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Dokumentenidentifikation DE3689622T2 16.06.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0290446
Titel IMPFSTOFFE GEGEN MENSCHLICHE RESPIRATORISCHE VIREN.
Anmelder University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, N.C., US
Erfinder WERTZ, Gail, W., Chapel Hill, NC 27514, US;
COLLINS, Peter, L., Kensington, MD 20895, US
Vertreter Feiler, L., Dr.rer.nat.; Hänzel, W., Dipl.-Ing.; Kottmann, D., Dipl.-Ing, Pat.-Anwälte, 81675 München
DE-Aktenzeichen 3689622
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 23.12.1986
EP-Aktenzeichen 879007573
WO-Anmeldetag 23.12.1986
PCT-Aktenzeichen US8602756
WO-Veröffentlichungsnummer 8704185
WO-Veröffentlichungsdatum 16.07.1987
EP-Offenlegungsdatum 17.11.1988
EP date of grant 02.02.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.06.1994
IPC-Hauptklasse C12N 15/45
IPC-Nebenklasse A61K 39/155   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung.

Diese Erfindung offenbart Zusammensetzungen aus DNA und Protein, die sich für die Herstellung von Impfstoffen gegen das humane respiratorische Syncytialvirus ("human respiratory syncytial virus") [HRSV] eignen. Die Proteine schließen die nativen strukturellen viralen Proteine und immunogene Fragmente davon ein. Die DNA-Zusammensetzungen umfassen strukturelle Gene, die für diese Proteine codieren, sowie die strukturellen Gene enthaltende Expressions- und Replikationsplasmide. Auch mit den oben genannten DNA-Zusammensetzungen transformierte Wirtszellen sind vorliegend offenbart. Schließlich werden Impfstoffe aus den nativen strukturellen viralen Proteinen und deren immunogene Derivaten wie auch Verfahren zum Schützen von Menschen durch Impfung mit diesen Vaccinen offenbart. Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung, zuerkannt durch das National Institute of Health unter At-12464, gemacht. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.

Hintergrund.

HRSV wurde 1956 entdeckt. Es findet sich weltweit. Es ist eine wesentliche Ursache von Krankheiten des oberen und unteren Respirationstraktes und bewirkt körperliche Beschwerden bei Babies und Kleinkindern. Bei Babies erfordert diese schwere Krankheit häufig die Einlieferung in Krankenhäuser. Etwa 30% der kleinen Kinder mit akuter Atemwegserkrankung in Krankenhäusern hat eine Infektion mit dem respiratorischen Syncytialvirus. Bei größeren Kindern und Erwachsenen verläuft die Krankheit milder. Infektionen mit dem respiratorischen Syncytialvirus betreffen alle Segmente des Atemwegetraktes, sind gewöhnlich mit Fieber, Husten, laufender Nase und Ermüdungserscheinungen verbunden und werden klinisch als Bronchitis, Bronchiolitis, Lungenentzündung, Krupp oder virale Infektion diagnostiziert. Bei größeren Kindern und Erwachsenen vermehrt sich das Virus im allgemeinen nur noch beschränkt auf den oberen Atemwegetrakt. Kinder können schwerer betroffen sein, wenn sich das Virus in die Lungen ausbreitet. Die Schädigung der Lunge kann bleibend sein.

Die Primärinfektion mit dem respiratorischen Syncytialvirus tritt in einem frühen Lebensstadium auf, gewöhnlich vor dem 5. Lebensjahr. Bei Kindern tritt die durch dieses Virus verursachte Krankheit häufig mindestens einmal pro Jahr in ziemlich deutlich definierten Ausbrüchen mit einer Länge von mehreren Monaten auf. Epidemische Ausbrüche sind scharf umschrieben, im allgemeinen dauern sie 3-5 Monate. In Familienstudien tragen Kinder in den unteren Schulklassen häufig das Virus nach Hause, wobei sie jüngere Mitglieder der Familie in schwererem Grade infizieren als andere Familienmitglieder. Die klinische Folge der Infektion ist beim ersten Kontakt am schlimmsten und verläuft bei älteren Personen milder, die immunologisch bereits Kontakt gehabt haben.

Die Wirkungen des respiratorischen Syncytialvirus können von einer nicht in Erscheinung tretenden Infektion bis zu schwerer Lungenentzündung und zum Tode reichen. Eine Entzündung des Atemwegtrakts ist für die meisten Symptome verantwortlich. Die vollständige Genesung tritt in den meisten Fällen innerhalb von 1-3 Wochen unter Erzeugung von Antikörpern auf, die durch das gesamte Leben zu persistieren scheinen. In den Vereinigten Staaten von Amerika haben etwa 30% der einjährigen Babies und 95% der 5 Jahre alten Kinder zirkulierende Antikörper gegen das respiratorische Syncytialvirus. Nochmals auftretende Infektionen bei größeren Babies, Kindern und Erwachsenen mit Antikörpern sind meist mild verlaufende Erkrankungen des oberen Atemwegetraktes in Form von Erkältungen.

Außer der vorliegenden Erfindung gibt es keine wirksamen Impfstoffe, um HRSV zu bekämpfen.

Beschreibung des Standes der Technik.

