweise hauptsächlich aus Chymosin, während das von einem erwachsenen Tier stammende hauptsächlich aus Rinderpepsin besteht.

Bei Verwendung zur Herstellung von Käse ergeben Labe mit einem hohen Chymosingehalt im allgemeinen größere Ausbeuten und bessere Geschmacks- und Strukturcharakteristika. Variationen im Chymosingehalt erfordern Änderungen der Menge des verwendeten Labs, um dieselbe Ausbeute und Käsequalität beizubehalten. Die Verfügbarkeit von Lab mit hohem Chymosingehalt wird immer beschränkter, da die Anzahl der geschlachteten Kälber zurückgeht.

Die Norm 110 : 1982 der International Dairy Federation (IDF) beschreibt ein chromatographisches Verfahren zur Bestimmung des Chymosin- und Rinderpepsingehalts in Labextrakten. Chymosin und Pepsin werden zuerst auf ein Diethylaminoethyl (DEAE)-Cellulose- Harz aufgetragen. Danach werden Natriumchloridlösungen unterschiedlicher Konzentrationen der Reihe nach durch die Säule geleitet, um eine erste, Chymosin enthaltende Fraktion und eine zweite, Pepsin enthaltende Fraktion zu erhalten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Abtrennung von Chymosin aus einer die Milchgerinnungsenzyme Chymosin und Pepsin enthaltenden Flüssigkeit, wie einem Labextrakt, mit welchem ein minimaler Verlusts der ursprünglichen Milchgerinnungsaktivität jedes Enzyms erhältlich ist.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, mittels welchem eine einen Chymosingehalt von 98% oder mehr enthaltende Fraktion aus Materialien mit relativ geringeren Mengen an Chymosin erhalten werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines säulenchromatographischen Verfahrens zur Abtrennung von Chymosin aus einer die Milchgerinnungsenzyme Chymosin und Pepsin enthaltenden Flüssigkeit, bei welchem die Säule nur periodisch zur Entfernung des gebundenen Enzyms eluiert werden muß.

Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Erhöhung des Chymosingehalts von Milchgerinnungsenzym-hältigen Materialien, die von Chymosin minderer Qualität enthaltendem Gewebe stammen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird Chymosin aus einer die Milchgerinnungsenzyme Chymosin und Pepsin enthaltenden Flüssigkeit, wie einem Labextrakt, durch In-Berührung-Bringen eines Pepsin selektiv bindenden Anionenaustauschermediums mit der Flüssigkeit abgetrennt. Chymosin wird aus der Flüssigkeit, die sich nach dem Kontakt mit dem Austauschermedium ergibt, gewonnen, und das Austauschermedium wird periodisch mit einer Lösung zur Entfernung von Pepsin in Berührung gebracht. Vor dem Trennungsschritt wird der Labextrakt od. dgl. auf einen pH-Wert von 3,8 bis 5,2, vorzugsweise 4,0 bis 5,0 und insbesondere 4,4 bis 4,6 und auf eine Leitfähigkeit von 2 · 10³ bis 19 · 10³, vorzugsweise 5 · 10³ bis 15 · 10³ und insbesondere 8 · 10³ bis 10 · 10³ uS (umho) eingestellt. Das Austauschermedium wird auf etwa denselben pH-Wert und dieselbe Leitfähigkeit äquilibriert. Da die Labextrakte üblicherweise wesentlich geringere Mengen an Pepsin als an Chymosin enthalten, können relativ große Mengen an Chymosin abgetrennt werden, bevor das gebundene Pepsin vom Austauschermedium entfernt werden muß.

Bei einer Ausführungsform wird das Austauschermedium, welches vorzugsweise ein DEAE-Celluloseharz ist, als Bett in eine Flüssigkeitschromatographiesäule gepackt, der Labextrakt od. dgl. wird durch das Austauschermediumbett geleitet, Chymosin wird aus der aus der Säule austretenden Flüssigkeit gewonnen, und ein Eluierungsmittel wird periodisch durch das Austauschermediumbett zur Entfernung des gebundenen Pepsins geleitet. Pepsin kann aus dem austretenden Eluat gewonnen werden.

