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Dokumentenidentifikation DE68913402T2 29.09.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0359063
Titel Antikörper mit hoher Affinität für Methamphetamine sowie geeignetes Immunogen für seine Herstellung.
Anmelder Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma, Osaka, JP
Erfinder Miyazaki, Jinsei, Higashiosaka-shi, JP;
Taketani, Makoto, Ashiya-shi, JP;
Mitsumata, Tadayasu, Hirakata-shi, JP
Vertreter Zimmermann, H., Dipl.-Ing.; Graf von Wengersky, A., Dipl.-Ing.; Kraus, J., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Busch, T., Dipl.-Ing., Pat.-Anwälte, 80331 München
DE-Aktenzeichen 68913402
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 01.09.1989
EP-Aktenzeichen 891161853
EP-Offenlegungsdatum 21.03.1990
EP date of grant 02.03.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.09.1994
IPC-Hauptklasse G01N 33/94
IPC-Nebenklasse C12P 21/08   C12N 5/00   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von hochwirksamen Antikörpern, welche die wichtigste Rolle beim Immunoassay auf den Gebieten der medizinischen Diagnose, chemischen Analyse etc. einnehmen, und insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern, die eine hohe Affinitat für Methamphetamin besitzen, das von sich aus nicht zum Hervorrufen von Immunoansprechen in der Lage ist, und das eine Zentral-anregende Wirkung ausübt und eines der Analeptika ist.

VERWANDTER STAND DER TECHNIK

Beim Nachweis einer Spurenkomponente in Blut oder einer spezifischen Komponente der Atmosphäre ist es erforderlich, mit Bestimmtheit eine in einer Spurenmenge vorliegende Komponente aus sehr zahlreichen Verunreinigungen nachzuweisen. In den letzten Jahren wurde der Immunoassay, basierend auf der Reaktion eines Antikörpers mit einem Antigen ausführlich zu diesem Zweck untersucht.

Ein Immunoassay wird grob unterteilt in den Radioimmunoassay unter Verwendung eines radioaktiven Isotops und den Enzymimmunoassay (EIA) unter Verwendung eines Enzyms. Unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit und Einfachheit ist der EIA Vorteilhafter.

Der Enzym-gebundene Immunosorbens-Assay (ELISA), welcher ein typischer EIA ist, wird im folgenden unter Bezug auf Fig. 1 beschrieben. In Fig. 1 bezeichnet die Bezugsziffer 1 eine aus Kunststoff wie Polystyrol hergestellte Mikroplatte, welche Protein nicht-spezifisch adsorbiert. Die Bezugsziffer 2 bezeichnet ein auf der Mikroplatte adsorbiertes Festphasen- Antigen, wobei dieses Antigen durch Einführen einer geeigneten funktionellen Gruppe in ein Antigen als Analyt und chemische Bindung des Antigens an Protein über die funktionelle Gruppe hergestellt ist. Die Bezugsziffer 3 bedeutet ein zur Bindung an den Analyten fähigen Antikörper, und der Antikörper bindet an das Festphasen-Antigen 2 in einem Gleichgewichtszustand. Dies heißt, der Antikörper 3 wird auf der Mikroplatte 1 mittels des Festphasen-Antigens 2 immobilisiert. Wenn ein Antigen 4 als Analyt in das System eingeführt wird, binden Festphasen-Antigen 2 und Antigen 4 als Analyt konkurrierend an den Antikörper 3. Daher bindet ein Teil des Antikörpers 3 an das Antigen 4 als Analyt und als Folge hiervon verbleibt ein Teil des Antikörpers 3 nichtgebunden auf der Mikroplatte 1. Je größer die Menge des Antigens 4 als Analyt ist, desto mehr nimmt selbstverständlich die Menge des an die Mikroplatte 1 nichtgebundenen Antikörpers 3 zu. In dieser Stufe kann der nichtgebundene Antikörper 3 durch Waschen entfernt werden. Nach Entfernung des nichtgebundenen Antikörpers 3 wird Antikörper 5, der zur Bindung an Antikörper 3 in der Lage ist, zu dem System zugefügt. Antikörper 5 bindet chemisch an Enzym 6 in einem definierten Verhältnis. Nachdem nicht an Antikörper 3 gebundener Antikörper 5 durch Waschen entfernt wurde, wird die Aktivität des Enzyms 6 bestimmt. Es existiert eine positive Beziehung zwischen der Aktivität und der Menge von Enzym 6, so daß die Menge des Enzyms 6 durch Untersuchung der Reaktivität quantitativ bestimmt werden kann. Wenn die Menge von Enzym 6 bekannt ist, ist es möglich die Menge des an die Mikroplatte 1 über das Festphasen-Antigen 2 gebundenen Antikörpers 3 zu bestimmen und dann Antigen 4 als Analyt quantitativ zu bestimmen. In diesem Fall ist eine Affinität des Antikörpers 3 zu Antigen 4 als Analyt ein primärer Faktor zur Festlegung der Nachweisempfindlichkeit.

