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Dokumentenidentifikation DE3586580T2 18.03.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0183272
Titel Zur wirksamen Gen-Expression fähiger Vektor und Verwendung desselben.
Anmelder Suntory Ltd., Osaka, JP
Erfinder Oshima, Takehiro, Takatsuki-shi Osaka, JP;
Tanaka, Shoji, Suita-shi Osaka, JP
Vertreter Eitle, W., Dipl.-Ing.; Hoffmann, K., Dipl.-Ing. Dr.rer.nat.; Lehn, W., Dipl.-Ing.; Füchsle, K., Dipl.-Ing.; Hansen, B., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Brauns, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Görg, K., Dipl.-Ing.; Kohlmann, K., Dipl.-Ing.; Ritter und Edler von Fischern, B., Dipl.-Ing.; Kolb, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte; Nette, A., Rechtsanw., 8000 München
DE-Aktenzeichen 3586580
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 29.11.1985
EP-Aktenzeichen 851151464
EP-Offenlegungsdatum 04.06.1986
EP date of grant 02.09.1992
Veröffentlichungstag im Patentblatt 18.03.1993
IPC-Hauptklasse C12N 15/71
IPC-Nebenklasse C12N 15/19   C12N 1/21   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft einen zur effizienten Genexpression befähigten Vektor, der bei der Protein- oder Polypeptidproduktion unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie einsetzbar ist, und die Verwendung eines solchen Vektors. Insbesondere betrifft die Erfindung einen zur effizienten Genexpression befähigten Vektor, worin eine Basensequenz, die eine Region mit der Transkriptionsabbruchfunktion enthält, unmittelbar stromabwärts an die Basensequenz gebunden ist, die den Translationsabbruch eines Strukturgens für das zu produzierende Protein oder Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids unter Verwendung eines solchen Vektors.

Es wurden viele Versuche unternommen, rekombinante DNA-Technologie bei der Herstellung von nützlichen Substanzen, insbesondere physiologisch aktiven Proteinen oder Polypeptiden, in Mikroorganismen, Tieren oder pflanzlichen Zellen einzusetzen, und die grundlegenden Verfahren zur Erreichung dieses Ziels sind im wesentlichen ausgearbeitet. Gleichzeitig wurden von vielen Forschern Versuche unternommen, die Produktion der erwünschten Substanzen zu optimieren. Verbesserungen und Modifikationen an Expressionsvektoren wurden in der Promotorregion zur Beschleunigung der Transkription, an der Ribosom-Bindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz) zur Sicherstellung einer effizienten Translation der mRNA, wie auch an der Basensequenz der Ribosom-Bindungsstelle und am Abstand zwischen der Ribosom-Bindungsstelle und dem Initiationscodon der Translation (ATG) unternommen. Alle diese Bemühungen sind auf das 5'-Ende der nicht-translationalen Region stromaufwärts des zu exprimierenden Strukturgens gerichtet, und wenige Untersuchungen sind am 3'-Ende der nicht-translationalen Region im Hinblick auf die Erzielung einer effizienten Expression eines exogenen Gens unternommen worden. Es ist bereits bekannt, daß in eukaryontischen Zellen die nicht-translationale Region stromabwärts (am 3'-Ende) des Abbruchcodons der Translation eines Strukturgens die Effizienz der Produktion eines exogenen Proteins oder Polypeptids verbessert (ungeprüfte veröffentliche japanische Patentanmeldungen Nr. 146281/1983 und 74986/1984). Es ist jedoch kein Fall bekannt, bei dem spezifische Untersuchungen am 3'-Ende der nicht-translationalen Region unternommen wurden, welche die Effizienz der Produktion eines exogenen Proteins oder Polypeptids unter Einsatz rekombinanter DNA-Technologie in prokaryontischen Zellen, wie E. coli, beeinflussen könnten.

Die Erfinder postulierten, daß nicht nur in eukaryontischen Wirtszellen, sondern auch in prokaryontischen Zellen, wie E. coli, das 3'-Ende der nicht-translationalen Region einen Effekt auf die Expression eines exogenen Gens, welches in einen Expressionsvektor eingebaut war, oder auf die Produktion eines exogenen Proteins oder Polypeptids ausüben würde. Als Ergebnis einer Reihe von Untersuchungen zur Bestätigung dieser Behauptung wurde gefunden, daß, falls eine Basensequenz, die eine Region mit dem E. coli TrpA-Terminator enthält, unmittelbar stromabwärts an eine Basensequenz gebunden ist, die den Abbruch der Translation des zu exprimierenden Strukturgens codiert, die Effizienz der Expression des gewünschten Strukturgens, und daher die Produktion des gewünschten Proteins oder Polypeptids in E. coli bedeutend verbessert werden kann. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen.

Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Produktion eines exogenen Polypeptides in E. coli unter Verwendung einer chemisch synthetisierten Basensequenz, die für das Polypeptid mit einer humanen gamma-Interferonaktivität (im folgenden als hIFN-gamma bezeichnet) als Strukturgen codiert, und unter Verwendung einer Basensequenz mit der TrpA- Transkriptionsabbruchfunktion in E. coli beschrieben,

Fig. 1 zeigt ein Schema des Einbaus eines chemisch synthetisierten TrpA-Terminators in den Plasmidvektor pIN5GIF54 unter Konstruktion des erfindungsgemäßen Plasmidvektors pIN5A2;

Fig. 2 zeigt ein Schema zur Konstruktion des Plasmidvektors pIN5T8, worin Apr als Drogenresistenzmarker durch Tcr im Plasmidvektor pIN5A2 aus Fig. 1 ersetzt wurde, wie auch das Schema zur Konstruktion des zu pIN5T8 äquivalenten Plasmidvektor pIN5T4 mit der Ausnahme, daß dieser frei von der TrpA-Terminatorregion ist;

Fig. 3 ist eine fotografische Darstellung der Coomassie blue gefärbten Proteinbanden aus einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einschließlich der Bande für GIF146, hergestellt durch Kulturen von E. coli W3110/pIN5T8 und W3110/pIN5T4, die durch Plasmidvektoren pIN5T8 und pIN5T4 entsprechend dem Schema in Fig. 2 transformiert wurden.

