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Dokumentenidentifikation DE3687589T2 19.05.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0200381
Titel Festkörpersystem zur Verwendung in Ligand-Rezeptoruntersuchungen.
Anmelder Hybritech Inc., San Diego, Calif., US
Erfinder Rubenstein, Albert Samuel, Encinitas, CA 92024, US
Vertreter Louis, D., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., 8183 Rottach-Egern; Pöhlau, C., Dipl.-Phys., 8500 Nürnberg; Lohrentz, F., Dipl.-Ing., 8130 Starnberg; Segeth, W., Dipl.-Phys., Pat.-Anwälte, 8500 Nürnberg
DE-Aktenzeichen 3687589
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 04.04.1986
EP-Aktenzeichen 863025219
EP-Offenlegungsdatum 05.11.1986
EP date of grant 27.01.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.05.1993
IPC-Hauptklasse G01N 33/549
IPC-Nebenklasse G01N 33/545   G01N 33/551   G01N 33/577   G01N 33/564   G01N 33/569   G01N 33/74   G01N 33/70   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren. Gemäß einem anderen Aspekt betrifft sie ein Festphasensystem zur Verwendung in Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren, insbesondere monoklonale Antikörper verwendende Immunoassays.

Diese Anmeldung betrifft den Gegenstand von G. Valkirs et al., US-PS 4 632 901. Die Offenbarung all dieser Druckschriften werden hiermit durch Inbezugnahme eingeschlossen.

Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren, insbesondere Immunoassays, stellen empfindliche diagnostische Werkzeuge für die in vitro-Erfassung bzw. -Bestimmung in Serum und anderen Körperflüssigkeiten von Analyten, die mit Erkrankungen und anderen physiologischen Bedingungen mit klinischer Bedeutung in Zusammenhang stehen, zur Verfügung.

In der Vergangenheit waren Immunoassays typischerweise auf einer Zubereitung eines polyklonalen Antikörpers aufgebaut, der an eine feste Phase gebunden war. Bei solchen Bestimmungen läßt man eine Lösung eines Antigens, welches zum Ermöglichen der Bestimmung markiert ist, mit einem Antigen in einer Probe um den Festphasen-Antikörper in Konkurrenz treten. Das Ausmaß, in dem das markierte Antigen an die feste Phase gebunden oder in der flüssigen Phase erfaßt wird, kann als Maß für die Anwesenheit und Menge an Antigen in der analysierten Probe verwendet werden.

Im Anschluß daran wurden nichtkompetitive immunometrische Bestimmungsverfahren verfügbar. Bei diesen Bestimmungsverfahren wird ebenfalls eine Zubereitung eines polyklonalen Antikörpers verwendet, der an eine feste Phase gebunden ist. Die das vermutete Antigen enthaltende Probe wird mit der festen Phase in Kontakt gebracht, damit sich das Antigen an die Antikörper auf der festen Phase bindet. Typischerweise wird nach einem Inkubationsschritt die Probe von der festen Phase abgetrennt, die dann gewaschen und mit einer Lösung zusätzlicher polyklonaler Antikörper inkubiert wird, die beispielsweise mit einem Radionuklid, einem Enzym oder einem fluoreszierenden Teil markiert worden sind, um die Bestimmung zu ermöglichen.

Nach dieser zweiten Inkubation wird der ungebundene markierte Antikörper von der festen Phase abgetrennt, und die Menge des markierten Antikörpers wird entweder in der flüssigen Phase oder gebunden an die feste Phase in einer Antikörper/Antigen/Antikörper-Sandwichanordnung als Maß für die Anwesenheit und/oder Konzentration des Antigens in der untersuchten Probe, gemessen.

Kürzlich wurden Immunoassay-Verfahren für die Verwendung von monoklonalen Antikörpern modifiziert. Die US- PS 4 376 110 beispielsweise beschreibt immunometrische Bestimmungsverfahren mit zwei Epitopstellen, welche Paare monoklonaler Antikörper verwenden, wobei einer an eine feste Phase gebunden ist und der andere zum Ermöglichen der Bestimmung markiert ist. Die Verwendung von Paaren monoklonaler Antikörper, die unterschiedliche Epitopstellen auf einem Antigen erkennen, hat es ermöglicht, immunometrische Bestimmungsverfahren gleichzeitig durchzuführen, bei denen das Inkubieren von Antigen und markiertem Antikörper nicht die Zwischenschritte der Verfahren des Standes der Technik erfordern.

Bei den vorstehenden Immunoassay-Verfahren umfaßt die feste Phase typischerweise einen an ein Kügelchen gebundenen Antikörper oder alternativ einen Antikörper, der auf ein Material wie beispielsweise eine Membran oder einen Filter aufbeschichtet ist und der zum Einfangen eines interessierenden Antigens geeignet ist. Im Moment erfordert das Herstellen solcher Festphasensysteme charakteristischerweise Aktivierungsschritte, um das Aufbeschichten eines Antikörpers auf einen festen Träger zu erleichtern. Zusätzlich ist im allgemeinen ein Rückbeschichtungsschritt erforderlich, der das Beschichten des festen Trägers mit einer Substanz umfaßt, die unspezifische Bindungen wirksam inhibiert. Der Aktivierungs- und Rückbindungsschritt sind zeitaufwendige und schwierige Schritte und machen das Herstellen von Festphasensystemen infolgedessen sehr kostenaufwendig.

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Beschränkungen, die mit der Herstellung von augenblicklich verfügbaren Festphasensystemen verknüpft sind, ist es nicht möglich gewesen, in einer gegebenen Probe mehr als einen interessierenden Analyten gleichzeitig auf einem Einfach- Festphasensystem zu bestimmen. Daneben fehlen dem augenblicklichen Festphasensystem die inneren Kontrollen (d. h. positive und negative Kontrollen), die zur Bestimmung der Gültigkeit und Zuverlässigkeit eines Bestimmungsverfahrens wesentlich sind. Das Herstellen von Festphasensystemen für Mehrfach-Immunoassay-Verfahren und/oder ein System mit einer inneren Kontrolle war vor der vorliegenden Erfindung sehr schwierig.