Ein Antikörper ist ein durch einen Organismus gebildetes Protein und hat die Eigenschaft der selektiven Bindung nur an eine spezifische Substanz, d. h. Antigen. Antigene werden grob in zwei Typen wegen der Unterschiede in der Bildung eines an das Antigen bindenden Antikörpers unterteilt. Einer ist ein Antigen, welches die Bildung eines Antikörpers durch direkte Injektion in ein Tier induzieren kann. Im allgmeinen entsprechen makromolekulare Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehreren Zehntausend oder höher solch einem Antigen. Der andere Typ hat ein relativ geringes Molekulargewicht und kann durch chemische Bindung an ein geeignetes Protein als ein Immunogen wirken, das die Bildung eines Antikörpers induziert. Im Besonderen wird das letztgenannte Antigen Hapten genannt. Eine Methode zur Bildung eines Antikörpers zu einem Hapten als Antigen ist in "Haptens and Carriers", O. Makela und I.J.T. Seppala, Handbook of Experimental Immunology, 4. Auflage, Band 1, Kapitel 3, herausgegeben von D.M. Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford 1986, beschrieben. Das heißt, es wird beschrieben, daß - falls Hapten eine zur chemischen Bindung fähige, funktionelle Gruppe enthält - Hapten an Protein über die funktionelle Gruppe unter Bildung eines Immunogens gebunden wird. Falls irgendeine funktionelle Gruppe in dem Hapten fehlt, wird ein Immunogen im allgemeinen durch Einführung einer geeigneten funktionellen Gruppe wie einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe und einer Hydroxylgruppe und eines aus einer Alkylgruppe mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen bestehenden Spacers in das Hapten zur Synthese von Haptenderivaten und Bindung der Derivate an ein geeignetes Protein unter Benutzung eines Vernetzungsmittels erhalten. Spezifischer berichten Takami et al. über die Antikörperbildung unter Verwendung von Methamphetamin (MA) mit einer zentral erregenden Wirkung, das eines der Analeptika ist, als ein Hapten [Takami, Fukuda und Takahashi, Japan, J. Legal Med., 37 (4), 417, 1983]. Das heißt, es wird berichtet, daß die Aminobutylgruppe in der sekundären Aminogruppe von MA unter Bildung von Aminobutylmethamphetamin (ABMA) eingeführt wird. Das Derivat wird an Protein gebunden und das erhaltene Produkt wird als ein Immunogen verwendet.

Jedoch haben Untersuchungen der vorliegenden Erfinder gezeigt, daß der unter Verwendung des Immunogens gebildete Antikörper eine höhere Affinität zu dem Antigenderivat, d. h. ABMA, statt zu dem gesuchten Antigen, i. e. MA, besitzt. Dies bedeutet, daß die Antikörper, die nach Methoden des Standes der Technik gebildet wurden, Antikörper nicht für das Antigen sondern für die Antigenderivate sind. Die Antigenderivate haben eine von derjenigen des Antigens verschiedene Struktur, weil funktionelle Gruppen, Spacer etc. eingeführt werden. Daher ist klar deut-lich gemacht, daß ein Antikörper mit einer hohen Affinität zu dem gewünschten Antigen nur mit Schwierigkeit gebildet wird. Bei dem Nachweis eines Antigens als Analyt mittels - beispielsweise - des zuvor beschriebenen ELISA unter Anwendung des nach Methoden des Standes der Technik gebildetem Antikörper, selbst bei Einführung des Antigens als Analyt in das System in großen Mengen, nimmt daher der ungebundene Antikörper nicht zu, so daß es unmöglich ist, das Antigen als Analyt mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines Antikörpers mit hoher Affinität für Methamphetamin im Vergleich zu dem unter Anwendung eines konventionellen Immunogens gebildeten Antikörper, der durch chemische Bindung eines Methamphetaminderivates an Protein hergestellt wird.

Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe durch ein Immunogen entsprechend Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen beansprucht.

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Immunogen bereit zu stellen, das durch Einführung eines Alkylkettenspacers und einer zur Bindung an Protein fähigen, funktionellen Gruppe in die Aminogruppe von Amphetamin erhalten wurde, und das so hergestellte Antigenderivat an Protein über die funktionelle Gruppe zu binden. Das Immunogen der vorliegenden Erfindung ist eines mit einer chemischen Struktur, die derjenigen von Methamphetamin hoch ähnlich ist, verglichen mit konventionellen Immunogenen, die unter Verwendung von Methamphetamin als Ausgangsmaterial, Einführen einer funktionellen Gruppe und Spacer in das Ausgangsmaterial und Bindung an Protein über die funktionelle Gruppe hergestellt wurden. Als Ergebnis kann ein Antikörper mit hoher Affinität zu Methamphetamin hergestellt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 zeigt eine erläuternde Darstellung des ELISA, wobei die Bezugsziffer 1 eine Mikroplatte bezeichnet, die Bezugsziffer 2 ein durch Einführen einer geeigneten funktionellen Gruppe in ein Antigen und chemische Bindung des Antigens an Protein gebildetes Festphasen-Antigen als Analyt bezeichnet, die Bezugsziffer 3 einen zur Bindung an das Antigen als Analyt fähigen Antikörper bezeichnet, die Bezugsziffer 4 ein Antigen als Analyt bezeichnet, die Bezugsziffer 5 einen zur Bindung an Antikörper 3 fähigen Antikörper bezeichnet, und die Bezugsziffer 6 ein chemisch an Antikörper 5 gebundenes Enzym bezeichnet.

Fig. 2 zeigt eine chemische Struktur von Methamphetamin (MA). Fig. 3 zeigt eine chemische Struktur von Aminobutylmethamphetamin (ABMA). Fig. 4 zeigt eine chemische Struktur von Aminobutylamphetamin (ABAP). Fig. 5 zeigt eine chemische Struktur von Amphetamin (AP).

Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Nachweisempfindlichkeit auf MA mit derjenigen auf ABMA beim ELISA mit Antiseren vergleicht, die nach dem Stand der Technik und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, wobei die Abszisse logarithmisch Konzentrationen von zugesetztem MA und ABMA und die Ordinate die Enzymaktivität in Werten des relativen Absorptionsvermögens anzeigt. Wo ein relatives Absorptionsvermögen bei einer bestimmten Konzentration von MA abnimmt, kann MA mit dieser Konzentration bestimmt werden. Die waagerecht gezogene, gestrichelte Linie gibt 50 %ige relative Absorption an. Die Kurven a, b, c und d geben wieder: eine Kurve zum Nachweis von MA unter Anwendung eines nach der Methode des Standes der Technik hergestellten Antikörpers, eine Kurve zum Nachweis von ABMA unter Anwendung eines nach der Methode des Standes der Technik hergestellten Antikörpers, eine Kurve zum Nachweis von MA unter Anwendung eines nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Antikörpers, bzw. eine Kurve zum Nachweis von ABMA unter Anwendung eines nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Antikörpers.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Als eine Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden die Herstellung eines Antikörpers mit einer hohen Affinität zu dem gesuchten Antigen beschrieben, wobei als gesuchtes Antigen Methamphetamin (MA), das eine Zentral-anregende Wirkung aufweist und eines der Analeptika ist, eingesetzt wird. Bei dieser Ausführungsform wurde ein Antigenderivat (Aminobutylamphetamin, ABAP) durch Einführung der Aminobutylgruppe als zur Bindung an Protein fähiger, funktioneller Gruppe in Amphetamin (AP) (siehe Fig.5), erhalten, wobei dies einer Verbindung entspricht, worin Methyl als die N-Alkylgruppe in MA durch ein Wasserstoffatom ersetzt ist. Die Strukturen von MA, ABMA, ABAP und AP sind in den Fig. 2, 3, 4 bzw. 5 gezeigt. Eine hohe Ähnlichkeit zwischen MA und ABAP ist feststellbar.

Andere bevorzugte Beispiele der Antigenderivate schließen durch die folgende allgemeine Formel wiedergegebene Amphetaminderivate ein:

worin n eine ganze Zahl bedeutet. n ist bevorzugt eine ganze Zahl von 1 bis 10. Wenn n = 4 ist, stellt die zuvor angegebene Strukturformel ABAP dar.

Diese Amphetaminderivate können leicht durch Reaktion von AP mit beispielsweise einem N-Halogenalkylphthalimid wie N-Brombutylphthalimid und dann Behandlung mit Hydrazin erhalten werden.

Als nächstes wird ABAP an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) [KLH = Keyhole-limpet hemocyanine] über die Aminobutylgruppe zur Bildung eines Immunogens gebunden. Alternativ können ebenfalls proteine wie von Hühnern etc. stammende Gamma-Globuline und Rinder-Serumalbumin benutzt werden. Andere Amphetaminderivate können ebenfalls an protein wie KLH über die Aminobutylgruppe in deren Molekül gebunden werden. Bindung zwischen Amphetaminderivaten wie ABAP und Protein können in einer konventionellen Weise herbeigeführt werden. Das heißt, die Bindung kann unter Verwendung üblicher Bindungsreagentien wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP), Tolylen-2,4-diisocyanat, Glutaraldehyd, Perjodsäure, 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol (DFDNB), Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyclohexan- 1-carboxylat (SMCC), N-(τ-Maleinimidobutyryloxy)-succinimid (GMBS) und N-(ε-Maleinimidocaproyloxy)-succinimid (EMCS) bewirkt werden.

Durch Injizieren des so erhaltenen Immunogens in ein Tier wird ein Antikörper mit einer hohen Affinität für MA, nämlich ein Anti-MA-Antikörper im Tierserum erzeugt. So ergibt das Sammeln von Seren aus mit dem Immunogen sensibilisierten Tieren einen Antikörper mit einer hohen Affinität für MA. Die so erhaltenen Seren können ohne weitere Reinigung als ein Agens für einen Immunoassay, d. h. ELISA, eingesetzt werden. Jedes Tier kann zur Immunisierung verwendet werden, sofern diese Säugetiere sind. Zur Vereinfachung des Experiments wurden bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Mäuse benutzt. Mäuse vom A/J- Stamm sind vorteilhaft, da der Stamm das höchste Immunansprechen bewirkt.

Durch Fusion der Milzzellen, gesammelt von dem mit dem zuvorgenannten Immunogen sensibilisierten Tier, mit Myeloma- Zellen können Hybridoma-Zellen, welche einen monoklonalen Antikörper mit hoher Affinität für MA bilden können, erhalten werden. Die Hybridoma-Zellen können nach der als Kohler- und Millstein-Methode [Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)] bekannten Methode erzeugt werden. Beispielsweise können die Hybridoma-Zellen unter Verwendung von X63-Ag8.653, der einer von 8-Azaguanin-resistenten Stämme ist, als Mäuse-Myeloma-Zellen, Fusion der Zellen mit Milz-Zellen in Anwesenheit eines Fusionsbeschleunigers wie Polyethylenglykol und Sendai-Virus, Kultivierung der erhaltenen, verschmolzenen Zellen in HAT-Medium und Sammeln des Hybridoma, das Antikörper mit einer hohen Affinität für MA bildet, geerntet werden.

