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Dokumentenidentifikation DE3782394T2 19.05.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0263184
Titel IMMOBILISIERTES, PHYSIOLOGISCH AKTIVES MATERIAL.
Anmelder Toray Industries, Inc., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder NAGAOKA, Shoji;
KURUMATANI, Hajimu;
MORI, Yuichi, Kamakura-shi Kanagawa-ken 248, JP
Vertreter Kador, U., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 8000 München
DE-Aktenzeichen 3782394
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 26.03.1987
EP-Aktenzeichen 879021517
WO-Anmeldetag 26.03.1987
PCT-Aktenzeichen JP8700185
WO-Veröffentlichungsnummer 8706007
WO-Veröffentlichungsdatum 08.10.1987
EP-Offenlegungsdatum 13.04.1988
EP date of grant 28.10.1992
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.05.1993
IPC-Hauptklasse G01N 33/545
IPC-Nebenklasse C12N 11/06   C07K 17/06   

Beschreibung[de]
Gebiet dieser Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf eine fixierte bzw. befestigte physiologisch aktive Substanz und auf Fixier- bzw. Befestigungsmaterialien zum Fixieren dieser physiologisch aktiven Substanzen nach den Ansprüchen.

Hintergrund dieser Erfindung

Gegenwärtig ist eine Anzahl von Untersuchungen über die Fixierung physiologisch aktiver Substanzen auf Trägern in der festen Phase bekannt. Die Grundrichtung dieser Untersuchung richtet sich heute auf die Fixierung von Enzymen, und so gibt es viele Versuche dieser Art; sie umfassen: die Fixierung von immunitätsreaktiven Substanzen, z. B. Antigenen und Antikörpern, um Materialien zur medizinischen Behandlung zu gewinnen; die Adsorption bestimmter physioaktiver bzw. physiologisch aktiver (nachfolgend als physiologisch aktiv bezeichnet) Substanzen durch Trennmaterialien bei der Affinitätschromatographie; und die Fixierung faßbarer Komponenten, z. B. vorteilhafter Pilzkörper und Zellen für die Verwendung in Bioreaktoren und/oder künstlichen Organen.

Der hier verwendete Begriff "Fixierung" bedeutet, daß diese physiologisch aktiven Substanzen, die ursprünglich wasserlöslich sind, ohne Beeinflussung ihrer physiologischen Funktionen wasserunlöslich gemacht werden. Es gibt verschiedene Verfahren für diese Fixierung, sie umfassen das Binden an einen Träger, Brückenbildungs- und Integrationsverfahren. Von diesen Verfahren bildet das Binden an einen Träger, das die Fixierung der gewünschten Substanz durch eine kovalente Bindung mit dem Träger erreicht, das beständigste Ergebnis mit der höchsten Bindungskraft und folglich mit der geringsten Ablösung. Eines von vielen beschriebenen Beispielen dieses Verfahrens ist die Diazo-Bindung eines Proteins (z. B. Albumin) zu dessen Fixierung an einer Diazoniumverbindung, die durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure und Natriumnitrat zu einem wasserlöslichen Träger (R-NH&sub2;) erhalten wurde, der eine Aminogruppe enthält. (Chambell et al., Proc.Nat.Acad.Sci., 37, 575 (1951)).

Als Verbesserung dieses Verfahrens zum Binden an einen Träger wird seit neuestem eine geradkettige Struktur, die als "Spacer bzw. Zwischenstück" oder "Arm" bezeichnet wird und eine n-Alkylkette enthält, zwischen dem Träger und der zu bindenden physiologisch aktiven Substanz eingeführt. Dies erfolgt, weil die Einführung dieser Struktur die Fixierung der physiologisch aktiven Substanz an einer Seite der Struktur gestattet, wodurch eine sterische Beeinflussung bzw. Infektion verringert wird, die aus der Reaktion der Substanz mit dem Substrat entsteht, wodurch deren Funktion erleichtert wird.

EP-A-187 391 (Entgegenhaltung gemäß Artikel 54(3)) beschreibt einen Träger zum Fixieren physiologisch aktiver Substanzen. Dieser Träger ist vom Typ vernetzter Polymere und Polyoxyethylen.