Obwohl niedrige Ausbeuten an Virus in der Zellkultur die HRSV-Forschung behindert hat, ist das Virus gründlich studiert worden. HRSV ist ein Paramyxovirus mit einem einzelnen negativen RNA-Strang, der in 10 vorwiegend monocistrone Messenger transkribiert wird. Die Messenger sind in vitro isoliert und translatiert worden. Die Produkte sind mittels Gelelektrophorese, Peptidkartierung und Immunpräzipitation als mit aus Virions isolierten strukturellen Proteinen vergleichbar charakterisiert worden. Die strukturellen Proteine umfassen ein vorherrschend auftretendes Nucleocapsid-Protein (N; MG etwa 42 000), ein Nucleocapsid-Phosphoprotein (P; MG etwa 34 000), ein großes Nucleocapsid-Protein (L; MG etwa 200 000), ein Hüllmatrix-Protein (M; MG etwa 26 000), ein Matrix-Glycoprotein (ungefähr 22 000) und zwei Hüll-Glycoproteine, das Fusions-Glycoprotein (F; MG etwa 68 000 bis 70 000) und ein zweites, methioninarmes Glycoprotein (G; MG etwa 84 000 bis 90 000). Weiterhin ist bekannt, daß ein viral codiertes Protein mit etwa 9 500 Dalton und andere kleine Proteine in infizierten Zellen vorhanden sind. P.L. Collins und Mitarbeiter, Identification of a tenth mRNA of RSV and assignment of polypeptides to the 10 viral genes - J. of Virol. 49 : 572-578 (1984) sowie darin aufgeführte Zitate. Obwohl die strukturellen Proteine von HRSV isoliert worden sind, sind ihre Aminosäuresequenzen nicht bekannt.

Es sind vielfache Versuche unternommen worden, um einen wirksamen Impfstoff gegen HRSV zu gewinnen. Friedewald und Mitarbeiter, Journal of the American Medical Association, Band 204, 20. Mai 1968, Seiten 690-694 beschreiben die Propagation des respiratorischen Syncytialvirus in einer Kultur von embryonalem Rindernierengewebe. Die Infektivität oder Virulenz von bei 34ºC oder 28ºC gezüchtetem Virus nahm nicht ab. Bei 26ºC gezüchtetes HRSV konnte, weil mit einer Abnahme der Infektivität für Erwachsene verbunden, nicht für die Verwendung zur Verhinderung von Infektionen bei Erwachsenen in Betracht gezogen werden, da das Virus in seiner Infektivität begrenzt und nur wenig immunogen war.

Kim und Mitarbeiter, Pediatrics, Band 48, November 1971, Seiten 745-755 offenbaren, daß ein Impfstoff aus inaktiviertem respiratorischem Syncytialvirus, der aus bei 26ºC gezüchtetem Virus gewonnen war, die Entwicklung von hohen Antikörperserumspiegeln in Babies und Kindern im Alter von 6 Monaten bis 13 Jahren stimulierte, die Infektion jedoch nicht verhinderte.

McIntosh und Mitarbeiter, Pediatric Research, Band 8, 1974, Seiten 689-696 diskutieren zwei experimentelle Lebendimpfstoffe aus respiratorischem Syncytialvirus, der eine hergestellt aus bei 26ºC gezüchtetem Virus und der andere hergestellt aus einer temperaturempfindlichen Mutante, die bei 32ºC gut, aber bei 37ºC oder darüber überhaupt nicht vermehrbar war. Der erste Impfstoff war nicht zufriedenstellend, da er keinen Infektionsschutz bot, wenn der Zeitraum zwischen Impfung und Exposition mehr als 4 Monate betrug. Der zweite Impfstoff war ebenfalls nicht zufriedenstellend, da er in einigen geimpften Personen offensichtlich seine Tenperaturempfindlichkeit verlor.

Craighead, Journal of Infectious Diseases, Band 131, Juni 1975, Seiten 749-753 diskutieren im Jahre 1966 durchgeführte Untersuchungen, worin verschiedene Forschergruppen ein formaldehydbehandeltes, alaungefälltes, in Gewebekultur gewachsenes Virus an Babies und kleinen Kindern testeten. Nachdem die Impfstoffempfänger nachfolgend dem Virus vom Wildtyp ausgesetzt worden waren, zeigten sie ein betontes Muster einer Erkrankung des Atemwegetrakts. Craighead schließt daraus, daß die Immunisierung mit mit Formaldehyd behandeltem Virus die Schwere der Krankheit steigerte.

Wright und Mitarbeiter, Journal of Pediatrics, Band 88, Juni 1976, Seiten 931-936 beschreiben die Evaluierung eines temperaturempfindlichen, abgeschwächten respiratorischen Syncytial-Lebendimpfstoffs bei Babies. Während dieser Impfstoff bei der Verabreichung mit einer ausreichend hohen Dosis, um alle seronegativen Babies zu infizieren, eine leichte Erkrankung des oberen Respirationstraktes verursachte, erreichte man beim Absenken der Dosis keine annehmbare Infektivitätsrate. Auch war das Virus genetisch instabil, denn in einer geimpften Person wurde ein Verlust der Temperaturempfindlichkeit festgestellt. Potenzierung der natürlichen Krankheit konnte mit diesem Impfstoff nicht gezeigt werden, und unter den beimpften Personen trat Reinfektion auf.

Die US-A-4 122 167 und US-A-4 145 252 beschreiben ein Verfahren zum Abschwächen von Virions durch serielle Passage durch menschliche diploide Lungenfibroblasten. Die US-A- 4 517 304 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von immunogen-aktiven HRSV-Proteinen auf den Zellmembranen von in Kultur gezüchteten hierfür geeigneten Zellen. Diese Zellen werden dann in einen Wirt injiziert, wo sie eine Immunantwort hervorrufen.

