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Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat. - Dokument DE3888307T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE3888307T2 16.06.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0319130
Titel Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat.
Anmelder Kyowa Hakko Kogyo K.K., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Fujio, Tatsuro, Sagamihara-shi Kanagawa-ken, JP;
Maruyama, Akihiko, Kawasaki-shi Kanagawa-ken, JP;
Koizumi, Satoshi, Machida-shi Tokyo-to, JP
Vertreter Kinzebach, W., Dipl.-Chem. Dr.phil.; Riedl, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Schweiger, G., Dipl.-Chem.Univ. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte, 81679 München
DE-Aktenzeichen 3888307
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 05.10.1988
EP-Aktenzeichen 883092793
EP-Offenlegungsdatum 07.06.1989
EP date of grant 09.03.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.06.1994
IPC-Hauptklasse C12P 17/04
IPC-Nebenklasse C12N 1/20   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat (im folgenden bezeichnet als AsA2P). Ascorbinsäure findet verbreitet Anwendung, z. B. auf den Gebieten der Medizin, der Nahrungsmittel und der Kosmetika, besitzt jedoch den Nachteil, daß sie z. B. unter Einwirkung von Hitze, Luft oder Licht zersetzbar ist.

AsA2P ist ein stabiles Derivat der Säure, das durch die Phosphorylierung im Körper leicht in Ascorbinsäure umgewandelt werden kann und findet daher ein weites Anwendungsgebiet, beispielsweise als Rohmaterial bei der Herstellung von Kosmetika und Medikamenten, insbesondere von Kosmetika, sowie als Nahrungsmittelzusatz.

Verfahren zur Herstellung von AsA2P durch chemische Synthese sind bekannt [beispielsweise JP-A-30328/70, 15605/73 und 18191/77 und J. Org. Chem. 47, 3453, (1982)]. Die Verwendung von Enzymen mikrobiellen Ursprungs für die Herstellung von AsA2P wurde in dem Abstract of Lectures einer Konferenz der Japanese Society of Agricultural Chemistry, 4 L-1, S. 696 (1987) beschrieben.

Die chemische Synthese wurde bereits zur Herstellung von AsA2P in industriellem Maßstab eingesetzt. Jedoch weist die chemische Synthese den ihr inherenten Nachteil auf, daß zusätzlich zu der gewünschten Phosphorylierung in 2-Position unvermeidlich verschiedene Isomere gebildet werden, die beispielsweise in der 3- und der 6-Position phosphoryliert sind, so daß es schwierig ist, AsA2P in hoher Ausbeute herzustellen. Folglich wurden verschiedene Versuche unternommen, um die Produktionsausbeute von AsA2P zu erhöhen, wie z. B. durch Einführung einer Schutzgruppe oder durch besondere Auswahl der Verfahrensbedingungen. Jedoch sind die bekannten Herstellungsverfahren noch immer kompliziert und teuer und darüber hinaus besteht die Schwierigkeit, AsA2P in hoher Reinheit herzustellen.

Im Zusammenhang mit der bekannten, präparativen Methode unter Verwendung eines aus dem Mikroorganismus der Spezies Citrobacter freundii stammenden Enzyms (vgl. Abstracts of the Lectures der Konferenz der Japanese Society of Agricultural Chemistry, 4 L-1, S. 696 (1987)) wird berichtet, daß in diesem Fall ein Hauptteil des Produktes in 6-Position phosphoryliert ist und daß es, um AsA2P herzustellen, erforderlich ist, eine Schutzgruppe einzuführen (wie z. B. Isopropyliden), bevor man mit der Reaktion beginnt und daß diese nach Beendigung der Reaktion wieder entfernt wird.

