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Dokumentenidentifikation DE3784655T2 15.07.1993
EP-Veröffentlichungsnummer 0272064
Titel Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat.
Anmelder Kyowa Hakko Kogyo K.K., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Fujio, Tatsuro, Sagamihara-shi Kanagawa-ken, JP;
Maruyama, Akihiko, Kawasaki-shi Kanagawa-ken, JP
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 3784655
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 11.12.1987
EP-Aktenzeichen 873109383
EP-Offenlegungsdatum 22.06.1988
EP date of grant 10.03.1993
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.07.1993
IPC-Hauptklasse C12P 17/04

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat (im folgenden bezeichnet als AsA2P). Ascorbinsäure wird häufig verwendet, beispielsweise auf dem Gebiet der Medizin, in Nahrungsmitteln und in der Kosmetik, wird jedoch nachteiligerweise, beispielsweise durch Hitze, Luft oder Licht, zersetzt. AsA2P ist ein stabiles Derivat, das durch Dephosphorylierung im Körper leicht zu Ascorbinsäure umgewandelt werden kann und somit Vitamin C- Aktivität aufweist. AsA2P wird deshalb häufig verwendet, wie zum Beipiel als Rohmaterial für die Herstellung von Kosmetika und Medikamenten, insbesondere Kosmetika, sowie als Nahrungsmittel-Additiv.

Verfahren zur Herstellung von AsA2P durch chemische Synthese sind bekannt [zum Beipiel JP-A-30328/70, 15605/73 und 18191/77 und J. Org. Chem. 47, 3453 (1982)]. Die Herstellung von AsA2P mit Hilfe eines mikrobiologischen Verfahrens wurde jedoch bisher noch nicht beschrieben.

AsA2P wurde durch chemische Synthese bereits in industriellem Maßstab hergestellt. Die chemische Synthese weist jedoch den inherenten Nachteil auf, daß zusätzlich zu der gewünschten Phosphorylierung in 2-Position beispielsweise verschiedene Isomere produziert werden können, die in 3- und 4-Position phosphoryliert sind, so daß das Erreichen einer hohen AsA2P-Ausbeute schwierig ist. Folglich wurden verschiedene Versuche unternommen, die Produktionsausbeute von AsA2P zu verbessern, wie z.B. durch Einführung einer Schutzgruppe oder durch ausgewählte Verfahrensbedingungen. Die Anwendung bekannter Herstellungsverfahren ist jedoch kompliziert und kostspielig und zusätzlich ist es schwierig, AsA2P in hoher Reinheit herzustellen.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß bestimmte Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen, die 2-Position von Ascorbinsäure und Araboascorbinsäure spezifisch zu phosphorylieren. Es wurden Mikroorganismen gefunden, welche AsA2P aus Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und Adenosintriphosphat (ATP) produzieren können. Erfindungsgemäß wird somit ein alternatives Verfahren zur Herstellung von AsA2P in industriellem Maßstab bereitgestellt.

Die vorliegende Erfindung wird in folgender Beschreibung detailliert erklärt.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat bereitgestellt, wobei man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit ATP zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat in einem wäßrigen Medium in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Enzyms umsetzt, welches aus einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der ausgewählt ist unter den Genera Aeromonas, Bacillus, Beneckea, Flavobacterium, Klebsiella und Pseudomonas, und befähigt ist, die enzymatische Reaktion von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit ATP unter Bildung von Ascorbinsäure-2-phosphat zu katalysieren, und man das resultierende Ascorbinsäure-2-phosphat aus der Reaktionslösung isoliert.

Der Ausdruck Ascorbinsäure umfaßt sowohl die D- als auch die L-isomere Form von Ascorbinsäure.

Die für den erfindungsgemäßen Zweck verwendbaren Mikroorganismen umfassen solche, die zur Produktion von AsA2P aus Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und ATP befähigt sind und einem Genus, ausgewählt unter Aeromonas, Klebsiella, Flavobacterium, Pseudomonas, Bacillus oder Beneckea zuzuordnen sind. Wie vorzugsweise z.B.

Aeromonas caviae ATCC 13137

Bacillus subtilis ATCC 19221

Beneckea hyperoptica ATCC 15803

Flavobacterium devorans ATCC 10829

Klebsiella oxytoca ATCC 8724

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417

Pseudomonas chlororaphis ATCC 9446

und die Mutanten davon.