In den oben beschriebenen Zitaten wird der Versuch gemacht, einen Impfstoff durch Injektion von Virions, die sowohl aus Protein als auch aus Nucleinsäure bestehen, oder durch Injektion nicht-definierter Zusammensetzungen von Virusproteinen zu erzeugen, die an die Zellmembranen der Wirtszellen gebunden sind. Keine der obigen Arbeiten führte zu einem wirksamen Impfstoff; s. Raeburn, The Houdini Virus, Science 85, Band 6 : 52-57 (Dezember 1985).

Collins und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 7683-7687 (Dezember 1984) offenbaren die Gensequenz für das F-Glycoprotein. Wertz und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4075-4079 (Juni 1985) offenbaren die Gensequenz für das G-Glycoprotein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß enthält der Impfstoff gegen das humane respiratorische Syncytialvirus, der frei von anderem, virussynthetisiertem Protein ist, glycosyliertes F-Protein, glycosyliertes G-Protein oder ein Derivat davon mit ausreichender antigener Kapazität, um in einem Patienten, der virulentem HRSV ausgesetzt ist, wirksamen immunologischen Schutz zu erzeugen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäße Impfstoffe können derart "maßgeschneidert" werden, daß sie einen beliebigen Teil derjenigen strukturellen Proteine enthalten, die den besten Immunschutz bieten. Im Hinblick auf die Sicherheit vermeidet diese Erfindung, daß kleine Kinder intakten HRSV-Virions in entweder inaktivierter oder abgeschwächter Form und viraler Nukleinsäure ausgesetzt werden. Durch Vermeiden der Injektion eines vollständigen Virions ist es nicht erforderlich, daß die hier offenbarten Impfstoffe mit einem Fixativ wie z. B. Formaldehyd behandelt werden, was - wie gezeigt - zur Entwicklung unwirksamer Antikörper und zu einer nachfolgenden gesteigerten Empfänglichkeit des Wirtes/Patienten führt, wenn dieser virulentem HRSV ausgesetzt ist.

Es ist gezeigt worden, daß sich das Vaccina-Virus-Expressionssystem für die Expression der G und F Glycoproteine von HRSV eignet; s. Ball und Mitarbeiter, P.N.A.S. USA 83 : 246-250 (1986) und Olmsted, P.N.A.S. USA 83 : 7462-7466 (1986). Diese beiden Glycoproteine induzieren ebenfalls immunologischen Schutz gegenüber der Exposition durch lebendes HRSV-Virus in Säugern; s. Stott und Mitarbeiter, J. Virology 67 : 607-613 (1986) und auch P.N.A.S. USA 83 : 246-250 (1986). Auf in diesen Arbeiten dargelegte Methoden und Ergebnisse wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.

Die jeweilige Sequenz und die Positionen der zugehörigen Basennumerierung für die offenbarten Proteine des HRSV-Stamms A&sub2; sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Die Abbildungen 1 bzw. 2 enthalten die Nucleinsäuresequenzen für die strukturellen HRSV-Proteine F und G.

Es ist zu erwarten, daß Protein aus dem A&sub2;-Stamm in Kreuzreaktion Schutz gegen andere Stämme von HRSV bieten wird; es ist jedoch möglich, daß der größtmögliche Schutz die Immunisierung mit einer Mischung von Proteinen aus verschiedenen Stämmen umfassen wird.

A. Allgemeine Verfahren

Im allgemeinen lassen sich die Nomenklatur und die allgemeinen Laborverfahren, die in dieser Anmeldung erforderlich sind, bei T. Maniatis und Mitarbeitern, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982, finden. Dieses "Manual" wird hier im folgenden als "Maniatis" bezeichnet.

Alle E. coli-Stämme werden auf Luria-Medium (LB) mit Glucose, Difco's antibiotischem Medium #2 und M9-Medium, ergänzt mit Glucose und säurehydrolysierten Casein-Aminosäuren, gezüchtet. Stämme mit Resistenz gegen Antibiotika wurden unter den bei Maniatis beschriebenen Arzneistoffkonzentrationen gehalten. Transformationen wurden nach dem von W. Rowekamp und R.A. Firtel, Dev. Biol., 79 : 409-418 (1980) beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Alle Enzyme wurden gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet. Transformanten wurden durch Kolonie-Hybridisierung wie in M. Grunstein und J. Wallis, Methods in Enzymology, 68 : 379-388 beschrieben analysiert.

Nach der Hybridisierung werden die Sonden entfernt und aufgehoben, und die Filter werden in 0,1% SDS, 0,2x SSC insgesamt 3 h lang unter 5maligem Wechsel eines Volumens von jeweils 400 ml gewaschen. Die Filter werden gründlich an der Luft getrocknet, befestigt und unter Verwendung eines Kodak X- OMAT AR-Films und Dupont Cronex Lightening Plus-Verstärkungsschirmen 16 h lang bei -70ºC autoradiographiert.

Für die Sequenzierung von Plasmiden wird gereinigte Plasmid-DNA nach den bei Maniatis beschriebenen Verfahren hergestellt. Endmarkierte DNA-Fragmente werden hergestellt und gemäß den chemischen Sequenzierungsverfahren von Maxam und Gilbert mit den von P.L. Collins und G.W. Wertz, J. Virol. 54 : 65-71 (1985) beschriebenen Abwandlungen analysiert.

Die Größen von Nukleotiden sind entweder in Kilobasen (kB) oder Basenpaaren (Bp) angegeben. Es handelt sich dabei um auf Agarosegel-Elektrophorese gestützte Schätzungen.