Aus FR-A-2 351 990 ist ein Verfahren zur Herstellung einer Trägersubstanz bekannt, die sich mit einem biologischen Material binden kann, indem das Verbindungsmittel über einen Spacer und ein Kopplungsmittel mit dem Träger reagiert. Dieser Spacer kann Polyethylenglycol mit geringem Molekulargewicht sein.

Kim et al. fixierte zum Beispiel Heparin, ein gerinnungsbzw. flockungshemmendes Mittel, auf Agarose-Perlen, die als Spacer eine n-Alkylkette enthalten (worin n 2, 4, 8, 10 oder 12 ist), und fand, daß die gerinnungshemmende Wirkung mit längerer Alkylkette höher wird, dies wurde durch den aktivierten Teil der Thromboplastinzeit (APTT) gemessen. Dieses Phänomen wurde als "Spacer-Effekt" bezeichnet. (Kim et al., Thrombosis Research, 26, 43 (1982))

Ein hydrophober Spacer, z. B. eine n-Alkylkette hat eine geringere Affinität gegenüber im wesentlichen wasserlöslichen physiologisch aktiven Substanzen, und folglich muß die Fixiergeschwindigkeit verringert werden, oder durch die Firung kann eine Denaturierung oder Deaktivierung der physiologisch aktiven Substanzen hervorgerufen werden. Da eine lange n-Alkylkette im Verhältnis zur funktionellen Endgruppe wasserunlöslich ist, ist es außerdem notwendig, ein organisches Lösungsmittel zu verwenden, um sie in den Träger einzubringen, und das verwendete organische Lösungsmittel sollte aus einem äußerst begrenzten Bereich ausgewählt werden, da einige Träger durch einige organische Lösungsmittel gelöst, denaturiert oder beschädigt werden.

Auf der Oberfläche dieses Trägers, der durch die Einführung eines hydrophoben Spacers hydrophob gemacht wurde, können eine unspezifische Adsorption und/oder Denaturierung anderer physiologisch aktiver Substanzen auftreten, insbesondere von Proteinen. Dies kann die wesentliche Funktion der fixierten physiologisch aktiven Substanzen beeinflussen.

Ein Zweck dieser Erfindung besteht in der Schaffung von Fixiermaterialien zur Verwendung bei physiologisch aktiven Substanzen, die deren physiologisch aktive Funktionen deutlich zeigen können, nachdem sie fixiert wurden. Ein weiterer Zweck dieser Erfindung besteht in der Schaffung fixierter physiologisch aktiver Substanzen, die durch diese Fixiermaterialien fixiert wurden und eine hohe Aktivität aufweisen.

Beschreibung dieser Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auffixierte physiologisch aktive Substanzen, die durch Bindung von physiologisch aktiven Substanzen und Trägern über eine Alkylenoxidkette nach den Ansprüchen erhalten wurden, und auch auf Fixiermaterialien zur Verwendung bei dieser Verbindung.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Die als Spacer bei dieser Erfindung verwendete Alkylenoxidkette ist entweder Polyethylenoxid oder ein Ethylenoxid-Copolymer mit der allgemeinen Formel:

(worin eine ganze Zahl eines Wertes im Bereich von 2 bis einschließlich 100 ist; m und n 0 oder eine positive ganze Zahl sind; und

Wenn ein Copolymer verwendet wird, kann es entweder ein statistisches oder ein Blockcopolymer oder eine Mischung davon sein, der bevorzugteste Spacer ist das Blockpolymer oder Homopolymer mit einem Polymerisationsgrad im Bereich von 2 bis 100 und einem Gehalt an Ethylenoxid-Einheiten (-CH&sub2;CH&sub2;O-) von mehr als 50 Gew.-%.

Die in dieser Erfindung verwendeten Träger sind wasserunlöslich. Wasserunlöslich bedeutet hier eine wesentliche Unlöslichkeit in Wasser bei 20ºC. Als derartige wasserunlösliche Materialien werden natürliche oder synthetische organische oder anorganische Polymere verwendet, sie umfassen: Cellulosen, wie Celluloseacetat; Polysaccharide, wie Dextrin; Collagene; Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen; Homopolymere oder Copolymere von Vinylverbindungen, wie Vinylacetat, Vinylchlorid, Acrylnitril, Acrylsäureester, Methacrylsäureester und Styrol; Polyester, wie Polyethylenterephthalat und Polybutylenterephthalat; und aliphatische und aromatische Polyamide. Bei Bedarf wird bei diesen Materialien eine Brückenbildungs-Behandlung vorgenommen, um sie wasserunlöslich zu machen.

