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Dokumentenidentifikation DE69008701T2 15.09.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0439601
Titel EIN B-EPITOP DES HÜLLGLYKOPROTEINS EINES RETROVIRUS UND EIN T-EPITOP EINES ANDEREN PROTEINS DIESES RETROVIRUS ENTHALTENDE ZUSAMMENSETZUNG.
Anmelder Université Pierre et Marie Curie (Paris VI), Paris, FR;
Institut Pasteur, Paris, FR
Erfinder GIRARD, Marc, F-75015 Paris, FR;
GLUCKMAN, Jean-Claude, F-75005 Paris, FR;
BAHRAOUI, El, Mustapha, F-13003 Marseille, FR
Vertreter Tauchner, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Heunemann, D., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Rauh, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Hermann, G., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Schmidt, J., Dipl.-Ing.; Jaenichen, H., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., 81675 München; von Uexküll-Güldenband-Menzel, A., Dr.phil. (Ph.D.), 82166 Gräfelfing; Weinberger, R., Dipl.-Chem.Univ. Dr.rer.nat.; Bublak, W., Dipl.-Chem. Univ., Pat.-Anwälte; Tremmel, H., Rechtsanw., 81675 München
DE-Aktenzeichen 69008701
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument Fr
EP-Anmeldetag 17.08.1990
EP-Aktenzeichen 909132201
WO-Anmeldetag 17.08.1990
PCT-Aktenzeichen FR9000620
WO-Veröffentlichungsnummer 9102544
WO-Veröffentlichungsdatum 07.03.1991
EP-Offenlegungsdatum 07.08.1991
EP date of grant 04.05.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.09.1994
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse C12N 15/49   C12N 15/48   C12N 15/62   C12N 1/21   C12N 5/10   C12Q 1/70   G01N 33/569   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Hybridmoleküle, umfassend mindestens ein immunogenes Peptid, welches ein Epitop B enthält, das von einem Hüllglykoprotein eines der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-II stammt, und mindestens ein Epitop T, das von einem anderen Protein als einem Hüllglykoprotein eines der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-II stammt, wobei die beiden Proteine nicht vom gleichen Retrovirus stammen.

Die Erfindung betrifft ebenso Impfstoffzusammensetzungen, bei denen diese Moleküle verwendet werden.

Bis heute erwiesen sich die Mittel, die verwendet wurden, um Zusammensetzungen mit schützenden Impfeigenschaften gegen eine Infektion durch ein Retrovirus, das AIDS bei seinem natürlichen Wirt hervorrufen kann, zu ergeben, als nicht zufriedenstellend. Zahlreiche Probleme stehen der Entwicklung von Impfstoffzusammensetzungen entgegen. Unter den größten Problemen ist die Tatsache zu erwähnen, daß das Virus nach der Infektion für einen sehr langen Zeitraum in einem latenten Stadium bleiben kann, wahrscheinlich im Stadium eines in das Genom der Wirtszellen integrierten Provirus. Man kann ebenso Probleme nennen, die auf die beträchtliche genetische Variabilität dieses Virus, insbesondere auf der Ebene der Hüllglykoproteine der Oberfläche (env), gp160 und gp120, auf der Ebene ihrer Strukturproteine, insbesondere des Proteins gag sowie der Nicht-Strukturproteine, wie der Regulatorproteine, beispielsweise der Produkte der Gene tat, rev, nef, vpr, vpu und/oder vpx zurückzuführen sind.

Aus Gründen der sprachlichen Vereinfachung werden nachstehend die Proteine oder Glykoproteine immer durch die Abkürzung bezeichnet, die die Gene, die sie jeweils codieren, bezeichnet.

Es wird ebenso daran erinnert, daß die HIV-Retroviren hauptsächlich in zwei verschiedene Subtypen klassifiziert sind, HIV-1 und HIV-2, und daß es innerhalb jeder dieser Subtypen zahlreiche Varianten gibt, von denen manche Sequenzunterschiede von mehr als 25 % besitzen. Ein anderes Problem ergibt sich aus der Fähigkeit des HIV-Retrovirus, der Immunantwort zu entgehen, beispielsweise indem es sich von Zelle zu Zelle verbreitet und so den neutralisierenden Antikörpern entgeht, oder auch indem es für lange Zeitspannen im latenten Stadium bleibt. Außerdem könnten Antikörper gegen ein Protein oder ein Glykoprotein eines Retrovirus, das LAS oder AIDS hervorrufen kann, inbesondere der Retroviren HIV oder SIV, beispielsweise Anti-gp120-Antikörper und solche, die keine ausreichenden neutralisierenden Eigenschaften besitzen, die Vermehrung des Virus über die Bindung von Virus-IgG-Komplexen an die Fc-Rezeptoren der Makrophagen fördern.

Außerdem müßte eine wirksame Impfstoffzusammensetzung die rasche Neutralisation des HIV-Virus erlauben, wobei zu berücksichtigen ist, daß das HIV-Virus sich in den T4- Lymphocyten vermehrt und genau diese Zellen abtötet, wobei diese zuletztgenannten durch einen Kontakt mit spezifischen Antigenen aktiviert werden und somit ein wichtiges Element der Immunantwort darstellen.

Die Autoren der Publikation FEBS Letters, Band 218 (2), 1987, S. 231-237, erkannten das Interesse an einem Impfstoff, der die Epitope B und T umfaßt. Ein derartiger Impfstoff könnte im Zusammenhang mit einer HIV-Infektion angewendet werden.

Die Erfinder entwickelten ein neues Mittel, das zur Herstellung eines Impfstoffs verwendet werden kann und das zumindest teilweise die vorstehend aufgeworfenen Probleme lösen könnte.

Die Erfindung betrifft in dieser Hinsicht ein Hybridmolekül, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens ein immunogenes Peptid umfaßt, welches ein Epitop B enthält, das von einem Hüllglykoprotein eines der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-II stammt und mindestens ein Epitop T, das von einem anderen Protein als einem Hüllglykoprotein eines der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-II stammt, wobei die beiden Proteine nicht vom gleichen Retrovirus stammen.

Unter Vereinigung dieser Epitope B und T in dem gleichen Mittel versteht man eine Assoziation der beiden Epitope unter Bedingungen, die ihnen erlauben, in Wechselwirkung zu treten, oder bevorzugt eine Kombination dieser beiden Epitope, insbesondere durch Kopplung (kovalente Bindungen) oder auf jedem anderen nicht-kovalenten Weg, beispielsweise den Einbau der beiden Epitope in ein gemeinsames Molekül oder eine gemeinsame rekombinante Struktur, die gentechnisch oder durch physikalische Kopplung über hydrophobe Wechselwirkungen erhalten wurde. Zur Vereinfachung des Ausdrucks werden die Kombinationsprodukte nachstehend oft mit dem Ausdruck "Hybridmolekül" bezeichnet.

Es wird darauf hingewiesen, daß die "Epitope B" der Aminosäuresequenz (oder einer der Sequenzen) entsprechen, die in einem immunogenen Protein an der Produktion von Antikörpern, bevorzugt neutralisierenden Antikörpern, des entsprechenden Retrovirus bei dem Wirt, dem das immunogene Protein verabreicht wurde, beteiligt sind.

Die Epitope T sind auf der Ebene der Stimulierung des Immunsystems des Wirts beteiligt. Sie sind insbesondere dank ihrer Eignung, eine Proliferation von Lymphocyten bei dem Wirt bei Kontakt mit ihnen, wenn sie in Kultur gegeben werden, erkennbar (Test auf die zelluläre Proliferation).

Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung dieser Hybridmoleküle zur Herstellung von Impfstoffen, die gegen die Infektion durch ein Lentivirus schützen, insbesondere ein Retrovirus vom Typ HIV, pathogenes SIV oder HTLV-I oder HTLV-II, bevorzugt gegen die Infektion durch irgendeines der Retroviren, die sich voneinander unterscheiden, wobei die vorstehend unterstrichene Variabilität, sogar ihre jeweiligen Zugehörigkeiten zu mehreren möglichen Subtypen, berücksichtigt werden muß. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Hybridmoleküle oder der Impfstoffzusammensetzungen, die mehrere Hybridmoleküle dieses Typs enthalten, wobei diese sich auch untereinander durch die jeweils den Sequenzen verschiedener Peptide entsprechenden Epitope B, sogar T, unterscheiden, die selbst aus verschiedenen Retroviren stammen.