Das Hybridoma wird in einem geeigneten Medium kultiviert, und es kann ein monoklonaler Antikörper mit einer hohen Affinität für MA aus der überstehenden Flüssigkeit gewonnen werden.

Unter Anwendung des Antikörpers und monoklonalem Antikörper mit einer hohen Affinität für MA, der nach der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, kann MA im Blut quantitativ mit hoher Empfindlichkeit, beispielsweise mittels ELISA, bestimmt werden. Daher sind diese Antikörper extrem brauchbar auf dem Gebiet der Diagnose, chemischen Analyse etc..

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Arbeitsweise mehr im Einzelnen unter Bezug auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Zuerst wird ein Verfahren zur Herstellung von Antiseren im folgenden beschrieben.

(1) Synthese von ABAP

Eine Mischung von 2,00 g Amphetamin (AP), 4,17 g N-Brombutylphthalimid (hergestellt von Aldrich Chemical Company Inc.) und 3,14 g Natriumhydrogenkarbonat wurde in 10 ml Benzol für 16 h unter Rückfluß gekocht. Nach Entfernung des Lösungsmittels aus der Reaktionslösung wurde der Rückstand durch präparative Dünnschichtchromatographie (TLC, hergestellt von Merck und Co. Inc.) unter Verwendung von Kieselgel als Träger gereinigt. Als Elutionslösungsmittel wurde eine Mischung aus Methanol und Chloroform in einem Volumenverhältnis von 5 : 95, die zuvor mit Ammoniak gesättigt worden war, eingesetzt. Der Rf-Wert des Produktes betrug 0,7. Extraktion des Produktes auf Kieselgel mit Ethanol ergab 1,59 g von N-(4-Phthalimidylbutyl)-amphetamin (PIBAP).

In 5 ml 95 %igem Ethanol wurden 1,50 g PIBAP aufgelöst, und es wurden 0,25 g Hydrazinmonohydrat zu der Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde für 1,5 h unter Rückfluß unter Bildung einer kleinen Menge von weißen Niederschlägen gekocht. Nach erneuter Filtration der Mischung wurde das Filtrat mit 1 N Salzsäure angesäuert, und die gebildeten weißen Niederschlä.ge wurden entfernt. Die Lösung wurde dann weiter mit Natriumhydroxid alkalisch eingestellt, wodurch die Ölphase abgetrennt wurde. Die Ölphase wurde mit Diethylether extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels durch Destillation wurde der Rückstand durch TLC unter denselben, zuvor beschriebenen Bedingungen gereinigt. Das Produkt reagiert mit Ninhydrin unter Bildung einer bläulich-pur purnen Färbung. Unter Anwendung der Reaktion wurde das Produkt auf Kieselgel bestimmt, und es wurden 0,75 g N-(4-Aminobutyl)- amphetamin (ABAP) schließlich erhalten.

(2) Herstellung von Immunogen

In 200 ul 0,5 N Salzsäure wurden 19,1 mg ABAP aufgelöst. Die Lösung wurde mit 4,8 ml 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5) verdünnt. Eine Lösung von 12,5 mg Thiolgruppen einführendem N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP, hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology) in 1 ml Ethanol wurde zu der Lö-Sung zugesetzt, gefolgt von deren Reaktion für 30 min unter Rühren. Um den Fortschritt der Reaktion festzustellen, wurde die Lösung auf TLC entwickelt. Als Elutionslösungsmittel wurde dieselbe, zuvor beschriebene Lösungsmittelmischung benutzt. SPDP wird auf TLC als schwarzer Fleck identifiziert, der UV-Licht bei 245 nm absorbiert. Nach Rühren für 30 min verschwand der schwarze Fleck auf TLC in der Reaktionslösung, was anzeigt, daß SPDP mit ABAP vollständig reagierte. Auf diese Weise wurde das Konjugat von SPDP und ABAP (AP-SPDP) erhalten.

Andererseits wurde KLH in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 M NaCl enthielt, zur Herstellung von 2,2 mg/ml KLH-Lösung aufgelöst. Eine Lösung von 51,6 mg SPDP in 4,2 ml Ethanol wurde tropfenweise zu der KLH-Lösung zugegeben, und die Mischung wurde für 12 h unter Rühren reagieren gelassen. Danach wurde nichtumgesetztes SPDP in der Reaktionslösung durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25 (hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology) zum Erhalt des Konjugates von KLH und SPDP (KLH-SPDP) getrennt. Sephadex G-25 wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 4 cm und einer Länge von 50 cm gepackt und bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 6,9 ml/min verwendet. Dithioerythrit (DTT) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer aufgelöst, und 1,8 ml der erhaltenen Lösung wurden zu KLH-SPDP zur Durchführung der Reduktion zugegeben. Nachdem die Mischlösung erneut der Gelfiltration unter denselben Bedingungen, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung der Sephadex G-25-Säule unterworfen worden war, wurde die AP-SPDP-Lösung allmählich zu 106 ml der Lösung zugegeben. 30 min danach wurde Gelfiltration unter denselben, zuvor beschriebenen Bedingungen unter Verwendung der Sephadex G-25- Säule durchgeführt, wodurch 14,3 Moleküle von AP pro 1 Molekül KLH eingeführt wurden. Das so erhaltene Konjugat von KLH und AP (AP-KLH) wurde als Immunogen eingesetzt.