Da der Träger bei dieser Erfindung mit einer Alkylenoxidkette als Spacer gebunden ist, muß der Träger als Verbindung mit dem Spacer eine funktionelle Gruppe enthalten. Wenn diese funktionelle Gruppe nicht enthalten ist, wird folglich eine Aktivierungsbehandlung durchgeführt, um die funktionelle Gruppe in den Träger einzuführen. Außerdem kann die Alkylenoxidkette unter Verwendung eines Monomers, das eine Alkylenoxidkette als Nebenkette enthält, als Copolymerisationskomponente des Polymers eingebracht werden, aus dem der Träger gebildet wird, dies wird später beschrieben.

Nach dieser Erfindung ist der Träger eine äußerst dünne Faser mit weniger als 9 tex (1,0 den). Diese Faser kann aus Polymeren zusammengesetzt werden, diese umfassen Polyester, Polyamid, Polytetrafluorethylen, Polystyrol, Polyolefin, Cellulose, Polyaminosäure und Collagen, obwohl Polyester besonders bevorzugt ist. Wenn eine Mehrkomponentenfaser verwendet wird, sollte das Polymer, das schließlich zurückbleibt, eines von den oben genannten sein; Polystyrol, Polyethylen, wasserlösliches Polyamid, in einer alkalischen Lösung löslicher Polyester und wasserlösliche Polyvinylakohole können jedoch für andere Verbindungskomponenten verwendet werden. Die aus diesen Polymeren zusammengesetzten äußerst dünnen Fasern werden bei dieser Erfindung für die Träger in Form eines Gewebes, eines Gewirkes oder einer ungewebten Anordnung verwendet.

Die Alkylenoxidkette kann mit der Trägeroberfläche verbunden werden, z. B. durch:

(1) ein Verfahren, das eine Kopplungsreaktion verwendet, oder

(2) ein Verfahren, das ein Polymer oder Copolymer verwendet, das ein Monomer mit der Alkylenoxidkette als Nebenkette umfaßt und auch eine polymerisierbare Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung aufweist.

Von diesen Verfahren ist (1) bevorzugt, und es ist besonders bevorzugt, eine Alkylenoxidkette zu verwenden, die an einer Seite als funktionelle Gruppe eine Aminogruppe oder eine Epoxygruppe enthält.

Konkret wird diese Bindung erreicht, indem die Überschußmenge der Alkylenoxidkette, die an jeder Seite als funktionelle Gruppe eine Aminogruppe enthält, mit dem Träger reagieren kann, der ein Polymer umfaßt, das eine funktionelle Gruppe enthält, die sich mit der Aminogruppe verbinden kann. Diese funktionelle Gruppe kann zum Beispiel eine Epoxygruppe sein; dieses Polymer kann zum Beispiel ein Polymer, das als Copolymerkomponente Glycidilmethacrylat enthält; oder kann ein ungehärtetes Epoxyharz sein.

Andererseits kann das Verfahren (2) einen Träger verwenden, der ein wasserunlösliches Copolymer mit einer Monomereinheit aufweist, die durch die Formel dargestellt wird:

(worin p eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 oder mehr ist; und R entweder H oder CH&sub3; darstellt), oder es kann einen Träger verwenden, der mit diesem Monomer beschichtet ist.

Als Copolymerkomponente kann alles verwendet werden, das mit dem Monomer polymerisiert werden und ein wasserunlösliches Polymer bilden kann. Methylmethacrylat, Acrylnitril, Styrol und Vinylchlorid sind Beispiele dafür. Es ist auch bevorzugt, eine Copolymerisation mit einem brückenbildenden Monomer vorzunehmen, z. B. Diethylenglycoldimethacrylat.

Wenn dieses Copolymer als Beschichtungsmittel verwendet wird, ist die Dicke der Überzugsschicht nicht besonders eingeschränkt, obwohl 10 nm (100 ) oder mehr üblicherweise bevorzugt sind. Das Material des inneren Teils dieses Trägers ist nicht besonders begrenzt, es sollte jedoch entsprechend der Anwendung eine geeignete Auswahl aus zum Beispiel organischen Polymeren, Glas, Metallen usw. vorgenommen werden.