Bei einer anderen Ausführungsform wird das Austauschermediumbett bewegt oder gerührt, und der Labextrakt wird chargenweise zugegeben.

Der Chymosingehalt von Labextrakten, die von Mägen geringer Qualität stammen, kann durch Zugabe einer geeigneten Menge des gewonnenen Chymosins auf eine vorbestimmte Höher erhöht werden.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Das Ausgangsmaterial ist eine die Milchgerinnungsenzyme Chymosin und Pepsin enthaltende Flüssigkeit. Diese beiden Milchgerinnungsenzyme können aus einer Anzahl verschiedener bekannter Quellen, einschließlich Lab, welches aus Tiergewebe stammt oder in Produkten existiert, die aus Enzymmischungen bestehen, wie aus einer Mischung von Schweinepepsin, Rinderpepsin und Rinderchymosin, erhalten werden. Das Verfahren ist besonders wirksam für Labe, die aus dem vierten Magen (Labmagen) von Rindern stammen, und das Verfahren wird in Verbindung mit einem solchen Labextrakt beschrieben. Es kann auch bei einem Material, das Chymosin und Pepsine (kein Rinderpepsin) enthält, die bei den unten beschriebenen Bedingungen an ein Anionenaustauschermedium binden, verwendet werden.

Das Lab kann mittels jedes herkömmlichen Verfahrens aus Tiergewebe gewonnen werden. Um eine selektive Bindung von Rinderpepsin an das Austauschermedium zu erreichen, wird der flüssige Labextrakt zuerst auf einen pH-Wert von 3,8 bis 5,2 und eine Leitfähigkeit von 2 · 10³ bis 19 · 10³ uS (umho) eingestellt. Es besteht die Tendenz, daß weder Chymosin noch Rinderpepsin an ein Anionenaustauschermedium binden, wenn der pH-Wert des Labextrakts unter 3,8 liegt, und beide neigen dazu, an ein Anionenaustauschermedium zu binden, wenn der pH-Wert über 5,2 liegt. Vollständigere Trennungen des Chymosins von Rinderpepsin können bei einem pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 5,0 erhalten werden, und noch vollständigere Trennungen können gewöhnlich bei einem pH-Wert im Bereich von 4,4 bis 4,6 erhalten werden.

Wenn die Leitfähigkeit des Labextrakts unter 2 · 10³ uS (umho) liegt, neigen Rinderpepsin und andere gebundene Moleküle, wie Pigment, dazu, irreversibel an ein Anionenaustauschermedium gebunden zu werden. Wenn die Leitfähigkeit über 19 · 10³ uS (umho) liegt, besteht die Tendenz, daß weder Rinderpepsin noch Chymosin an ein Anionenaustauschermedium binden. Vollständigere Trennungen des Chymosin von Rinderpepsin können bei einer Leitfähigkeit im Bereich von 5 · 10³ bis 15 · 10³ erreicht werden, und noch vollständigere Trennungen können gewöhnlich bei einer Leitfähigkeit im Bereich von 8 · 10³ bis 10 · 10³ uS (umho) erzielt werden. Derzeit scheint es, daß der optimale pH- Wert und die optimale Leitfähigkeit 4,5 bzw. 9 · 10³ uS (umho) sind.

Der pH-Wert des Labextrakts kann durch Zugabe einer geeigneten Menge einer geeigneten nahrungsmittelsicheren Säure, wie verdünnter Schwefelsäure (wenn der ursprüngliche pH-Wert über der gewünschten Höhe liegt), oder einer geeigneten nahrungsmittelsicheren Base, wie Ammoniumhydroxid (wenn der pH- Wert unter der gewünschten Höhe liegt), eingestellt werden. Die Leitfähigkeit des Labextrakts, wie durch eine Leitfähigkeitsbrücke od. dgl. gemessen, kann durch Zugabe einer geeigneten Menge eines geeigneten nahrungsmittelsicheren Salzes, wie Natriumchlorid, (wenn die ursprüngliche Leitfähigkeit unter der gewünschten Höhe liegt), oder durch Verdünnen mit entionisiertem Wasser, (wenn die Leitfähigkeit über der gewünschten Höhe liegt), eingestellt werden.