Fig. 4 zeigt ein Schema zur Konstruktion des Plasmidvektors pIN5T5 worin die Region des Apr-Gens im pBR322, die stromabwärts von der PstI- Schnittstelle liegt, unmittelbar stromabwärts an das Codon für den Terminationsabbruch des GIF146-Strukturgens auf dem pIN5GIF54 gebunden wurde, und das Konstruktionsschema für den Plasmidvektor pIN5T13, worin dieselbe Region des Apr stromabwärts an den TrpA-Terminator von pIN5A2 verknüpft wurde;

Fig. 5 zeigt das Konstruktionsschema für den Plasmidvektor pIN5T15, worin der TrpA-Terminator weit stromabwärts des Translationsabbruchcodons des GIF146-Strukturgens eingefügt wurde;

Fig. 6a ist eine Aufnahme des SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresemusters der durch Kultur von W3110 E. coli-Stämmen, die mit den Plasmidvektoren pIN5T5, pIN5T13 und pIN5T15 transformiert wurden, erhaltenen Produkte, und

Fig. 6b zeigt das durch Scannen des Gels der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese-Proteinbanden erhaltenen Diagramme;

Fig. 7 zeigt das Konstruktionsschema des Plasmidvektors pIN5T9, worin die Region des Apr-Gens auf dem pBR322, welche stromabwärts der BglI-Schnittstelle liegt, unmittelbar stromabwärts an das Codon des Terminationsabbruches des GIF146-Strukturgens auf dem pIN5GIF54 gebunden wurde, und das Konstruktionsschema des Plasmidvektors pIN5T11, wo dieselbe Region des Apr stromabwärts an den TrpA-Terminator auf pIN5A2 gebunden ist;

Fig. 8 zeigt ein Konstruktionsschema der Plasmidvektoren pIN5T5-131 und pIN5T13-131, worin die Anteile des GIF146-Strukturgens auf pIN5T5 und pIN5T13 durch Teile des GIF131-Strukturgens ersetzt wurden;

Fig. 9 zeigt ein Konstruktionsschema für die Plasmidvektoren pIN5T11-131 und pIN5T8-131, worin die Anteile des GIF146-Strukturgens auf pIN5T1 und pIN5T8 durch Anteile des GIF131-Strukturgens ersetzt wurden; und

Fig. 10a ist eine Aufnahme des SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresediagrammes der durch Kultur von W3110 E. coli-Stämmen, die mit Plasmidvektoren pIN5T5-131 und pIN5-T13-131 transformiert wurden, erhaltenen Produkte, und

Fig. 10b zeigt das durch Scannen des Gels der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese-Proteinbanden erhaltenen Diagramme mit einem nichttransformierten E. coli W3110 als Kontrolle in jeder Figur.

Die Erfinder konstruierten zuvor einen Expressionsvektor pIN5GIF54 für das chemisch synthetisierte Gen von hIFN-gamma, zusammengesetzt aus 146 Aminosäsuren (das Gen wird im folgenden als GIF146 abgekürzt) unter Verwendung eines verbesserten Promotors des Gens für ein E. coli-Hüllprotein (Lipoprotein) (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 132524/1983). Die Erfinder konstruierten ebenfalls einen Expressionsvektor pIN5GIF54-131 für das chemisch synthetisierte Gen des hIFN-gamma-Analogs, zusammengesetzt aus 131 Aminosäuren (das Gen wird im folgenden als GIF131 abgekürzt) unter Verwendung desselben verbesserten Promotors. Unter Einsatz dieser zwei Vektoren gelang den Erfindern die effiziente Produktion von GIF146 und GIF131 in E. coli (siehe japanische Patentanmeldungen Nr. 132524/1983 und 241457/1983). Auf Grundlage dieses Erfolges versuchten die Erfinder die Expressionsvektoren durch Modifikation der nicht-translationalen Region am 3'-Ende eines jeden synthetischen Gens zu verbessern.

Auf den folgenden Seiten wird die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors, der zur effizienten Expression des humanen IFN-gamma-Gens als nützlicher Substanz in der Lage ist, und die Verwendung eines solchen Vektors beschrieben. Es wird jedoch angenommen, daß das erfindungsgemäße Konzept auf die gleiche Weise auf die Konstruktion und Verwendung von Vektoren, die zur effizienten Expression anderer nützlicher Gene in der Lage sind, z. B. humanem IFN-alpha, humanem IFN-beta, alpha-Neoendorphin, Carcitonin, Wachstumshormonen, Interleukin 2 und einer Vielzahl von immunassoziierten Polypeptiden geeignet ist.

(1) Aminosäuresequenzen von GIF146 und GIF131 und die hierfür codierenden Basensequenzen:

Die Gene GIF146 und GIF131 haben die folgenden Aminosäuresequenzen.

Chemisch synthetisierte Gene, die diese Basensequenzen enthalten, codieren die oben dargelegten Aminosäuresequenzen und werden als SUN-GIF146 und SUN-GIF131 mit den folgenden Basensequenzen bezeichnet.

(2) Konstruktion eines verbesserten Expressionsvektors zur Verwendung bei der Herstellung von GIF146:

Plasmid pIN5A2 wurde nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren konstruiert. Dieses Plasmid war in einer solchen Weise aufgebaut, daß, wie in Fig. 1 gezeigt, eine Basensequenz mit der Transkriptionsabbruchfunktion des E. coli-TrpA-Gens (diese Basensequenz wird im folgenden als TrpA-Terminator bezeichnet) unmittelbar stromabwärts an das Codon TAA für den Translationsabbruch des GIF146 codierenden Gens (siehe SUN-GIF146) gebunden wurde, das auf dem bereits konstruierten, GIF146 produzierenden Plasmidvektor pIN5GIF54 vorhanden war (offenbart in der japanischen Patentanmeldung Nr. 132524/1983).

Es wurde berichtet, daß der TrpA-Terminator ein effizienter p-Faktor-unabhängiger Terminator ist (Christie, G.E. et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78, 4180, 1981). Ein DNA-Fragment dieses Terminators ist im Handel von Pharmacia Japan Co., Ltd., Tokyo erhältlich. Die Erfinder erhielten eine Probe dieses DNA-Fragmentes und fügten an den einen Terminus der Basensequenz ein versetztes SalI-Ende und an den anderen Terminus ein versetztes AvaI-Ende ein. Das erhaltene DNA-Fragment hatte die folgende Basensequenz:

versetztes SaII-Ende versetztes AvaI-Ende

Dieses Fragment wurde als TrpA-Terminator eingesetzt. Das Plasmid pIN5GIF54 war ein GIF146-produzierendes Plasmid mit einer Lipoproteinpromotorregion (lppP), die eine verbesserte Shine-Darfarno-Sequenz umfaßte; in diesem Plasmid war der Terminator des Tetracyclin-Resistenzgens (Tcr) stromabwärts vom Codon für den Translationsabbruch des GIF146- codierenden Gens vorhanden.