In jedem der erfindungsgemäßen Hybridmoleküle kann das immunogene Peptid, das ein oder mehrere Epitope B aus dem Glykoprotein env des Retrovirus IV, inbesondere HIV oder HTLV-I oder HTLV-II, enthält, mit einer Trägeraminosäuresequenz kombiniert werden, die ein oder mehrere Epitope T aus einem oder mehreren Struktur- oder Nicht- Strukturproteinen entweder des gleichen HIV, pathogenen SIV oder HTLV-I bzw. HTLV-II, oder eines HIV, pathogenen SIV, HTLV-I bzw. HTLV-II trägt, dessen Glycoprotein env immunologisch mit denjenigen des vorstehenden Kreuzreaktion zeigt.

Selbstverständlich gelten die nachstehenden Ausführungen hinsichtlich eines bestimmten "Hybridmoleküls" unmittelbar für andere "Hybridmoleküle", die als erstes in den Impfstoffzusammensetzungen des vorstehenden Typs vereinigt werden können.

Unter "Aminosäuresequenz", die das Epitop T trägt, versteht man entweder jeden Teil des Proteins, der es trägt und der es bis zur Vollständigkeit des ganzen Proteins, aus dem das Epitop T hervorgeht, tragen kann, wobei dieses Protein (oder Teil des Proteins) auch die Rolle des Trägerproteins spielen kann, oder ein viel kleineres Peptid, das insbesondere hinsichtlich der Sequenz des Epitops T verringert ist, wobei dieses Peptid auch selbst über eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung an ein anderes Trägermolekül gebunden sein kann. Dieses Trägermolekül (sofern es vorhanden ist) muß dank seines ausreichenden Molekulargewichts, das es folglich besitzen muß, zur Verstärkung der Leistungsfähigkeit des Immunsystems des Wirts beitragen, bei dem das Mittel schützende Antikörper, die gegen die Epitope B gerichtet sind, produzieren muß, ohne mit den erwünschten B- und T-Immunmechanismen eine immunologische Wechselwirkung zu zeigen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Hybridmoleküle gemäß der vorstehenden Definition dadurch gekennzeichnet, daß das das Epitop B tragende immunogene Peptid und die Trägeraminosäuresequenz, die das Epitop T trägt, chemisch miteinander verbunden sind.

Eine erste Kategorie von erfindungsgemäßen Hybridmolekülen ist dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid, das das Epitop B trägt, dem Hauptepitop der Neutralisation des Hüllglykoproteins von HIV-1 oder einem Teil dieses Epitops entspricht, der ausreicht, die Eigenschaften eines "Epitops B", wie vorstehend definiert, zu erhalten. Eine zweite Kategorie der Hybridmoleküle umfaßt ein Peptid, das das Epitop B enthält, das dem Hauptepitop der Neutralisation eines anderen Retrovirus HIV oder SIV, HTLV-I oder HTLV-II entspricht. Vorzugsweise enthalten die vorstehenden Hybridmoleküle mehrere Epitope B entsprechend dem Hauptepitop der Neutralisation.

Das Hauptepitop der Neutralisation, insbesondere von HIV-1, stammt von einer Peptidsequenz aus etwa 20 bis 30 Aminosäuren, der Sequenz, die in der Schleife lokalisiert ist, die dieses Hauptepitop in einer hypervariablen Region des Hüllglykoproteins des Retrovirus HIV-1 bildet. Dieses Hauptepitop der Neutralisation von HIV-1 wurde von Putney SD et al. 1986 (Science 234, 1392-1395) und von Rusche JR et al. 1988 (Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85 3198-3202) beschrieben. Dieses Hauptepitop der Neutralisation wird manchmal als "Putney-Peptid" bezeichnet. Es handelt sich insbesondere um die Sequenz, die sich von etwa der 301ten bis zur 336sten Position der Aminosäuresequenz des Hüllglycoproteins des Retrovirus HIV-1 BRU erstreckt, wie in der Arbeit Human Retroviruses and AIDS 1989, Myers, Rabson, Josephs, Smith, Berzofsky, WongStaal, Edition "Los Alamos National Laboratory" beschrieben ist.

Ebenfalls unter den Bereich der Erfindung fallen zur Bildung von Hybridmolekülen die Peptide, die ein Epitop B entsprechend dem Hauptepitop der Neutralisation des Hüllglycoproteins einer anderen Variante von HIV-1 oder auch eines anderen HIV-Retrovirus, beispielsweise HIV-2, oder auch eines Virus, das eine immunologische Verwandtschaft mit einem HIV-Retrovirus besitzt, beispielsweise das SIV-Virus oder ein anderes Lentivirus, wie HTLV-I oder HTLV-II, enthalten. Diese Peptide können dadurch erhalten werden, daß man die Aminosäuresequenz der Variante oder des Retrovirus verwendet, das entsprechend den vorstehend definierten Sequenzen ausgewählt wurde.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können die speziellen erfindungsgemäßen Hybridmoleküle zur Bildung des Trägerpeptids des Epitops B Peptidregionen des Hüllglykoproteins von HIV-1 BRU, umfassend inbesondere die Aminosäuren 267 und 128, tragen. Die Länge dieser Peptidregionen wird als Funktion der Fähigkeit der so bestimmten Peptidregion bestimmt, an der Bildung eines Hauptepitops der funktionellen Neutralisation teilzunehmen.

Die Erfindung betrifft auch die Peptidregionen, die einer anderen Variante von HIV-1 BRU oder den Peptidregionen eines anderen Retrovirus HIV oder eines anderen verwandten Lentivirus entsprechen, das an der Konstitution des Hauptepitops der Neutralisation beteiligt ist.

Die erfindungsgemäßen Hybridmoleküle besitzen die interessante Eigenschaft, daß sie eine gute Immunantwort induzieren können, an der die T-Zellen beteiligt sind, und daß sie eine gute primäre Immunantwort auslösen können. Außerdem könnte, wenn der geimpfte Patient schließlich in Kontakt mit dem Virus kommt, der Gedächtniseffekt durch Vermittlung der T-Gedächtniszellen mit der Fähigkeit zur Erkennung der T-Determinanten der Antigene des Virus ausgelöst werden.

Nachstehend wird auf die Nomenklatur der Bezeichnung durch den Einbuchstaben-Code der Aminosäuren Bezug genommen. Es wird darauf hingewiesen, daß ein Peptid, das das Epitop B enthält, insbesondere einen Teil des Hauptepitops der Neutralisation des Glykoproteins env von HIV oder SIV enthält, der ausreicht, eine schützende Immunantwort zu induzieren oder daran beteiligt zu sein.

Die nachstehend identifizierten Sequenzen sind unter Verwendung des Einbuchstaben-Codes angegeben, dessen Entsprechungen mit den Aminosäuren nachstehend angegeben sind:

Alanin A

Arginin R

Asparagin N

Asparaginsäure D

Cystein C

Glutamin Q

Glutaminsäure E

Glycin G

Histidin H

Isoleucin I

Leucin L

Lysin K

Methionin M

Phenylalanin F

Prolin P

Serin S

Threonin T

Tryptophan W

Tyrosin Y

Valin V

Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße Hybridmolekül dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid, das das Epitop B enthält, mindestens eine der folgenden Sequenzen oder einen Teil dieser Sequenzen, die das Epitop B enthalten, umfaßt:

In den vorstehenden und in den nachstehenden Peptidsequenzen entsprechen die Bindestriche (sofern vorhanden) direkten Bindungen. Ihr Vorhandensein dient der vertikalen Ausrichtung der Sequenzen, die eine mindestens teilweise Homologie zwischen den verschiedenen Retroviren vom Typ HIV oder SIV, von denen die Peptide stammen, bezeugen.