Das Anionenaustauschermedium kann von jeder Art sein, die äquilibriert werden kann, um Rinderpepsin selektiv zu binden und danach das gebundene Rinderpepsin nach Berührung durch ein nahrungsmittelsicheres Eluierungsmittel freizusetzen. Geeignete Austauschermedien umfassen solche mit inerter, unlöslicher Matrix, wie Cellulose, acrylische Polymere u. dgl., und in die anionische funktionelle Gruppen, wie Amino-, Alkylamino-, Guanidino- und quaternäre Ammoniumgruppen, eingeführt worden sind. Die Matrix sollte eine Struktur aufweisen, die offen oder locker genug ist, daß sie nicht durch die Teilchem im Labextrakt verstopft wird und einen angemessenen Durchsatz gestattet, wenn sie in einer Flüssigkeitschromatographiesäule, wie unten beschrieben, verwendet wird.

Celluloseharze mit einer offenen, faserigen Matrix sind bevorzugt. Repräsentative geeignete Celluloseharze sind im U.S. Patent 3,573,277, welches durch Hinweis hierin miteinbezogen ist, geoffenbart. DEAE-Celluloseharze erwiesen sich als besonders wirksam.

Wenn ein DEAE-Celluloseharz als Austauschermedium verwendet wird, wird es vor Verwendung auf herkömmliche Weise vorbehandelt. Beispielsweise wird das Harz in 0,5 N Salzsäure 30 Minuten lang eingerührt, und der Überstand wird dekantiert. Das Harz wird dann mit entionisiertem Wasser gespült, bis der Überstand einen pH-Wert von 4,0 hat. Das Harz wird dann 30 Minuten lang in 0,5 N Natriumhydroxid gerührt und der Überstand wird dekantiert. Das Harz wird dann mit entionisiertem Wasser gespült, bis der Über stand einen pH-Wert von 8,0 hat.

Das vorbehandelte Austauschermedium wird auf einen pH-Wert und eine Leitfähigkeit im obigen Bereich äquilibriert, so daß Rinderpepsin selektiv vom Austauschermedium angezogen wird. Das Äquilibrieren kann durch Waschen des Austauschermediums mit einer Pufferlösung mit dem gewünschten pH-Wert und der gewünschten Leitfähigkeit erfolgen. Beispielsweise kann eine typische Äquilibrierlösung aus einer wässerigen Lösung, die 0,5% (Gew./Vol.) Natriumbenzoat und eine ausreichende Menge an Natriumchlorid enthält, um eine Leitfähigkeit von 9 · 10³ uS zu ergeben, und zu welcher verdünnte Schwefelsäure zugegeben wird, um den pH-Wert auf 4,5 einzustellen, bestehen. Es wird weiter äquilibriert, bis der dekantierte Überstand den gewünschten pH- Wert und die gewünschte Leitfähigkeit hat.

Das vorbehandelte und äquilibrierte Austauschermedium kann in eine herkömmliche Chromatographiesäule, die einen porösen Träger, wie ein Sieb, für ein Bett des Austauschermediums und ein Ventil zur Steuerung eines kontinuierlichen Labextraktflusses durch die Säule umfaßt.

Der eingestellte Labextrakt wird in die Säule eingeleitet, durchläuft das statische Harzbett, und der Strom der austretenden chymosinhältigen Flüssigkeit wird mit dem Steuerventil eingestellt, um einen ausreichender Kontakt zwischen dem Labextrakt und dem Harz zu ermöglichen, so daß das Rinderpepsin an das Harz bindet. Diese Zeit kann durch Analysieren des Eluats auf herkömmliche Weise auf Chymosin und Rinderpepsin bestimmt werden. Wenn die Menge des in die Säule eingeleiteten Extrakts oder die Geschwindigkeit, mit welcher er das Harzbett durchläuft, zu groß ist, bindet ein Teil des Rinderpepsins nicht an das Harz (d. h., es liegt eine unvollständige Trennung zwischen Rinderpepsin und Chymosin vor), was sich im Vorhandensein größerer Mengen von Rinderpepsin im Eluat niederschlägt.