B. HRSV-cDNA

Um die Expression von HRSV-Proteinen zu bewirken, wird als erstes die für das Protein codierende DNA-Sequenz aus cDNA-Klonen gewonnen. Diese Sequenz wird dann in ein Expressionsplasmid kloniert, das die Transkription des Gens steuern und eine wirksame Translation des Transkripts ermöglichen kann.

Das Genbank-Verfahren zum Gewinnen von für HRSV-Proteine codierende cDNA ist in allgemeiner Form bei T. Maniatis, E.F. Fritsh und J. Sambrook (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, und im einzelnen bei P.L. Collins und G.W. Wertz, cDNA cloning and transcriptional mapping of nine polyadenylated RNAs encoded by the genome of HRSV, Proc. Natl. Acad. USA 80 : 3208-3212 (1983) beschrieben.

Klone werden durch Insertieren der cDNA in mit PstI geschnittenes pBR322, dem an die 3'-Enden der Schnittstelle homopolymere Stücke aus dGTP enzymatisch angefügt worden sind, hergestellt. Homopolymere Stücke von dCTP werden nach den bei Maniatis beschriebenen Verfahren enzymatisch an die 3'-Termini der cDNA-Moleküle angefügt. Idealerweise sollten 10-30 dCTP- oder dGTP-Reste angefügt werden, um die Klonierungseffizienz zu maximieren. Die cDNA und das Plasmid werden miteinander verbunden und in E. coli transformiert. Diejenigen Klone, die die HRSV-cDNA in voller Länge enthalten, werden durch Sonden aus markierter viraler cDNA oder Oligonukleotiden, die zu Teilen der in den Abbildungen 12 bis 16 dargestellten Sequenzen komplementär sind, aufgefunden und im Anschluß daran der Restriktionsenzym-Analyse und DNA-Sequenzierung unterworfen.

Oligonukleotide werden chemisch nach dem Festphasen- Phosphoramidittriester-Verfahren synthetisiert, das zuerst von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862 (1981) beschrieben wurde, und zwar unter Verwendung einer automatisierten Synthesevorrichtung, die in D.R. Needham-VanDevanter und Mitarbeiter, Nucleic Acids Res., 12 : 6159-6168 (1984) beschrieben ist. Die Reinigung von Oligonukleotiden erfolgt entweder durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustauscher-HPLC, wie in J.D. Pearson und F.E. Regnier, J. Chrom., 255 : 137-149 (1983) beschrieben.

Die Sequenz der synthetischen Oligonukleotide kann unter Verwendung des chemischen Abbauverfahrens von A.M. Maxam und W. Gilbert, L. Grossman und D. Moldave, Hrsg., Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65 : 499-560 (1980) gesichert werden.

C. Expression in E. coli.

Um Überexpression eines klonierten Gens, beispielsweise der HRSV-Protein-cDNA in einem prokaryontischen System zu erhalten, ist es wesentlich, Expressionsvektoren zu konstruieren, die zumindest einen starken Promotor für die Steuerung der mRNA-Transkription, eine ribosomale Bindungsstelle für die Initiation der Translation und einen Transkriptionsterminator enthalten. Beispiele für regulatorische Regionen, die sich hierfür eignen, sind die Promotor- und Operator-Region des Tryptophan-Biosynthesewegs in E. coli, beschrieben von

C. Yanofsky, R.L. Kelley und V. Horn, J. Bacteriol., 158 : 1018- 1024 (1984) und der linksseitig angeordnete Promotor des Phagen Lambda (PL), beschrieben von I. Herskowitz und D. Hagen, Ann. Rev. Genet., 14 : 399-445 (1980).

Die in E. coli erzeugten HRSV-artigen Proteine falten sich infolge des Vorhandenseins von Cystein-Resten und des Fehlens von geeigneten post-translationalen Modifikationen nicht richtig auf. Während der Reinigung aus E. coli müssen die exprimierten Protein zuerst denaturiert und dann wieder renaturiert werden. Dies kann durch Löslichmachen der von E. coli erzeugten Proteine in Guanidin-HCl und Reduktion aller Cystein-Reste mit β-Mercaptoethanol erfolgen. Das Protein wird dann entweder durch langsame Dialyse oder durch Gelfiltration wieder renaturiert, US-Patent Nr. 4 511 503.

Das Auffinden von HRSV-artigen Proteinen erfolgt nach auf diesem Gebiet bekannten Verfahren, beispielsweise Radioimmuntests oder Westernblot-Techniken oder auch Immunpräzipitation. Die Reinigung aus E. coli kann nach im US-Patent Nr. 4 511 503 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

D. Expression von HRSV-artigen Proteinen in Hefe.

Die Expression von heterologen Proteinen in Hefe ist gut bekannt und beschrieben worden. Methods in Yeast Genetics, F. Sherman und Mitarbeiter, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ist eine in weitem Umfang bekannte Arbeit, die die verschiedenen zur Herstellung von HRSV-artigen Proteinen in Hefe verwendeten Verfahren beschreibt.

Für die Überexpression eines Gens in Hefe ist es wesentlich, das Gen mit einem solch starken Promotorsystem wie im Prokaryonten zu verbinden und außerdem wirksame Transkriptions-Terminations-/Polyadenylierungs-Sequenzen aus einem Hefegen bereitzustellen. Beispiele für geeignete Promotoren umfassen Gal1,10 (M. Johnston und R.W. Davis, Mol. and Cell.