Ein anderes besonders vorteilhaftes Hybridmolekül ist dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerpeptid des Epitops B mindestens eine der nachstehenden Sequenzen oder einen Teil dieser Sequenzen, die das Epitop B umfassen, umfaßt:

Bevorzugte immunogene Mittel umfassen eine Vielzahl von erfindungsgemäßen Hybridmolekülen, die sich voneinander auf der Ebene ihrer Epitope B, sogar auf der Ebene der Gesamtheit ihrer jeweiligen Epitope, unterscheiden. Bevorzugt umfaßt ein derartiges Mittel die Gesamtheit der vorstehend beschriebenen Sequenzen oder eine Kombination aus mehreren dieser Sequenzen.

Zur Kopplung der vorstehend definierten Peptide mit den Trägermolekülen wird bevorzugt eine Aminosäure, wie Cystein oder Tyrosin verwendet, die am Anfang oder am Ende des Peptids, das man koppeln möchte, angeordnet ist.

Bevorzugte Mittel enthalten alle oder fast alle Hybride, die jeweils die Sequenzen des Epitops B tragen, die Gegenstand der vorstehenden Liste sind.

Andere bevorzugte Mittel enthalten Hybride, umfassend die vorstehenden Sequenzen des Epitops B in Kombination mit Peptidregionen entsprechend Teilen des Hauptepitops, umfassend die Aminosäuren 267 und 128 für HIV-1 BRU, oder Peptidregionen mit der gleichen Funktion in einem anderen Lentivirus, wie HIV-2, SIV, HTLV-I, HTLV-II.

Andere vorteilhafte Epitopzusammensetzungen enthalten ein Epitop T, das für ein bestimmtes Virus charakteristisch ist, in Kombination mit den Epitopen B dieses Virus und seiner Varianten.

Andere Hybridmoleküle entsprechend der vorstehend angegebenen allgemeinen Definition sind dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Nebenepitop für die Neutralisation umfassen, insbesondere ein Epitop, das von einer konservierten Region des Hüllglykoproteins von HIV oder SIV stammt.

Als Nebenepitop für die Neutralisation werden Peptidsequenzen bezeichnet, die dem Hüllglykoprotein eines HIV- oder SIV-Retrovirus oder eines anderen, vorstehend zitierten Virus angehören, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einer konservierten Region des Glykoproteins env angehören, daß sie ein Epitop B enthalten, und daß sie neutralisierende Antikörper bei Inokulation in ein Tier induzieren.

Ein Hybridmolekül, das ein derartiges Nebenepitop für die Neutralisation enthält, eignet sich in Assoziation oder Kombination mit mindestens einem Epitop T unter den vorstehend angegebenen Bedingungen nun dazu, in vivo Antikörper zu induzieren, die mehrere Varianten oder Stämme von verschiedenen Viren, sogar mehrere verschiedene Retroviren, neutralisieren können.

Besonders bevorzugt sind die Hybridmoleküle, die diese Nebenepitope für die Neutralisation enthalten, mit einem oder mehreren Hybridmolekülen assoziiert, die ein oder bevorzugt mehrere Hauptepitope für die Neutralisation, wie vorstehend beschrieben, sogar die Gesamtheit dieser zuletzt genannten Hybridmoleküle enthalten.

Unter einer konservierten Region versteht man eine Domäne des Hüllglykoproteins, die aus Aminosäuren mit einem Konservierungsgrad von mindestens etwa 85 % zwischen den verschiedenen HIV-Stämmen zusammengesetzt ist.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hybridmoleküle umfaßt das Nebenepitop beispielsweise eine der folgenden Sequenzen, die jeweils von Chanh et al. in The EMBO Journal, Band 5, Nr. 11, S. 3065- 3071, 1986, für die beiden ersteren und von HO et al. in Science, Band 239, 26. Feb. 1988, S. 1021-1023 für die beiden letzteren beschrieben sind:

Die Aminosäuresequenz, die das Epitop T trägt und an der Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Hybridmoleküle beteiligt ist, stammt von dem Protein, das von dem Gen nef codiert wird ("Protein nef") oder einem Protein gag, d.h. einem Protein, ausgewählt aus denjenigen, die durch die Gene tat, rev, vif, pol, vpr, vpu, vpx codiert werden. Sie umfaßt vorteilhafterweise 6 bis 15 Aminosäuren. Die Nomenklatur der von HIV und SIV codierten Gene ist in "Nature", Band 333, 9. Juni 1988, Gallo et al. beschrieben.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Hybridmoleküle stammt die Trägeraminosäuresequenz von dem Protein, das von dem Gen nef codiert wird, oder einem davon abgeleiteten Antigen.

Das Protein, das von dem Gen nef codiert wird, ist ein Regulatorprotein, das eine Immunogenität für die T-Helfer- Lymphocyten und die cytotoxischen Lymphocyten (CTL) besitzt. Dieses Nicht-Strukturprotein fehlt in infektiösen HIV- Virionen und kann in dem Cytoplasma der HIV-infizierten Zellen nachgewiesen werden. Der Nachweis der Expression des nef-Proteins an der Zelloberfläche entweder durch Immunfluoreszenz oder durch andere serologische Verfahren erweist sich als schwierig. Das nef-Protein reift wahrscheinlich im Cytoplasma der Erzeugerzelle und wird an die Oberfläche der Zelle in Form von Oligopeptidfragmenten, die von den cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt werden, exportiert. Die für das menschlische HIV-Retrovirus spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten umfassen mehrere Subpopulationen, von denen eine für das nef-Protein spezifisch ist. Das nef-Protein ist in dem Artikel von Guy et al., Nature, 1987, 330:366 und in der Patentanmeldung EP-0 253 693 (87 401 388.6 vom 15.6.87) beschrieben.

Unter abgeleitetem Antigen versteht man jedes Molekül, das aus einer Modifikation des Ursprungsproteins oder aus einer Spaltung dieses Proteins stammt, die das T-Epitop nicht verändert, das es enthält.

Vorteilhafterweise kann die Aminosäuresequenz, die das Epitop T trägt, aus den nachstehenden Gruppen von Peptiden, die von dem nef-Protein (Protein F) von LAV-BRU (HIV-1 BRU) stammen oder auch die vollständige oder partielle Aminosäuresequenz dieser Peptide umfassen, ausgewählt werden, beispielsweise:

PF 16-Peptid des Proteins F, bestehend aus 16 Aminosäuren (Reste 171-205):

PF 17 (Reste 141-205):

PF 63 (Reste 185-205):

Eine andere Gruppe von Trägerpeptiden eines Epitops T umfaßt die folgenden nef-Peptide, die für LAV-BRU charakteristisch sind:

PF 15 (Reste 118-167):

PF 18 (Reste 93-122):

Die Erfindung betrifft ebenso Sequenzen, die anderen Isolaten von HIV-1 und anderen HIV- oder SIV-Retroviren entsprechen.

Andere Aminosäuresequenzen, die das Epitop T enthalten, können Trägersequenzen bilden, um die Hybridmoleküle zu ergeben. Beispielsweise kann man vorteilhafterweise ein gag- Protein, insbesondere ein Protein P55, P25, P18 oder P12 von HIV-1 oder auch ein Protein, das durch das Gen gag von HIV-2 oder SIV codiert wird, oder ein Fragment dieser Proteine, die durch das Gen gag codiert werden, verwenden, sofern sie ein Epitop T tragen, oder man kann ein zusammengesetztes Präparat aus mehreren dieser Proteine und/oder Fragmente verwenden.

Andere Proteine als die Proteine, die für das HIV- Retrovirus oder verwandte Retroviren, wie SIV, HTLV-I, HTLV-II, spezifisch sind, können auch an der Produktion der erfindungsgemäßen Hybridmoleküle als Trägermoleküle der vorstehend genannten Epitope B und T beteiligt sein. In dieser Hinsicht verwendet man vorteilhafterweise bestimmte Antigene, die Teile des Hepatitis B-Virus bilden, beispielsweise die HBs- oder HBc-Antigene, das Tetanusanatoxin oder auch das Hämocyanin (KLH) oder das Humanalbumin (HSA) etc. ... Die vorstehend genannten Trägermoleküle stellen nur bevorzugte Beispiele aus einer anderen möglichen Wahl dar. Ein Kriterium zur Bestimmung der Möglichkeit zur Verwendung eines anderen Moleküls ist beispielsweise seine Verträglichkeit mit dem HLA-Haplotyp des Empfängers der Impfstoffzusammensetzung, welche die genannten Hybridmoleküle umfaßt. Aminosäuresequenzen mit der Konstitution der Hybridmoleküle können somit ebenso aus einer chemischen Kopplung eines Peptids, umfassend ein Epitop T aus einem Protein, das von einem der Gene tat, rev, vif, pol, vpr, vpx, vpu, gag oder nef codiert wird, oder eines abgeleiteten Antigens, insbesondere des HBs-Antigens, des HBc-Antigens, des Tetanusanatoxins, des Hämocyanins und des Humanalbumins, an das Trägermolekül stammen.