Die Erfinder schnitten pIN5GIF54 mit SalI und AvaI und fügten in die Schnittstelle den TrpA-Terminator mit versetzten SalI- und Aval- Termini an beiden Enden ein, wodurch das Plasmid pIN5A2 konstruiert wurde, wobei der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Translationsabbruchcodon gebunden war (siehe Fig. 1). Anschließend wurde E. coli W3110 nach Routineverfahren mit diesem Plasmid transformiert. Ein weiterer Stamm von E. coli W3110 wurde mit unmodifiziertem pIN5GIF54 transformiert. Die beiden Transformanten wurden in einem GC-Medium (3 % Glyzerin, 2 % Casaminosäuren, 0,2 % Hefeextrakt, 0,1 % MgSO&sub4;·7H&sub2;O und 0,5 % KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,5) bei 36ºC 24 Stunden kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Interferonaktivität und die Menge des gebildeten GIF146 bestimmt. Die Interferonaktivität wurde in bezug auf die antivirale Aktivität des durch Einfrieren und Auftauen kultivierter Zellen nach Lysozym- Behandlung erhaltenen Extraktes gemessen. Die Menge der GIF46-Produktion wurde nach dem folgenden Verfahren gemessen. Die Zellen wurden mit SDS unter Erhalt des Gesamtproteins hitzebehandelt, welches einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (im Folgenden als SDS-PAGE abgekürzt) unterworfen, mit Coomassie blue gefärbt und einem Scannen des Gels bei 550 nm zur Berechnung des Anteils der ca. 18 kd-Proteinbande des Gesamtproteins unterzogen, beim Stamm W3110, der keinen GIF146-Expressionsvektor trug, wurde die 18 kd-Proteinbande in einer Menge von ca. 3 % des Gesamtproteins beobachtet, und dieser Anteil der 18 kd-Bande wurde als Hintergrund genommen und bei der Berechnung der Menge von GIF146 relativ zum Gesamtproteingehalt nicht berücksichtigt.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, hatte E. coli W3110/pIN5A2, der mit dem Plasmid pIN5A2 mit dem TrpA-Terminator transformiert worden war, welcher unmittelbar stromabwärts vom Translationsabbruchcodon eingebaut war, eine antivirale Aktivität, die ca. zweimal so hoch war wie für E. coli W3110/pIN5GIF54, der durch unmodifizierten pIN5GIF54 transformiert war, und die vom ersteren Stamm produzierte Menge an GIF146 war ca. 1,7-fach so groß wie der Wert für den letzteren. Dies zeigt offenbar die vorteilhaften Effekte, die durch Insertion des TrpA-Terminators unmittelbar stromabwärts des Terminationscodons erzielt werden.

TABELLE 1 Vergleich der gamma-IFN-Produktivität
Stamm Antivirale Aktivität* % 18 kd-Protein GIF

*Einheit/ml Kultur

Plasmid pIN5T4, das keinen TrpA-Terminator enthielt, wurde aus pIN5GIF54 und pBR322 konstruiert. Gleichzeitig wurde Plasmid pIN5T8 mit dem TrpA-Terminator, der unmittelbar stromabwärts des Abbruchcodons der Translation des GIF146-Strukturgens eingebaut war, aus pIN5A2 (siehe Fig. 1) und pBR322 konstruiert. Die beiden Plasmide pIN5T4 und pIN5T8 unterschieden sich nur im Hinblick auf das Vorhandensein des TrpA-Terminators, und beide hatten Tetracyclin-Resistenz (Tcr) anstelle von Ampiliccil-Resistenz (Apr) als Drogenresistenzmarker auf dem Plasmid, wie in Fig. 1 gezeigt. Die beiden E. coli W3110-Stämme wurden entsprechend mit den beiden Plasmiden transformiert, und die antivirale Aktivität jeder Transformante und die Menge der GIF146-Produktion wurde nach den oben beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, aus der man sehen kann, daß mit pIN5T8 transformiertes E. coli W3110/pIN5T8 eine ca. 4-fach so hohe antivirale Aktivität, wie E. coli W3110/pIN5T4, welches mit dem TrpA-Terminator-freiem pIN5T4 transformiert wurde, zeigte, und die Menge an GIF, welche durch den ersten E. coli- Stamm hergestellt wurde, war ca. 3-fach so groß wie diejenige, die durch den letzteren Stamm erhalten wurde. Die Daten zeigen offenbar den vorteilhaften Effekt des Einfügens des TrpA-Terminators unmittelbar stromabwärts vom Translationsabbruchcodon.

TABELLE 2 Vergleich der gamma-IFN-Produktivität
Stamm Antivirale Aktivität* % 18 kd-Protein GIF

*Einheit/ml Kultur

Eine Aufnahme der Proteinbanden, erhalten durch SDS-PAGE und gefärbt mit Coomassie blue, ist in Fig. 3 gezeigt.

Die Erfinder setzten ihre Untersuchungen unter Verwendung von Plasmiden fort, deren Strukturen sich leicht von den obigen unterschied. Als Ergebnis wurden die vorteilhaften Effekte des Einfügens des TrpA-Terminators bestätigt, und gleichzeitig wurde demonstriert, daß Binden des TrpA- Terminators unmittelbar stromabwärts an das Codon für den Translationsabbruch des zu exprimierenden Strukturgens für die Erfindung wesentlich war. Es wurden drei Plasmide, wie unten gezeigt, konstruiert. Der erste war Plasmid pIN5T5, worin die Region des Ampicillin-Resistenzgens (Apr) auf dem pBR322, die stromabwärts der PstI-Schnittstelle lag (im Apr- Strukturgen) unmittelbar stromabwärts an das Translationsabbruchcodon des GIF146-Strukturgens gebunden wurde. Das zweite war das Plasmid pIN5T13, wo der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das selbe Abbruchcodon gebunden wurde und unmittelbar stromabwärts an den Terminator wurde die Region des Apo gebunden, die stromabwärts vor der PstI-Schnittstelle lag (siehe Fig. 4). Das dritte war das Plasmid pIN5T15, das nach dem in Fig. 5 gezeigten Verfahren konstruiert wurde, und worin die Region des Apr, welche stromabwärts der PstI-Schnittstelle lag, zwischen das Terminatorcodon des GIF146-Strukturgens und dem TrpA-Terminator eingefügt wurde. Im pIN5T15 wurde der TrpA-Terminator 370 bp stromabwärts des Abbruchcodons des GIF146-Strukturgens eingefügt.