Das Volumen und die Geschwindigkeit, mit welcher der Labextrakt in die Säule eingeleitet werden, können durch Routineversuche bestimmt werden und hängen vom Volumen des Anionenaustauschermediums in der Säule, der Enzymbindekapazität des speziellen verwendeten Austauschermediums, der Konzentration des Rinderpepsins im Labextrakt und der Konzentration jener Verunreinigungen im Labextrakt, die kein Enzym sind (z. B. Pigment), die an das Austauschermedium gebunden werden, ab. Für Anwendungsbereiche, in welchen eine geringere als eine im wesentlichen vollständige Abtrennung von Chymosin annehmbar ist, kann die Fließgeschwindigkeit des Labextrakts durch die Säule erhöht werden. Dies verringert die Kontaktzeit und ergibt eine weniger vollständige Trennung.

Eine solche Vorgangsweise mit einem statischen Bett kann bei Verwendung mit einigen Rohlabextrakten Nachteile haben. Es kann schwierig sein, eine akzeptable Fließgeschwindigkeit durch die Säule beizubehalten, insbesondere bei Verwendung eines viskosen Extrakts. Die obere Schicht des Austauschermediums kann mit unlöslichen Materialien, wie Fetten, Mucinen usw. gesättigt werden, was eine Verringerung der Fließgeschwindigkeit bewirkt. Es kann eine Kanalisierung des Austauschermediums eintreten, was dazu führt, daß der Kontakt zwischen dem Austauschermedium und den Enzymen verringert und weniger Rinderpepsin gebunden wird.

Diese Nachteile können durch Verwendung einer Säule mit einem gerührten Bett auf ein Minimum reduziert werden. Eine solche Säule ist ähnlich einer Säule mit statischem Bett, außer daß das Austauschermediumbett bewegt oder gerührt wird, der Extrakt chargenweise zugegeben wird und für dasselbe Volumen an Austauschermedium der innere Durchmesser der Säule üblicherweise etwas größer ist.

Wenn eine Chromatographiesäule mit gerührtem Bett verwendet wird, wird das vorbehandelte und äquilibrierte Austauschermedium in eine Säule mit einem porösen Träger und einem geeigneten Rührer, wie einem Rührer vom Paddeltyp mit Luftantrieb, eingeleitet. Ein Volumen an eingestelltem Labextrakt wird in die Säule eingeleitet, und die Extrakt-Austauschermedium-Mischung wird lang genug gerührt, um einen innigen Kontakt zwischen diesen zu bewirken und Rinderpepsin an das Austauschermedium zu binden. Die für gute Trennungen benötigte Kontaktzeit ist üblicherweise für eine Säule mit gerührtem Bett kürzer als für eine Säule mit statischem Bett. Nach der erwünschten Kontaktzeit wird das Rühren eingestellt, die flüssige Phase entweder von der Säule abfließen gelassen oder dekantiert, und ein weiteres Volumen Labextrakt wird in die Säule eingeleitet. Dieser Zyklus kann wiederholt werden, bis die Bindekapazität des Austauschermediums erschöpft ist oder das gesamte Labextraktvolumen in die Säule eingeleitet worden ist.

Im wesentlichen reines Chymosin kann aus dem Eluat oder dem flüssigen Extrakt aus der Säule mittels einer geeigneten Reinigungstechnik gewonnen werden. Beispielsweise kann das Eluat auf einen pH-Wert von etwa 5,6 eingestellt werden und dann in eine Chromatographiesäule eingeleitet werden, in welcher Chymosin an das Austauschermedium gebunden und danach mit einem geeigneten, nahrungsmittelsicheren Eluierungsmittel entfernt wird.