Die EP-A-0 119 622 beschreibt ein integrales Element für eine biologische Reaktion, umfassend mindestens Zwei Schichten, die im wesentlichen bestehen aus (1) einer porösen biologischen Kompositreaktionsschicht umfassend ein faserartiges Material, in welchem ein teilchenförmiges Material dispergiert ist, an das eine aktive Substanz fixiert ist, die zur Teilnahme an einer biochemischen Reaktion befähigt ist und (2) eine poröse Schicht eines faserartigen Materials. Zum Herstellen der zwei faserartigen Schichten und zum Erreichen der Dispersion des teilchenförmigen Materials in der Schicht (1) wird ein Verfahren analog zur Papierherstellung unter Einschluß von Feuchtaufschlämmungen verwendet.

Die US-A-3 951 748 beschreibt eine Matrix, in der ein teilchenförmiges Sorbens - an Rezeptoren gebundene Trägerproteinmoleküle - physikalisch innerhalb der Poren der Matrix immobilisiert ist.

Die US-A-4 338 094 beschreibt eine feste Kapsel, welche gegenüber Fluiden porös ist (d. h. hergestellt aus zwei durch Pressen erzeugten Halbkugeln), in der Antikörper tragende Teilchen verkapselt sind.

Dementsprechend besteht ein Bedürfnis für ein Festphasensystem, welches günstiger herzustellen ist und welches die Schwierigkeiten und Kosten bei der Herstellung minimiert. Zusätzlich besteht ein Bedürfnis für ein verbessertes Festphasensystem, das dazu verwendet werden kann, in einer Probe mindestens zwei interessierende Analyten gleichzeitig zu bestimmen. Weiter besteht ein Bedürfnis für ein verbessertes Festphasensystem, welches den Einbau von inneren Kontrollen für die Durchführung von Bestimmungsverfahren gestattet.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Festphasensystem zur Verwendung in einem Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren, insbesondere Immunoassays, zum Erfassen bzw. Bestimmen eines ausgewählten Analyten in einer Fluidprobe zur Verfügung. Soweit hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren" auf ein Bestimmungsverfahren für einen Analyten, der durch Bildung eines Komplexes zwischen einem Liganden und einer weiteren Substanz erfaßt wird, die zur spezifischen Wechselwirkung mit dem Liganden, d. h. dem Rezeptor, befähigt ist. Der Ligand kann der Analyt selbst sein oder eine Substanz, deren Erfassung dazu verwendet werden kann, die Anwesenheit des Analyten in einer Probe vermuten zu lassen. Dem Fachmann ist klar, daß in Abhängigkeit vom interessierenden Analyten und in Abhängigkeit vom Aufbau des Bestimmungsverfahrens ein Beteiligter eines spezifischen Bindungspaares entweder der Rezeptor oder der Ligand sein kann. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Ligand" Antigene, Haptene, Antikörper, Deoxyribonukleinsäure (DNA), Ribosukleinsäure (RNA), Hormone, Metabolite und andere natürlich auftretende Substanzen von diagnostischem Interesse, für die es einen spezifischen Bindungspartner gibt, d. h. den Rezeptor des Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptor.

Das erfindungsgemäße Festphasensystem weist eine poröse Matrix auf, beispielsweise eine Membran oder einen Filter, in der Mikrobereiche eingeschlossen sind. Bevorzugt sind die Mikrobereiche innerhalb einer diskreten oder definierten Zone der Matrix eingeschlossen. Zusätzlich sind die Mikrobereiche - die so ausgewählt sind, daß sie eine Größe aufweisen, die mit der Porengröße der porösen Matrix verträglich ist - mit einem Rezeptor verbunden wie beispielsweise einem Antikörper, bevorzugt einem monoklonalen Antikörper, einem Antigen, einer Nukleinsäuresequenz oder einer anderen Substanz, die zum Einfangen des ausgewählten Liganden befähigt ist, wenn sie einer Probe ausgesetzt wird, die den Liganden enthält. Die Mikrobereiche können beispielsweise mit einem Allergen verbunden sein, welches zum Einfangen eines IgE-Antikörpers in einer Probe befähigt ist, der für das gebundene Allergen spezifisch ist.

Bei bevorzugten Festphasensystemen sind bestimmte Gruppen von Mikrobereichen, an die ein Antikörper, Antigen oder eine andere geeignete Rezeptorsubstanz gebunden ist, innerhalb diskreter Zonen der porösen Matrix eingeschlossen, um das Durchführen eines Mehrfach-Bestimmungsverfahrens zum Erfassen von mindestens zwei ausgewählten Analyten zu ermöglichen. Daneben können bestimmte Gruppen von Mikrobereichen so innerhalb der porösen Matrix eingeschlossen sein, daß sie ein inneres Kontrollsystem für das Erfassen von ausgewählten Analyten bilden.

Die Erfindung ist weiter auf ein Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren gerichtet, welches als ersten Schritt das Einführen einer Fluidprobe auf das Festphasensystem umfaßt, wodurch beim Laufen des Fluids durch das Festphasensystem der mit den Mikrobereichen verbundene Rezeptor den ausgewählten Zielliganden einfängt. Im Anschluß an die Probenzugabe wird dem Festphasensystem eine Lösung eines Rezeptorkonjugats zugesetzt, welches zum Binden des Zielliganden befähigt und so markiert ist, daß dessen Erfassung möglich ist. Soweit hier verwendet, betrifft der Begriff "Rezeptorkonjugat" einen Komplex umfassend einen Rezeptor und eine Markierung, die das Erfassen ermöglicht. Bei einem immunometrischen Bestimmungsverfahren für ein Zielantigen kann das Rezeptorkonjugat ein markierter Antikörper sein, bevorzugt ein monoklonaler Antikörper.

Wenn alternativ der Zielligand ein Antikörper ist, kann als Rezeptorkonjugat ein markiertes Antigen verwendet werden. Ungebundenes Rezeptorkonjugat kann danach mit einem Waschschritt entfernt werden. Die Anwesenheit von gebundenem Rezeptorkonjugat auf dem Festphasensystem ergibt dann einen Hinweis für die Anwesenheit des Analyten in der Probe.

Die Erfindung wurde zusammenfassend dargestellt, damit die nachfolgenden Zeichnungen und die nachfolgende detaillierte Beschreibung besser verstanden und der Beitrag zum Stand der Technik besser gewürdigt werden kann.

Fig. 1 zeigt ein Konzept einer erfindungsgemäß verwendbaren porösen Matrix und die Art und Weise, in der die Mikrobereiche zugegeben werden.