Drei Stämme von E. coli W3110 wurden durch die Plasmide pIN5T5, pIN5T13 und pIN5T15 transformiert und die erhaltenen Transformanten E. coli W3110/pIN5T5, W3110/pIN5T13 und W3110/pIN5T15 wurden auf ihre antivirale Aktivität und GIF146-Produktion geprüft. Nicht-transformierte E. coli W3110-Wirtszellen wurden als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

TABELLE 3 Vergleich der gamma-IFN-Produktivität
Stamm Antivirale Aktivität* % 18 kd-Protein GIF

*Einheit/ml Kultur

Fig. 6a ist eine Aufnahme der Proteinbanden, erhalten durch SDS-PAGE und gefärbt mit Coomassie blue, und Fig. 6b zeigt das Proteindiagramm, welches durch Scannen des Gels dieser Banden erhalten wurde. Die Bande für ca. 18 kb entspricht dem GIF146-Protein.

Die Daten in Tabelle 3 und Fig. 6 zeigen das folgende.

E. coli W3110/pIN5T13, transformiert durch Plasmid pIN5T13, wobei der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Abbruchcodon des GIF146-Strukturgens gebunden war, zeigte eine antivirale Aktivität und eine GIF146-Produktivität, die ca. 2 mal und 1,7 mal so hoch wie die Werte für E. coli W3110/pIN5T5 und W3110/pIN5T15, die entsprechend durch Plasmid pIN5T5 ohne TrpA-Terminatorinsert und Plasmid pIN5T15, worin der TrpA-Terminator in einer Distanz von Abbruchcodon vorhanden war, transformiert wurden. Es ist daher klar, daß der unmittelbar stromabwärts an das Abbruchcodon gebundene TrpA-Terminator zum Zwecke der Produktivitätssteigerung von exogenem Protein GIF146 wirksam war.

Die Erfinder konstruierten zwei zusätzliche Plasmide pIN5T11 und pIN5T9 nach dem in Fig. 7 gezeigten Verfahren. Das Plasmid pIN5T11 war in einer solchen Weise gebildet, daß der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Abbruchcodon des GIF146-Strukturgens gebunden war, während des pIN5T9-Plasmid keinen TrpA-Terminator enthielt. Diese Plasmide wurden in zwei Stämme E. coli W3110 eingeführt und die Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit zur Produktion von GIF146 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt, aus denen erkennbar ist, daß E. coli W3110/pIN5T11, transformiert durch Plasmid pIN5T11, worin der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Abbruchcodon des GIF146-Strukturgens gebunden war, eine GIF146-Produktion erreichte, die zweimal so hoch wie sie für E. coli W3110/pIN5T9 war, das durch Plasmid pIN5T9 ohne TrpA- Terminatorinsert transformiert wurde. Diese Daten demonstrieren noch einmal den vorteilhaften Effekt der Insertion des TrpA-Terminators.

TABELLE 4 Vergleich der gamma-IFN-Produktivität
Stamm Antivirale Aktivität* %18 kd-Protein GIF

*Einheit/ml Kultur

Sowohl pIN5T9 (Fig. 7) und pIN5T5 waren Plasmide ohne TrpA-Terminator. In pIN5T5 war die Region des Apr auf dem pBR322, die stromabwärts der PstI-Schnittstelle lag, stromabwärts an das Abbruchcodon für das GIF146-Strukturgen gebunden, und in pIN5T9 war die Region des Apr, die stromabwärts der BglI-Schnittstelle 127 bp stromabwärts der PstI-Schnittstelle lag, stromabwärts an das gleiche Abbruchcodon gebunden. Wie aus den Tabelle 3 und 4 ersichtlich ist, waren E. coli W3110/pIN5T5 und W3110/pIN5T9, die entsprechend mit pIN5T5 und pIN5T9 transformiert wurden, gleichwertig im Hinblick auf die Produktivität von GIF146 und antiviraler Aktivität.

(3) Binden des TrpA-Terminators an einen GIF131-produzierenden Vektor:

Die Erfinder prüften auch die Auswirkungen der Bindung von TrpA- Terminator stromabwärts an das Translationsabbruchscodon in einem Vektor zur Produktion von GIF131, worin 15 Aminosäurereste vom C-Terminus des GIF146 entfernt wurden.

Es wurden nach dem Verfahren in Fig. 8 zwei Plasmide, pIN5T5-131 und pIN5T13-131 konstruiert, worin die auf dem pIN5T5 und pIN5T13 (siehe Fig. 4) vorhandenen Anteile des GIF146-Strukturgens durch die entsprechenden Anteile des GIF131-Struktgurgens ersetzt wurden. Diese Plasmide wurden in zwei Stämme von E. coli W3110 eingeführt, und die erhaltenen Transformanten wurden auf ihre GIF131-Produktivität und antivirale Aktivität überprüft. In pIN5T13-131 war der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Translationsabbruchcodon des GIF131-Strukturgens gebunden, und in pIN5T5-131 wurde kein solcher Terminator eingefügt. Fig. 10a zeigt die Proteinbanden nach SDS-PAGE der Fraktionen, die aus den kultivierten Zellen der beiden Transformanten und dem Kontroll-W3110- Stamm extrahiert wurden, und Fig. 10b zeigt die Diagramme nach dem Scannen des Gels dieser Proteinbanden. Die Bande oder Peak für ca. 16 kd entspricht dem GIF131-Protein. Wie aus Fig. 10 hervorgeht, insbesondere aus Fig. 10b, ließ sich mit E. coli W3110/pIN5T13-131, transformiert durch pIN5T13-131, worin der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Abbruchcodon des GIF131-Strukturgens gebunden war, eine effizientere Produktion von GIF131 als in E. coli W3110/pIN5T5-131, transformiert durch pIN5T5-131 ohne einen solchen Terminator, erreichen. In Tabelle 5, wie unten dargestellt, zeigte W3110/pIN5T13-131 eine antivirale Aktivität und eine GIF131-Produktivität, die entsprechend viermal so hoch und ca. zweimal so hoch wie die Werte für W3110/pIN5T5-131 waren. Es wurde daher bestätigt, daß "Binden eines Terminators unmittelbar stromabwärts an das Translationsabbruchcodon" in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zur Verstärkung der Produktion nicht nur von GIF146, sondern auch von einem anderen exogenen Protein oder GIF131, wie in der oben beschriebenen speziellen Ausführungsform gezeigt, effektiv ist.