Dieses Chymosin kann zu Labextrakten zugesetzt werden, um den Chymosingehalt auf eine vorbestimmte Höhe zu steigern. So können Labextrakte minderer Qualität qualitativ verbessert werden, und der Chymosingehalt von Labextrakten mit hoher oder geringer Qualität kann auf einen Standardwert eingestellt werden, wodurch Qualitätsschwankungen in Käseerzeugungsverfahren eliminiert werden. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um Chymosin aus Labextrakten, die nur etwa 15% Chymosin (bezogen auf die gesamte Milchgerinnungsaktivität) und bis zu etwa 85% enthalten, abzutrennen und dann Extrakten zuzusetzen, die denselben Bereich an Chymosinkonzentrationen aufweisen, um den Chymosingehalt auf eine gewünschte Höhe anzuheben.

Vorzugsweise wird das Harzbett periodisch gespült, um ungebundene Fremdstoffe zu entfernen. Das Harzbett wird vorzugsweise während des Spülzyklus bewegt, um das Entfernen solcher Fremdstoffe zu verbessern. Das Eluat aus dem Spülzyklus wird vorzugsweise in einem separaten Behälter gesammelt.

Ein Eluierungsmittel wird periodisch in die Säule eingeleitet, um das gebundene Rinderpepsin aus dem Harz zu entfernen, und das Eluat wird in einem separaten Behälter gesammelt. Der Durchfluß des Eluierungsmittels durch das Harzbett wird fortgesetzt, bis eine geringe oder keine Milchgerinnungsaktivität im Eluat nachgewiesen wird. Rinderpepsin kann durch Ultrafiltration, umgekehrte Osmose oder andere geeignete Konzentrationstechniken aus dem Eluat konzentriert werden.

Die Elutionslösung hat vorzugsweise eine wässerige Basis und enthält ein nahrungsmittelsicheres wasserlösliches Salz mit annehmbaren Dissoziationscharakteristika. Zweckmäßige Salze umfassen Natriumchlorid, Natriumphosphat und Natriumacetat. Ein besonders wirksames Eluierungsmittel für DEAE-Celluloseharze ist eine 10% Natriumchloridlösung, die auf einen pH-Wert von etwa 4,4 bis etwa 4,6 eingestellt ist. Die Elution sollte durchgeführt werden, bevor das Harz mit Rinderpepsin bis zu jenem Punkt beladen ist, an welchem es nicht mehr fähig ist, Rinderpepsin zu binden.

Nach der Elution kann das Harzbett wie oben beschrieben äquilibriert werden, um für den nächsten Trennzyklus bereitgemacht zu werden.

Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung präsentiert und sollten nicht als Einschränkungen derselben ausgelegt werden. In den Beispielen wurden die Enzymzusammensetzungen mittels des in Collin et al., "A Determination of Chymosin and Bovine Pepsin A in Commercial Rennets and Pepsin", Milchwissenschaft 36(1) 1981, beschriebenen Verfahrens bestimmt.

BEISPIEL 1

Ein aus dem vierten Magen von Kalbfleisch-Kälbern erhaltener Labextrakt wurde auf einen pH-wert von 4,5 und eine Leitfähigkeit von 7,8 · 10³ uS (umho) eingestellt und auf Milchgerinnungsaktivität und Enzymzusammensetzung untersucht. 100 g DEAE-Celluloseharz wurden gemäß dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren vorbehandelt und dann mit einer 0,5% (Gew./Vol.) Natriumbenzoat enthaltenden Lösung, zu welcher Natriumchlorid zugegeben wurde, um die Leitfähigkeit auf 8,0 · 10³ uS (umho) einzustellen, und verdünnte Schwefelsäure zugegeben wurde, um dem pH-Wert auf 4,5 einzustellen, äquilibriert.