(3) Verfahren zur Immunisierung

Die AP-KLH-Lösung wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zur Einstellung der Konzentration des KLH auf 1 mg/ml verdünnt. Die AP-KLH-Lösung wurde mit vollständigem Freund'schem Adjuvans in einer äquivalenten Menge vermischt, und die Mischung wurde in einem Homogenisator homogenisiert. Die Emulsion wurde intraperitoneal bei Mäusen mit einem Alter von 8 Wochen injiziert. Eine Injektionsdosis betrug 100 ul pro Maus. Der eingesetzte Mäusestamm war A/J, wie zuvor beschrieben.

(4) Auswertung von Antiseren durch ELISA

Nachdem 18 Wochen nach der Immunisierung mit AP-KLH verstrichen waren, wurden die Seren der Mäuse gesammelt. Unter Verwendung der Seren wurde der ELISA durchgeführt, und die Nachweisempfindlichkeit wurde bei Anwendung von MA und ABMA als Analyte bestimmt. Der ELISA wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt.

Chemisch gebundenes Konjugat von BSA und ABMA (MA-BSA), worin 0,4 Moleküle von ABMA als das Antigenderivat in 1 Molekül von Rinderserumalbumin (BSA) eingeführt worden waren, wurde als Festphasen-Antigen benutzt. MA-BSA wurde auf einer 96-Loch Polystyrolplatte für den ELISA (hergestellt von Coaster Corporation) immobilisiert. Die von Mäusen gesammelten Antiseren wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf das 10.000-fache verdünnt, und die verdünnten Antiseren wurden mit MA- oder ABMA- Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen 1 : 1 vermischt. Die Lösungsmischung wurde getrennt in jedes Loch der 96-Loch- Platte für den ELISA, jeweils 100 ul, eingegeben. Nach 3 h wurde die Lösungsmischung entfernt, und die 96-Loch-Platte für den ELISA wurde mit PBS gewaschen. Durch diese Operation wurde der Antikörper der Seren, der auf der Platte ungebunden an MA-BSA war, entfernt. Dann wurde Antikörper, der zur Bindung an den in den Antiseren enthaltenen Mäuse-Antikörper fähig war, getrennt in derselben Menge, wie zuvor beschrieben zugesetzt, Der Antikörper ist ein sogenannter PODF-markierter Antikörper, wobei dies ein chemisch an Peroxidase (POD) gebundener Antikörper ist. Nach 30 min wurde die POD-markierte Antikörperlösung entfernt, und die 96-Loch-Platte für den ELISA wurde erneut mit PBS gewaschen. Durch diese Arbeitsweise wurde der POD-markierte Antikörper, der an dem an dem Festphasen-Antigen auf der Platte befestigtem Mäuse-Antikörper nichtgebunden war, entfernt. Andererseits wurden 40 mg o-Phenylendiamin (OPD) in 10 ml Phosphat-Citrat-Puffer (pH 5,0) aufgelöst, und es wurden 4 ul 30 %iges H&sub2;O&sub2; mit der Lösung vermischt. Die Lösungsmischung wurde getrennt auf die 96-Loch-Platte für den ELISA aufgegeben, mit 100 ul pro Loch, welches mit PBS-Puffer nach der Entfernung des nichtgebundenen, POD-markierten Antikörpers gewaschen worden war. Nach 1 bis 2 min wurde OPD durch die Einwirkung von POD des POD-markierten, an die Platte gebundenen Antikörpers oxidiert, wodurch Bildung einer Färbung mit maximaler Absorption bei 492 nm beobachtet wurde. Nach Abschluß der Enzymreaktion durch getrennte Zugabe von jeweils 25 ul von 4 N Schwefelsäure in jedes Loch wurde das Absorptionsvermögen der Lösung in jedem Loch bei 492 nm mittels eines Spektrophotometers bestimmt. Die Ergebnisse sind durch ausgezogene Linien in Fig. 6 gezeigt. Für Vergleichszwecke hinsichtlich der von Mäusen 18 Wochen nach der Immunisierung gesammelten Seren wurde der ELISA unter denselben, zuvor beschriebenen Bedingungen an Mäusen durchgeführt, die mit dem chemisch gebundenen Konjugat (MA-KLH) von ABMA und KLH, synthetisiert in einer vergleichbaren Weise zu dem zuvor beschriebenen Konjugat, sensibilisiert worden waren. Die Ergebnisse sind durch gestrichelte Linien in Fig. 6 gezeigt. In Fig. 6 stellt die Ordinate ein relatives Absorptionsvermögen bei 492 nm dar und zeigt die relative Menge von Mäuse-Antikörper in den an das Festphasen-Antigen gebundenen Antiseren an. Die Abszisse stellt eine Konzentration von MA oder ABMA in der Lösungsmischung des für den Assay mit MA oder ABMA benutzten Antiseren dar.