Das Plasmid pIN5GIF131 aus Fig. 8 wurde so konstruiert, um eine wirksame Produktion von GIF131 unter Kontrolle einer verbesserten Promotorregion des Lipoprotein (Ipp)-gens sicherzustellen. Für Einzelheiten des Konstruktionsverfahrens für dieses Plasmid siehe japanische Patentanmeldung Nr. 241457/1983.

Zur weiteren Bestätigung der Wirkung der Terminatorinsertion bei der GIF131-Produktion konstruierten die Erfinder zwei weitere Plasmide, pIN5T11-131 und pIN5T8-131, worin die Anteile des GIF146-Strukturgens auf dem pIN5T11 (siehe Fig. 7) und pIN5T8 (siehe Fig. 2) durch GIF131-Strukturgene ersetzt wurden. Nach Einführung dieser Plasmide in zwei Stämme von E. coli W3110 wurden die Transformanten auf ihre GIF131-Produktivität und antivirale Aktivität untersucht. Jeder dieser Plasmide war so aufgebaut, daß der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Abbruchcodon des GIF131-Strukturgens gebunden war. Die GIF131-Produktivität und die Werte für die antivirale Aktivität der beiden Transformanten sind in Tabelle 5 gezeigt und sie sind bezüglich dieser Faktoren identisch. Im Vergleich mit E. coli W3110/pIN5T5-131, transformiert durch pIN5T5-131 ohne Terminatorinsertion, waren die GIF131-Produktivitäts- und antiviralen Aktivitätswerte dieser beiden Transformanden ca. 3- bis 4-fach. Tabelle 5 zeigt daher die vorteilhaften Effekte der Insertion eines Terminators.

TABELLE 5 Vergleich von GIF131-Produktivität
Stamm Antivirale Aktivität* % 16 kd-Protein GIF131

*Einheit/ml Kultur

Wie aus der vorangehenden Beschreibung hervorgeht, ist die erfindungsgemäße Einfügung eines Terminators sehr effektiv zur Sicherstellung einer effizienten Produktion eines exogenen Proteins oder Polypeptids in einem Wirtsmikroorganismus, insbesondere E. coli. Offensichtlich bietet die vorliegende Erfindung einen großen industriellen Vorteil bei der Realisierung wirksamer Produktion nicht nur von den oben erwähnten und in den folgenden Beispielen erwähnten Proteinen (GIF146 und GIF131), sondern auch für andere Proteine und Polypeptide.

Die Erfindung wird im einzelnen unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.

BEISPIEL

Zur effizienten Genexpression durch Insertion eines Terminators befähigter Plasmidvektor:

(1) Herstellung von pIN5A2:

3 ug pIN5GIF54 (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 132524/1983) wurde komplett mit 15 Einheiten SalI und 15 Einheiten AvaI verdaut. Das verdaute Plasmid wurde einer Agargelelektrophorse unterworfen und das größere DNA-Fragment wurde vom Gel durch Elektrophorese elektroeluiert. Wiedergewinnung der DNA wurde anschließend durch Präzipitation mit Ethanol durchgeführt. Ein TrpA-Transkriptionsterminator wurde entworfen (Basensequenz siehe Tabelle 1), so daß er überlappende SalI- und AvaI- (AGCC)-Termini an den Enden aufwies. Dieses DNA-Fragment wurde mit einem DNA-Synthesizer Modell 380 A von Applied Biosystems synthetisiert, und Entfernung der Schutzgruppen und Reinigung wurden nach Routineverfahren durchgeführt. Das gereinigte DNA-Fragment wurde am 5'-Terminus mit ATP und Polynukleotidkinase phosphoryliert. Ein Anteil (0,2 ug) des phosphorylierten DNA-Fragmentes wurde mit dem zuvor erhaltenen SalI-AvaI-Fragment aus pIN5G54 vermischt und man ließ die Mischung bei 15ºC 18 Stunden in einer Ligationslösung (20 ul) zusammengesetzt aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT (Dithiotreithol) und 1 mM ATP ligatisieren. Nach Behandlung mit 0,3 ml CaCl&sub2; wurde E. coli W3110 durch Zusatz von 10 ul zur Ligationslösung transformiert. Ampicillinresistente Klone der Transformanden wurden nach Routineverfahren unter Erhalt von W3110-Klonen mit dem pIN5A2 (siehe Fig. 1) analysiert. Die Produktivität von IFN-gamma (GIF146) unter Verwendung der Transformante mit pIN5A2 und pIN5GIF54 wurde nach dem folgenden Verfahren geprüft.

Die Transformante wurde in einer Schüttelkultur bei 30ºC 24 Stunden in 1,5 ml eines GC-Mediums in einem 16,5 mm-Teströhrchen kultiviert. Das Medium enthielt 40 ug/ul Ampicillin und hatte die folgende Zusammensetzung: 2 % Glyzerin, 3 % Casaminosäuren, 0,2 % Hefeextrakt, 0,5 % KH&sub2;PO&sub4; und 0,1 % MgSO&sub4;·7H&sub2;O, und der pH war auf 6,5 mit NaOH eingestellt. Nach Abschluß der Kultivierung (OD&sub6;&sub6;&sub0; = 7) wurden 0,5 ml der Kulturlösung in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gegeben und bei 10.000 Upm 5 Minuten zentrifugiert. Die gesammelten Zellen wurden in 0,5 ml PBS-Lösung suspendiert (0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,115 % Natriummonohydrogenphosphat und 0,02 % Kaliumdihydrogenphosphat), das 1 mg/ml Lysozym und 1 mM EDTA enthielt. Nach Reaktion bei 0ºC für 30 Minuten wurden die Zellen durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen aufgebrochen. Die überstehende Fraktion wurde durch Zentrifugation bei 10.000 Upm für 10 Minuten wiedergewonnen und auf antivirale Aktivität nach dem Verfahren aus der ungeprüften veröffentlichten, japanischen Patentanmeldung Nr. 201995/1983 überprüft.