Die Menge der mit der Trägeroberfläche gebundenen Alkylenoxidkette kann willkürlich geregelt werden, indem die chemische Zusammensetzung des Trägers und/oder die Bedingungen für die Reaktion geändert werden. Um einen wirksamen Betrag der Fixierung der physiologisch aktiven Substanz zu erhalten, ist es bevorzugt, mindestens 1 · 10&supmin;&sup8; Mol pro cm² des Trägers zu binden.

Die Fixierung der physiologisch aktiven Substanz auf der mit dem Träger gebundenen Alkylenoxidkette kann einfach erreicht werden, indem eine funktionelle Gruppe eingeführt wird, die mit der funktionellen Gruppe eine kovalente Bindung in die Alkylenoxidkette an einem Ende bilden kann.

Diese funktionelle Gruppe, die reagieren kann, um mit der physiologisch aktiven Substanz eine kovalente Bindung zu bilden, kann eine Amino-, Carboxyl-, Epoxy-, Hydroxy-, Carbodiimid-, Aldehyd-, Isocyanat- oder Imidazolgruppe sein, obwohl die Hydroxyl-, Amino- und Epoxygruppen besonders bevorzugt sind, da sie leicht in eine Seite der Polyethylenoxidverbindung eingeführt werden können. Zur Bildung dieser kovalenten Bindung zwischen der funktionellen Gruppe und der physiologisch aktiven Substanz können bei Bedarf bekannte Verfahren verwendet werden, wie sie zum Beispiel in "Fixed Enzymes" von Ichiro SENBATA, Seiten 11 bis 40, Kodansha (1975) aufgestellt sind.

Falls die Polyethylenoxidverbindung, die mit der Oberfläche des wasserunlöslichen Trägers verbunden ist, zum Beispiel an einer Seite eine freie Aminogruppe enthält, kann die Fixierung erreicht werden, indem als Bindemittel Glutaraldehyd verwendet wird, um zwischen der Aminogruppe in der Polyethylenoxidverbindung und der anderen Aminogruppe, die in der physiologisch aktiven Substanz enthalten ist, z. B. ein Protein, eine Schiffsche Base zu bilden.

Wenn die zu fixierende physiologisch aktive Substanz eine Carboxylgruppe enthält, kann die Fixierung auf diesem Träger nur dann leicht erreicht werden, wenn die entsprechende Substanz später mit einem Kondensationsmittel behandelt wird, z. B. Carbodiimid-Reagenz oder Woodwards-Reagenz K (N-Ethyl-5- phenylisooxazolium-3-sulphonat). Beispiele der zu fixierenden physiologisch aktiven Substanz sind folgende: Enzyme, wie z. B. Asparaginase, Urease und Urokinase; Hormone, wie Human- Chorionogonatropin und Schilddrüsen stimulierendes Hormon; Blutplasmaproteine, die durch Coagulationsfaktoren repräsentiert werden, z. B. Albumin, verschiedene ergänzende Materialien und Thrombin und gerinnungshemmende Faktoren, wie Antithrombin III; immunitätsreaktive Materialien, wie Mykoplasma- Antigen und Östrogen-Antigen; Mukopolysaccharide, wie Heparin, Heparan-Schwefelsäure (heparan sulfuric acid), Chondroitin-Schwefelsäure und Hyaluronsäure; Aminosäuren, wie Alanin, Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; verschiedene Prostaglandin-Derivate; Glycolipide, wie Lipopolysaccharid; Antibiotika, wie Polymyxin B und Chloramphenicol; Blutzellen, wie Erythrozyt, Leucozyt (Granulozyt und Phagozyt) und Lymphe; Epithelzellen oder Endothelzellen, wie Endothelzellen vom Blutgefäß, Leberzellen und Pankreaszellen B; verschiedene Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren, wie ECFG und CSF (Zerebrospinalflüssigkeit), die mit der Differenzierung und/oder dem Wachstum der Zellen in Zusammenhang stehen; und Gen-verwandte Materialien- wie DNS und RNS. Davon können je nach Anwendung geeignete Substanzen ausgewählt werden.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung weiter.