Die Entwicklung der erfindungsgemäßen Hybridmoleküle mit Hilfe einer Sequenz, enthaltend mindestens ein Epitop B und einer Trägersequenz, enthaltend mindestens ein Epitop T, kann durch Kopplung dieser Sequenzen durchgeführt werden. Die Hybridmoleküle können auch aus einer Assoziation verschiedener, vorstehend beschriebener Sequenzen in der gleichen Zusammensetzung bestehen.

Sie können auch das Ergebnis der Expression einer rekombinanten DNA sein, welche gleichzeitig eine ein immunogenes Peptid codierende Nucleotidsequenz umfaßt, das ein Epitop B enthält und von dem Glykoprotein env aus einem HIV, einem pathogenen SIV, einem HTLV-I oder einem HTLV-II stammt, und eine eine Aminosäuresequenz codierende Sequenz, die mindestens ein Epitop T, wie vorstehend definiert, umfaßt, gegebenenfalls unter der Kontrolle eines promotors, der die Expression in einem bestimmten Wirt, ausgewählt beispielsweise unter Bakterien, Hefen, Viren oder eukaryotischen Zellen, erlaubt.

Die zur Bildung der erfindungsgemäßen Hybridmoleküle verwendeten Peptide können nach klassischen Techniken auf dem Gebiet der Peptidsynthese hergestellt werden. Diese Synthese kann in homogener Lösung oder an einer festen Phase durchgeführt werden.

Beispielsweise kann man auf die Synthesetechnik in homogener Lösung zurückgreifen, wie sie von Houben-Weyl in der Arbeit mit dem Titel "Methode der Organischen Chemie", herausgegeben von E. Wünsch, Band 15-I und II, Thieme, Stuttgart, 1974, beschrieben ist.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Hybridmoleküle, in denen die Sequenzen, die die Epitope B enthalten, und die Sequenzen, die die Epitope T enthalten, chemisch gekoppelt sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man insbesondere die Aminosäuresequenzen, die das Epitop T tragen, mit einem oder mehreren Peptiden, die das Epitop B tragen, in Gegenwart eines Kopplungsmittels, ausgewählt gemäß den an dieser Kopplung beteiligten reaktiven Funktionen, umsetzt, wobei die anderen reaktiven Funktionen, die gegebenenfalls vorhanden sind, geschützt werden müssen, anschließend nach Abspalten der Schutzgruppen der gegebenenfalls geschützten Funktionen die erhaltenen Kopplungsprodukte, die dann die Epitope B und T tragen, gewinnt.

Die Kopplungssysteme, die die Durchführung der Bindung zwischen den verschiedenen Aminosäuresequenzen erlauben, werden als Funktion der Natur der endständigen Reste der Aminosäuresequenzen ausgewählt. Wenn die endständigen Reste Cysteine sind, kann die Kopplung beispielsweise mit Lysinresten unter Verwendung von SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat oder Sulfo-MBS (beschrieben von Lerner et al. in Nature, Oktober 1980, S. 801 bis 805, Band 287) oder mit anderen bifunktionellen Reagentien durchgeführt werden.

Wenn an der Kopplung Tyrosinreste beteiligt sind, können andere Kopplungsreagentien verwendet werden. Wenn die zu koppelnden Reste Lysinreste sind, kann man Glutaraldehyd verwenden.

Um die erfindungsgemäßen Hybridmoleküle herzustellen, besteht dieses Verfahren daraus, daß man ein erstes Peptid, das eine erste reaktive Funktion umfaßt, mit einem zweiten Peptid (oder mehreren Peptiden), die mit einer zweiten reaktiven Funktion (oder mehreren reaktiven Funktionen), die derjenigen des ersten Peptids komplementär sind, umsetzt, wobei die reaktiven Funktionen, die voneinander verschieden sind und gegebenenfalls auf bestimmten dieser Peptide vorhanden sind, und die Reaktion (oder die Reaktionen) nicht stören, gegebenenfalls geschützt werden müssen. Natürlich bedeutet bei den vorstehenden Ausführungen der Ausdruck "Komplementarität" die Fähigkeit der reaktiven Funktionen von zwei verschiedenen Peptiden zu einer kovalenten Kopplungsreaktion, die entweder direkt oder indirekt ist, zu führen, gegebenenfalls in Gegenwart eines ebenfalls bifunktionellen Mittels oder einfach eines chemischen Mittels, das die kovalente Kopplungsreaktion begünstigt.

Bevorzugt umfaßt das erste Peptid mindestens eine Amin-, freie Carboxyl-, Ester- oder Alkoholfunktion, die bei der Kopplungsreaktion mit einer entsprechenden Funktion, die von einem zweiten Peptid getragen wird, eingesetzt werden kann.

Gemäß einer ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kondensation zwischen einem ersten Peptid, das mindestens eine freie Aminfunktion trägt, und einem zweiten Peptid, das ebenso mindestens eine freie Aminfunktion trägt, durchgeführt, und die Kondensation dieser zwei Peptide wird in Gegenwart eines bifunktionellen Reagenses, wie beispielsweise Glutaraldehyd oder Benzochinon, durchgeführt.

Gemäß einer anderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das erste Peptid, das eine reaktive Amin-, Carboxyl-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylfunktion trägt, nach einer der gegenwärtig auf dem Gebiet der Peptidsynthese verwendeten Techniken mit dem zweiten Peptid, das seinerseits auch eine komplementäre, reaktive Amin-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Alkohol- oder Sulfhydrylfunktion trägt, umgesetzt.

Wenn die Kopplung zwischen einer Carboxylfunktion, die von einem der Partner getragen wird, mit einer Aminfunktion, die von dem anderen Reaktionspartner getragen wird, durchgeführt wird, wird die Reaktion bevorzugt in wäßriger Phase in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids oder eines lipidlöslichen Carbodiimids in einem inerten, organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid (DMF) oder Tetrahydrofuran (THF), Ethylacetat, Methylenchlorid etc. ... durchgeführt.

Vorteilhafte wasserlösliche Carbodiimide bestehen aus N-Cyclohexyl-N'-(β-(N-methylmorpholino)ethyl)carbodiimid-p- toluolsulfonat, (3-Methyl)aminopropylcarbodiimidchlorhydrat.

Geeignete Carbodiimide für die Reaktionen in einem organischen Lösungsmittel sind beispielsweise N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid.

Gemäß einer anderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Carboxylfunktion, die von einem der Partner getragen wird, mit einem Chloralkylcarbonat (C&sub2; bis C&sub4;) umgesetzt, anschließend das von diesem ersten Partner erhaltene gemischte Anhydrid mit dem zweiten Partner, der die Aminfunktion trägt, die an der Kopplung beteiligt sein muß, in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie vorstehend definiert, oder einer wäßrigen Phase umgesetzt.

Die erste Stufe der Reaktion wird beispielsweise in Dimethylformamid in Gegenwart eines tertiären Amins, beispielsweise N-Methylmorpholin, unter Verwendung beispielsweise von Chlorisobutylcarbonat durchgeführt. Nach 3 min bei -16ºC wird dem Reaktionsgemisch der Partner, der eine deprotonierte Aminfunktion trägt, beispielsweise in N-Methyl-morpholin, zugesetzt.

Gemäß einer dritten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein aktivierter Ester, der zuvor von dem der Partner gebildet wurde, die die Carboxylgruppe, die an der Kopplungsreaktion beteiligt sein muß, trägt, mit dem anderen eine Aminfunktion tragenden Partner umgesetzt. Vorteilhafte aktivierte Ester sind p-Nitrophenylester oder N- Hydroxysuccinimidester.