Die in Fig. 6 gezeigten Ergebnisse werden im folgenden geprüft. Zunächst werden die durch Immunisierung mit MA-KLH erhaltenen Antiseren betrachtet, wobei die eine 50 %ige Reduzierung des relativen Absorptionsvermögens zeigende MA-Konzentration als 10-3,6 M, basierend auf Kurve a, gefunden wurde. Hinsichtlich ABMA nahm das relative Absorptionsvermögen auf 50 % bei der Konzentration von 10-5,2 M, basierend auf Kurve b, ab. Dies bedeutet, daß geschlossen werden kann, ABMA die Bindung des Mäuse-Antikörpers in den Antiseren an das Festphasen-Antigen um etwa 50 mal stärker als MA hemmt. Anders ausgedrückt, der durch Immunisierung mit MA-KLH erhaltene Antikörper bindet an ABMA um etwa 50 mal stärker als an MA. Andererseits ist unter Berücksichtigung der Tatsache, daß das für den ELISA benutzte Fest-Phasen-Antigen das chemisch gebundene Konjugat von ABMA und BSA ist und dieselbe Struktur wie diejenige von ABMA enthält, zu erwarten, daß der durch Immunisierung mit MA-KLH erhaltene Antikörper an das Festphasen-Antigen stärker als an MA binden würde. Wie zuvor beschrieben, binden das Festphasen-Antigen und das Antigen als Analyt konkurrierend an den Antikörper; als Ergebnis wird der Antikörper gehindert, an das Festphasen-Antigen anzubinden, so daß die Menge des an das Festphasen-Antigen angebundenen Antikörpers abnimmt. Diese Erscheinung wird für den ELISA ausgenutzt. Wenn der Antikörper an das Festphasen-Antigen stärker bindet, ist es schwierig, die Hemmung der Bindung des Antikörpers an das Festphasen-Antigen durch das Antigen als Analyt zu bewirken, was eine Reduzierung der Meßempfindlichkeit ergibt.

Andererseits wurde in den mit AP-KLH immunisierten Antiseren aus Kurve a gefunden, daß die 50 %ige Reduzierung im relativen Absorptionsvermögen zeigende MA-Konzentration 10-6,5 M betrug, und aus Kurve d wurde die ABMA-Konzentration zu 10-5,6 M gefunden. Dies heißt, daß der durch Immunisierung mit AP-KLH erhaltene Antikörper an MA um etwa 50 mal stärker bindet als an ABMA im Gegensatz zu dem Fall, wo der Antikörper durch Immunisierung mit MA-KLH erhalten worden war. Daher besteht keine Chance zum Bewirken einer Reduzierung der Meßempfindlichkeit, wie zuvor beschrieben. Tatsächlich war bei dem ELISA unter Verwendung der durch Immunisierung mit AP-KLH erhaltenen Antiseren die MA-Konzentration, 10-6,5 M, bei der das relative Absorptionsvermögen um 50 % erniedrigt war, so niedrig wie 1/1000, verglichen mit dem Fall der Verwendung der durch Immunisierung mit MA-KLH erhaltenen Antiseren.

Das auf dem zuvor beschriebenen Konzept basierende Immunogen ist auch allgemein auf die Herstellung eines Antikörpers zu einem Hapten mit einem Molekulargewicht unterhalb 1000 anwendbar hinsichtlich anderer Stoffe als in diesem Beispiel genanntem MA. Zusätzlich kann ein Antikörper, hergestellt aus Hybridoma-Zellen, die durch Fusion von aus in diesem Beispiel sensibilisierten Tieren gesammelten Milz-Zellen mit Myeloma-Zellen erhalten wurden, ein sogenannter monoklonaler Antikörper, ebenfalls selbstverständlich dieselben Eigenschaften wie die Antiseren ausüben. Dies heißt, daß ein monoklonaler Antikörper erhalten werden kann, der eine sehr hohe Affinität zu einem Hapten als Antigen besitzt. Im folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers beschrieben.

Beispiel 2

Unter Verwendung von Mäusen, in denen die Bildung des eine hohe Affinität zu MA statt zu ABMA zeigende Antikörper in Beispiel 1 bestätigt wurde, wurde ein monoklonaler Antikörper hergestellt. Im folgenden wird das Verfahren stufenweise beschrieben.

(1) Booster-Reaktion bei Mäusen

Zum Zeitpunkt 7 Wochen nach der Immunisierung mit AP-KLH wurden die Mäuse einer Booster-Behandlung (Verstärkungs-Behandlung) zur Herbeiführung der Hypertrophie der Milz unterworfen. Hierzu wurde AP-KLH auf 1 mg/ml verdünnt und 100 ul der Verdünnung wurden intraperitoneal bei jeder Maus injiziert.

(2) Zellen-Fusion

3 Tage nach der Booster-Behandlung wurden Milz-Zellen aus den Mäusen entnommen und mit Maus-Myeloma-Zellen X63-A8.653 fusioniert. Die Arbeitsweise ist im folgenden im Detail gezeigt:

(i) Nach dem Töten und Pasteurisieren der Mäuse wurden die Mäuse auf eine saubere Bank überführt. Die folgende Prozedur wurde auf der sauberen Bank durchgeführt.

(ii) Die Milz wurde aus jeder Maus entnommen und auf ein Sieb aus rostfreiem Stahl überführt, das zuvor in Isove's modifiziertes Dulbeco'sches Medium (IMDM) (hergestellt von Sigma Chemical Company) eingetaucht worden war. Die Milz wurde mit Scheren zur Bildung von etwa 10 Schnitten eingeschnitten und sorgfältig unter Benutzung eines Glasstabes zur Entnahme von Zellen ausgeguetscht. Durch diesen Vorgang wurden die Milz- Zellen in IMDM suspendiert. Nachdem 5 ml IMDM mit suspendierten Milz-Zellen in ein Zentrifugiergefäß überführt worden waren, wurden die auf dem Sieb verbliebenen Milz-Zellen weiter mit 5 ml IMDM gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden ebenfalls in das Zentrifugiergefäß überführt. In den nachfolgenden Arbeitsschritten bis (ix) war die Zentrifuge gekühlt, und es wurde ein Eisbad bei Bedarf benutzt, um die Temperatur der Zellen so gut wie möglich auf höchstens 4º C zu halten.