Fig. 2 zeigt ein Konzept eines Querschnitts eines erfindungsgemäßen Festphasensystems.

Fig. 3 ist eine Draufsicht auf ein erfindungsgemäßes Festphasensystem zum Erfassen eines einzelnen Analyten in einer Probe.

Fig. 4 ist eine Draufsicht eines bevorzugten Festphasensystems gemäß der Erfindung zur Vielfacherfassung unterschiedlicher Analyten in einer Probe.

Fig. 5 ist eine Draufsicht eines bevorzugten Festphasensystems gemäß der Erfindung zum Erfassen eines einzelnen Analyten in einer Probe unter Einschluß von positiven und negativen Kontrollen.

Wie vorstehend angedeutet, stellt die vorliegende Erfindung ein Festphasensystem zur Verwendung in Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren, insbesondere Immunoassays, zum Erfassen eines ausgewählten Analyten in einer Fluidprobe zur Verfügung. Erfindungsgemäß umfaßt das Festphasensystem eine poröse Matrix, in die Mikrobereiche eingeschlossen sind. Eine Vielzahl poröser Matrizes unter Einschluß natürlicher und synthetischer Matrizes kann in nützlicher Weise eingesetzt werden, vorausgesetzt, es können Mikrobereiche einer Größe erfindungsgemäß eingeschlossen sein, deren Größe mit der Porengröße der Matrix verträglich ist. Beispiele für bevorzugte Matrizes zur Verwendung als Membranen oder Filter sind Glasfasern, Nylon oder keramische Materalien, die eine definierte Porösität aufweisen.

Das Festphasensystem umfaßt weiter Mikrobereiche, die mit einem ausgewählten Rezeptor verbunden sind, wie beispielsweise einem Antikörper, bevorzugt einem monoklonalen Antikörper, einem Antigen oder einer anderen geeigneten Rezeptorsubstanz, die zum Einfangen des interessierenden Liganden befähigt ist. Mikrobereiche aus einem polymeren Material wie beispielsweise Latex, Polyethylen, Polypropylen oder Polystyrol sind zur erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt. Dem Fachmann ist jedoch klar, daß eine Vielzahl von Mikrobereichen eingesetzt werden können, die entweder aus natürlichen oder synthetischen Materialien aufgebaut sind. Im Falle von Polymeren wird das Polymer ausgewählt auf der Grundlage seiner Fähigkeit, die Bindung mit dem ausgewählten Vertreter des Liganden/Rezeptor-Paares zu erleichtern, d. h. es kann ein Polymer oder Copolymer mit einer funktionellen Gruppe sein, die das Binden durch Bildung einer kovalenten Bindung oder durch einen Beschichtungsschritt erleichtert. Zusätzlich werden die Mikrobereiche so ausgewählt, daß sie eine Größe aufweisen, die sowohl das Einschließen innerhalb der porösen Matrix als auch den Fluß des Fluids um die Mikrobereiche und die Matrix wirksam erlauben. Bevorzugt verwendet werden Mikrobereiche, die eine Durchmessergröße im Bereich von etwa 0,1 bis 50 Mikron haben. Es wurde gefunden, daß Mikrobereiche mit einer Größe innerhalb dieses Bereiches eine Neigung zeigen, die wirksame Oberfläche zu maximieren, die zur Reaktion mit dem Zielliganden zur Verfügung steht, weil Aggregation und Adhäsion der Mikrobereiche innerhalb der Matrix minimiert werden. Insbesondere bevorzugt verwendet werden Mikrobereiche mit einer Durchmessergröße innerhalb des Bereiches von 0,1 bis etwa 2,0 Mikron; Mikrobereiche mit einer Größe innerhalb dieses Bereichs zeigen eine Neigung, den Kontakt und die Kinetik zur Reaktion zwischen dem an die Mikrobereiche gebundenen Rezeptor und dem Zielliganden zu verbessern.

Erfindungsgemäß werden die zur Verwendung ausgewählten Mikrobereiche mit einem geeigneten Rezeptor aktiviert, z. B. einem Antikörper, einem Antigen oder einer anderen biologischen Substanz, die zur Verwendung als Rezeptor zum Binden und Einfangen des Zielliganden geeignet ist. Das Aktivieren kann erreicht werden durch kovalente Bindung oder in geeigneten Fällen durch Aufbringen einer Beschichtung auf den Rezeptor auf den Mikrobereichen. Im Falle eines Immunoassays zum Bestimmen der Anwesenheit eines Antigens in einer Probe ist der Rezeptor bevorzugt ein monoklonaler Antikörper, es können jedoch polyklonale Antikörper aus Antiseren in geeigneter Weise eingesetzt werden. Arbeitstechniken für das Beschichten oder das kovalente Binden von Proteinen an Mikrobereiche wie auch für das Herstellen monoklonaler und polyklonaler Antikörper-Zubereitungen sind im Stand der Technik bekannt und bedürfen an dieser Stelle keiner Wiederholung. Die aktivierten Mikrobereiche werden in eine Matrix eingeschlossen, bevorzugt innerhalb einer definierten Zone oder Zonen der Matrix, und in einem vorbestimmten Muster. Zusätzlich wurde unerwarteter Weise gefunden, daß es wünschenswert ist, eine äußerst niedrige Konzentration der aktivierten Mikrobereiche in der Lösung zum Einschließen zu verwenden, bevorzugt innerhalb des Bereichs von etwa 0,01 bis 1,0%, um in einem Bestimmungsverfahren erhöhte Empfindlichkeit zur Verfügung zu stellen. Das Mittel zum Einschließen der Mikrobereiche innerhalb der Matrix ist nicht kritisch, und man kann eine Vielzahl von Mitteln verwenden. Beispielsweise können die Mikrobereiche auf die Oberfläche der porösen Matrix als Suspension in einem geeigneten flüssigen Träger gegeben werden, beispielsweise als Polymerlatex, bevorzugt ein monodisperser Latex, der anschließend in einem Trockenschritt entfernt wird. Schwerkraft, Vakuum oder Kapillarkräfte können eingesetzt werden, um die Mikrobereiche in diskrete Zonen innerhalb der porösen Matrix vor dem Entfernen des Trägers einzuziehen. Wenn die Mikrobereiche vor dem Einschließen aktiviert werden, überwindet die vorliegende Erfindung die Beschränkungen, die mit dem Herstellen der Festphasensysteme gemäß dem Stand der Technik verbunden sind.