Wie in der EP-A-0 272 064 des Patentinhabers beschrieben, wurde bereits festgestellt, daß verschiedene Mikroorganismen zur spezifischen Phosphorylierung von Ascorbinsäure in 2-Position in Gegenwart von ATP unter Ausbildung von AsA2P befähigt sind. Der Nachteil des obigen Verfahrens besteht in den hohen Kosten für ATP. Es wurde nun festgestellt, daß bestimmte Mikroorganismen befähigt sind, Ascorbinsäure in 2-Position in Gegenwart einfacherer und billigerer Phosphatdonoren, wie z. B. Pyrophosphorsäure, spezifisch zu phosphorylieren.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-Phosphat, wobei man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit einem von ATP verschiedenen Phosphatdonor in einem wäßrigen Medium in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Enzyms umsetzt, das abgeleitet ist aus einem Mikroorganismus, der ausgewählt unter den Genera Klebsiella, Cellulomonas, Alcaligenes, Aeromonas, Brevibacterium, Pseudomonas, Flavobacterium, Xanthomonas, Morganella, Serratia, Enterobacter, Bacillus und Corynebacterium, und das zur Katalysierung der enzymatischen Phosphorylierung in 2-Position von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure durch den Phosphatdonor befähigt ist, und man das resultierende Ascorbinsäure-2-phosphat aus der Reaktionslösung isoliert.

Der Ausdruck Ascorbinsäure umfaßt sowohl das D- als auch das L- Isomer von Ascorbinsäure.

Beispiele für verwendbare Phosphatdonoren umfassen Nicht- Nukleotidphosphatester, insbesondere substituierte Phenylphosphate, wie para-Nitrophenylphosphat; gemischte Anhydride von Phosphorsäure, z. B. mit Niedrigcarbonsäuren, wie Acetylphosphorsäure; und kondensierte oder polymerisierte Phosphorsäuren, wie Pyrophosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Tetrapolyphosphorsäure und Polyphosphorsäure.

Beispiele für geeignete Mikroorganismen umfassen:

Klebsiella oxytoca ATCC 8724

Cellulomonas flavigena SK-4 FERM-BP 1575*

Cellulomonas cartae ATCC 21681

Alcaligenes eutrophus ATCC 17697

Beneckea hyperoptica ATCC 15803

Aeromonas hydrophila ATCC 11163

Klebsiella pneumoniae ATCC 21524

Brevibacterium lyticum ATCC 15921

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872

Brevibacterium flavum ATCC 13826

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655

Pseudomonas riboflavina ATCC 9526

Pseudomonas diminuta ATCC 11568

Flavobacterium devorans ATCC 10829

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417

Pseudomonas maltophilia ATCC 17806

Xanthomonas oryzae IFO 3995

Morganella morganii ATCC 25830

Serratia rubidaca ATCC 11634

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Bacillus subtilis ATCC 19221

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

* Hinterlegt bei der Fermentation Research Institution am 21. November 1987.

Es besteht die Möglichkeit, die Mikroorganismen unter Verwendung herkömmlicher Medien zu kultivieren, wie z. B. KM102-Medium, enthaltend Polypepton (10 g/l), Fleischextrakt (7 g/l), Hefeextrakt (5 g/l) und Natriumchlorid (3 g/l) bei einem pH von 7,2, vorausgesetzt, die verwendeten Mikroorganismen können ohne Inhibierung ihrer Fähigkeit zur AsA2P-Produktion gut wachsen. Es besteht außerdem die Möglichkeit, verschiedene organische, halb-synthetische und synthetische Medien zu verwenden, die Quellen für Stickstoff und Kohlenstoff und andere anorganische und/oder organische Substanzen enthalten.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen umfassen beispielsweise Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Sucrose oder Maltose; Zuckeralkohole, wie Mannitol oder Sorbitol; Alkohole, wie Glycerin; organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Milchsäure oder Citronensäure; und Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Methionin oder Lysin. Gewünschtenfalls können andere natürlich vorkommende organische Nährstoffe, wie Stärkehydrolysat, Melasse, Melasseabfall, Kleie von weißem Reis, Cassava, Bagasse oder Maisquellwasser verwendet werden.

Beispiele für Stickstoffquellen umfassen anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat; Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Glutamin oder Methionin; und stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, NZ-Amin, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Fischmehl und Verdauungsprodukte davon oder Chrysalis-Hydrolysat.