Ein weiterer 0,5 ml-Anteil der Kulturlösung wurde 5 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Die gesammelten Zellen wurden in 200 ul SDS- Probenlösung (10 mM Phosphatpuffer mit pH 7,2, 7 M Harnstoff, 1 %V SDS und 1% 2-Mercaptoethanol) gelöst und die erhaltene Losung auf einem kochenden Wasserbad 10 Minuten erhitzt. Ein Anteil (20 ul) der Probe wurde in Fraktionen durch 13 %-iges SDS-PAGE aufgetrennt und das Protein wurde mit Coomassie blue gefärbt. Die Proteinbanden wurden einem Scannen des Gels bei 85 nm zur Berechnung des Anteils des GIF146 am Gesamtprotein unterworfen. GIF146 produzierte eine Bande bei ca. 18 kd, jedoch das untransformierte W3110 produzierte ebenfalls die Bande in einer Menge von ca. 3 %, so daß dieser Wert vom beobachteten Wert des GIF146-Proteins relativ zum Gesamtprotein abgezogen wurde. Die Ergebnisse der Messungen der antiviralen Aktivität und G1F146-Produktion sind in Tabelle 1 gezeigt, aus der man entnehmen kann, dass pIN5A2 mit dem unmittelbar stromabwärts des GIF146-Gens eingefügten TrpA-Terminator eine antivirale Aktivität und GIF146-Produktionswerte aufwies, die ca. 2- und 1,7-fach hoher als die Werte von pIN5GIF54 waren.

(2) Herstellung von pIN5T4 und pIN5T8:

Ein Anteil (5 ug) pIN5GIF54 wurde komplett mit 20 Einheiten AatII und 20 Einheiten SalI verdaut. Die überlappenden AatII-Enden (3'-Terminus) und SalI-Ende (5'-Terminus) wurden unter Verendung von T4 DNA-Polymerase und 4dNTP glatt gemacht (einschließlich dATP, dGTP, dCTP und dTTP); das AatII-Ende wurde abgeschnitten, wogegen das SalI-Ende aufgefüllt wurde. Das verdaute Plasmid wurde durch Agar-Elektrophorese aufgetrennt und ein DNA-Fragment (ca. 750 bp), enthaltend den Lipoproteinpromotor (IppP) und das GIF146-Gen, wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten.

Ein Anteil (5 ug) pBR322 wurde komplett mit 20 Einheiten von EcoRI verdaut und die erhaltenen versetzten Enden wurden durch das oben beschriebene Auffüllverfahren glatt gemacht. Das Plasmid wurde anschliessend komplett mit 20 Einheiten AhaIII verdaut. Das verdaute Plasmid wurde durch Agar-Elektrophorese aufgetrennt und ein DNA-Fragment (ca. 3,3 kd), enthaltend den DNA-Replikationsinitiationspunkt und das Tetracyclin-Resistenzgen, wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten.

Die beiden DNA-Fragmente wurden gemischt, ligatisiert und nach dem oben beschriebenen Verfahren unter Erhalt von pIN5T4 (siehe Fig. 2) behandelt.

Ein Anteil (5 ug) pIN5A2 wurde komplett mit 20 Einheiten AatII und 20 Einheiten AvaI verdaut und die erhaltenen zusammenhängenden Enden wurden durch Abschneiden und Auffülltechniken, wie oben beschrieben, glatt gemacht. Das verdaute Plasmid wurde durch Agar-Elektrophorese aufgetrennt und ein DNA-Fragment (ca. 800 bp), enthaltend das GIF146-Gen und den TrpA- Terminator, wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem DNA-Fragment aus pBR322 gemischt (ca. 3,3 kp), wie oben beschrieben, und die Mischung wurde ligatisiert und nach dem oben beschriebenen Verfahren unter Erhalt von pIN5T8 behandelt (Fig. 2).

Zwei Stämme E. coli W3110 wurden durch pIN5T4 und pIN5T8 tansformiert und die antivirale Aktivität und die GIF146-Produktivität jeder dieser Transformanten wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 2 und 3 gezeigt; pIN5T8 zeigte eine ca. 4-fach so hohe antivirale Aktivität wie pIN5T4 und die erstere war ca. dreimal wirksamer bei der GIF146-Produktion als die letztere (d. h. 32 % des gesamten Proteins). Fig. 3 zeigt eine Aufnahme der durch SDS-PAGE erhaltenen und mit Coomassie blue gefärbten Proteinbanden, und die Effizienz der Expression durch pIN5T8 im Vergleich zu pIN5T4 geht ebenfalls aus dieser Aufnahme hervor. Die obigen Daten zeigen die vorteilhaften Effekte der Einfügung eines Terminators.

(3) Herstellung von pIN5T5, pIN5T13 und pIN5T15:

Die zwei Plasmide pIN5T5 und pIN5T9 (wie später beschrieben) wurden zuerst hergestellt. Durch Einfügung des TrpA-Terminators in pIN5T5 wurden pIN5T13 und pIN5T15 konstruiert und durch Einfügen desselben Terminators in pIN5T9 wurde pIN5T11 (wie später beschrieben) konstruiert.

Ausgehend von pIN5G54 wurde ein glattes AatII-SalI-DNA-Fragment (ca. 750 bp), enthaltend IppP (Ipp-Promotor) und das GIF-Gen nach dem unter (2) beschriebenen Verfahren erhalten. Ein Anteil (5 ug) von pBR322 wurde komplett mit 20 Einheiten PstI und 20 Einheiten EcoRI verdaut und die erhaltenen zusammenhängenden Enden wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren glatt gemacht, so daß ein 3,6 kp-DNA-Fragment, enthaltend den Replikationsinitiierungspunkt, das Tetracyclin-Resistenzgen und den Anteil des beta-Lactamasegens der stromabwärts der PstI-Schnittstelle lag, erhalten wurde. Die beiden DNA-Fragmente wurden miteinander vermischt und unter Konstruktion von pIN5T5 ligatisiert (siehe Fig. 4).

Das PstI-EcoRI-DNA-Fragment aus pBR322 (3,6 kb) mit versetzten Enden wurde mit einem AatII-AvaI (0,8 kb)-DNA-Fragment mit versetzten Enden aus pIN5A2, das nach demselben Verfahren wie unter (2) erhalten wurde, vermischt und die Mischung wurde ligatisiert und nach dem oben beschriebenen Verfahren unter Erhalt von pIN5T13 behandelt.