Biol., 4 : 1440-48, 1984), ADH2 (D. Russell und Mitarbeiter, J. Biol. Chem. 258 : 2674-2682, 1983), PHO5 (EMBOJ. 6 : 675-680, 1982) und MFal. Ein Multikopie-Plasmid mit einem selektiven Marker, wie z. B. Lue-2, URA-3, Trp-1 und His-3 ist ebenfalls wünschenswert. Der MFα1-Promotor ist bevorzugt. Der MFα1- Promotor ist in einem Wirt vom Mating-Typ α konstitutiv, ist jedoch in Diploiden oder Zellen vom Mating-Typ a abgeschaltet. Er kann jedoch durch Anheben oder Senken der Temperatur in Wirten mit einer ts-Mutation auf einem der SIR-Loci reguliert werden. Eine solche Mutation bewirkt in einer Zelle vom α-Typ bei 35ºC das Anspringen des normalerweise stillen Gens, das für den Mating-Typ a codiert. Die Expression des stillen Gens für den Mating-Typ a bewirkt seinerseits die Abschaltung des MFα1-Promotors. Das Absenken der Wachstumstemperatur auf 27ºC kehrt den gesamten Prozeß um, d. h. bewirkt das Abschalten des Mating-Typs a und das Anschalten des MFα1 (I. Herskowitz & Y. Oshima (1982) in The molecular biology of the yeast saccharomyces (Hrsg. J.N. Strathern, E.W. Jones & J.R. Broach, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, Seiten 181- 209).

Die Polyadenylierungs-Sequenzen werden durch die 3'-Endsequenzen beliebiger der hochgradig exprimierten Gene wie ADH1, MFα1 oder TPI bereitgestellt (T. Alber und G. Kawasaki, J. of Mol. & Appl. Genet. 1 : 419-434, 1982).

Eine Reihe von Hefeexpressionsplasmiden wie YEp6, YEp13, YEp24 kann als Vektor verwendet werden. Ein interessierendes Gen, wie z. B. die cDNA für das HRSV-artige Protein kann mit einem der oben genannten Promotoren fusioniert und dann für die Expression in verschiedenen Hefe-Wirten an die Plasmide ligiert werden. Die oben genannten Plasmide sind in der Literatur vollständig beschrieben (Botstein und Mitarbeiter, Gene, 8 : 17-24, 1979; Broach und Mitarbeiter, Gene, 8 : 121-133, 1979).

Zwei Verfahren werden für die Transformation von Hefezellen verwendet. Im einen Fall werden Hefezellen unter Verwendung von Zymolyase, Lyticase oder Glusulase und anschließend durch Zugabe von DNA und Polyethylenglykol (PEG) in Protoplasten überführt. Die PEG-behandelten Protoplasten werden dann unter selektiven Bedingungen in einem 3%igen Agar-Medium regeneriert. Einzelheiten bezüglich dieses Verfahrens sind in den Arbeiten von J.D. Beggs, Nature (London), 275 : 104-109 (1978) und A. Hinnen und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929-1933 (1978) angegeben. Das zweite Verfahren beinhaltet keine Entfernung der Zellwand. Statt dessen werden die Zellen mit Lithiumchlorid oder -acetat und PEG behandelt und auf selektive Schalen ausgebracht (H. Ito und Mitarbeiter, J. Bact., 153 : 163-168, 1983).

HRSV-artige Proteine können aus Hefe durch Lysieren der Zellen und Anwendung von Standardverfahren für die Proteinisolierung auf die Lysate isoliert werden. Die Proteine können mit Hilfe von Westernblot-Techniken oder Radioimmunotests aufgefunden werden.

E. Expression in Zellkulturen.

Die HRSV-cDNA kann für die Verwendung zur Transformierung von Wirtszellkulturen an verschiedene Expressionsvektoren ligiert werden. Die Vektoren enthalten allesamt Gensequenzen für die Initiation der Transkription und Translation des HRSV- artigen Proteins, die mit der zu transformierenden Wirtszelle kompatibel sind.

Darüber hinaus enthalten die Vektoren vorzugsweise einen Marker, um ein phänotypisches Merkmal für die Selektion transformierter Wirtszellen zur Verfügung zu stellen, beispielsweise Dihydrofolatreduktase oder Metallothionein. Zusätzlich kann ein Replikationsvektor ein Replicon enthalten.

Beispielhaft für Zellkulturen, die sich für die Herstellung von HRSV-artigen Proteinen eignen, sind Zellen, die von Insekten oder Säugern abstammen. Säugerzell-Systeme liegen häufig in der Form von Monozellschichten (Zellrasen) vor, obwohl auch Säugerzell-Suspensionen verwendet werden können. Anschauliche Beispiele für Säugerzellinien umfassen VERO- und HeLa-Zellen, Ovarium-Zellinien des Chinesischen Hamsters (CHO), WI38-, BHK-, COS-7- oder MDCK-Zellinien.