Diese Reaktionen werden gegebenenfalls in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, durchgeführt.

Gemäß einer noch anderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird einer der Partner, der eine Sulfhydrylfunktion trägt, mit dem anderen Partner, der dann eine Maleimidgruppe trägt, umgesetzt.

Man kann mit dem Partner, der die Sulfhydrylgruppe trägt, auch den anderen Partner, der eine 6-Maleimidocapronsäuregruppe oder eine 3-(2-Pyridyldithio)propionatgruppe trägt, umsetzen.

Die reaktiven Funktionen, die die Reaktion nicht stören dürfen, können durch klassische Blockierungsgruppen geschützt werden.

Die Carboxylgruppen können insbesondere durch Benzyl-, Benzyliden- oder Anizilidengruppen geschützt werden.

Diese Estergruppen können anschließend, inbesondere durch Hydrogenolyse, abgespalten werden. Dies erlaubt außerdem ebenso die gleichzeitige Abspaltung anderer Schutzgruppen, wie der N-Carbobenzoxygruppe.

Die Aminfunktionen werden vorteilhafterweise durch Benzyloxycarbonylgruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen oder Toluolsulfonylgruppen geschützt. Diese Gruppen können anschließend durch katalytische Hydrierung, die beispielsweise in Gegenwart von Palladium durchgeführt wird, oder durch Acidolyse oder auch durch Wirkung von Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden.

Die Sulfhydrylfunktionen, die an der Kopplungsreaktion beteiligt sind, können durch Acetamidomethyl- oder Formamidomethylgruppen geschützt werden.

Natürlich kann man auf jeden anderen Bindungstyp zurückgreifen, an dem Kombinationen beteiligt sind, die eine Sulfhydrylfunktion, die von einem der Partner getragen wird, und eine Maleimidgruppe, die von dem anderen Partner getragen wird, verbinden, beispielsweise indem man die von T. Kitagawa und T. Aikagawa in "J. Biochem." 79 (1976), 233, beschriebene Technik verwendet.

Die Verbindung kann auch unter Verwendung klassischer Diazotisierungsverfahren oder Reaktionen, an denen ein Isothiocyanat beteiligt ist, durchgeführt werden, insbesondere, wenn das eine der Peptide eine aromatische Aminfunktion trägt, und das andere Peptid eine Aminfunktion trägt, die an dieser Reaktion teilnehmen kann. Derartige Ausführungstechniken sind beispielsweise in B.F. Erlanger in "Pharmacol. Rev.", 25 5, 1973, S. 271, beschrieben.

Die Kopplung kann auch durch die Reduktion einer Schiff'schen Base, die zwischen einer Aldehydfunktion, die von einem der Peptide getragen wird, und einer Aminfunktion, die von dem anderen Peptid getragen wird, gebildet wurde, durchgeführt werden (beispielsweise gemäß der Technik von G.R. Gray, "Arch. Biochem. Biophys.", 163 (1974), S. 425).

Alle diese Reaktionen sind an sich gut bekannt, und einem Fachmann ist klar, daß zahlreiche Varianten durchgeführt werden können, um zu den gleichen Ergebnissen zu gelangen. Es ist auch zu bemerken, daß die Verbindungen zwischen den Peptiden mit einer Brücke durchgeführt werden können, wobei das Brückenbildungsmittel beispielsweise aus einem bifunktionellen Reagens besteht. In diesem Fall ist die brückenbildende Gruppe zwischen den beiden Peptiden in dem abschließend erhaltenen Konjugat bevorzugt nicht länger als eine Verkettung, welche derjenigen einer p-Decylkohlenwasserstoffkette entspricht.

Derartige Brückenbildungsmittel sind beispielsweise in der Patentanmeldung FR-A-2 428 050 beschrieben.

Bei allen vorstehenden Reaktionen können die relativen Verhältnisse der eingesetzten Peptide nach den gewünschten Endverhältnissen jedes Peptids in dem abschließend erhaltenen Hybridmolekül variieren. Insbesondere werden die relativen Verhältnisse als Funktion der Anzahl der funktionellen Gruppen, die von jedem von ihnen getragen werden und die an der Konjugationsreaktion mit den komplementären funktionellen Gruppen beteiligt sein können, angepaßt.

Die erfindungsgemäßen Hybridmoleküle können auch gentechnisch durch Expression einer rekombinanten DNA, die gleichzeitig mindestens eine Nucleinsäuresequenz enthält, die ein immunogenes Peptid des Glykoproteins env codiert, welches das Epitop B trägt, und eine Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, die das Epitop T trägt, wobei all diese Bestandteile unter der Kontrolle von Regulatorelementen stehen, die die Expression in einem kompetenten Wirt, ausgewählt beispielsweise aus Hefe, einem Bakterienstamm oder einer eukaryotischen Zellinie, erlauben, in einem geeigneten zellulären Wirt und durch Isolieren und anschließende Reinigung der erhaltenen Expressionsprodukte produziert werden.

Die Erfindung betrifft auch eine Impfstoffzusammensetzung, die eine Vielzahl von erfindungsgemäßen Hybridmolekülen umfaßt. Bevorzugte Zusammensetzungen enthalten eine Assoziation von Hybridmolekülen, die der Gesamtheit der Hybridmoleküle entspricht, welche die Aminosäuresequenzen, welche insbesondere für die Epitope B angegeben wurden, enthalten.

Die Erfindung betrifft auch immunogene Zusammensetzungen mit der Fähigkeit, in vivo die Produktion von schützenden Antikörpern und/oder neutralisierenden Antikörpern gegen ein pathogenes Retrovirus IV, insbesondere ein pathogenes HIV oder auch ein HTLV-I oder ein HTLV-II hervorzurufen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als Wirkstoff die erfindungsgemäßen Hybridmoleküle zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.

Die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen werden vorteilhafterweise in Form von Gemischen, die den Wirkstoff mit einem Immunadjuvans enthalten, verabreicht.

Sie können beispielsweise durch Injektion parenteral verabreicht werden.

Vorteilhafterweise enthalten die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen weiterhin einen Träger, der die Verabreichung des Impfstoffs erleichtert. Derartige Träger sind beispielsweise: Polyvinylpyrrolidin oder jedes bekannte Adjuvans, d.h. jede Substanz, die eine leichtere Absorption des Medikaments erlaubt oder dessen Wirkung im Organismus unterstützt.

Als Beispiele für andere Adjuvantien dieses zuletzt genannten Typs sind weiterhin Carboxymethylcellulose, Aluminiumhydroxide und -phosphate oder jedes andere Adjuvans des Typs, wie er einem Fachmann gut bekannt ist, zu nennen. Schließlich enthalten die immunogenen Zusammensetzungen gegebenenfalls ein immunologisches Adjuvans, insbesondere vom Typ eines Muramylpeptids oder auch das Adjuvans Syntex , wie von Allison et al. insbesondere in "Proceeding book - colloque des Cent Gardes - Octobre 1986 - Paris - France" beschrieben.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Hybridmoleküle als Antigene in den Zusammensetzungen zur Diagnose des Vorhandenseins von Antikörpern als Ergebnis einer Infektion durch ein Retrovirus IV, HTLV-I oder HTLV-II. Derartige Zusammensetzungen können an einer Probe verwendet werden, die beispielsweise aus einem Patientenserum besteht, und man kann beispielsweise zum Nachweis auf die ELISA-Techniken zurückgreifen.

Die Erfindung betrifft auch die DNA- und RNA-Nucleotidsequenzen, die die vorstehend beschriebenen Peptidsequenzen und insbesondere die Peptidsequenzen der bevorzugten Epitope B codieren.

Diese Nucleotidsequenzen können in Form von Sonden verwendet werden oder können auch Bestandteil der Sondenzusammensetzung zur Diagnose einer Infektion durch ein Retrovirus HIV sein.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform zur in vitro Diagnose einer Infektion durch ein Retrovirus werden die Techniken der genetischen Amplifikation verwendet, wobei die Sonden als Starter eingesetzt werden. In dieser Hinsicht wird auf die in den Patentanmeldungen EP-A-0 200 362, EP-A- 0 229 701 und EP-A-0 283 327 beschriebenen Techniken Bezug genommen.