Beispiele für anorganische Substanzen umfassen dibasisches Kaliumphosphat, monobasisches Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Kalziumchlorid, Eisenchlorid, Kupfersulfat, Manganchlorid, Ammoniummolybdat und Zinksulfat, von denen geeignete Mengen dem Medium zugesetzt werden.

Vitamine, Aminosäuren, Nukleinsäuren und andere Substanzen, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sein können, werden gewünschtenfalls und erforderlichenfalls dem Medium zugesetzt.

Vorzugsweise führt man die Kultivierung unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Schütteln oder durch Belüftung und Rühren, durch. Üblicherweise erfolgt die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC, vorzugsweise bei 25 bis 35ºC und bei einem pH von 4 bis 10, vorzugsweise von 6,5 bis 7,5 über einen Zeitraum von 1 bis 100 Stunden.

AsA2P wird durch Reaktion von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit einem Phosphatdonor gebildet. Die Reaktion kann unter Anwendung einer der folgenden Methoden durchgeführt werden:

(1) Vereinigung von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit einem Phosphatdonor in der Kulturbrühe eines Mikroorganismus; oder

(2) Vermischen von wenigstens einer Komponente, ausgewählt unter einer Kulturbrühe, mikrobiellen Zellen, Überstand einer Kulturbrühe oder Produkten, die man durch deren Behandlung erhält, mit einer Lösung, enthaltend Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und einen von ATP verschiedenen Phosphatdonor.

Zusätze, wie oberflächenaktive Mittel oder organische Lösungsmittel, können gewünschtenfalls zur Reaktionslösung hinzugegeben werden, um die AsA2P-Ausbeute zu erhöhen.

Geeignete oberflächenaktive Mittel umfassen beispielsweise kationische oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylenstearylamin (wie z. B. Nymeen S-215, Handelsprodukt von Nihon Yushi K.K., Japan), oder Cetyltrimethylammoniumbromid; anionische oberflächenaktive Mittel, wie Natriumoleylamidsulfat; und amphotere oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylensorbitanmonostearat (wie z. B. Nonion ST 221, Handelsprodukt von Nihon Yushi K.K., Japan), welche die Herstellung von AsA2P aus Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und einem Phosphatdonor fördern. Üblicherweise verwendet man das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von 1 bis 50 mg/ml, vorzugsweise von 1 bis 20 mg/ml.

Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel umfassen Toluol, Xylol, Aceton, aliphatische Alkohole, Benzol und Ethylacetat, die üblicherweise in einer Menge von 0,1 bis 50 ul/ml, vorzugsweise von 1 bis 20 ul/ml verwendet werden können.

Sowohl chemisch reine als auch rohe Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und von ATP verschiedene Phosphatdonoren können zu dem erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden, sofern sie Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und den Phosphatdonor enthalten und die AsA2P-Bildung nicht beeinträchtigen.

Vorzugsweise verwendet man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und den von ATP verschiedenen Phosphatdonor in Konzentrationen von 1 bis 500 mM beziehungsweise von 1 bis 1000 mM.

Gemäß dem zweiten Verfahren wird die Reaktion vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 70ºC über einen Zeitraum von 1 bis 48 Stunden durchgeführt, wobei man den pH-Wert bei 3 bis 11 hält, indem man beispielsweise Ammoniak, KOH oder NaOH zugibt.

Beispiele für die durch Behandlung der Kulturbrühe erhaltenen Produkte umfassen konzentrierte oder getrocknete Kulturbrühe, Produkte, erhalten durch Zugabe eines oberflächenaktives Mittels und/oder einer organischen Säure zu der Kulturbrühe, Produkte erhalten durch Behandlung von Zellen mit bakteriolytischem Enzym, immobilisierte mikrobielle Zellen und aus den mikrobiellen Zellen extrahierte Enzymprodukte.

Die von der Kulturbrühe abgetrennten Zellen können vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 400 mg/ml (Feuchtgewicht der Zellen) verwendet werden.