Das äquilibrierte Harz wurde in eine Glas-Chromatographiesäule mit einem porösen Bett-Träger und einem Absperrhahn zum Regulieren des Ausflusses gepackt. Der eingestellte Labextrakt wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 10 ml/min in die Säule eingeleitet, und das Eluat wurde gesammelt und auf seine Enzymzusammensetzung untersucht. Nachdem 1000 ml Labextrakt getrennt worden waren, wurde das Harz mit 200 ml der Äquilibrierlösung gespült. Das Spülmitteleluat wurde gesammelt und auf Milchgerinnungsaktivität untersucht.

Nach dieser Spülung wurde die Säule mit einer auf einen pH- Wert von 4,5 eingestellten 10% Natriumchloridlösung eluiert. Die Elution wurde fortgesetzt, bis eine Milchgerinnungsaktivität von weniger als 1,0 E/ml im Elutionseluat nachgewiesen wurde. Das Elutionseluat wurde gesammelt und auf Milchgerinnungsaktivität und Enzymzusammensetzung untersucht.

Die Ergebnisse aus diesem Test sind in Tabelle I zusammengefaßt.

TABELLE I UNTERSUCHUNG VON LAB UND ELUATEN
Milchgerinnungsaktivität, Einh. Enzymzusammensetzung, akt. (1) Chymosin Pepsin (2) Labextrakt Trennungseluat Spüleluat Elutionseluat Anmerkungen: (1) Prozent der gesamten Milchgerinnungsaktivität (2) Rinderpepsin

BEISPIEL 2

Ein aus dem vierten Magen von Kalbfleisch-Kälbern erhaltener Labextrakt wurde auf einen pH-Wert von 4,5 und eine Leitfähigkeit von 9,0 · 10³ uS (umho) eingestellt und auf Milchgerinnungsaktivität und Enzymzusammensetzung untersucht. 200 kg DEAE-Celluloseharz wurden gemäß dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren vorbehandelt und dann mit einer Natriumbenzoat enthaltenden Lösung, zu welcher Natriumchlorid zugegeben wurde, um die Leitfähigkeit auf 9,0 · 10³ uS (umho) einzustellen, und verdünnte Schwefelsäure zugegeben wurde, um dem pH-Wert auf 4,5 einzustellen, äquilibriert.

Das äquilibrierte Harz wurde in eine Glasfaser-Chromatographiesäule mit einem Innendurchmesser von 122 cm und einer Höhe von 183 cm, die einen motorbetriebenen Rührer, einen porösen Harzbett-Träger und ein Steuerventil aufwies, gepackt. Das eingestellte Lab wurde in die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 25 l/m eingeleitet, und das Eluat wurde gesammelt. Nachdem 23.000 l des Labextrakts durch die Säule durchgeleitet worden waren, wurden etwa 1900 l der Equilibrierlösung bei eingeschaltetem Rührer in die Säule eingeleitet, um das Harz zu waschen. Die Einleitung des Labextrakts wurde nach Beendigung dieses Waschzyklus fortgesetzt. Nach weiteren 19.300 l eingeleitetem Labextrakt wurde ein zweiter Waschzyklus vorgenommen, und ein dritter Waschzyklus wurde nach Einleitung von weiteren 19.840 l des Extrakts durchgeführt. Das Wascheluat wurde gesammelt und mit dem Trennungseluat vereinigt. Diese vereinigten Eluate wurden auf Milchgerinnungsaktivität und Enzymzusammensetzung untersucht.

Nach Beendigung des dritten Waschzyklus wurde die Säule mit einer 10% Natriumchloridlösung, die auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt war, eluiert. Die Elution wurde fortgesetzt, bis eine Milchgerinnungsaktivität von weniger als 1,0 E/ml im Elutionseluat nachgewiesen wurde, und das Elutionseluat wurde auf Milchgerinnungsaktivität und Enzymzusammensetzung untersucht.

Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle II zusammengefaßt.