Beispiel 1 und Vergleiche 1 und 2 (Effektivität des Spacer) (Herstellung des Spacer)

Eine gemischte Lösung von Polyethylenglycol mit einem Polymerisationsgrad von 23 (Zahlenmittel des Molekulargewichts 1000) und Acrylnitril konnte zur Cyanoethylbildung in Gegenwart eines mikrogranularen stark basischen Anionenaustauschharzes "Amberlite® IRA-400" (Rohm & Haas) reagieren, um die Polyethylenoxidverbindung herzustellen, die an jeder Seite eine β-Cyanoethoxygruppe aufweist. Dann wurden 100 g dieser Verbindung in 1 l Wasser gelöst, danach wurde 6 Stunden lang Wasserstoff bei 60ºC in diese Lösung eingeführt. Somit wurden 91 g der Bisaminopolyethylenoxid-Verbindung (PGD-1000) mit einer Aminogruppe an jeder Seite und mit einem Polymerisationsgrad von 23 hergestellt.

(Herstellung des Trägers zum Vergleich)

Um den Träger herzustellen, wurde das oben hergestellte PGD- 1000 in einen Film bzw. eine Folie aus Polyvinylchlorid-Copolymer eingeführt, das eine Epoxygruppe enthielt, wobei das nachfolgend beschriebene Verfahren verwendet wurde.

Zuerst wurde handelsübliches Polyvinylchlorid (PVC) in 4 l N,N-Dimethylformaldehyd (DMF) gelöst. Dann wurden der Lösung 11 g Natriumdiethyldithiocarbamat (PTC) zugesetzt und das ganze konnte 3 Stunden lang bei 50ºC bei lichtgeschützten Bedingungen reagieren, um photofunktionelles DTC-iertes PVC zu erzeugen.

50 g dieses so erzeugten DTC-ierten PVC wurden in 1 l Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Dann wurden der Lösung 80 g Glycidylmethacrylat (GMA) zugesetzt, und es konnte 6 Stunden lang bei 40ºC beim Licht einer Quecksilber-Hochdrucklampe mit 100 Watt eine Licht-Pfropfreaktion stattfinden, um das Polyvinylchlorid-Glycidylmethacrylat-Pfropfcopolymer (PVC-g-GMA) zu erzeugen, das eine Epoxygruppe enthielt. Die Pfropfrate dieses Copolymers wurde durch Elementaranalyse bestimmt und betrug 86%.

Von einer 5%-igen THF-Lösung dieses Polymers wurde durch ein Gußverfahren mit einem Lösungsmittel unter Verwendung einer Glasplatte ein Film mit einer Dicke von etwa 100 um hergestellt. Dieser dünne Film wurde in eine 50%-ige Lösung von PGD-1000 getaucht und konnte 24 Stunden lang bei 60ºC reagieren, so daß der Spacer auf der Filmoberfläche eingeführt wurde.

Nach dem Bestimmungsverfahren der eingeführten Aminogruppe unter Verwendung einer Addukt-Bildung von Benzilamin und 2- Hydroxy-q-naphthylamid (HNA) (C.D. Ebert et al., J. Biomed. Mater. Res., 16, 629 (1982)) wurde die Menge des in die Filmoberfläche eingeführten PGD-1000 mit 0,7 uMol/cm² bestimmt. Aus der Abnahme des Wasserkontaktwinkels an der Filmoberfläche von 650 auf 430 aufgrund der Einführung von PGD-1000 wurde gefunden, daß die Filmoberfläche deutlich hydrophilisiert war (die Messung wurde mit einem Kontaktwinkel- Meßgerät vom Typ CA-P von Kyowa Kagaku K.K. durchgeführt).

(Fixierung von Heparin)

800 mg Natriumheparin und 0,07 g Woodwards-Reagenz K wurden in einem Glasgefäß in 100 ml einer Phosphor-Pufferlösung von isotonischem Natriumchlorid (PBS) gelöst und dann 8 Stunden lang bei 4ºC langsam gerührt, um das Heparin zu aktivieren. In diese aktivierte Heparinlösung wurde der Film mit dem eingeführten PGD-1000 getaucht, es wurde eine Reaktionszeit bei 4ºC gestattet, um das Heparin auf der Filmoberfläche zu fixieren.