Es besteht die Möglichkeit, die AsA2P-Menge durch Messung der Absorption bei 254 nm nach Durchführung einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie über eine Nucleosil 10 C&sub1;&sub8;- Säule (Mandelsprodukt von Masherey-Nagel, Deutschland) zu bestimmen, wobei man ein durch chemische Synthese erhaltenes, reines AsA2P-Präparat als Referenz verwendet.

Die Isolierung von AsA2P aus der Kulturbrühe oder der Reaktionslösung kann dadurch erfolgen, daß man die Zellen aus der Kulturbrühe entfernt, erforderlichenfalls Protein aus dem Überstand entfernt, den Überstand neutralisiert und anschließend die Lösung durch Säulenchromatographie, beispielsweise unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, Sephadex oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie, reinigt.

Die folgenden, nichtlimitierenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.

Beispiel 1

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417 kultiviert man in KM 102 Medium (30 ml) bei einer Temperatur von 30ºC über einen Zeitraum von 20 Stunden unter Rühren (220 Upm), wobei man eine Impfkultur erhält. Die Impfkultur (12 ml) überführt man in KM 102 Medium (300 ml) und kultiviert 20 Stunden bei 30ºC unter Rühren (220 Upm). Die resultierende Kulturbrühe zentrifugiert man (10.000 x g, 10 min), wobei man feuchte Zellen (11,8 g) erhält, die man bei einer Temperatur von -20ºC gefriertrocknet und aufbewahrt.

Zu einer Lösung (50 ml), bestehend aus Ascorbinsäure (200 mM), Natriumacetat-gepufferte Lösung (100 mM), Nymeen S-215 (4g/l; Handelsprodukt von Nihon Yushi K.K., Japan) und xylol (10 ml/l), wird eine Reaktionslösung (50 ml), enthaltend die gefriergetrockneten Zellen (50 mg/ml; berechnet als Naßgewicht der Zellen) und ein Phosphatdonor gemäß folgender Tabelle 1 (40 mM) zugesetzt.

Das Gemisch rührt man (100 Upm) mit einem Magnetrührer über einen Zeitraum von 10 Stunden, während man den pH mit Natronlauge und/oder Chlorwasserstoffsäure einstellt, und man die Temperatur bei 30ºC hält.

Die Menge an resultierendem AsA2P bestimmt man durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie. Tabelle 1 zeigt die auf diese Weise erzielten relativen Aktivitäten (im Vergleich zu der bei Verwendung von ATP erzielten Aktivität), sowie den pH- Wert der Reaktionslösung.

Tabelle 1
Phosphatdonor Reaktion bei pH Relative Aktivität (%) Adenosintriphosphat Acetylphosphorsäure para-Nitrophenylphosphat Pyrophosphorsäure Tripolyphosphorsäure Tetrapolyphosphorsäure Polyphosphorsäure Orthophosphorsäure Spur

Anmerkung: Sämtliche Reagenzien sind Handelsprodukte von Nakarai Kagaku Kogyo K.K., Japan

Beispiel 2

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417 kultiviert man in KM 102 Medium (30 ml) über einen Zeitraum von 20 Stunden bei 30ºC. Die resultierende Impfkultur (12 ml) kultiviert man bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden im KM 102 Medium (30 ml). Die Kulturbrühe zentrifugiert man (10.000 x g, 10 Minuten), um feuchte Zellen (11,8 g) abzutrennen, die man dann zur Aufbewahrung bei einer Temperatur von -20ºC einfriert. Eine Reaktionslösung (50 ml), zusammengesetzt aus gefrorenen Zellen (50 mg/ml feuchte Zellen), Ascorbinsäure (200 mM), Kaliumpyrophosphat (200 mM), Natriumacetat-gepufferte Lösung (pH 4,0; 100 mM), Nymeen S-215 (4 g/l) und Xylol (10 ml/l) rührt man (100 Upm) bei 40ºc über einen Zeitraum von 36 Stunden mit einem Magnetrührer. Die Menge an gebildetem AsA2P bestimmt man durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie.