(iii) Die Suspension der Milz-Zellen wurde bei 800 g für 7 min zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels eines Aspirators entfernt.

(iv) Zur Zerstörung der roten Blutzellen, welche unnötige Bestandteile sind, wurde 10 ml Tris-Puffer mit einem Gehalt von NH&sub4;Cl zugesetzt, und die am Boden haftenden Zellen wurden mit einer Pipette zum Ablösen aufgerührt. Nach dem Stehenlassen auf Eis für 5 bis 10 min wurde ein Zentrifugieren bei 800 g für 7 min durchgeführt, und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels eines Aspirators entfernt.

(v) Hanks'sche ins Gleichgewicht gesetzte Salzlösung (hergestellt von Research Institute for Microbiological Disease, Osaka University), 10 ml, wurde zu dem System zugesetzt, und die am Boden des Zentrifugiergefäßes verbliebenen Zellen wurden zum Ablösen aufgerührt und auf Eis für 5 bis 10 min stehen gelassen. Wenn die Gewebefragmente niedergeschlagen waren, wurde die Zellen-Suspension alleine in ein anderes Zentrifugiergefäß überführt, so daß die Fragmente nicht mitgenommen wurden. Die Zellen-Suspension wurde bei 800 g für 7 min zentrifuglert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels eines Aspirators entfernt.

(vi) Erneut wurden 10 ml von Hanks'scher ins Gleichgewicht gesetzter Salzlösung zugesetzt, und die Zellen am Boden des Gefäßes wurden zum Ablösen aufgerührt. Zentrifugieren wurde bei 800 g für 7 min durchgeführt, und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels eines Aspirators entfernt.

(vii) Hanks'sche ins Gleichgewicht gesetzte Salzlösung, 13 bis 14 ml, wurde zu den Zellen zugesetzt, und die Zellen am Boden des Gefäßes wurden zum Ablösen aufgerührt.

(viii) Zu 50 ul der bei (vii) erhaltenen Milz-Zellensuspension wurden 50 ul Nigrosin-Lösung, welches eine Zellenfärbelösung war, zugegeben. Etwa 1 min danach wurde eine Zellzählung mit einem Hämocytometer durchgeführt. Die Zellenzahl betrug 5,1 x 10&sup6; Zellen/ml.

(ix) (Die folgende Operation wird bevorzugt alternativ durchgeführt, wobei die Zentrifugierzeit der vorangegangenen Stufe (vi) angewandt wird, um hierdurch die Milz-Zellen und Myeloma-Zellen gleichzeitig zu zählen. Weiter werden bei der folgenden Operation Zentrifugen mit unterschiedlichen Temperaturen benutzt so daß das Kühlen der Myeloma-Zellen unterhalb Normaltemperatur vermieden wird.) Myeloma-Zellen, 45 ml, wurden während des Kultivierungsablaufs zu 50 ml eines Zentrifugiergefäßes zugesetzt, gefolgt von einem Zentrifugieren bei 800 g für 7 min. Die überstehende Flüssigkeit wurde mittels eines Aspirators abgesaugt.

(x) Hanks'sche ins Gleichgewicht gesetzte Salzlösung, 13 ml, wurde zu den Zellen zugesetzt, und die Zellen am Boden des Gefäßes wurden zum Ablösen auf gerührt. Das Zentrifugieren wurde bei 800 g für 7 min durchgeführt, und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels eines Aspirators abgesaugt. Dieser Arbeitsvorgang wurde zweimal wiederholt.

(xi) Nach Zugabe von 13 ml von Hanks'scher ins Gleichgewicht gesetzter Salzlösung wurden die Myeloma-Zellen am Boden des Gefäßes zu ihrer Ablösung aufgerührt.

(xii) Die Zellen wurden in ähnlicher Weise wie in Stufe (viii) ausgezählt. Die Zellzählung ergab 1,5 x 10&sup6; Zellen/ml.

(xiii) 9 ml der unter (viii) erhaltenen Milz-Zellensuspension, welche auf Normaltemperatur kommen gelassen worden waren, wurden mit 6 ml der unter (xii) erhaltenen Myeloma-Zellensuspension gut vermischt. Nach Zentrifugieren bei 2000 g für 5 min wurde die überstehende Flüssigkeit mittels eines Aspirators entfernt.

(xiv) (Die folgende Operation wurde auf einem auf die saubere Arbeitsbank gesetzten Wasserbad bei etwa 40º C durchgeführt.) Unter sanftem Rühren wurden etwa 0,5 ml Polyethylenglykol (PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 1500 zu den in (xiii) erhaltenen, niedergeschlagenen Zellen während 1 min zugegeben. Das Rühren wurde für weitere 1,5 min fortgeführt.

(xv) Nachdem weiter 5 ml IMDM mit einer Rate von 1 ml/min zugegeben worden waren, wurden 5 ml IMDM während 1 min im Anschluß hieran zugesetzt. Nachdem 10 ml IMDM abschließend zugegeben worden waren, wurde ein Zentrifugieren bei 1000 g für 7 min durchgeführt, und die überstehenden Flüssigkeit wurde mittels eines Aspirators entfernt.