Es besteht die Möglichkeit, die Mikroorganismen unter Verwendung herkömmlicher Medien zu kultivieren, wie z.B. dem KM102-Medium, enthaltend Polypepton (10 g/l), Fleischextrakt (7 g/l), Hefeextrakt (5 g/l) und Natriumchlorid (3 g/l) mit einem eingestellten pH-Wert von 7,2, mit der Maßgabe, daß die verwendeten Mikroorganismen darin gut wachsen und ihre Fähigkeit zur Produktion von AsA2P nicht inhibiert wird. Es besteht außerdem die Möglichkeit, verschiedene organische, halbsynthetische und synthetische Medien zu verwenden, die Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und andere anorganische und/oder organische Substanzen enthalten.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen umfassen beispielsweise Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Sucrose oder Maltose; Zuckeralkohole, wie Mannitol oder Sorbitol; Alkohole, wie Glycerin; organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Milchsäure oder Citronensäure; und Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Methionin oder Lysin. Gewünschtenfalls können andere natürlich vorkommende organische Nährstoffe, wie Stärkehydrolysat, Melasse, Abfallmelasse, weiße Reiskleie, Kassava, Bagasse oder Getreideschlempe verwendet werden.

Beispiele für Stickstoffquellen sind anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat; Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Glutamin oder Methionin; stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, NZ-Amin, Getreideschlempe, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Fischmehl und entsprechende Verdauungsprodukte oder Chrysalishydrolysat.

Beispiele für anorganische Substanzen sind dibasisches Kaliumphosphat, monobasisches Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Eisenchlorid, Kupfersulfat, Manganchlorid, Ammoniummolybdat und Zinksulfat, wovon geeignete Mengen zum Medium zugesetzt werden können.

Vitamine, Aminosäuren, Nukleinsäuren und andere Substanzen, die zum Wachstum des Mikroorganismus erforderlich sein können, können gewünschtenfalls dem Medium zugesetzt werden.

Bevorzugt führt man die Kultivierung unter aeroben Bedingungen, wie z.B. unter Schütteln oder unter Belüftung und Rühren durch. Üblicherweise kann die Kultivierung bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40ºC, vorzugsweise bei 25 bis 35ºC und bei einem pH von 5 bis 10, vorzugsweise bei 6,5 bis 7,5 über einen Zeitraum von 10 bis 100 Stunden durchgeführt werden.

AsA2P wird durch die Reaktion von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit ATP gebildet, die gemäß einem der folgenden Verfahren durchgeführt werden kann:

(1) Kombinieren von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit ATP in der Kulturbrühe eines Mikroorganismus; oder

(2) Vermischen von wenigstens einer Komponente, ausgewählt unter konzentrierter Kulturbrühe, getrockneter Kulturbrühe, Überstand einer Kulturbrühe, Mikrobenzellen und durch deren Behandlung erhaltene Produkte, wie z.B. gefrorene und wieder aufgetaute oder gefriergetrocknete Zellen, immobilisiertes Enzym und aus den mikrobiellen Zellen extrahiertes Enzym (entweder aus einem nativen mikrobiellen Stamm oder aus einem in geeigneter Weise durch Genetic Engineering bearbeiteten Stamm), mit einer Lösung, die Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und ATP enthält.

Additive, wie oberflächenaktive Mittel oder organische Lösungsmittel können gewünschtenfalls zur Reaktionslösung hinzugegeben werden, um die Produktionsausbeute von AsA2P zu erhöhen.

Geeignete oberflächenaktive Mittel sind kationische oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylenstearylamin (wie z.B. Nymin S-215, Handelsprodukt von Nihon Yushi K.K., Japan) oder Cetyltrimethylammoniumbromid; anionische oberflächenaktive Mittel, wie Natriumoleylamidsulfat; und amphotere oberflächenaktive Mittel wie Polyoxyethylensorbitanmonostearat (wie z.B. Nonion ST 221, Handelsprodukt von Nihon Yushi K.K., Japan), welche die Reaktion zur Bildung von AsA2P aus Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und ATP fördern können. Üblicherweise kann das oberflächenaktive Mittel in einer Menge im Bereich von 1 bis 50 mg/ml, vorzugsweise von 1 bis 20 mg/ml verwendet werden.

Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel sind Toluol, Xylol, Aceton, aliphatische Alkohole, Benzol und Ethylacetat, die üblicherweise in einer Menge von 0,1 bis 50 µl/ml, vorzugsweise von 1 bis 20 µl/ml verwendet werden können. Außerdem ist die Verwendung von Magnesiumionen in einer Konzentration von 1 bis 100 mM möglich.

Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und ATP können sowohl chemisch rein als auch in verunreinigter Form zu dem erfindungsgemäßen Zweck insofern verwendet werden, als darin Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure oder ATP enthalten ist und die AsA2P-Bildung nicht nachteilig beeinflußt wird.

Vorzugsweise verwendet man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und ATP in Konzentrationen von 1 bis 500 mM bzw. 1 bis 1000 mM.

Gemäß dem zweiten Verfahren führt man die Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 70ºC über einen Zeitraum von 1 bis 48 Stunden durch, wobei der pH bei 3 bis 11 durch Zugabe von beispielsweise Ammoniak, NaOH oder KOH gehalten wird.

Beispiele für Produkte, die man durch Behandlung der Kulturbrühe erhält, sind konzentrierte oder getrocknete Kulturbrühe, Produkte, erhalten durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels und/oder eines organischen Lösungsmittels zu der Kulturbrühe, Produkte, erhalten durch Behandlung der Zellen mit bakteriolytischem Enzym, immobilisierte mikrobielle Zellen und Enzymprodukte, welche aus den mikrobiellen Zellen extrahiert wurden.

Die aus der Kulturbrühe abgetrennten Zellen können vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 400 mg/ml (Gewicht feuchter Zellen) verwendet werden.

Es besteht die Möglichkeit, AsA2P quantitativ über die Absorption bei 254 nm im Anschluß an eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie über eine Nucleosil 10 C&sub1;&sub8;-Säule (Handelsprodukt von Macherey-Nagel) zu bestimmen, wobei man ein durch chemische Synthese erhaltenes reines Präparat von AsA2P als Standard verwendet.

Die Isolierung von AsA2P aus der Kulturbrühe oder der Reaktionslösung kann dadurch erfolgen, daß man die Zellen aus der Kulturbrühe falls notwendig entfernt, Proteine aus dem Überstand entfernt, den Überstand neutralisiert und anschließend die Lösung durch Säulenchromatographie unter Verwendung von beispielsweise Ionenaustauscherharzen und Sephadex, oder Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie reinigt.

Die folgenden nichtlimitierenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Die Figuren 1A und 1B zeigen die Ultraviolett- Absorptionsspektren einer AsA2P-Referenz und von AsA2P, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens gemäß Beispiel 1 (RCI);

die Figuren 2A, B und C zeigen die Ergebnisse einer Protonen-NMR von Referenz-AsA2P, AsA2P, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens gemäß Beispiel 1 (RCI) und eines Gemisches aus Referenz-AsA2P und RCI; und

die Figuren 3A und B zeigen die Ergebnisse einer ¹³C-NMR von Referenz-AsA2P und RCI.

Beispiel 1

Flavobacterium devorans ATCC 10829 kultiviert man in KM102 Medium (30 ml) bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden in einem Erlenmeyer-Kolben (300 ml Fassungsvermögen), wobei man eine Impfkultur (12 ml) erhält. Die Impfkultur überführt man dann in KM102-Medium (300 ml) in einen Erlenmayer-Kolben (Fassungsvermögen 2 l) und kultiviert bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden. Man erhält durch Zentrifugation (10 000 x g, 10 Minuten) der resultierenden Kulturbrühe nasse Zellen (5,4 g). Die nassen Zellen friert man ein und bewahrt sie bei einer Temperatur von -20ºC auf. Eine Reaktionslösung (50 ml), zusammengesetzt aus Ascorbinsäure (30 mM), ATP (40 mM), MgSO&sub4; (10 mM) und KH&sub2;PO&sub4; (40 mM), enthaltend die aufbewahrten Zellen (50 mg/ml Feuchtgewicht) rührt man mit einem Magnetrührer (100 Upm) in einem Becher (Fassungsvermögen 200 ml) 24 Stunden bei 30ºC, um die Reaktion zu beenden, wobei man den pH unter Verwendung von kaustischem Soda auf etwa 6,5 einstellt

Der Überstand der Kulturbrühe enthält nach der Reaktion 1,16 mg/ml AsA2P und im wesentlichen keine Nebenprodukte, wie Ascorbinsäure-5-phosphat und Ascorbinsäure-3-phosphat.