Es wurde festgestellt, daß 32,0 mg/ml AsA2P im Überstand der Reaktionslösung am Ende der Reaktion zu finden sind und daß Nebenprodukte wie Ascorbinsäure-6-phosphat, Ascorbinsäure-3- phosphat und deren Pyrophosphate im wesentlichen nicht vorliegen.

Beispiel 3

Jeden der in Tabelle 2 aufgeführten Stämme kultiviert man bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden in KM 102 Medium (30 ml). In jedem Fall überführt man die resultierende Impfkultur (12 ml) in KM 102 Medium (300 ml) und kultiviert 20 Stunden bei 30 ºC. Jede auf diese Weise erhaltene Fermentationsflüssigkeit zentrifugiert man (10.000 x g, 10 Minuten) und isoliert die mikrobiellen Zellen. Die Zellen werden gefriergetrocknet und bei -20ºC aufbewahrt. Anschließend wird jede Reaktionslösung (50 ml), zusammengesetzt aus gefriergetrockneten Zellen (50 mg/ml, basierend auf Naßgewicht der Zellen), Ascorbinsäure (200 mM), Kaliumpyrophosphat (200 mM), Natriumacetat-gepufferte Lösung (pH 4,0; 100 mM), Nymeen S-215 (4g/l) und xylol (10 ml/l) 24 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt, während man den pH auf etwa 4,0 mit NaOH einstellt und die Temperatur bei 30ºC hält. Nach Beendigung der Reaktion wird die Menge an gebildetem AsA2P, die im Überstand des Reaktionsansatzes zu finden ist, durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2
Mikroorganismus AsA2P (g/l) Klebsiella oxytoca Cellulomonas flavigena Cellulomonas cartae Alcaligenes eutrophus Beneckea hyperoptica Aeromonas hydrophila Klebsiella pneumoniae Brevibacterium lyticum Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Pseudomonas riboflavina Pseudomonas diminuta Flavobacterium devorans Pseudomonas maltophilia Xanthomonas oryzae Morganella morganii Serratia rubidaca Enterobacter aerogenes Bacillus subtilis Corynebacterium glutamicum

Beispiel 4

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417 kultiviert man bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden in KM 102 Medium (30 ml) unter Rotation (220 Upm), wobei man eine Impfkultur erhält, die man (12 ml) in KM 102 Medium (300 ml) überführt und bei einer Temperatur von 30ºC 20 Stunden unter Rotation (220 Upm) kultiviert.

Die resultierende Kulturbrühe stellt man auf pH 4,0 mit Chlorwasserstoffsäure ein. Nach Zugabe von Ascorbinsäure (200 mM), Nymeen S-215 (4 g/l), Xylol (10 ml/l) und Pyrophosphorsäure (40 mM) rührt man die Reaktionslösung (100 Upm) 10 Stunden bei 30ºC, um die Reaktion zu beenden. In der Reaktionslösung findet man 8,84 g/l AsA2P.

Beispiel 5

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 kultiviert man Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417. Die kultivierten Zellen werden bei einer Temperatur von -20ºC gefriergetrocknet. Nach Zugabe von Nymeen S-215 (4 g/l) und Xylol (10 ml/l) erhitzt man die gefrorenen Zellen auf eine Temperatur von 30ºC über einen Zeitraum von 10 Minuten. Diese Zellen gibt man zu Araboascorbinsäure (200 mM) und einem der in der folgenden Tabelle 3 aufgeführten Phosphatdonoren (150 mM) in Natriumacetatgepufferter Lösung (pH 4,0; 40 mM) in einer Menge von 50 mg/ml (auf Basis des Feuchtgewichts der Zellen) hinzu. Die Reaktion erfolgt über einen Zeitraum von 60 Minuten. Während der Reaktion wird die Reaktionslösung mit einem Magnetrührer (100 Upm) gerührt und der pH der Lösung mit NaOH auf etwa 4,0 eingestellt. Die Reaktionstemperatur wird bei 30ºC gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wird mit Hilfe von Hochdruckflüssigkeitschromatographie die Menge an gebildetem AsA2P im Überstand der Reaktionslösung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3
Phosphatdonor AsA2P (g/l) Pyrophosphorsäure Tripolyphosphorsäure Tetrapolyphosphorsäure Acetylphosphorsäure p-Nitrophenylphosphorsäure Adenosintriphosphat Adenosintriphosphat (pH 5,5)