Erfindungsgemäß werden die rezeptorgebundenen Mikrobereiche innerhalb der Matrix bevorzugt auf eine Art und Weise eingeschlossen, die deren Mobilität innerhalb der Matrix erlaubt und ihre Agglutination oder Aggregation innerhalb der Matrix unterbindet, und die weiter einen schnellen Fluidfluß durch die Matrix und um die Partikel erlaubt. Ohne Wunsch einer Bindung an eine bestimmte Theorie nimmt die Patentanmelderin an, daß die freie Bewegung der Mikrobereiche innerhalb der Matrix den Kontakt zwischen dem an die Mikrobereiche gebundenen Rezeptor und dem Zielliganden verbessern kann und ein wirksames Waschen während des Ablaufs eines Bestimmungsverfahrens erlaubt. Zusätzlich müssen wie vorstehend angedeutet zum Erreichen der gewünschten Empfindlichkeit eines Bestimmungsverfahrens die Anzahl und die Größe der eingeschlossenen Mikrobereiche innerhalb der hier angegebenen Bereiche optimiert werden. Weiterhin können die Mikrobereiche vor dem Einschluß beschichtet werden, um ihre Aggregation und ihre Adhäsion innerhalb der Matrix zu minimieren oder zu unterbinden.

Fig. 1 zeigt im Querschnitt ein Konzept einer erfindungsgemäß brauchbaren porösen Matrix 10 und die Art des Zusatzes von aktivierten Mikrobereichen 12 dazu (der Träger für die Mikrobereiche ist nicht gezeigt). In Fig. 2 ist im Querschnitt ein Konzept eines erfindungsgemäßen Festphasensystems 14 gezeigt. Somit ist in Fig. 2 gezeigt, daß die poröse Matrix 10 aktivierte Mikrobereiche 12 aufweist, die in einer definierten oder diskreten Zone 16 innerhalb der Matrix 10 eingeschlossen sind. Eine Draufsicht des Festphasensystems 14 zum Einsatz in einem Bestimmungsverfahren für das Bestimmen eines einzelnen Analyten (wie vom Konzept her in Fig. 2 dargestellt) wird in Fig. 3 erläutert. Dementsprechend zeigt Fig. 1 die diskrete Zone 16, in der Mikrobereiche 12 eingeschlossen sind, um einen Liganden in der Matrix 10 des Festphasensystems 14 einzufangen.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Festphasensystem weist mehrere Gruppen von Mikrobereichen auf, die innerhalb der Matrix in diskreten Zonen (bevorzugt in einem vorbestimmten Muster) eingeschlossen sind. Jede Gruppe von Mikrobereichen wird vor dem Einschluß mit einem unterschiedlichen Rezeptor verbunden, wie beispielsweise einem Antikörper oder Antigen, der bzw. das zum Einfangen von unterschiedlichen interessierenden Liganden befähigt ist. Dementsprechend weist bei einer Ausführungsform der Erfindung jede Gruppe von Mikrobereichen eine Population an Mikrobereichen auf, die mit dem gleichen Antikörper, Antigen oder anderen Rezeptor verbunden sind, der zur Verwendung in dem Bestimmungsverfahren ausgewählt wird. Alternativ kann eine Gruppe von Mikrobereichen ein Gemisch aus Mikrobereichen aufweisen, an die unterschiedliche Rezeptoren gebunden sind. Beispielsweise kann im Fall eines Immunoassays für ein Antigen jede Gruppe von Mikrobereichen mindestens zwei Subpopulationen von Mikrobereichen aufweisen, wobei jede Subpopulation mit einem Antikörper (bevorzugt einem monoklonalen Antikörper) verbunden ist, der in der Lage ist, sich an eine andere Determinante oder ein anderes Epitop des Antigens zu binden. Die monoklonalen Antikörper, die mit den Subpopulationen von Mikrobereichen verbunden sind, die eine bestimmte Gruppe von Mikrobereichen aufweisen, werden bevorzugt so ausgewählt, daß sie eine spezifische Reaktivität mit nicht-interferrierenden Epitopen des Zielliganden aufweisen, wodurch die Empfindlichkeit und Spezifität des Bestimmungsverfahrens verbessert wird.

Dementsprechend ist ein vorstehend beschriebenes Festphasensystem in einem Bestimmungsverfahren mit Vielfach- Ligandenrezeptor einsetzbar für die gleichzeitige Bestimmung von mindestens zwei ausgewählten Analyten in einer gegebenen Probe. Im Falle eines Immunoassays kann die Anwesenheit von unterschiedlichen Analyten in einer Probe gleichzeitig mit Hilfe einer bestimmten Farbreaktion für jeden Analyten durch Einsatz unterschiedlicher enzymmarkierter Antikörper bestimmt werden, die bestimmte Farbreaktionen bei Zusatz eines geeigneten Substrats ergeben. Alternativ können unterschiedliche Gruppen von Mikrobereichen in der porösen Matrix auf eine Art und Weise eingeschlossen sein, die ihre Indentifizierung aufgrund ihrer speziellen räumlichen Unterbringung in der Matrix erlaubt.

Weiter ist das bevorzugte und vorstehend erläuterte Festphasensystem in besonderer Weise brauchbar, wenn es besonders wünschenswert ist, gleichzeitig die Anwesenheit von mehr als einem interessierenden Analyten in einer Probe zu bestimmen, wie beispielsweise die Bestimmung von auslösenden Stoffen bei einer allergischen Reaktion. Dies kann in einfacher Weise bewerkstelligt werden durch Einschließen bestimmter Gruppen von Mikrobereichen, wobei jede davon mit einem aus einer Gruppe bestimmter spezifischer Allergene verbunden wird (d. h. Proteine oder Kohlenhydrate, von denen man vermutet, daß sie eine Immunantwort auslösen), und zwar innerhalb diskreter Zonen der Matrix. Ein solches Festphasensystem stellt im wesentlichen ein Feld von Allergenen zur Verfügung, die zum Einfangen von IgE-Antikörpern befähigt sind, die in einer Serumprobe eines Patienten anwesend sein können. Dementsprechend ergibt das Reaktionsmuster des Festphasensystems, wie es durch die Anwesenheit von allergenspezifischen IgE-Antikörpern in einer gegebenen Probe bestimmt wird, einen Hinweis auf die Allergene, die eine gegebene allergische Reaktion hervorrufen. In solchen Bestimmungsverfahren werden die Allergen/IgE-Paare typischerweise durch Verwendung von markiertem anti-IgE-Antikörper bestimmt, wie es in der US-PS 3 720 760 beschrieben ist.