Durch Einsatz der folgenden Verfahren wurde pIN5T15 konstruiert, bei dem der TrpA-Terminator ca. 380 bp stromabwärts des GIF-Gens eingefügt wurde (Fig. 5). Ein Anteil (5 ug) von pBR322 wurde mit 20 Einheiten EcoRI geschnitten und die erhaltenen zusammenhängenden Enden wurden mit T4 DNA-Polymerase nach der obigen Methode aufgefüllt. Anschließend wurde das Plasmid mit 20 Einheiten AhaIII geschnitten und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes (3,2 kb) behandelt, das das Tetracyclin-Resistenzgen enthielt. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem AatII-AvaI (0,8 kb)-DNA-Fragment aus pIN5A2 mit versetzten Enden, das aus 5 ug verdautem pIN5A2 nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, vermischt. Die Mischung wurde ligatisiert und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt von pIN5T7 behandelt. Ein Anteil (5 ug) pIN5T7 wurde mit 30 Einheiten SalI verdaut und die erhaltenen zusammenhängenden Enden wurden nach dem obigen Verfahren aufgefüllt. Das Plasmid wurde anschließend mit 20 Einheiten AvaI verdaut und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes (1,8 kb), das den Replikationsinitiierungspunkt enthielt, behandelt. Ein Anteil (5 ug) von pIN5T5 wurde komplett mit 20 Einheiten AhaII und 20 Einheiten AvaI verdaut und anschließend nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes behandelt, das das GIF146-Gen und das Tetracyclin-Resistenzgen enthielt. Die beiden DNA-Fragmente wurden miteinander vermischt, ligatisiert und anschließend behandelt unter Erhalt von pIN5T15.

Drei Stämme von E. coli W3110 wurden durch pIN5T5, pIN5T13 und pIN5T15 transformiert und die erhaltenen Transformanden wurden kultiviert und nach dem in (2) beschriebenen Verfahren analysiert. Fig. 6 zeigt eine Aufnahme der Proteinbanden, erhalten durch SDS-PAGE und gefärbt mit Coomassie blue, und die Proteindiagramme nach Gelscannen der Banden. Das Plasmid pIN5T13 mit dem TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts des GIF-Gens war effizienter als pIN5T5 bei der Produktion des 18 kd GIF146- Proteins. Tabelle 3 faßt die Daten für die antivirale Aktivität und den Anteil des GIF146-Proteins am Gesamtprotein nach Bestimmung durch Gelscananalyse zusammen. Das Plasmid pIN5T13, das zur effizienten Genexpression in der Lage war, hatte eine zweifach so hohe antivirale Aktivität wie pIN5T5 und produzierte das GIF146-Protein in einer 1,7-fach größeren Menge als pIN5T5. Das dritte Plasmid pIN5T15 mit dem TrpA-Terminator, eingefügt 380 bp stromabwärts des Strukturgens, war vergleichbar zum pIN5T5 in der Effektivität der Genexpression. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Einfügung des TrpA-Terminators nur effektiv ist, wenn er unmittelbar stromabwärts des Strukturgens lokalisiert ist.

(4) Herstellung von pIN5T9 und pIN5T11:

In pIN5T5 lag das 3'-terminale Ende des GIF146-Gens an der PstI- Stelle des 6-Lactamasegens auf dem pBR322. In diesem Abschnitt werden die Ergebnisse eines Experimentes mit einem Plasmid beschrieben, bei dem das 3'-terminale Ende des GIF146-Gens an der BglI-Stelle des beta-Lactamasegens lokalisiert war.

Fig. 7 zeigt Verfahren zur Herstellung von pIN5T9 und pIN5T11 (mit dem TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts des GIF146-Gens in pIN5T9 eingefügt). Ein Anteil (5 ug) pIN5GIF54 wurde mit 20 Einheiten von AatII und 20 Einheiten von SalI verdaut und die erhaltenen zusammenhängenden Enden wurden nach dem obigen Verfahren glatt gemacht. Anschließend wurde ein DNA-Fragment mit dem GIF146-Gen abgetrennt. Ein Anteil (5 ug) pBR322 wurde mit 20 Einheiten BglI geschnitten und das erhaltene versetzte Ende glatt gemacht. Das Plasmid wurde anschließend mit 20 Einheiten AvaI geschnitten und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem Replikationsinitiierungspunkt behandelt.

Ein Anteil (5 ug) pBR322 wurde mit 20 Einheiten EcoRI geschnitten, glatt gemacht, geschnitten mit 20 Einheiten AvaI und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem Tetracyclin-Resistenzgen behandelt. Die drei DNA-Fragmente wurden miteinander vermischt und unter Erhalt von pIN5T9 ligatisiert.

Ein Anteil (5 ug) pIN5A2 wurde mit 20 Einheiten AatII und 20 Einheiten AvaI verdaut und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA- Fragmentes mit versetzten Enden, enthaltend das GIF146-Gen, behandelt. Ein Anteil (5 ug) pBR322 wurde mit 20 Einheiten BglI geschnitten, mit versetzten Enden versehen, mit 20 Einheiten AvaI geschnitten und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem Replikationsinitiierungspunkt behandelt. Ein Anteil (5 ug) pBR322 wurde mit 20 Einheiten EcoRI geschnitten, glatt gemacht, mit 20 Einheiten Ava geschnitten und nach dem obigen Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem Tetracyclin-Resistenzgen behandelt. Die drei DNA-Fragmente wurden miteinander vermischt und unter Erhalt von pIN5T11 ligatisiert. Zwei Stämme von E. coli W3110 wurden mit pIN5T9 und pIN5T11 transformiert und die erhaltenen Transformanden wurden auf ihre GIF146-Produktivität nach dem unter (2) beschriebenen Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt, aus denen hervorgeht, daß das pIN5T11 mit dem TrpA- Terminator, unmittelbar stromabwärts des GIF146-Gens eingefügt, im Hinblick auf die antivirale Aktivität wie auch die GIF146-Produktion ca. zweimal so wirksam wie das terminatorfreie pIN5T9 war.

(5) Herstellung von pIN5T5-131, pIN5T13-131, pIN5T8-131 und pIN5T11-131:

In diesem Abschnitt werden die Wirkungen der Terminatorinsertion auf die Expression des GIF131-Gens, wie beschrieben in der japanischen Patentanmeldung Nr. 241457/1983 (worin 15 Aminosäurereste vom C-Terminus entfernt wurden) wiederholt.

Fig. 8 zeigt die Abfolge der Schritte zur Herstellung von pIN5T5-131 und pIN5T13-131. Ein Anteil (5 ug) pBR322 wurde mit 10 Einheiten PstI geschnitten, nach dem obigen Verfahren glatt gemacht und mit 0,5 ug SalI-Linker ligatisiert, wobei pT12 mit einer in die PStI- Schnittstelle eingefügtem SalI erhalten wurde. Ein Anteil (5 ug) von pT12 wurde komplett mit 20 Einheiten EcoRI verdaut, nach dem obigen Verfahren glatt gemacht, teilweise mit einer Einheit SalI verdaut und anschließend nach obigem Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem Tetracyclin-Resistenzgen behandelt.