Nach Abschluß dieser Reaktion wurde der Film dreimal mit PBS gewaschen, um das nicht fixierte Heparin zu entfernen. Dann wurde eine 2 m Ethanolamin-PBS-Lösung zugesetzt, die vorher mit Chlorwasserstoffsäure auf pH = 7,4 eingestellt worden war, so daß sie 24 Stunden lang bei 4ºC hindurchgehen konnte, um die restliche aktive Gruppe des Heparin zu blockieren. Es wurde gefunden, daß auf der so erhaltenen Filmoberfläche mit dem fixierten Heparin 0,2 mg/cm² Heparin fixiert waren, dies ist das Ergebnis einer ESCA (Elektronenspektroskopie zur chemischen Analyse) (die unter Verwendung eines Röntgenelektronenspektroskops ESCA 750 von Shimazu durchgeführt wurde).

(Messung der Aktivität von Heparin)

Der aktivierte Teil der Thromboplastinzeit (APTT) wurde verwendet, um die gerinnungshemmende Wirkung des fixierten Heparin zu messen.

Unter Verwendung einer 3,8%-igen Lösung von Natriumcitrat als gerinnungshemmendes Mittel wurde ein Versuch bei Rinderblutplasma vorgenommen, bei dem die Zellkomponenten vorher durch Zentrifugieren entfernt worden waren. In 1 ml dieses Plasmas wurde der Film mit dem fixierten Heparin mit einer spezifischen Oberfläche von 20 cm² eingeführt, und diese Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC gerührt. Dann wurde das Plasma vom Film getrennt und in ein Prüfrohr aus mit Silicon beschichtetem Glas gegossen, dem außerdem 0,1 ml eines aktivierten Phospholipid-Mittels zugesetzt wurde. Diese Mischung wurde 30 Sekunden lang bei 37ºC gehalten und dann 5 Minuten lang erwärmt. Danach wurden diesem Prüfrohr 0,1 ml einer 1/40 m CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt, die dann 30 Sekunden lang bei 37ºC stehen konnte und leicht geneigt wurde. In diesem Zustand wurde die Dauer der Fibrinfällung bei APTT gemessen.

Zum Vergleich wurden Träger hergestellt, die Hexamethylendiamin bzw. Diaminododecan als Spacer enthielten, auf ihnen wurde Heparin fixiert und die Aktivität des Heparin wurde jeweils bei den gleichen Bedingungen gemessen. Die Meßergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1: Aktivität der Polyvinylchloridfilme mit fixiertem Heparin, die verschiedene Spacer enthalten
Spacer Strukturformel Menge des eingeführten Spacer Menge des fixierten Heparin Kontrolle (PVC-g-GMA-Film) keiner Null Beispiel Vergleich Hexamethylendiamin Diaminododecan

Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, war die Gerinnungsaktivität des Heparin, das unter Verwendung des Spacers dieser Erfindung fixiert worden war, deutlich höher als die von Heparin, das unter Verwendung der herkömmlichen hydrophoben n-Alkyl-Spacer fixiert worden war.

Beispiel 2 und Vergleich 3 (zum Vergleich)

In 1000 g Isopropanol wurden 120 g Methylmethacrylat (MMA), 80 g Polyethylenglycolmonomethacrylat ("Blenmer-PE-350" von Nihon Yushi K.K., das einen Polyethylenglycol-Teil mit einem Zahlenmittel des Polymerisationsgrads von 9 aufweist) und 1,4 g α,α'-Azobis(α,α'-dimethylvaleronitryl) zugesetzt und konnten unter einem Stickstoffgasstrom bei 50&sup0;C reagieren. Nach 5 Stunden wurde die erhaltene polymerisierte Lösung in ein Gefäß mit 2 mm kleinen Löchern im Boden gegeben, durch diese Löcher konnte die Lösung aus einer Höhe von 1 m in kontinuierlich gerührtes kaltes Wasser fallen. Somit konnten Polymerpartikel von 50 bis 100 um Durchmesser erhalten werden. Durch ESCA-Analyse wurden auf der Oberfläche dieser Polymerpartikel etwa 20 mMol/g der Polyethylenglycol-Kette gefunden.