Fig. 4 zeigt eine Draufsicht eines bevorzugten Festphasensystems 18 zum Einsatz in einem Vielfach-Bestimmungsverfahren gemäß dem Konzept eines Festphasensystems 14 in Fig. 2. Fig. 4 zeigt also eine Matrix 10, in der sich diskrete Zonen 20, 22, 24 und 26 befinden, die Gruppen von Mikrobereichen enthalten, von denen jeder mit einem anderen Rezeptor zum Einfangen unterschiedlicher interessierender Liganden auf dem Festphasensystem 18 aktiviert ist.

Erfindungsgemäß weist ein bevorzugtes Festphasensystem weiterhin bestimmte Gruppen an Mikrobereichen als inneres Kontrollsystem auf (d. h. positive und/oder negative Kontrollen). Beispielsweise können die eine positive Kontrolle aufweisenden Mikrobereiche mit dem Zielliganden oder mit einer anderen geeigneten Rezeptorsubstanz verbunden sein, die geeignet ist, das Binden des Zielliganden nachzuahmen. Im Vergleich dazu sind die eine negative Kontrolle aufweisenden Mikrobereiche entweder ohne eine gebundene Komponente oder bevorzugt mit einer Substanz verbunden - z. B. je nach Fall einem Antikörper oder Antigen oder DNA -, die nicht befähigt ist, den interessierenden Liganden einzufangen, die jedoch befähigt ist, die unspezifischen Bindungswechselwirkungen des mit den Mikrobereichen verbundenen Rezeptors mit Komponenten der Probe nachzuahmen, die nicht den Zielliganden darstellen. Ein solches Festphasensystem, welches in einem Einfach- oder Mehrfachbestimmungsverfahren eingesetzt werden kann, stellt ein Mittel zum Bestimmen der Gültigkeit und Zuverlässigkeit des Bestimmungsverfahrens zur Verfügung. In einem Immunoassay ergibt somit der Einbau einer negativen Kontrolle ein Mittel zur Entscheidung darüber, ob ein falsch positives Ergebnis aufgetreten ist, welches im allgemeinen der unspezifischen Bindung einer Probenkomponente mit dem Rezeptor zuzuschreiben ist. Auf der anderen Seite vermindert eine positive Kontrolle die Wahrscheinlichkeit, daß ein falsch negatives Ergebnis nicht erfaßt wird.

Zusätzlich stellt die Erfindung ein Mittel zum Einbau eines internen Bezugs für qualitative und quantitative Bestimmungen eines Zielliganden in einem Bestimmungsverfahren zur Verfügung wie es vorgestellt und beschrieben wird in der Anmeldung von G. Valkirs et al., die am 21. März 1986 eingereicht und auf dieselbe Berechtigte wie die der vorliegenden Erfindung übertragen wurde, und die hiermit durch Inbezugnahme eingeschlossen wird.

Fig. 5 schließlich zeigt eine Draufsicht eines bevorzugten Festphasensystems 28 gemäß vorstehender Beschreibung zum Erfassen eines einzelnen Analyten, welches interne Kontrollen enthält. Fig. 5 beschreibt deshalb in Übereinstimmung mit dem Konzept von Fig. 2 ein Festphasensystem 28, welches innerhalb der Matrix 10 eine diskrete Zone 16 aufweist, die die Mikrobereiche aufweist, an die der ausgewählte Rezeptor gebunden ist. Die diskrete Zone 30 innerhalb der Matrix 10 enthält Mikrobereiche, an die der Zielligand als positive Kontrolle gebunden ist, und die diskrete Zone 32 innerhalb der Matrix 10 enthält Mikrobereiche, die bevorzugt mit einer Substanz beschichtet sind, die die unspezifischen Bindungseigenschaften des Rezeptors als negative Kontrolle nachahmt. Wenn das System 28 somit in einem Bestimmungsverfahren für eine Patientenprobe eingesetzt wird, die den interessierenden Analyten enthält, sollten sowohl die Zone 16 als auch 30 ein positives Ergebnis anzeigen. Andererseits würde eine Veränderung in Zone 32, die einer Veränderung in Zone 16 entspricht, als falsch positives Ergebnis interpretiert werden.