Wie oben erläutert, enthält der für die Transformierung der Wirtszelle verwendete Vektor, beispielsweise ein Plasmid, vorzugsweise Gensequenzen für die Initiation der Transkription und Translation der Gensequenz des HRSV-artigen Proteins. Diese Sequenzen werden als Expressions-Kontrollsequenzen bezeichnet. Wenn die Wirtszelle von einem Säuger oder Insekt stammt, erhält man verwendbare Expressionskontrollsequenzen, die hier als Beispiele angegeben sind, aus dem SV-40-Promotor (Science, 222, 524-527, 1983), dem CMV I.E.-Promotor (Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 659-663, 1984), dem Metallothionein-Promotor (Nature, 296, 39-42, 1982) oder dem Baculoviruspolyhedrin- Promotor (Insektenzellen) (Virol., 131, 561-565, 1983). Das die Expressionskontrollsequenzen enthaltende Plasmid oder replizierende oder integrierende DNA-Material wird mit Restriktionsenzymen geschnitten und auf die erforderliche oder gewünschte Größe eingestellt und nach auf diesem Gebiet gut bekannten Verfahren mit für die HRSV-artigen Proteine codierender cDNA ligiert.

Wie bei Hefe ist es auch bei der Verwendung von höheren tierischen Wirtszellen notwendig, Polyadenylierungs- oder Transkriptions-Terminator-Sequenzen aus bekannten Säugetiergenen in den Vektor einzubauen. Ein Beispiel für eine Terminator-Sequenz ist die Polyadenylierungs-Sequenz aus dem Rinderwachstumshormon-(bGH-)Gen.

Man kann das HRSV-Glycoprotein F so konstruieren, daß es von den Zellen in das umgebende Medium sezerniert wird. Dies geschieht dadurch; daß die frühe Termination des Glycoproteins vor seiner Ankerregion verursacht wird. L. Lasky und Mitarbeiter, Biotechnology, 2 : 527-532 (1984). Der Anker ist eine hydrophobe Region am carboxyterminalen Ende des Glycoproteins, der den Verbleib des Glycoproteins in der Zellmembran verursacht. Eine frühe Termination kann durch Insertieren eines universellen Translations-Terminator-Oligonukleotids in einen geeigneten Ort in der DNA des Gens bewirkt werden. Diese Oligonukleotide sind im Handel erhältlich. Für das F-Gen ist ein bevorzugter Ort für die Insertion die NsiI-Restriktionsenzym-Schnittstelle, die ungefähr 1,5 kB vom 5'-Ende des Gens entfernt liegt.

Weitere Gensequenzen für die Kontrolle der Replikation in der Wirtszelle können in den Vektor eingebaut werden, beispielsweise solche, die man in Vektoren vom Rinder-Papillomavirus-Typ findet. M. Saveria-Campo, "Bovine papillomavirus DNA: a eukaryotic cloning vector" in DNA Cloning Vol II, a practical approach, Hrsg. D.M. Glover, IRL Press, Arlington, Virginia, Seiten 213-238 (1985).

Der bevorzugte für die Expression von HRSV-artigen Proteinen in Ovarium-Zellen des Chinesischen Hamsters geeignete Expressionsvektor ist ein Schaukelvektor pSVCOW7, der sowohl in CHO- als auch E. coli-Zellen repliziert wird, wobei Ampicillinresistenz- bzw. Dihydrofolatreduktase-Gene als Marker in E. coli- bzw. CHO-Zellen verwendet werden. Das Plasmid pSVCOW7 stellt auch die Polyadenylierungs-Sequenz des Rinder-Wachstumshormons zur Verfügung, die für die Expression in CHO-Zellen notwendig ist. Das Plasmid pSVCOW7 wird gespalten, und ein viraler Promotor und die cDNAs für die HRSV-artigen Proteine werden insertiert.

Der bevorzugte Expressionsvektor zur Erzeugung von rekombinantem Baculovirus für die Expression von HRSV-artigen Proteinen in Insektenzellen ist pAc373. Smith und Mitarbeiter, Mol. Cell. Biol. 3 : 2156-2165 (1983). Das Plasmid wird in E. coli-Zellen repliziert, wobei Ampicillinresistenz genutzt wird und liefert den eukaryontischen Promotor und das Polyadenylierungs-Signal aus dem Baculovirus-Polyhedrin-Gen für die Expression von HRSV-Genen. Das Plasmid pAc373 wird gespalten, und eine HRSV-cDNA wird in die Nachbarschaft zum Promotor insertiert. Dieses neue Plasmid wird zusammen mit Baculovirus- DNA (Autographa californica Kernpolyhedrosis-Virus) mittels Calciumphosphat-Ausfällung in Insektenzellen transfiziert. Rekombinantes Baculovirus, in welchem das pAc373-Polyhedrin-Gen mit einer HRSV-cDNA durch homologe Rekombination das residente virale Polyhedrin-Gen ersetzt hat, wird mit Hilfe der "Dot Blot"-Hybridisierung (M. Summers und G. Smith, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas A & M University, College Station, Texas, Seiten 29-30 (1986)) unter Verwendung von ³²p-markierter HRSV- cDNA als Sonde detektiert. Mit rekombinantem Baculovirus infizierte Insektenzellen können auch durch ihre Einschlußkörpernegative Morphologie unterschieden werden, da die Insertion der HRSV-cDNA in das Polyhedrin-Gen die Synthese dieses Einschlußkörper bildenden Proteins verhindert. Die Isolierung von HRSV-Proteinen aus infizierten Insektenzellen wird wie für CHO-Zellen beschrieben durchgeführt.