Dann wurden 10 g dieser Polymerpartikel ausreichend mit Wasser gewaschen und in 180 ml einer 1 m NaOH-Lösung suspendiert, der außerdem 10 ml Epichlorhydrin zugesetzt wurden. Dann wurde die Mischung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur kräftig gerührt, damit die Reaktion auftrat. Nach Abschluß der Reaktion wurde der Träger, der den Spacer aus mit Epichlorhydrin aktiviertem Polyethylenoxid enthielt, gesammelt und das überschüssige Epichlorhydrin wurde ausgewaschen. Dieser Träger wurde in eine 2 m Kaliumcarbonat-Pufferlösung gehängt, die 3 g Sulfanilsäure (pH = 10) enthielt. Der pH-Wert dieser Mischung wurde wieder auf 10 eingestellt und dann konnte sie 6 Tage lang stehen bleiben. Auf dem so erhaltenen Träger konnte Phloroglicinol arbeiten, um ein Phloroglicinol- Derivat zu erzeugen, dem 5%-iges Divinylsulfon zugesetzt wurde, um 30 Minuten lang bei einem pH-Wert von 11 zu reagieren. Dann wurde bei einem pH-Wert von 9 Sojabohnen-Trypsininhibitor als Ligand zugesetzt.

Durch dieses Verfahren konnte ein Träger erhalten werden, auf dem der Sojabohnen-Trypsininhibitor fixiert war und der Polyethylenoxid als Spacer enthielt.

Zum Vergleich wurden Polymerpartikel unter Verwendung von Hydroxyethylmethacrylat als Copolymerkomponente von MMA hergestellt, und der Sojabohnen-Trypsininhibitor wurde in der gleichen Weise wie oben beschrieben auf dem Träger fixiert.

Die Ergebnisse des Vergleichs der Trypsin-Adsorptionskapazität sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2: Trypsin-Adsorptionskapazität verschiedener Träger
Spacer (Strukturformel) Menge des fixierten Trypsininhibitors (in mg oder ml bei einem feuchten Träger) Trypsin-Adsorptionskapazität Beispiel Vergleich

Wie es oben gezeigt ist, lieferte das durch die vorliegende Erfindung erhaltene Adsorbat eine höhere Adsorptionskapazität.

Beispiel 3 und Vergleich 4

400 g einer Komplexfaser vom See-Insel-Typ mit 50 Teilen Polypropylen (Mitsui "Noblen" J3HG) als Insel-Komponente und mit einer Mischung aus 46 Teilen Polystyrol ("Styrop" 679) und 4 Teilen Polypropylen (Sumitomo "Reblen" WF-727-F) als See-Komponente wurden in eine Mischungslösung getaucht, die 560 g N-Methylolchloracetamid, 3100 ml Nitrobenzol, 2020 ml konzentrierte Schwefelsäure und 8 g Paraformaldehyd enthielt, und das ganze konnte eine Stunde lang bei 20ºC reagieren. Dann wurde die Faser aus der Reaktionslösung entnommen und in 5 l Eiswasser mit 0ºC gegeben, um die Reaktion zu unterbrechen. Dann wurde sie mit Wasser gewaschen, gefolgt von einer Extraktion und Entfernung von Nitrobenzol aus der Faser unter Verwendung von Methanol. Die Faser wurde bei 40ºC im Vakuum getrocknet, um die chloracetamidmethylierte Faser (Faser A) zu erzeugen.

Diese Faser hatte einen Durchmesser von 4,5 tex (0,5 den). Dann wurden 3000 ml einer 20 Gew.-%-igen Dimethylsulfoxidlösung der gleichen Bisaminopolyethylenoxid-Verbindung (PGD- 1000) wie in Beispiel 1 zu 80 g der Faser A gegeben, und das ganze konnte 48 Stunden lang bei Raumtemperatur zur Reaktion stehen bleiben. Dann wurde die Faser mit 20 l Wasser und anschließend mit 1 n HCl gewaschen. Außerdem wurde sie mit 20 l Wasser gewaschen, um die Faser zu erzeugen, in die die Polyethylenoxidkette mit einer Aminogruppe an einem Ende eingeführt worden war.

In einen Kolben wurden 1,3 g dieser Faser gegeben und eine 3%-ige Phosphor-Pufferlösung von isotonischem Natriumchlorid (PBS) wurde zugesetzt. Der Kolben wurde dann 4 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt.