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat, wobei man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit einem von ATP verschiedenen Phosphatdonor in einem wäßrigen Medium in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Enzyms umsetzt, das abgeleitet ist aus einem Mikroorganismus, der ausgewählt unter den Genera Klebsiella, Cellulomonas, Alcaligenes, Aeromonas, Brevibacterium, Pseudomonas, Flavobacterium, Xanthomonas, Morganella, Serratia, Enterobacter, Bacillus und Corynebacterium, und das zur Katalysierung der enzymatischen Phosphorylierung in 2-Position von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure durch den Phosphatdonor befähigt ist, und man das resultierende Ascorbinsäure-2-phosphat aus der Reaktionslösung isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Phosphatdonor ein Nicht-Nukleotidphosphatester, ein gemischtes Anhydrid von Phosphorsäure oder eine kondensierte oder polymerisierte Phosphorsäure ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Phosphatdonor ein substituiertes Phenylphosphat oder ein gemischtes Anhydrid von Phosphorsäure mit einer Niedrigcarbonsäure ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Phosphatdonor ausgewählt ist unter para-Nitrophenylphosphat, Acetylphosphorsäure, Pyrophosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Tetrapolyphosphorsäure und Polyphosphorsäure.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Mikroorganismus ausgewählt ist unter

Klebsiella oxytoca ATCC 8724

Cellulomonas flavigena SK-4 FERM-BP 1575

Cellulomonas cartae ATCC 21681

Alcaligenes eutrophus ATCC 17697

Beneckea hyperoptica ATCC 15803

Aeromonas hydrophila ATCC 11163

Klebsiella pneumoniae ATCC 21524

Brevibacterium lyticum ATCC 15921

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872

Brevibacterium flavum ATCC 13826

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655

Pseudomonas riboflavina ATCC 9526

Pseudomonas diminuta ATCC 11568

Flavobacterium devorans ATCC 10829

Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417

Pseudomonas maltophilia ATCC 17806

Xanthomonas oryzae IFO 3995

Morganella morganii ATCC 25830

Serratia rubidaca ATCC 11634

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Bacillus subtilis ATCC 19221

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Mikroorganismus Cellulomonas flavigena SK-4 FERM-BP 1575, Cellulomonas cartae ATCC 21681 oder Pseudomonas riboflavina ATCC 9526 ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Mikroorganismus Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417 ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die enzymatische Reaktion in der Kulturbrühe des Mikroorganismus durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Kultivierung bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40ºC, bei einem pH im Bereich von 4 bis 10 und über einen Zeitraum von 1 bis 100 Stunden in Gegenwart von Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure und einer wirksamen Menge des Phosphatdonors durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die enzymatische Reaktion dadurch bewirkt wird, daß man Ascorbinsäure oder Araboascorbinsäure mit einem von ATP verschiedenen Phosphatdonor in Gegenwart wenigstens einer der folgenden Komponenten in Kontakt bringt: konzentrierte Kulturbrühe, getrocknete Kulturbrühe, Überstand der Kulturbrühe, mikrobielle Zellen, behandelt mit bakteriolytischem Enzym, immobilisiertem Enzym und aus den mikrobiellen Zellen extrahierten Enzym.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 70ºC und bei einem pH von 3 bis 11 über einen Zeitraum von 1 bis 48 Stunden durchgeführt wird.

12. Cellulomonas flavigena SK-4, hinterlegt als FERM-BP 1575, und die Mutanten davon, die in dem Verfahren gemäß Anspruch 1 anwendbar sind.







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