Wie bereits angedeutet wurde, ist das erfindungsgemäße Festphasensystem von besonderer Nützlichkeit bei der Durchführung von Bestimmungsverfahren von Ligandenrezeptoren, insbesondere in Vielfach-Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren zum Erfassen von mindestens zwei interessierenden Analyten und/oder Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren unter Einschluß eines internen Kontrollsystems. Während die Erfindung im wesentlichen bei der Durchführung von Immunoassays nützlich ist, wird der Fachmann erkennen, daß mit geeigneten Modifikationen das von der Erfindung zur Verfügung gestellte Festphasensystem für andere Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren eingesetzt werden kann, unter Einschluß von Bestimmungsverfahren, die die Nukleinsäuresonden-Technik verwenden.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Ligandenrezeptorverfahren wird eine Fluidprobe, von der vermutet wird, daß sie den bzw. die interessierenden Analyten enthält, auf das vorstehend beschriebene Festphasensystem aufgebracht. Im Falle eines Immunoassays enthält die feste Phase als Rezeptor bevorzugt einen mit den Mikrobereichen verbundenen monoklonalen Antikörper, obwohl auch eine polyklonale Antikörperzubereitung verwendet werden kann, wenn der interessierende Ligand ein Antigen ist. Wenn der interessierende Ligand ein Antikörper ist, kann die feste Phase jedoch ein Antigen enthalten, für das der zu erfassende Antikörper spezifisch ist. Im Anschluß an den Fluß der Fluidprobe durch das Festphasensystem und in das absorbierende Teil wird eine Lösung von Rezeptorkonjugat zugegeben, die in der Lage ist, sich mit dem Zielliganden zu verbinden und zum Ermöglichen der Bestimmung markiert ist. Im Falle von Immunoassays kann das Rezeptorkonjugat ein Antikörper sein, bevorzugt eine monoklonaler Antikörper oder ein Antigen, welcher zum Binden mit dem interessierenden Liganden befähigt sind. Der Zusatz von Rezeptorkonjugat (falls sinnvoll) erlaubt das Bilden eines Komplexes, womit der Ligand vom Festphasensystem eingefangen ist. Im Falle eines Immunoassays, wenn die das Festphasensystem aufweisenden Mikrobereiche mit einem monoklonalen Antikörper verbunden sind und der markierte Antikörper ebenfalls ein monoklonaler Antikörper ist, werden die zwei Antikörper so ausgewählt, daß sie sich an nicht interferrierende Bindungsstellen des Antigens anhängen, wie es insbesondere beschrieben ist in der US-PS 4 376 110 und der US-PS 4 486 530, deren Offenbarung durch Inbezugnahme eingeschlossen wird. Bei den augenblicklich bevorzugten Ausführungsformen ist das Rezeptorkonjugat mit einem Enzym markiert, es können jedoch auch andere herkömmliche Markierungen in geeigneter Weise eingesetzt werden, wie beispielsweise Radionuklide, Fluoreszenzmittel, Phosphoreszenzmittel und Polymere, die Farbstoffe enthalten oder Chemoluminiszenzanteile. Nachdem die Lösung des Rezeptorkonjugats das Festphasensystem durchflossen hat, kann zum Entfernen von ungebundenem Rezeptorkonjugat eine Waschlösung zugesetzt werden. Danach wird das mit dem Liganden komplexierte Rezeptorkonjugat bestimmt. Wenn als Markierungskomponente ein Enzym verwendet wird, wird das gebundene Rezeptorkonjugat durch Zusatz eines geeigneten Enzymsubstrats zum Festphasensystem bestimmt. Durch Reaktion mit dem Substrat erzeugt das Enzym bei richtiger Auswahl eine Farbänderung auf dem Festphasensystem, die mit dem Auge oder mit instrumentellen Mitteln erfaßt werden kann.

Dem Fachmann ist klar, daß erfindungsgemäß ein weiter Bereich von Analyten bearbeitet werden kann. Die Liste potentieller interessierender Analyten ist zu lange, um hier wiedergegeben zu werden. Es können jedoch Antigene, wie beispielsweise prostatische saure Phosphatasen, prostatspezifisches Antigen, Alphafetoprotein, karzinoembryonales Antigen, leutenisierendes Hormon, Kreatinkinase-Isoenzyme und andere Antigene in Serum, Plasma, Urin oder anderen biologischen Flüssigkeiten mit einem Immunoassay erfaßt werden. Daneben ist die Erfindung brauchbar bei der Bestimmung von Viren, Bakterien, Parasiten oder Pilzen oder damit zusammenhängenden Antigenen oder Antikörpern unter Einschluß von beispielsweise Rubellavirus, Rotavirus, Adenovirus, respiratorisch synzitischem Virus, HTLV, Hepatitisvirus, Hepatitis/A, Hepatitis/B, nicht-A-nicht-B-Hepatitis, Grippevirus, Zytomegalovirus und Herpesvirus, wie auch für Streptokokken der Gruppe A und Gruppe B, Neisseria gonorrhea, Trichomonas vaginalis, Candida ablicans, Chlamydia trachomatis und Hemophilus influenza.

Weiter ist dem Fachmann auf der Grundlage dieser Offenbarung klar, daß die vorliegende Erfindung für Bestimmungsverfahren anwendbar ist, die die Nukleinsäuresonden- Technik einsetzen. Insbesondere kann an die Mikrobereiche, die später in einer porösen Matrix eingeschlossen werden, eine Nukleinsäuresequenz angebunden werden, die zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines interessierenden Liganden komplementär ist. Ein solches Festphasensystem kann für Bestimmungsverfahren eingesetzt werden. Zur Durchführung solcher Bestimmungsverfahren wird eine Fluidprobe, von der vermutet wird, daß sie den Zielliganden enthält, auf die feste Phase aufgebracht, und der interessierende Ligand wird auf der festen Phase eingefangen. Danach wird eine markierte Nukleinsäuresonde zugesetzt, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die zu einem davon verschiedenen Teil der Nukleinsäuresequenz des Zielliganden komplementär ist, um die Bildung eines Komplexes der markierten Nukleinsäuresonde und des auf der festen Phase eingefangenen Liganden zu ermöglichen. Das Erfassen der mit dem Festphasensystem verbundenen Nukleinsäureprobe ergibt einen Hinweis auf die Anwesenheit des Analyten in einer gegebenen Probe.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung eines Festphasensystems, welches Mikrobereiche aufweist, die in einem Glasfaserfilter eingeschlossen sind und die Verwendung eines solchen Festphasensystems zur Durchführung eines Immunoassays gemäß der Erfindung. Die Beispiele werden nur zu Erläuterungszwecken vorgestellt und sollen keinerlei Beschränkung der vorliegenden Erfindung bedeuten.

Beispiel 1 Bestimmung von Antigen

Das im folgenden Beispiel vorgestellte Bestimmungsverfahren ist ein Immunoassay zur Bestimmung von Human-Choriogonadotripin (HCG), ein Antigen, welches mit erhöhten Werten im Urin schwangerer Frauen auftritt.

Aktivieren von Mikrobereichen

Eine monodisperse Schicht aus Polystyrol-Mikrobereichen mit einem Durchmesser von 0,8 Mikron (Interfacial Dynamics Corporation, Portland, Oregon) wurde ausgewählt und aktiviert durch passive Absorption einer Zubereitung monoklonaler Antikörper, die aus der Hybrid-Zellenlinie HCU 061 (Hybritech Invorporated, San Diego, CA) abgeleitet und spezifisch für das HCG-Antigen waren. Die Größe der Mikrobereiche wurde so gewählt, daß sie mit einem Whatman GF/F-Glasfaserfilter (Whatman Company, Clifton, New Jersey) verträglich waren, und zwar durch vorherige Untersuche unter Einsatz von fluoreszenzmarkierten Mikrobereichen, um die Retention innerhalb der Filter zu bestimmen. Die monoklonalen Antikörper wurden erhalten aus Aszites-Fluid und gereinigt durch Na&sub2;SO&sub4;-Fällung und DEAE-Ionenaustauschchromatographie unter Einsatz von Standardverfahren.