Nach Einstellung des pH-Wertes der Reaktionslösung auf 3,0 mit Salzsäure zentrifugiert man die Lösung (50 ml), um Protein zu entfernen. Den Überstand neutralisiert man mit kaustischem Soda und gibt ihn über eine Säule, die mit 300 ml Dowex 1 × 8- Harz (Cl-Form) gepackt ist und eluiert anschließend mit einem Konzentrationsgradienten von 0,2 - 0,6 M NaHCO&sub3;. Die resultierenden AsA2P-haltigen Fraktionen werden gesammelt, vereinigt und mit Salzsäure neutralisiert und anschließend konzentriert. Die resultierende Fraktion (163 ml) enthält 42 mg AsA2P. Das Konzentrat gibt man anschließend über eine Säule, die mit Sephadex G-10 (500 ml) bepackt ist, wobei man eine Fraktion (63 ml) erhält, die 30 mg AsA2P enthält, das einen einzigen Peak bei der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie zeigt. Die resultierende Probe wird als RCI bezeichnet und zur Analyse der chemischen Struktur, wie im folgenden beschrieben, verwendet.

(1) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Die Figuren 1 (A) und (B) zeigen das Ultraviolett- Absorptionsspektrum von Referenz-AsA2P bzw. der RCI-Probe. RCI weist ein Absorptionsmaximum bei 240 nm auf und sein Absorptionsmuster stimmt mit dem Muster von Referenz-AsA2P vollständig überein.

(2) Spaltung mit alkalischer Phosphatase:

15 µl RCI (25 mg/ml) gibt man zu einer Lösung aus 0,5 M Glycin-gepufferte Lösung (pH 10,5; 20 µl), 0,1 M ZnSO&sub4; (1 µl), 0,1 M MnSO&sub4; (1 µl), 2 µl alkalische Phosphatase (enthaltend 20 mg/ml des Enzyms; Handelsprodukt von Sigma) und entionisiertem Wasser (36 µl). Die Lösung hält man 30 Minuten bei einer Temperatur von 37ºC, um den Grad der enzymatischen Zersetzung von RCI zu beobachten.

Die folgende Tabelle 1 zeigt die Analysenergebnisse des Überstandes durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie.

Tabelle 1
Probe Konzentration (mM) I Reaktionsprodukt Vor Reaktion Nach Reaktion Kontrolle* II Referenz

Fußnote: * Enthaltend entionisiertes Wasser anstelle von alkalischer Phosphatase

** anorganisches Phosphat

Diese Tabelle zeigt, daß RCI phosphorylierte Ascorbinsäure ist.

(3) Analyse durch Protonen-NMR:

Die Figuren 2 (A), (B) und (C) zeigen die Protonen-NMR- Spektren von Referenz-AsA2P, RCI und von einem Gemisch aus Referenz-AsA2P und RCI. Daraus ergibt sich, daß RCI mit Referenz-AsA2P identisch ist.

(4) Analyse durch ¹³C-NMR:

Die Figuren 3 (A) und (B) zeigen die ¹³C-NMR-Spektren von RCI und Referenz-AsA2P, wobei beide darauf hinweisen, daß das Kohlenstoffatom in 2-Position einer jeden Probe phosphoryliert ist. Daraus ergibt sich, daß RCI identisch ist mit Referenz- AsA2P.