Die Erfindung betrifft insbesondere eine rekombinante DNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine erste Nucleotidsequenz umfaßt, die ein immunogenes Peptid codiert, das von dem Glykoprotein env stammt und ein Epitop B enthält, und eine zweite Nucleotidsequenz, die ein Epitop T codiert, das von einem anderen HIV-Protein als das Glykoprotein env stammt, gegebenenfalls unter der Kontrolle eines Promotors, der die Expression in einem vorbestimmten Wirt, ausgewählt beispielsweise unter Hefen, Viren, Bakterien oder eukaryotischen Zellen, der zuerst genannten ersten und zweiten Sequenzen in Form eines Hybridmoleküls gestattet.

Sie betrifft ebenfalls einen durch die rekombinante DNA transformierten Wirt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um eine Hefe, ein Virus, beispielsweise ein Baculovirus, ein Pockenvirus, ein Adenovirus oder ein Herpesvirus, eine eukaryotische Zelle oder ein Bakterium, beispielsweise E. coli, handelt.

Andere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung gehen aus den nachstehenden Beispielen hervor.

Beispiel 1: Reinigung des rekombinanten Proteins p18 von HIV-1, produziert von einem Escherichia coli-Stamm.

Ein prokaryotisches Expressionsplasmid von p18 von HIV-1 (pTG2153) wird wie folgt konstruiert:

- Der Bakteriophage M13TG1154 [Rautmann G. et al. AIDS Res. & Human Retroviruses 5, S. 117-157] trägt das vollständige Gen gag, worin das TAC-Codon, das die letzte Aminosäure von p18 codiert, durch ein Stoppcodon, TAG, ersetzt wurde. Eine BglII-Restriktionsspaltstelle wurde unmittelbar stromaufwärts des Gens, das p18 codiert, durch gerichtete Mutagenese mit Hilfe des folgenden Oligonucleotids eingeführt:

Es wurde der Bakteriophage M13TG1161 erhalten.

- Ein BglII-PstI-Fragment, das das Gen enthält, das p18 codiert, wird in den prokaryotischen Expressionsvektor pTG959 eingeführt, dessen Konstruktion in der Patentveröffentlichung EP-0 292 404 beschrieben ist und der den PL-Promotor des Bakteriophagen λ, N, eine synthetische Sequenz (Ribosomenbindungsstelle), cII, lacz und ampR trägt. Diese Insertion wird nach Spaltung von pTG959 durch BglII und PstI, welche die Sequenz cII eliminiert, durchgeführt. So wird das Plasmid pTG2153 erhalten.

Der E. coli-Stamm 901 wird anschließend durch dieses prokaryotische Expressionsplasmid von p18 transformiert. Das Gen von p18 befindet sich nun unter der Kontrolle des Promotors PL, der durch seinen thermosensiblen Repressor reguliert wird. Nach etwa 2,5-stündigem Wachstum bei 30ºC (bis zu einer O.D. von 0,3 bei 550 nm) induziert die Temperaturerhöhung des Kulturmediums auf 42ºC die Expression des Proteins p18. Nach 7 h (O.D. etwa 2,4) bei dieser Temperatur werden die Zellen durch Zentrifugation (10 min bei 5000 UpM) gewonnen. Der Bodensatz wird in PBS-Puffer aufgenommen.

Das rekombinante Protein p18 wird von den Zellen nach Einfrieren auf -80ºC und anschließendes Auftauen auf 0 bis 2ºC oder durch Ultraschall freigesetzt. Danach wird zentrifugiert (20 min bei 10.000 UpM), und der Überstand wird gewonnen. Diese zwei Arbeitsschritte werden vor der Reinigung des Proteins einmal wiederholt.

Das rekombinante Protein p18 wird durch Kationenaustauschchromatographie auf S-Sepharose und nach einer Verdünnung (um eine Leitfähigkeit, die der von PBS identisch ist, zu erhalten) anschließender HPLC-Chromatographie mit einem starken Kationenaustauscher mit einer Ausbeute von etwa 20 % gereinigt.

Das so erhaltene rekombinante Protein p18 wird anschließend durch SDS-PAGE-Elektrophorese, Umkehrphasen- HPLC und durch Bestimmung seiner Aminosäuresequenz unter Aufstellen von Peptidkarten vor und nach tryptischer Spaltung oder Spaltung mit der Protease V8 von Staphylococcus aureus charakterisiert. Diese Nachweise bestätigen, daß die Sequenz des rekombinanten Proteins p18 derjenigen, die durch die Nucleotidsequenzanalyse der verwendeten komplementären DNA vorhergesagt wurde, entspricht. Sie wird durch für p18 von HIV-1 spezifische monoclonale Antikörper erkannt [Chassagne J. et al., J. Immunol. (1986) 186, S. 14442].

Das rekombinante Protein p18 besitzt einen Reinheitsgrad von 90 %, kann in einem Phosphat/NaCl-Puffer bei -80ºC konserviert werden und bleibt stabil.

Beispiel 2: Reinigung des rekombinanten Proteins p25 von HIV-1, produziert von einem Escherichia coli-Stamm.

Das prokaryotische Expressionsplasmid von p25 von HIV-1 (pTG2103) wird wie folgt konstruiert:

- Der in der Patentanmeldung EP-0 276 591 beschriebene Bakteriophage M13TG1124 besitzt ein Leseraster, das ein Protein p25, das an seinem N-terminalen Ende um zwei zusätzliche Aminosäuren verlängert ist, codiert: ein Methionin gefolgt von einem Glycin. Der Rest der Sequenz ist absolut identisch mit derjenigen von p25 von HIV-1. Es wird eine BglII-Spaltstelle und ein Alanincodon am N-terminalen Ende des Leserasters von p25 (unter Austausch von Glycin) durch gerichtete Mutagenese mit Hilfe des folgenden Oligonucleotids eingeführt.

Es wird der Phage M13TG1126 erhalten.

- Ein BglII-EcoRI-Fragment von M13TG1126 wird in das Plasmid pTG959, das durch BglII und EcoRI gespalten wurde, eingeführt, wodurch das prokaryotische Expressionsplasmid von p25, pTG2103, erhalten wird.

Der E. coli-Stamm 901 wird anschließend durch dieses Expressionsplasmid von P25 transformiert. Das Gen von P25 befindet sich nun unter der Kontrolle des Promotors PL, der durch seinen theromosensiblen Repressor reguliert wird. Nach etwa 2,5-stündigem Wachstum bei 30ºC (bis zu einer O.D. von 0,3) induziert die Temperaturerhöhung des Kulturmediums auf 42ºC die Expression des Proteins P25. Nach 7 h (O.D. = 2,4) bei dieser Temperatur werden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen (10 min bei 5000 UpM).

Das rekombinante Protein P25 wird von der Cytosolfraktion nach Ultraschall oder durch eine "French-Presse" extrahiert. Der Überstand wird gegen einen Puffer mit einer schwachen Ionenstärke (20 mM Tris/HCl, pH 8) dialysiert/diafiltriert. Die Adsorption des größten Teils der Proteine von E. coli wird auf einem schwachen Anionenaustauscherträger erhalten. Das Protein P25 befindet sich in der nicht-adsorbierten Fraktion mit einer Reinheit von etwa 80 %. Diese Fraktion wird einer Chromatographie auf metallchelatierter Sepharose (beladen mit Zn²&spplus;), die mit Tris- Puffer mit schwacher Ionenstärke (20 mM) und pH 8 äquilibriert worden war, unterworfen. Das Protein P25 wird durch einen linearen Glycingradienten (0 bis 200 mM, pH 8) und eine anschließende Stufe über 500 mM Imidazol, pH 8, freigesetzt.

Anstelle der Chromatographie mit einem Metallchelat kann man eine Chromatographie auf TSK-Orange durchführen. Diese Stufe kann auch als ergänzende Reinigungsstufe durchgeführt werden. Das Protein wird anschließend in einem Tris-Puffer mit schwacher Ionenstärke, pH 8, in Lösung gebracht. Die Elution wird mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 bis 1 M) durchgeführt.