Die Antikörper-gebundenen Mikrobereiche wurden dann rückbeschichtet mit einer 1-prozentigen Rinderserumalbuminlösung (BSA) in 50 mM Phosphat (pH = 8,0), um nichtspezifische Bindungen von HCG und markiertem Antikörper herabzusetzen, gefolgt von herkömmlichen Verfahren.

Einfangen von Mikrobereichen

Eine Menge von 10 ul der aktivierten Mikrobereiche wurde in 50 mM Phosphat (pH = 8,0) mit einer Konzentration von 0,25% (Masse/Volumen) resuspendiert und auf das Whatman GF/F-Glasfaserfilter pipettiert, welches in einer Immunokonzentrations-Vorrichtung gemäß Fig. 6 eingebaut war. Danach wurden die Mikrobereiche innerhalb des Filters in einer diskreten kreisförmigen Zone beim Mittelpunkt des Filters sedimentieren gelassen. Das Filter wurde 15 Minuten lang an Luft getrocknet.

Bestimmung von Antigen

Etwa 250 ul Urin mit einem Gehalt von 125 mIU/ml HCG wurden auf das Filter aufgebracht. Es wurden dann etwa 100 ul einer Zubereitung eines zweiten monoklonalen Antikörpers gegenüber HCG zugesetzt, der von der Hybrid-Zellenlinie HCO 514 abgeleitet und mit dem Enzym alkalische Phosphatase markiert war. Nach einer Inkubation von 5 Minuten, währenddessen das enzymmarkierte Antikörperkonjugat durch das Filter gezogen wurde, wurde das Filter mit 2 ml 10 mM mit Tris gepufferter Kochsalzlösung (pH = 8,0) gewaschen. Es wurden dann etwa 100 ul einer Lösung zugegeben, welche Indoxylphosphat, ein Substrat für die Enzymmarkierung, enthielt. Nach einer Inkubation von 5 Minuten wurde das Filter optisch auf eine Farbreaktion untersucht.

In der diskreten Zone des Filters, wo die mit HCO 061- aktivierten Mikrobereiche eingeschlossen war, entwickelte sich eine blaue Farbe, was die Anwesenheit von HCG-Antigen anzeigte.

Beispiel 2 Antikörperbestimmung

Antikörper gegenüber Rubellavirus wurden auf ähnliche Art bestimmt, wie es vorstehend in Beispiel 1 für die Bestimmung von HCG-Antigen beschrieben ist. Mikrobereiche mit einem Durchmesser von 0,8 Mikron, die mit gereinigtem Rubella-Antigen aktiviert worden waren, wurden in einer diskreten Zone des Whatman GF/F-Glasfaserfilters eingeschlossen, welches in einer Immunokonzentrations-Vorrichtung gemäß Fig. 6 eingebaut war. Als negative Kontrolle wurden eine Gruppe mit Nicht-Antigen beschichteten Mikrobereichen in einer benachbarten Zone auf dem Filter eingeschlossen.

Bestimmung von Antikörpern

Eine Menge von 100 ul eines Serums, von dem vorher ermittelt worden war, daß es positiv für die Anwesenheit von Antikörpern gegenüber dem Rubellavirus ist, wurde auf ein zweites Filter aufgebracht, welches wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war. Gleichzeitig wurde eine Menge von 100 ul eines Serums, von dem vorher ermittelt worden war, daß es negativ für die Anwesenheit von Antikörpern auf jedem Filter ist, mit 2 ml einer 10 mM Tris-gepufferten Kochsalzlösung (pH = 8,0), 100 ul enzymkonjugierte Antikörper gegenüber Human-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) zugesetzt und mit dem Human-IgG umgesetzt, welches mit dem mit den Mikrobereichen verbundenen Rubellavirus komplexiert war. Nach Waschen mit 2 ml einer 10 mM Tris-gepufferten Kochsalzlösung (pH = 8,0) zum Entfernen von ungebundenem Konjugat wurde Substrat für die Enzymmarkierung zugesetzt, um die Anwesenheit eines gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes zu bestimmen.

Das positive Serum ergab eine blaue Farbe in der diskreten Zone des Filters, wo mit Rubella-Antigen verbundene Mikrobereiche eingeschlossen waren. (In der Zone der negativen Kontrolle trat keine Farbe auf.) Das negative Serum ergab keine solche Farbreaktion.

Es ist klar, daß die Empfindlichkeit des Bestimmungsverfahrens der Beispiele dadurch eingestellt werden kann, daß man das Volumen und die Konzentration der Mikrobereiche oder Inkubationszeit, die Konzentration des Konjugats oder andere Parameter variiert, die normalerweise in Bestimmungsverfahren verwendet werden.


Anspruch[de]

1. Festphasensystem zur Verwendung in einem Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren zum Erfassen eines ausgewählten Analyten in einer Fluidprobe, umfassend eine poröse Matrix, in die Mikrobereiche eingeschlossen sind, wobei die Mikrobereiche mit einem Rezeptor verbunden sind, der zum Einfangen eines Zielliganden befähigt ist.

2. Festphasensystem nach Anspruch 1, wobei die Matrix eine Membran oder ein Filter ist, in welche(s) Mikrobereiche einer Größe eingeschlossen werden können, die mit der Porengröße der Matrix verträglich ist.

3. Festphasensystem nach Anspruch 2, wobei die Mikrobereiche so ausgewählt sind, daß sie eine Größe aufweisen, die die wirksame Oberfläche der Mikrobereiche innerhalb der Matrix maximiert.

4. Festphasensystem nach Anspruch 2, wobei die Mikrobereiche so ausgewählt sind, daß sie eine Durchmessergröße im Bereich von etwa 0,1 Mikron bis etwa 50 Mikron aufweisen.

5. Festphasensystem nach Anspruch 2, wobei die Mikrobereiche so ausgewählt sind, daß sie eine Durchmessergröße im Bereich von etwa 0,1 Mikron bis etwa 2,3 Mikron aufweisen.

6. Festphasensystem nach Anspruch 1, wobei die Mikrobereiche in der Matrix auf eine Weise eingeschlossen sind, daß sie Beweglichkeit der Mikrobereiche innerhalb der Matrix gestattet und die Aggregation oder Adhesion der Mikrobereiche innerhalb der Matrix unterbunden ist.