Beispiel 2

Jeden der in Tabelle 2 aufgeführten Stämme kultiviert man in KM102-Medium (30 ml) bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden in einem Erlenmeyer-Kolben (300 ml Fassungsvermögen). Die resultierende Impfkultur (12 ml) überführt man in KM102-Medium (300 ml) in einem Erlenmeyer-Kolben (Fassungsvermögen 2 l) und kultiviert 20 Stunden bei einer Temperatur von 30ºC. Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert man (10 000 x g, 10 Minuten) und friert die mikrobiellen Zellen ein und bewahrt diese bei einer Temperatur von -20ºC auf. Anschließend wird eine Reaktionslösung (50 ml), zusammengesetzt aus den gefrorenen Zellen (50 mg/ml), Ascorbinsäure (30 mM), ATP (40 mM), MgSO&sub4; (10 mM) und KH&sub2;PO&sub4; (40 mM) in einem Becher (200 ml Fassungsvermögen) mit einem Magnetrührer 24 Stunden bei 30ºC gerührt (100 Upm), wobei man den pH mit kaustischem Soda auf etwa 6,5 einstellt. Nach Beendigung der Reaktion bestimmt man die resultierende Konzentration von AsA2P im Überstand der Reaktionslösung mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeits- Chromatographie. Die Resultate sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2
Mikroorganismus Aeromonas caviae Bacillus subtilis Beneckea hyperoptica Klebsiella oxytoca Pseudomonas azotocolligans Pseudomonas chlororaphis

Beispiel 3

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417 kultiviert man in KM102-Medium (30 ml) 20 Stunden bei 30ºC in einem Erlenmeyer- Kolben (Fassungvermögen 300 ml). Die resultierende Impfkultur (12 ml) kultiviert man in KM102-Medium (300 ml) bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden in einem Erlenmeyer-Kolben (Fassungsvermögen 2 l). Die resultierende Kulturbrühe zentrifugiert man (10 000 x g, 10 Minuten) um die Zellen abzutrennen. Die Zellen teilt man in Portionen auf, die man jeweils unterschiedlichen Behandlungen unterzieht:

(a) keine Behandlung;

(b) Luftrockung;

(c) Einfrieren bei einer Temperatur von -20ºC, gefolgt von Auftauen;

(d) Suspendieren in einer Lösung, enthaltend ein oberflächenaktives Mittel;

(e) Suspendieren in einer Lösung, enthaltend ein organisches Lösungsmittel;

(f) Suspendieren in einer Lösung, enthaltend ein Gemisch aus oberflächenaktiven Mitteln und organischem Lösungsmittel; oder

(g) Behandlung mit Ultraschall. Der in Beispiel 4 verwendete Ultraschallbecher wird dabei verwendet, wobei man eine Output- Stufe "5" einstellt und Ultraschallwellen mit unbekanntem kHz- Wert sechsmal (jeweils 30 Sekunden in einem 30 Sekunden- Intervall) verwendet.

Die AsA2P-produzierende Aktivität einer jeden Probe wird in folgender Weise bestimmt:

Eine Reaktionslösung (50 ml) zusammengesetzt aus Zellen, die wie oben angegeben behandelt wurden (50 mg/ml), Ascorbinsäure (30 mM), ATP (40 mM), MgSO&sub4; (10 mM) und KH&sub2;PO&sub4; (40 mM) rührt man (100 U.p.m.) mit einem Magnetrührer in einem Becher (Fassungsvermögen 200 ml) über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 30ºC, während man die Lösung mit kaustischem Soda auf einen pH von etwa 6,5 einstellt. Die Hochdruckflüssigkeits- Chromatographie verwendet man, um die Konzentration von AsA2P im Überstand der Kulturbrühe zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

TABELLE 3
Enzym-Quelle Unbehandelte Zellen Luftgetrocknete Zellen Gefrorene Zellen Zugabe Behandlung mit Ultraschall

Anmerkungen:

* Polyoxyethylenstearylamin (Nymin S-215, Handelsprodukt von Nihon Yushi K.K., Japan)

** Xylol

Beispiel 4

Flavobacterium devorans ATCC 10829 kultiviert man in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben. Die resultierenden mikrobiellen Zellen zentrifugiert man und resuspendiert diese in einer Phosphat-gepufferten Lösung (pH 7,0) in einer Konzentration von 200 mg/ml. Die Zellsuspension behandelt man periodisch 10 Minuten mit einem Ultraschall- Becher (UR-200P, Handelsprodukt von Tomy Seiko K.K., Japan) um die Zellen zu zerstören. Die Zellen teilt man in Fraktionen auf und unterzieht jede Fraktion einer der folgenden unterschiedlichen Behandlungen:

(1) Behandlung der Kulturbrühe ohne Nachbehandlung;

(2) Behandlung der aufgeschlossenen Zellen oder

(3) Behandlung des durch Zentrifugation der aufgeschlossenen Zellen (12 000 x g, 15 Minuten) erhaltenen Überstandes.