Die an P25 reichen Fraktionen werden dann vermischt, bei Umgebungstemperatur mit 40 mM β-Mercaptoethanol eingeengt und gegen 170 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphat, pH 7, diafiltriert. Das so gereinigte, rekombinante Protein P25 besitzt eine Reinheit von mehr als 90 %. Es kann bei -80ºC ohne Abbau gelagert werden.

Das rekombinante Protein P25 wird durch Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Umkehrpasen-HPLC, Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung, N- und C-terminale Sequenzanalyse nach proteolytischer Spaltung, isoelektrische Fokussierung und Massenspektrometrie charakterisiert.

Beispiel 3: Reinigung des rekombinanten nef-Proteins von HIV-1, produziert von einem Escherichia coli-Stamm.

Die Produktion des rekombinanten nef-Proteins von HIV-1 durch den Stamm TGE901 wurde in der Patentanmeldung EP- 0 292 404 beschrieben.

Das rekombinante nef-Protein wird aus der Cytosolfraktion nach Ultraschall oder durch eine "French-Presse" extrahiert. Nach Zentrifugation werden der Bodensatz und der Überstand gewonnen, die verschieden behandelt werden:

- Der Überstand wird in einer Lösung aus 35 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; präzipitiert, anschließend bei 10.000 UpM 20 min lang zentrifugiert. Der Bodensatz wird in einem HEPES-1- Puffer (20 mM HEPES, pH 8, 50 uM GDP, 5 mM Mg²&spplus;, 10 mM DTT, 100 uM EDTA, 100 uM EGTA, 100 uM NaN&sub3; und 100 uM PMSF) aufgenommen.

Der Bodensatz wird 12 bis 16 h lang bei Umgebungstemperatur in einer 8 M Harnstofflösung solubilisiert und dann 24 h lang bei 4ºC in der HEPES-1-Lösung dialysiert. Nach 20- minütiger Zentrifugation bei 10.000 UpM wird der Überstand gewonnen.

Die in diesen beiden Stufen erhaltenen Überstände werden anschließend gleich behandelt.

Zuerst wird eine Anionenaustauschchromatographie auf DEAE Spherodex , welches mit HEPES-1 äquilibriert worden war, durchgeführt. Das nef-Protein wird durch einen NaCl- Gradienten (0 bis 1 M) eluiert, und dann werden die an nef- Protein reichen Fraktionen einer Affinitätschromatographie über Cibacron-Blue-F3GA-Agarose, äquilibriert mit dem HEPES-1-Puffer ohne DTT, EDTA und EGTA, unterworfen. Das nef-Protein wird anschließend durch einen NaCl-Gradienten (0, bis 1,5 M) in HEPES-1-Puffer eluiert, und anschließend werden die an nef-Protein reichen Fraktionen einer Affinitätschromatographie über ein Metallchelat (Zn²&spplus;) unter Verwendung von HEPES-2-Puffer (pH 7, 20 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 1 mM Imidazol, 50 uM GDP und 100 uM Mg²&spplus;) unterworfen.

Das nef-Protein wird durch einen Imidazolgradienten (1 bis 20 mM) eluiert, und die reichen Fraktionen werden diafiltriert. Sie werden anschließend in 20 mM HEPES-Puffer (pH 8, 50 uM GDP, 100 uM Mg²&spplus; und 5 mM DTT) aufgenommen.

Das so isolierte rekombinante nef-Protein wird durch Western-Blot analysiert. Seine Reinheit, die durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt wurde, liegt über 95 % und gemäß SDS- PAGE bei 90 %. Die N-terminale Sequenz sowie die Bindungsaktivität mit GTP werden ebenfalls festgestellt und als entsprechend befunden.

Beispiel 4: Kovalente Kopplung der HIV-Peptide aus der Region des Glykoproteins, die eine Putney-Schleife bildet, mit P18gag oder mit P27nef.

2 mg P18 oder P27nef in 4 ml 0,1 M Phosphat-/0,1 M NaCl-Puffer, pH 7,5, werden durch Zugabe von 20 ul einer Lösung aus 10 mg/ml SPDP in Ethanol behandelt. Nach 30 min bei 25ºC wird das Gemisch über Sephadex G-25 geleitet. Die ausgeschlossenen Fraktionen werden aufgenommen und mit dem Cocktail der 21 HIV-Peptide vermischt, entsprechend den 21 bekannten Sequenzen des Putney-Epitops, von denen jede einerseits ein Cystein und andererseits diese Sequenz trägt und jeweils in einem Verhältnis von 100 ug vorhanden ist. Der Cocktail war zuvor durch Behandlung mit β-Mercaptoethanol und 0 bis 1 M Ammoniumbicarbonat reduziert und anschließend rasch lyophilisiert worden.

Das Gemisch der P18-Peptide oder P27-Peptide wird über Nacht bei 25ºC inkubiert und dann über Sephadex G-50 nach Zentrifugation des unlöslichen Präzipitats, das sich während der Nacht gebildet hat, geleitet. Die ausgeschlossenen Fraktionen werden aufgenommen, sowie das Präzipitat, und werden dann einem Kaninchen in einer Menge von 200 ug/Dosis subkutan in Gegenwart von Freundschem Adjuvans (vollständig, dann unvollständig) injiziert. Die injizierten Fraktionen wurden mit einem RIA getestet, um das Vorhandensein der Peptide, wie in dem nachstehenden Beispiel beschrieben, nachzuweisen.

Beispiel 5: Kovalente Kopplung der HIV-1-Peptide an Rinderserumalbumin (BSA).

1 mg BSA (500 ug/ml in 0,1 M Phosphat-0,1 NaCl bei pH 7,5) wurde mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP 10 %l von 10 mg/ml Lösung in Ethanol) 30 min lang bei 25ºC vermischt. Die BSA-Derivate wurden von überschüssigen SPDP durch Ausschlußchromatographie auf Sephadex G25 abgetrennt. Die Fraktionen, die dem Ausschlußvolumen entsprechen, wurden mit 1 mg der Peptide mit den Cysteinresten vermischt und mit 2-Mercaptoethanol (10 mg/ml) in 0,1 M Ammoniumbicarbonat reduziert. Anschließend wurde vor der Verwendung rasch lyophilisert. Das Gemisch aus SPDP behandeltem BSA und reduzierten Peptiden wurde über Nacht bei 25ºC aufbewahrt, anschließend über eine Sephadex G50- Säule chromatographiert. Die zurückgehaltenen Fraktionen, die dem Ausschlußvolumen der Säule entsprachen, wurden getestet, um das Vorhandensein der Peptide nachzuweisen. Dafür wurden Polystyrolkugeln mit den gewonnenen Fraktionen in 10facher Reihenverdünnung in 0,1 M Tris, pH 8,8, während einer Nacht bei 20ºC beschichtet. Die Kugeln wurden anschließend mit BSA (10 mg/ml) und Gelatine (2,5 mg/ml) beschichtet. Die auf den Kugeln fixierten Peptide wurden mit einem RIA nachgewiesen.

Beispiel 6: Epitop von p27-nef, erkannt von T-Helferlymphocyten ("Helper").

Die spezielle Spezifität der proliferativen Antwort der Lymphocyten auf das Protein nef p27 wurde untersucht. Eine Reihe von 14 einander überlappenden synthetischen Peptiden, die die Gesamtheit der Sequenz des Genprodukts nef von HIV-1 LAV-BRU abdeckt, wurde getestet, um ihre Fähigkeit zur Induktion von proliferativen Antworten der Lymphocyten in peripherem Blut, PBL (periphere Blutlymphocyten), bei zwei Schimpansen zu verschieden Zeitpunkten nach der Injektion des nef-Antigens nachzuweisen.

Diese Schimpansen erhielten gereinigtes P27 nef, vermischt mit dem Adjuvans Syntex , auf der Basis von MDP- Threonyl. Drei Injektionen wurden in einmonatigen Intervallen durchgeführt, gefolgt von einer Auffrischung nach 6 Monaten.

Die notwendige Peptidkonzentration zur Beobachtung einer optimalen Antwort wurde zuerst als etwa 50 ug/ml unter Verwendung von Peptiden, deren Fähigkeit zur Induktion einer positiven oder negativen Antwort bekannt war, bestimmt.