Der in Verbindung mit dem Rinder-Papillomavirus (BPV) für die Expression von HRSV-artigen Proteinen verwendete, bevorzugte Expressionsvektor ist pTFW9, U.S. Ser.No. 935 490, der durch die Bezugnahme ausdrücklich vorliegend mitumfaßt ist. Das Plasmid wird unter Ausnutzung von Ampicillinresistenz in E. coli repliziert und liefert den Mäuse-Metallothionein- Promotor und das SV40-Polyadenylierungs-Signal für die Expression der HRSV-Gene. Das Plasmid pTFW9 wird geschnitten, und in Nachbarschaft zum Promotor wird eine HRSV cDNA insertiert. Dieses neue Plasmid wird dann gespalten, um die Insertion von BPV zu ermöglichen. Das rekombinante Plasmid wird mit Hilfe der Calciumphosphatfällung in Tierzellen transfiziert, und Herde transformierter Zellen werden selektioniert. In diesen transformierten Zellen exprimiertes HRSV-Protein wird wie für CHO-Zellen beschrieben isoliert.

Die Wirtszellen sind transfektions-kompetent oder werden auf verschiedene Arten dazu gemacht. Es gibt eine Reihe von gut bekannten Verfahren, um DNA in Tierzellen einzuführen. Diese schließen ein: Calciumphosphat-Fällung, Fusion der aufnehmenden Zellen mit die DNA enthaltenden bakteriellen Protoplasten, Behandeln der aufnehmenden Zellen mit die DNAenthaltenden Liposomen und Mikroinjektion der DNA direkt in die Zellen.

Die transfizierten Zellen werden nach auf diesem Gebiet der Technik gut bekannten Verfahren kultiviert. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, R.J. Kuchler, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977), und die exprimierten HRSV- artigen Proteinanaloga werden aus Zellsuspensionen isoliert, die durch Aufbrechen des Wirtszellsystems mittels gut bekannter mechanischer oder enzymatischer Methoden erzeugt werden. HRSV-artige Proteine, die so "geschneidert" sind, daß sie aus den Zellen sezerniert werden, werden ohne Aufbrechen der Zellen aus den Medien isoliert.

Die Isolierung der HRSV-Proteine erfolgt durch Lysieren der CHO-Zellen mit Detergentien. Für HRSV-Glycoproteine ist es hilfreich, zuerst die Cytoplasma-Fraktion auf eine Linsenlectin-Säule aufzubringen, die spezifisch Glycoproteine bindet. Die eluierten Glycoproteine werden dann auf eine Affinitätssäule mit Antikörpern gegen HRSV aufgetragen. Non-Glycoproteine von HRSV können direkt auf die Affinitätssäule aufgebracht werden.

F. Definitionen

Der Ausdruck "Zellkultur" bezieht sich auf das Halten von entweder aus einer mehrzelligen Pflanze oder einem solchen Tier stammenden, wachsenden Zellen, das den Zellen ermöglicht, außerhalb der ursprünglichen Pflanze oder des ursprünglichen Tieres lebensfähig zu bleiben.

Der Ausdruck "stromabwärts" identifiziert Sequenzen, die sich weiter entfernt in Expressionsrichtung befinden; beispielsweise liegt die codierende Region stromabwärts vom Initiationscodon.

Der Ausdruck "Mikroorganismus" umfaßt einzellige prokaryontische und eukaryontische Organismen, beispielsweise Bakterien, Aktinomyceten und Hefe.

Der Ausdruck "Operon" beschreibt eine vollständige Einheit für die Genexpression und -regulation einschließlich von strukturellen Genen, Regulatorgenen und Kontrollelementen in DNA, die vom regulatorischen Genprodukt erkannt werden.

Der Ausdruck "Plasmid" bezieht sich auf eine autonome, selbstreplizierende, extrachromosomale, zirkuläre DNA und umschließt sowohl die exprimierenden als auch die nicht-exprimierenden Typen. Wenn ein rekombinanter Mikroorganismus oder eine solche Zellkultur als ein Expressionsplasmid beherbergend beschrieben wird, umfaßt der Ausdruck "Expressionsplasmid" sowohl extrachromosomale zirkuläre DNA als auch DNA, die in das Wirtschromosom bzw. die Wirtschromosomen eingebaut worden ist. Wenn ein Plasmid in einer Wirtszelle dauerhaft verbleibt, wird das Plasmid von den Zellen während der Mitose entweder als autonome Struktur oder als eingebauter Teil des Wirtsgenoms stabil repliziert.

Der Ausdruck "Promotor" beschreibt eine Region von DNA, die an der Bindung der RNA-Polymerase für die Initiation der Transkription beteiligt ist.

Der Ausdruck "immunogene Fragmente" umfaßt Derivate der strukturellen Proteine von HRSV, die ausreichend antigene Kapazität besitzen, um in einem Patienten, der virulentem HRSV ausgesetzt ist, einen wirksamen immunologischen Schutz zu erzeugen. Der Ausdruck "HRSV-artige Proteine" soll diese Fragmente mitumfassen. Beispielsweise sind HRSV-Proteine aus Aminosäureresten gebildet, die nicht vollständig der wäßrigen Umgebung ausgesetzt sind und eine starke immunogene Antwort hervorrufen können. Bei sorgfältiger Auswahl sollte eine Modifikation oder Deletion in diesen Regionen die Antigenität nicht beeinflussen. Während sie keine nativen HRSV-Proteine mehr sind, sind die Proteine nun immunogene Fragmente, sofern Deletionen darin vorkommen, und HRSV-artige Proteine, wenn entweder Deletionen oder Modifikationen der primären Sequenz erfolgten.

Der Ausdruck "DNA-Sequenz" bezieht sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges DNA-Molekül, bestehend aus Nukleotidbasen, Adenosin, Thymidin, Cytosin und Guanosin.