Ein Anteil (5 ug) pIN5GIF131 (beschrieben in der japanischen Patentanmeldung Nr. 241457/1983) wurde mit 20 Einheiten AatII verdaut, nach dem obigen Verfahren glatt gemacht, mit 20 Einheiten SalI verdaut und anschließend nach obigem Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem GIF131-Gen behandelt.

Die beiden DNA-Fragmente wurden miteinander vermischt und unter Erhalt von pIN5T5-131 ligatisiert.

Ein Anteil (5 ug) von pIN5T5-131 wurde mit 40 Einheiten SalI verdaut und anschließend nach obigem Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem GIF131-Gen und einem Teil des Tetracyclin-Resistenzgens behandelt. Ein Anteil (5 ug) pIN5T13 (siehe Fig. 4) wurde mit 40 Einheiten SalI verdaut und anschließend nach obigem Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit einem Teil des Tetracyclin-Resistenzgens, dem TrpA-Terminator und dem Replikationsinitiierungspunkt behandelt. Die beiden DNA-Fragmente wurden gemischt und unter Erhalt von pIN5T13-131 ligatisiert. Dieses Plasmid war identisch mit pIN5T5-131, mit der Ausnahme, daß der TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts des GIF131-Gens eingefügt wurde.

Fig. 9 zeigt die Abfolge der Herstellungsschritte für pIN5T8-131 und pIN5T11-131, die beide den TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts von GIF131-Gen eingefügt hatten. Die beiden Plasmide pIN5T11 (siehe Fig. 7) und pIN5T5-131 wurden jeweils zu 5 ug mit 40 Einheiten SalI verdaut. Aus pIN5T11 wurde ein DNA-Fragment mit dem Tetracyclin-Resistenzgen, dem TrpA-Terminator und dem Replikationsinitiierungspunkt nach obigem Verfahren erhalten. Aus dem pIN5T5-131 wurde ein DNA-Fragment mit dem GIF131- Gen und einem Teil des Tetracyclin-Resistenzgens nach obigem Verfahren erhalten. Die beiden DNA-Fragmente wurden gemischt und unter Erhalt von pIN5T11-131 ligatisiert.

Ein Anteil (5 ug) pIN5T5-131 wurde mit 20 Einheiten EcoRI und 20 Einheiten SalI verdaut und anschließend nach obigem Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem GIF131-Gen behandelt. Ein Anteil (5 ug) pIN5T8 wurde komplett mit 20 Einheiten EcoRI verdaut, teilweise mit einer Einheit SalI verdaut und anschließend nach obigem Verfahren unter Erhalt eines DNA-Fragmentes mit dem Tetracyclin-Resistenzgen dem TrpA-Terminator, dem Ipp-Promotor und dem Replikationsinitiierungspunkt behandelt. Die beiden DNA-Fragmente wurden gemischt und unter Erhalt von pIN5T8-131 ligatisiert.

Stämme von E. coli W3110 wurden durch die oben konstruierten Plasmide transformiert und die Effizienz ihrer GIF-131-Produktion wurde nach dem obigen Verfahren untersucht. Fig. 10 zeigt die Ergebnisse der Analyse der SDS-PAGE-Banden für pIN5T5-131 und pIN5T13-131 (wie durch Proteinfärbung und Gelscannen erhalten).

Die Ergebnisse zeigen, daß pIN5T13-131 mit dem TrpA-Terminator, unmittelbar stromabwärts des zu exprimierenden GIF131 eingefügt, eine höhere GIF131-Produktivität als pIN5T5-131 ohne TrpA-Terminatorinsert aufwies. Tabelle 5 führt die antivirale Aktivität für die GIF131-produzierenden Plasmide und die Ergebnisse des Gelscannens der Proteinbanden, erhalten nach SDS-PAGE und Coomassie blue-Färbung, auf. Das Plasmid pIN5T13-131 zeigte offensichtlich die Wirkungen der Terminatorinsertion, da seine antivirale Aktivität und seine GIF11-Produktivität 4 und 2,5 mal so hoch wie die Werte für pIN5T5-131 waren. Ähnliche Ergebnisse wie bei pIN5T13-131 wurden mit pIN5T8-131 erhalten, wo die Expressionseinheit (d. h. das DNA-Fragment mit dem Ipp-Promotor GIF131-Gen und dem TrpA-Terminator zusammen verknüpft) in die entgegengesetzte Richtung im Vergleich zu pIN5T13-131 eingefügt wurde und bei pIN5T11-131, worin die Expressionseinheit an einer anderen Stelle als der in pIN5T13-131 eingefügt wurde.


Anspruch[de]

1. Vektor, der zur effizienten Expression eines Gens für ein Protein oder Polypeptid mit einer Interferonaktivität oder Antitumoraktivität in der Lage ist, dadurch gekennzeichnet, daß der E. coli TrpA-Terminator unmittelbar stromabwärts an das Stoppcodon des zu exprimierenden Gens gebunden ist.

2. Vektor nach Anspruch 1, worin das Protein oder Polypeptid eine Interferonaktivität vom gamma-Typ (oder Immuninterferon) aufweist.

3, Vektor nach Anspruch 2, worin das Protein oder Polypeptid mit der gamma-Interferonaktivität, die auf Seite 4 offenbarte Aminosäuresequenz oder die auf Seiten 4/5 offenbarte Aminosäuresequenz aufweist.

4. Vektor nach Anspruch 1, worin das Protein oder Polypeptid codierende Gen chemisch synthetisierte DNA umfaßt.

5. Vektor nach Anspruch 4, worin die chemisch synthetisierte DNA, die auf Seite 7 offenbarte Basensequenz oder auf Seite 8 offenbarte Basensequenz aufweist.

6. Vektor nach Anspruch 1, worin die E. coli TrpA-Terminatorfunktion ein chemisch synthetisiertes DNA-Fragment ist.

7. Vektor nach Anspruch 6, worin das chemisch synthetisierte DNA- Fragment durch die folgende Basensequenz dargestellt ist:

8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids mit einer Interferonaktivität oder einer Antitumoraktivität, welches die Kultur einer durch einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 transformierten Zelle umfaßt.







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