Zu der ausreichend mit PBS gewaschenen Faser wurden 2,5 Gew.- % einer wäßrigen Lösung von Polypeptid-antibiotischem Polymyxinsulfat B (Fiser Co.) und 7 ml PBS zugesetzt, und die Fixiereinrichtung wurde 24 Stunden lang bei 4ºC langsam gerührt, um die Fixierung zu erreichen. Dann wurde sie 24 Stunden lang bei 4ºC in diese Pufferlösung getaucht, um die restliche freie Aminogruppe zu blockieren. Dann wurde die Faser in 5 ml einer 0,1 Gew.-%-igen PBS-Lösung von Natriumborhydrid gegeben und 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, um die gebildete Schiffsche Base zu reduzieren. Somit wurde eine Faser mit fixiertem Polymyxin B (PMK-PEO) erhalten.

Die an diese Faser fixierte Menge von Polymyxin B wurde durch Aminosäureanalyse gemessen. Das Ergebnis lautete 3,5 mg/g der Faser.

Zum Vergleich wurde eine Faser (PMK-C12), an die Polymyxin B mit Diaminododecan als Spacer fixiert war, in der gleichen Weise wie oben erhalten. Die Menge des Polymyxin B, das an diese Faser fixiert war, betrug 3,8 mg/g der Faser.

Unter Verwendung von E. coli (ATCC25922) wurde die antibakterielle Wirkung dieser Fasern gemessen, und das erhaltene Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3: Antibakterielle Wirkung der Fasern, an denen Polymyxin B fixiert ist
Anfangskonzentration Nach 1 h Schütteln Bakterienlösung (Kontrolle) Bakterien/ml Beispiel Anzahl der Bakterien im Kontakt mit Vergleich

Bedingung des Versuchs:

1 g jeder Faser mit dem fixierten Polymyxin B wurde in 30 ml der Bakterienlösung getaucht, und nach dem Schütteln der Lösung bei 37ºC wurde die Anzahl der Bakterien gemessen.

Wie oben gezeigt hat das unter Verwendung des Spacers dieser Erfindung fixierte Polymyxin B eine höhere antibakterielle Wirkung als im Falle des Alkyl-Spacer.

Industrielle Anwendbarkeit

Die erfindungsgemäßen Fixiermaterialien zur Verwendung bei physiologisch aktiven Substanzen können eine Fixierung liefern, wobei die physiologisch aktive Funktion dieser Substanzen aufrechterhalten wird. Folglich können die physiologisch aktiven Substanzen, die unter Verwendung dieser Fixiermaterialien fixiert wurden, für Grundmaterialien der Affinitätschromatographie zum Zwecke der Trennung und/oder Reinigung der Materialien, Ausrüstungskomponenten für medizinische Diagnosen und Behandlung und Implantatmaterialien für Organe im lebenden Körper verwendet werden.


Anspruch[de]

1) Fixierte physiologisch aktive Substanz, in der die physiologisch aktive Substanz mit einem wasserunlöslichen Träger in Form einer drinnen Faser von 9 tex (1,0 den) oder weniger gebunden ist, der an die physiologisch aktive Substanz durch eine hydrophile Alkylenoxidkette gebunden ist, die eine Aminogruppe oder eine Epoxygruppe am den Träger bindenden Ende enthält, wobei die Alkylenoxidkette ein Polymer der Formel ist:

(worin l eine ganze Zahl eines Wertes im Bereich von 2 bis einschließlich 100 ist; m und n 0 oder eine positive ganze Zahl sind; und

ist).

2) Fixierte physiologisch aktive Substanz nach Anspruch 1, worin sowohl m als auch n 0 sind.

3) Fixiermaterial zur Verwendung bei physiologisch aktiven Substanzen, die die hydrophile Alkylenoxidkette nach Anspruch 1 enthalten, das mit dem wasserunlöslichen Träger in Form einer drinnen Faser mit 9 tex (1,0 Den) oder weniger gebunden ist und am anderen Ende eine funktionelle Gruppe aufweist, die mit den physiologisch aktiven Substanzen reagieren kann.

4) Fixiermaterial zur Verwendung bei einer physiologisch aktiven Substanz nach Anspruch 3, worin sowohl m als auch n 0 sind.

5) Fixiermaterial zur Verwendung bei einer physiologisch aktiven Substanz nach Anspruch 3, worin die funktionelle Gruppe aus Amino-, Carboxy-, Epoxy-, Hydroxy-, Carbodiimid-, Aldehyd-, Isocyanat- und Imidazolgruppen ausgewählt ist.







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