7. Festphasensystem nach Anspruch 2, wobei die Membran oder das Filter ein Material darstellt, welches ausgewählt ist aus Glasfasern, Nylon oder Keramikmaterialen.

8. Festphasensystem nach Anspruch 1, wobei die Mikrobereiche innerhalb einer diskreten Zone der Matrix eingeschlossen sind.

9. Festphasensystem nach Anspruch 1, wobei die Mikrobereiche ein polymeres Material aufweisen, welches zum Eingehen einer Bindung mit dem Rezeptor befähigt ist.

10. Festphasensystem nach Anspruch 9, wobei das polymere Material ausgewählt ist aus Latex, Polyethylen, Polypropylen und Polystyrol und Copolymeren davon.

11. Festphasensystem nach Anspruch 1, wobei das Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptor ein Immunoassay ist.

12. Festphasensystem nach Anspruch 11, wobei der mit den Mikrobereichen verbundene Rezeptor ein Antikörper oder ein Antigen ist, welcher(s) zum Einfangen des Zielliganden befähigt ist.

13. Festphasensystem nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

14. Festphasensystem zum Einsatz in einem Vielfach-Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren zum gleichzeitigen Erfassen von mindestens zwei ausgewählten Analyten in einer Fluidprobe, umfassend eine poröse Matrix, in die innerhalb diskreter Zonen unterschiedliche Gruppen von Mikrobereichen eingeschlossen sind, wobei jede der unterschiedlichen Gruppen von Mikrobereichen mit einem Rezeptor verbunden ist, der zum Einfangen eines anderen Zielliganden befähigt ist.

15. Festphasensystem nach Anspruch 14, wobei die Matrix eine Membran oder ein Filter ist, in welche(s) Mikrobereiche einer Größe eingeschlossen werden können, die mit der Porengröße der Matrix verträglich ist.

16. Festphasensystem nach Anspruch 15, wobei die Membran oder das Filter ein Material darstellt, welches ausgewählt ist aus Glasfasern, Nylon oder Keramikmaterialen.

17. Festphasensystem nach Anspruch 14, wobei die Mikrobereiche ein polymeres Material aufweisen, welches zum Eingehen einer Bindung mit dem Rezeptor befähigt ist.

18. Festphasensystem nach Anspruch 17, wobei das polymere Material ausgewählt ist aus Latex, Polyethylen, Polypropylen und Polystyrol und Copolymeren davon.

19. Festphasensystem nach Anspruch 14, wobei das Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptor ein Immunoassay ist.

20. Festphasensystem nach Anspruch 19, wobei der mit mindestens einer Gruppe von Mikrobereichen verbundene Rezeptor ein Antikörper oder ein Antigen ist, welcher(s) zum Einfangen des Zielliganden befähigt ist.

21. Festphasensystem nach Anspruch 20, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

22. Festphasensystem nach Anspruch 21, wobei die Gruppe von Mikrobereichen mindestens zwei Unterpopulationen von Mikrobereichen umfaßt, mit der monoklonale Antikörper verbunden sind, die so ausgewählt sind, daß sie sich an nicht interferierende Epitope des Zielliganden anhängen.

23. Festphasensystem zur Verwendung in einem Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren zum Erfassen mindestens eines ausgewählten Analyten in einer Fluidprobe, umfassend eine poröse Matrix, in die innerhalb diskreter Zonen bestimmte Gruppen von Mikrobereichen eingeschlossen sind, wobei

a) mindestens eine Gruppe von Mikrobereichen mit einem Rezeptor verbunden ist, der zum Einfangen eines Zielliganden befähigt ist; und

b) als positive Kontrolle für das Erfassen des Analyten mindestens eine Gruppe von Mikrobereichen mit dem Zielliganden oder einer anderen geeigneten Rezeptorsubstanz verbunden ist.

24. Festphasensystem zur Verwendung in einem Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptoren zum Erfassen mindestens eines ausgewählten Analyten in einer Fluidprobe, umfassend eine poröse Matrix, in die innerhalb diskreter Zonen bestimmte Gruppen von Mikrobereichen eingeschlossen sind, wobei

a) mindestens eine Gruppe von Mikrobereichen mit einem Rezeptor verbunden ist, der zum Einfangen eines Zielliganden befähigt ist; und

b) als negative Kontrolle für das Erfassen des Analyten mindestens eine Gruppe von Mikrobereichen mit einer Substanz verbunden ist, die zum Erfassen des Zielliganden nicht befähigt ist, oder ohne gebundene Komponente ist.

25. Festphasensystem nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Matrix eine Membran oder ein Filter ist, in welche(s) Mikrobereiche einer Größe eingeschlossen werden können, die mit der Porengröße der Matrix verträglich ist.

26. Festphasensystem nach Anspruch 25, wobei die Membran oder das Filter ein Material darstellt, welches ausgewählt ist aus Glasfasern, Nylon oder Keramikmaterialen.

27. Festphasensystem nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Mikrobereiche ein polymeres Material aufweisen, welches zum Eingehen einer Bindung mit dem Rezeptor befähigt ist.

28. Festphasensystem nach Anspruch 27, wobei das polymere Material ausgewählt ist aus Latex, Polyethylen, Polypropylen und Polystyrol und Copolymeren davon.

29. Festphasensystem nach Anspruch 23 oder 24, wobei das Bestimmungsverfahren mit Ligandenrezeptor ein Immunoassay ist.

30. Festphasensystem nach Anspruch 29, wobei der mit mindestens einer Gruppe von Mikrobereichen verbundene Rezeptor ein Antikörper oder ein Antigen ist, welcher(s) zum Einfangen des Zielliganden befähigt ist.

31. Festphasensystem nach Anspruch 30, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

32. Festphasensystem nach Anspruch 30, weiter aufweisend eine bestimmte Gruppe von Mikrobereichen, an die der Zielligand oder eine andere geeignete Rezeptorsubstanz als positive Kontrolle gebunden ist.

33. Festphasensystem nach Anspruch 1, wobei das Bestimmungsverfahren ein Verfahren zum Bestimmen von Nukleinsäuren ist, und wobei der Rezeptor eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die komplementär zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz des Zielliganden ist.

34. Festphasensystem nach Anspruch 10, 18 oder 28, wobei die Mikrobereiche Latex aufweisen.







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