TABELLE II UNTERSUCHUNG VON LAB UND ELUATEN
Milchgerinnungsaktivität, Einh. Enzymzusammensetzung, akt. (1) Chymosin Pepsin (2) Lab Trennungs- und Wascheluat Elutionseluat Anmerkungen: (1) Prozent der gesamten Milchgerinnungsaktivität (2) Rinderpepsin

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine im wesentlichen nur Chymosin und eine vernachlässigbare Menge Rinderpepsin enthaltende Fraktion aus einem Labextrakt bei geringem oder keinem Verlust der Milchgerinnungsaktivität erhalten werden kann.

BEISPIEL 3

Es wurden zwei Testserien durchgeführt, um die Wirksamkeit der Trennung zwischen Chymosin und Rinderpepsin in einem Labextrakt mit Variationen des pH-Werts und der Leitfähigkeit eines äquilibrierten Harzes und einem eingestellten Labextrakt zu bestimmen. In einer Serie wurde die Leitfähigkeit auf 9 · 10³ uS (umho) gehalten und der pH-Wert variiert, und in der anderen Serie wurde der pH-Wert auf 4,5 gehalten und die Leitfähigkeit variiert.

Für jeden Test wurden 25 g eines DEAE-Celluloseharzes gemäß dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren vorbehandelt und dann auf den gewünschten pH-Wert und die gewünschte Leitfähigkeit äquilibriert. Das äquilibrierte Harz wurde in eine Glas-Chromatographiesäule mit einem porösen Bett-Träger und einem Absperrhahn zum Regulieren des Durchflusses gepackt. Ein aus dem vierten Magen von Kalbfleisch-Kälbern erhaltener Labextrakt wurde auf denselben pH-Wert und dieselbe Leitfähigkeit wie das äquilibrierte Harz eingestellt und auf Milchgerinnungsaktivität und Enzymzusammensetzung untersucht. 1000 ml des eingestellten Extrakts wurden in die Säule eingeleitet und mit einer Geschwindigkeit von etwa 4 ml/min durch das Harzbett durchfließen gelassen, und das Eluat wurde gesammelt. Die Säule wurde mit. 100 ml der zum Äquilibrieren des Harzes verwendete Lösung gespült, und das Spüleluat wurde gesammelt und mit dem Abtrennungseluat vereinigt.

Nach dieser Spülung wurde die Säule mit 250 ml einer 10% Natriumchloridlösung, die auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt worden war, eluiert, und das Elutionseluat wurde gesammelt. Die vereinigten Abtrennungs- und Spüleluate und das Elutionseluat wurden getrennt auf Milchgerinnungsaktivität und Enzymzusammensetzung untersucht, und die Volumen beider wurden gemessen.

Die Ergebnisse aus diesen Tests sind in Tabelle III zusammengefaßt. Aus den Testergebnissen ist ersichtlich, daß keine wesentliche Trennung zwischen Chymosin und Rinderpepsin bei einem pH-Wert von 3,7 erreicht wurde, während ein bedeutender Anstieg des Chymosingehalts in den Trenn- und Spüleluaten vorlag, wenn der pH-Wert auf 4,0 erhöht wurde. Bei einem pH-Wert von 5,3 gab es keine wesentliche Trennung zwischen Chymosin und Rinderpepsin, und beide banden an das Harz, während ein bedeutender Anstieg des Chymosingehalts der Trenn- und Spüleluate vorlag, als der pH-Wert auf 5,0 erhöht wurde. Bei einer Leitfähigkeit von 2 · 10³uS (umho) gab es einen Anstieg des Chymosingehalts im Trenn- und Spüleluat; die gesamte Enzymgewinnung betrug jedoch weniger als 60%, was anzeigt, daß eine bedeutende Menge des Enzyms irreversibel an das Harz gebunden war. Es gab keine wesentliche Trennung zwischen Chymosin und Rinderpepsin bei einer Leitfähigkeit von 20 · 10³ umho, während sehr gute Trennungen bei Leitfähigkeiten von 5 · 10³ und 15 · 10³ uS (umho) vorlagen.