Der Ausdruck "im wesentlichen reines (HRSV-)Protein" bezieht sich auf Zusammensetzungen von viralem Protein, die kein vom Virus synthetisiertes Protein enthalten. Obwohl die im wesentlichen reinen Proteine mit geringen Mengen von Wirtszellbestandteilen kontaminiert sein können, ist das Protein frei von kontaminierendem strukturellem und nicht-strukturellem viralem Protein, das durch die Vermehrung von HRSV erzeugt wurde.

Der Ausdruck "geeigneter Wirt" bezieht sich auf eine Zellkultur oder einen Mikroorganismus, der mit einem rekombinanten Plasmid kompatibel ist und ermöglicht, daß sich das Plasmid vermehrt, in sein Genom eingebaut oder exprimiert wird.

Der Ausdruck "stromaufwärts" benennt Sequenzen, die in Gegenrichtung zur Expression angeordnet sind; beispielsweise liegt der bakterielle Promotor stromaufwärts zur Transkriptionseinheit, das Initiationscodon liegt stromaufwärts zur codierenden Region.

Beispiel 1 Herstellung eines Impfstoffs für HRSV

Das Immunogen kann nach gut bekannten Verfahren in die Dosierungsforms eines Impfstoffs gebracht werden. Der Impfstoff kann intramuskulär, subcutan oder intranasal verabreicht werden. Für die parenterale Gabe, beispielsweise die intramuskuläre Injektion, kann das Immunogen mit einem geeigneten Träger zusammengegeben werden, beispielsweise kann es in Wasser, Salzlösung oder gepufferten Trägern mit oder ohne Zusatz verschiedener Adjuvantien oder immunmodulierender Agentien, wie z. B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumkaliumsulfat (Alaun), Berylliumsulfat, Siliciumdioxid, Kaolin, Kohlenstoff, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Muramyldipeptid, bakteriellem Endotoxin, Lipid X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), Bordetella pertussis, Polyribonucleotiden, Natriumalginat, Lanolin, Lysolecithin, Vitamin A, Saponin, Liposomen, Lävamisol, DEAE- Dextran, Blockcopolymeren oder anderen synthetischen Adjuvantien verabreicht werden. Solche Adjuvantien sind im Handel bei verschiedenen Quellen erhältlich, beispielsweise das Merck Adjuvans 65 Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.).

Der Anteil an Immunogen und Adjuvans kann über einen weiten Bereich schwanken, sofern beide in wirksamen Mengen vorliegen. Beispielsweise kann Aluminiumhydroxid in einer Menge von etwa 0,5% der Impfstoffmischung (auf Basis Al&sub2;O&sub3;) vorliegen. Auf Basis der einzelnen Dosis kann die Konzentration des Immunogens im Bereich von etwa 0,015 ug bis etwa 1,5 mg/kg Körpergewicht des Patienten liegen. Ein bevorzugter Dosisbereich ist etwa 1,5 kg/kg bis etwa 0,043 mg/kg des Patientenkörpergewichts. Eine geeignete Dosisgröße für Menschen beträgt etwa 0,1-1 ml, vorzugsweise etwa 0,1 ml. Dementsprechend könnte eine Dosis für die intramuskuläre Injektion beispielsweise 0,1 ml betragen, wobei das Immunogen in Mischung mit 0,5% Aluminiumhydroxid enthalten ist.

Der Impfstoff kann an schwangere Frauen oder Frauen in gebärfähigem Alter verabreicht werden, um die mütterlichen HRSV-Antikörper zu stimulieren. Die Frauen können bei Bedarf nachgeimpft werden. Babies können im Alter von 2-3 Monaten geimpft und je nach Bedarf nachgeimpft werden, vorzugsweise im Alter von 6 bis 9 Monaten. Babies ungeimpfter Mütter können im Alter von 2 bis 3 Monaten geimpft werden. Der Impfstoff kann auch für andere anfällige Bevölkerungsgruppen von Wert sein, beispielsweise für ältere oder geschwächte Patienten.

Der Impfstoff kann auch mit anderen Impfstoffen für andere Krankheiten zusammengegeben werden, so daß multivalente Impfstoffe entstehen. Er kann auch mit anderen Arzneimitteln, wie z. B. Antibiotika, zusammengegeben werden.

ABBILDUNG 1 Nucleotidsequenz der F mRNA und die vorhergesagte Proteinsequenz
ABBILDUNG 1 (Fortsetzung)
ABBILDUNG 1 (Fortsetzung)
ABBILDUNG 1 (Fortsetzung)
ABBILDUNG 2 Nucleotidsequenz der RS Virus G mRNA und die vorhergesagte Proteinsequenz
ABBILDUNG 2 (Fortsetzung)

Anspruch[de]

1. Impfstoff gegen menschliches respiratorisches Syncytialvirus, enthaltend glycosyliertes F-Protein, glycosyliertes G-Protein oder ein Derivat davon mit ausreichender antigener Kapazität, um in einem Patienten, der virulentem HRSV ausgesetzt ist, wirksamen immunologischen Schutz zu erzeugen, das frei von anderem virussynthetisiertem Protein ist.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, enthaltend glycosyliertes F- Protein oder ein immunogenes Fragment davon.

3. Impfstoff nach Anspruch 1, enthaltend glycosyliertes G- Protein oder ein immunogenes Fragment davon.

4. Verwendung eines glycosylierten Proteins, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, das frei von anderem virussynthetisiertem Protein ist, für die Herstellung eines Medikamentes zum Schutz von Menschen vor menschlichem respiratorischem Syncytialvirus.







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