In unabhängigen Tests zeigten die Lymphocyten des Schimpansen 479, daß sie stark mit den Peptiden PF16 (Reste 171-205), PF17 (141-205) und PF63 (165-205) reagierten. Eine schwächere Proliferation (unter 20 bis 50 % RR, relative Antwort) wurde mit zwei der drei PBL-Proben gegenüber den Peptiden PF15 (118-167) und mit drei der vier Proben gegenüber den Peptiden PF18 (93-122) beobachtet. Keine signifikante Proliferation wurde reproduzierbar mit den anderen verwendeten Peptiden beobachtet (Tabelle 1).

Vergleichbare Ergebnisse wurden mit den PBL des Schimpansen 433 erhalten.

Es wurde so festgestellt, daß keines der stimulierenden Peptide unspezifisch mitogen auf die T-Zellen in der verwendeten Konzentration wirkte: die PBL des Kontrollschimpansen (411), der nur gegen das Virus des Impfstoffs immunisiert worden war und der wiederholte Adjuvansinjektionen erhalten hatte, proliferierten als Antwort auf diese Peptide nicht.

Diese Ergebnisse zeigen die Erkennung durch die T- Helferzellen der zwei Schimpansen von mindestens zwei Epitopen, die auf den T-Zellen des Proteins p27 nef vorhanden sind: ein Epitop scheint im Inneren der Sequenz aus 60 C-terminalen Aminosäuren des Moleküls und wahrscheinlicher in den 20 letzten Aminosäuren lokalisiert zu sein, wie die Antigenität von PF63 zeigt. Das andere Epitop könnte etwa in einer Region, die gleichzeitig PF18 und PF15 bedeckt (109-122), lokalisiert sein. Diese Peptide werden mit Vorteil mit den Epitopen B, wie vorstehend definiert, kombiniert.

Tabelle 1 Proliferative Antworten der PBL der Schimpansen Nr. 479 auf P27 nef (500 ug/ml) und auf die synthetischen Peptide (50 ug/ml) dieses Proteins
Relative Antwort auf P27 (%) von: Peptid Position AS Woche Reaktivität von PBL (3) Kontrolle P27 (1) % RR in dieser Spalte ist von den proliferativen Antworten bei einer Konzentration von 50 ug/ml Peptid abgeleitet (2) nicht bestimmt (3) Einbau von [³H]-Thymidin (cpmx10&supmin;³).


Anspruch[de]

1. Hybridmolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein immunogenes Peptid umfaßt, welches ein Epitop B enthält, das von einem Hüllglykoprotein eines der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-II stammt, und mindestens ein Epitop T, das von einem anderen Protein als einem Hüllglykoprotein eines der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-2 stammt, wobei die beiden Proteine nicht vom gleichen Retrovirus stammen.

2. Hybridmolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop T von einem Protein stammt, das ausgewählt ist aus den Proteinen, die von den Genen nef, gag, tat, rev, vif, pol, vpr, vpu, vpx von HIV, SIV, HTLV-I, oder HTLV-2 codiert werden.

3. Hybridmolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das immunogene Peptid und das Epitop T chemisch verknüpft sind.

4. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das das Epitop B enthaltende immunogene Peptid einem Hauptepitop für die Neutralisation eines Hüllglykoproteins entspricht.

5. Hybridmolekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das das Epitop B enthaltende immunogene Peptid einen Teil eines Hauptepitops für die Neutralisation eines Hüllglykoproteins umfaßt, wobei dieser Teil ausreicht, um in vivo die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die das entsprechende Retrovirus neutralisieren können.

6. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das das Epitop B enthaltende Peptid eine der folgenden Sequenzen oder einen das Epitop B umfassenden Teil dieser Sequenzen enthält:

7. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das das Epitop B enthaltende Peptid eine der folgenden Sequenzen oder einen das Epitop B umtassenden Teil dieser Sequenzen enthält:

8. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die Peptidbereiche des Hüllglykoproteins von HIV-1 umfaßt, die die Aminosäure 267 bzw. 128 enthalten, die an der Bildung des Hauptepitops für die Neutralisation beteiligt sind.

9. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Nebenepitop B für die Neutralisation umfaßt, insbesondere ein Epitop B, das von einem konservierten Bereich eines Hüllglykoproteins stammt.

10. Hybridmolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Nebenepitop eine der folgenden Sequenzen umfaßt:

11. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop T insgesamt oder zum Teil aus einem spezifischen HIV- oder SIV-Protein besteht, insbesondere ausgewählt aus den Proteinen, die von den Genen gag, tat, rev, vif, pol, vpr, vpu, vpx codiert werden.

12. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop T insgesamt oder zum Teil aus dem Protein besteht, das von dem Gen nef codiert wird, oder einem abgeleiteten Antigen.

13. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop T insgesamt oder zum Teil aus einem Protein gag besteht, ausgewählt insbesondere aus P55, P25, P18 oder P12 von HIV-1, und aus den Proteinen, die von den entsprechenden HIV-2- oder SIV-Genen codiert werden.

14. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem eine Sequenz oder ein Trägermolekül umfaßt, das die Erhöhung der immunogenen Wirkung des Gemisches ermöglicht und an das das immunogene Peptid und das Epitop T geknüpft sind oder in das das eine oder das andere oder beide eingebaut sind.

15. Hybridmolekül nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermolekül aus einem Teil oder der Gesamtheit der Aminosäuresequenz des Proteins besteht, zu dem das Epitop T natürlicherweise im nativen Retrovirus HIV oder SIV gehört, von dem es abstammt.

16. Hybridmolekül nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz die des Proteins nef vom HIV oder SIV ist.

17. Hybridmolekül nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz die eines Proteins gag von HIV oder SIV ist.

18. Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das das Epitop B oder das Epitop T tragende Peptid durch chemische Verknüpfung auf ein Trägermolekül aufgebracht wird, wie das Tetanusanatoxin, die Antigene HBs oder HBc, Hemocyanin oder menschliches Albumin.

19. Immunogenes Mittel, umfassend eine Vielzahl von Hybridmolekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 18.

20. Mittel nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sämtliche Hybridmoleküle gemäß der Definition in einem der Ansprüche 6 bis 9 enthält.

21. Mittel nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem mindestens ein Hybridmolekül gemäß der Definition in einem der Ansprüche 8 oder 9 enthält.

22. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine erste Nucleotidsequenz umfaßt, die ein immunogenes Peptid codiert, welches von einem Hüllglykoprotein der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-2 stammt und ein Epitop B enthält, und eine zweite Nucleotidsequenz, die ein Epitop T codiert, welches von einem Protein stammt, das nicht ein Hüllglykoprotein von den Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-II ist, gegebenenfalls unter der Kontrolle eines Promotors, der die Expression der ersten und zweiten Sequenzen unter Bildung eines Hybridmoleküls erlaubt, das einem der Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 20 entspricht, in einem Wirt, ausgewählt aus Hefen, Viren, Bakterien oder eukaryontischen Zellen.

23. Mit einer rekombinanten DNA nach Anspruch 22 transformierter Wirt, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hefe, ein Virus, beispielsweise ein Baculovirus, ein Pockenvirus, ein Adenovirus oder ein Herpesvirus, eine eukaryontische Zelle oder ein Bakterium handelt, z.B. E. coli.

24. Immunogenes Mittel, das zur Induktion der in vivo-Produktion von neutralisierenden und gegen eines der Retroviren HIV, pathogenes SIV, HTLV-I oder HTLV-II schützenden Antikörpern, insbesondere gegen ein für den Menschen pathogenes HIV-Retrovirus, fähig ist, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff ein Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Gemisch von Hybridmolekülen nach einem der Ansprüche 19 bis 21 umfaßt, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel.

25. DNA- oder RNA-Nucleotidsequenzen, die eine der Peptidsequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codieren, oder eine der Nucleotidsequenzen, die die Epitope B nach einem der Ansprüche 6, 7, 9 oder 10 codieren.

26. Mittel für die in vitro-Diagnose einer Infektion durch ein HIV-Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere Nucleotidsequenzen nach Anspruch 25 oder ein Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 18 umfaßt.







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