TABELLE III ENZYMTRENNUNGEN MIT VARIATIONEN VON pH-WERT UND LEITFÄHGKEIT
Leitfäh. Vol., Enzymzusammens. (1) (1) C = Chymosin; P = Rinderpepsin (2) MCA = Milchgerinnungsaktivität (3) n. d. = nicht durchgeführt (4) 10 uS = 10³ umho


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Abtrennen von Chymosin aus einer die Milchgerinnungsenzyme Chymosin und Pepsin enthaltenden Flüssigkeit, mit den Schritten:

Einstellen der enzymhältigen Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 3,8 bis 5,2 und auf eine Leitfähigkeit von 2 · 10³ bis 19 · 10³ uS (umho);

Äquilibrieren eines Anionenaustauschermediums auf einen pH- Wert von 3,8 bis 5,2 und eine Leitfähigkeit von 2 · 10³ bis 19 · 10³ uS (umho);

In-Berührung-Bringen des äquilibrierten Austauschermediums mit der eingestellten enzymhältigen Flüssigkeit, um Pepsin an das Austauschermedium zu binden;

Gewinnung von in der sich nach dem Kontakt mit dem Austauschermediumbett ergebenden Flüssigkeit befindlichem Chymosin; und

periodischem In-Berührung-Bringen des Austauschermediums mit einer Lösung, um das gebundene Pepsin von diesem zu entfernen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Austauschermedium in eine Flüssigkeitschromatographiesäule gepackt wird;

die eingestellte, enzymhältige Flüssigkeit durch das Austauschermediumbett geleitet wird;

Chymosin aus der aus der Säule austretenden Flüssigkeit gewonnen wird; und

die Pepsin-entfernende Lösung ein durch das Austauschermediumbett geleitetes Eluierungsmittel ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bett im wesentlichen statisch ist und die eingestellte enzymhältige Flüssigkeit kontinuierlich durchfließen gelassen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei

eine Charge der eingestellten, enzymhältigen Flüssigkeit in die Säule eingebracht wird;

das Bett genügend lange bewegt wird, um das Austauschermedium mit dem Enzym innig in Berührung zu bringen und das Pepsin daran zu binden; und

ein flüssiger Extrakt, der Chymosin enthält, von der Säule entfernt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die enzymhältige Flüssigkeit ein Labextrakt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Labextrakt von Rinderlabmagen stammt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Austauschermedium Diethylaminoethylcelluloseharz ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die enzymhältige Flüssigkeit und das Austauschermedium auf einen pH-Wert von 4,0 bis 5,0 eingestellt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die enzymhältige Flüssigkeit und das Austauschermedium auf einen pH-Wert von 4,4 bis 4,6 eingestellt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die enzymhältige Flüssigkeit und das Austauschermedium auf eine Leitfähigkeit von 5 · 10³ bis 15 · 10³ uS (umho) eingestellt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die enzymhältige Flüssigkeit und das Austauschermedium auf eine Leitfähigkeit von etwa 8 · 10³ bis etwa 10 · 10³ uS (umho) eingestellt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 1, welches den Schritt des Spülens des Austauschermediumbetts mit einer Flüssigkeit einschließt, nachdem eine vorbestimmte Menge der enzymhältigen Flüssigkeit hindurchgeleitet worden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Spülflüssigkeit dieselbe ist, die zum Äquilibrieren des Austauschermediums verwendet wird.

14. Verfahren zur Erhöhung des Chymosingehalts eines Milchgerinnungsenzym-enthaltenden Materials, das von einem chymosinhältigen Gewebe geringer Qualität stammt, auf eine vorbestimmte Höhe, welches die Schritte der

Untersuchung des enzymhältigen Materials zur Bestimmung seines Chymosingehalts; und der

Zugabe einer ausreichenden Menge von gemäß dem Verfahren des Anspruchs 1 hergestelltem Chymosin zum enzymhältigen Material zur Erhöhung des Gesamtchymosingehalts auf die vorbestimmte Höhe aufweist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das enzymhältige Material ein Labextrakt ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Labextrakt von Rinderlabmagen stammt.







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