Das jeweils erhaltene Material wird dann in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben einer Reaktion unterzogen. Unter Verwendung der Proben (1), (2) bzw. (3) werden 0,102 mg/ml, 0,175 mg/ml und 0,168 mg/ml AsA2P gebildet und akkumuliert.

Beispiel 5

Flavobacterium devorans ATCC 10829 kultiviert man in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben. Zu der resultierenden Kulturbrühe gibt man L-Ascorbinsäure (30 mM), ATP (40 mM), MgSO&sub4; (10 mM) und KH&sub2;PO&sub4; (40 mM) um eine Reaktionslösung herzustellen, die man 20 Stunden bei 30ºC mit einem Magnetrührer rührt (100 U.p.m.), während man den pH mit kaustischem Soda auf 6,5 einstellt. Man stellt fest, daß 0,131 mg/ml AsA2P gebildet und im Überstand des Reaktionsgemisches bis zur Beendigung der Reaktion angehäuft werden.

Beispiel 6

Flavobacterium devorans ATCC 10829 kultiviert man in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Kulturbrühe zentrifugiert man ab (10 000 x g, 10 Minuten), wobei man nasse Zellen (5,4 g) erhält, die man bei -20ºC einfriert und aufbewahrt. Eine Reaktionslösung aus Araboascorbinsäure (30 mM), ATP (40 mM), MgSO&sub4; (10 mM) und KH&sub2;PO&sub4; (40 mM), die 50 mg/ml (Gewicht nasser Zellen) der aufbewahrten Zellen enthält, gibt man in einen 200 ml Becher und rührt mit einem Magnetrührer (100 U.p.m., 24 Stunden). Den pH stellt man durch periodische Zugabe einer kaustischen Sodalösung im Verlauf der Reaktion auf 6,5 ein. 0,87 mg/ml AsA2P werden im Reaktionsgemisch akkumuliert. Es können im wesentlichen keine Nebenprodukte, wie Ascorbinsäure-5-phosphat, Ascorbinsäure-3- phosphat und Pyrophosphorverbindungen von Ascorbinsäure nachgewiesen werden.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von AsA2P aus Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und ATP bereitgestellt, wobei man als Enzymquelle wenigstens eine Komponente, ausgewählt unter mikrobiellen Zellen, der Kulturbrühe von Mikroorganismen, dem Überstand der Kulturbrühe und den Produkten mikrobieller Zellen, verwendet.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat, wobei man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit ATP zur Produktion von Ascorbinsäure-2-phosphat in einem wäßrigen Medium in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Enzyms umsetzt, welches aus einem Mikroorganismus, ausgewählt unter den Genera Aeromonas, Bacillus, Beneckea, Flavobacterium, Klebsiella und Pseudomonas, stammt und zur Katalyse der enzymatischen Reaktion von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit ATP zur Produktion von Ascorbinsäure-2-phosphat befähigt ist, und man das resultierende Ascorbinsäure-2-phosphat aus der Reaktionslösung isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, durchgeführt in Abwesenheit einer Schutzgruppe für Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Mikroorganismus ausgewählt ist unter

Aeromonas caviae ATCC 13137

Bacillus subtilis ATCC 19221

Beneckea hyperoptica ATCC 15803

Flavobacterium devorans ATCC 10829

Klebsiella oxytoca ATCC 8724

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417

Pseudomonas chlororaphis ATCC 9446

und den Mutanten davon.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der verwendete Mikroorganismus Flavobacterium devorans ATCC 10829 oder Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417 oder eine Mutante davon ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die enzymatische Reaktion in der Kulturbrühe dieses Mikroorganismus durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC und bei einem pH von 5 bis 10 über einen Zeitraum von 10-100 Stunden in Gegenwart von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und einer wirksamen Menge ATP durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die enzymatische Reaktion dadurch bewirkt wird, daß man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit ATP in Kontakt bringt, in Gegenwart wenigstens eines der folgenden Bestandteile: konzentrierte Kulturbrühe, getrocknete Kulturbrühe, Überstand einer Kulturbrühe, mikrobielle Zellen, behandelt mit einem bakteriolytischen Enzym, immobilisiertes Enzym und Enzym, extrahiert aus den mikrobiellen Zellen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 70ºC bei einem pH von 3 bis 11 über einen Zeitraum von 1 bis 48 Stunden durchgeführt wird.







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