(xvi) Zu den in (xvi) erhaltenen, niedergeschlagenen Zellen wurden 3 ml der Milz-Zellensuspension von (viii) als Zusatzzellen zugegeben, und es wurde HAT-Medium (hergestellt von Sigma Chemical Company) mit einem Gehalt von 10 % fötalem Kuhserum (FCS) weiter zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 23 ml zu bringen. Nach dem Ablösen der Zellen mit einer Pipette wurden jeweils 100 ul getrennt in jedes Loch einer 96-Loch-Platte zur Inkubation aufgegeben. Die vorgenannte Operation wurde unter Einsatz von 2 Mäusen durchgeführt, und die Zellensuspension wurde individuell insgesamt in 6 Platten aufgegeben.

(xvii) Die Platten wurden in einen CO&sub2;-Inkubator überführt, und die Inkubation wurde initiiert. Die CO&sub2;-Konzentration und die Temperatur im Inkubator wurden auf 5 % und auf 37º C eingestellt.

(xviii) Einen Tag später wurden jeweils 100 ul HAT-Medium zu jedem Loch zugegeben. Das Inkubieren wurde für 1 Woche fortgeführt.

(3) Bildung von monoklonalem Antikörper

Bei der Platte, bei welcher 1 Woche nach der Initiierung der Kultur der Hybridoma-Zelen in HAT-Medium verstrichen war, wurde folgende Operation durchgeführt:

(1) Aus jedem Loch wurden 100 ul der überstehenden Kultur- Flüssigkeit entnommen und mit PBS zur Herstellung einer 10.000- fachen Reihen-Verdünnung verdünnt. Unter Benutzung der Reihen-Verdünnung wurde der ELTSA durchgeführt. Als Festphasen-Antigen wurde Konjugat (MA-BSA), in welchem 0,4 Moleküle MA chemisch an 1 Molekül BSA gebunden war, verwendet, es wurde jedoch kein Analyt zugegeben. Die übrigen Bedingungen waren mit denjenigen des zuvor beschriebenen ELISA identisch. Durch einen solchen ELISA können die Bindungsfähigkeiten der Antikörper in den jeweiligen überstehenden Kultur-Flüssigkeiten an das Festphasen- Antigen miteinander verglichen werden. Das heißt, in der ein hohes Absorptionsvermögen bei einem großen Verdünnungsgrad zeigenden überstehenden Kultur-Flüssigkeit besteht eine hohe Möglichkeit, daß ein eine hohe Affinität für das Festphasen- Antigen aufweisender Antikörper enthalten ist. Mehrere überstehende Kultur-Flüssigkeiten wurden unter denen ausgewählt, die ein hohes Absorptionsvermögen hatten, und die Inkubation wurde nur mit den Zellen in den Löchern fortgeführt, aus welchen diese überstehenden Kultur-Flüssigkeiten entfernt worden waren. Es wurde ein Kulturmaßstab mit geeignet größerer Zunahme aufgestellt.

(ii) bei den in (i) ausgewählten überstehenden Kultur-Flüssigkeiten wurde der ELISA genauer durchgeführt. Die überstehenden Kultur-Flüssigkeiten wurden entsprechend verdünnt, und es wurde MA-BSA als Festphasen-Antigen benutzt. MA wurde als Analyt zugegeben. Die anderen Bedingungen waren identisch mit denjenigen des zuvor beschriebenen ELISA. 19 überstehende Kultur-Flüssigkeiten wurden unter denen ausgewählt, die eine hohe Empfindlichkeit bei der Messung von MA zeigten, und die Inkubation wurde nur mit den Zellen in den Löchern fortgeführt, aus denen diese überstehenden Kultur-Flüssigkeiten gewonnen worden waren.

(iii) Die Zellen, welche die ausgewählten 19 überstehenden Kultur-Flüssigkeiten bildeten, wurden jeweils in IMDM-Medium suspendiert, und die Zellen wurden wurden unter Verwendung von Nigrosin ausgezählt.

(iv) Jede Zellensuspension wurde mit HT-Medium (hergestellt von Sigma Chemical Company) verdünnt, um auf einen Gehalt von 1 Zelle pro 100 ul einzustellen.

(v) Von Mäusen wurde der Thymus 5 Wochen nach der Geburt entnommen. Die Thymus-Zellen wurden in HT-Medium suspendiert, um einen Gehalt von 2 x 10&sup5; Thymus-Zellen pro 100 ul einzustellen.

(vi) Die Thymus-Zellensuspension von (v) wurde individuell mit 100 ul auf jedes Loch in 10 Platten von 96-Loch-Platten zur Inkubation aufgegeben. Weiterhin wurde die Zellensuspension von (iv) mit jeweils 100 ul pro Loch zugesetzt.

(vii) Unter Fortführung der Inkubation in einem CO&sub2;-Inkubator wurden die überstehenden Kultur-Flüssigkeiten dem ELISA unterzogen. Die Bedingungen waren dieselben wie in (ii). Bei den Zellen, bei denen die Empfindlichkeiten eine hohe Empfindlichkeit für MA zeigten, wurde die Inkubation fortgeführt, während allmählich das Inkubationsmaß geeignet erhöht wurde. Als Ergebnis der fortwährenden Auswahl durch ELISA wurden abschließend 5 Löcher ausgewählt. Dies bedeutet, daß 5 monoklonale Antikörper bildende Zell-Linien erhalten wurden. Diese Zellen wurde kontinuierlich in 200 ml IMDM-Medium kultiviert, bis 5 x 10&sup5; Zellen pro ml enthalten waren.

Von den 5 Zell-Linien wurde eine Zell-Linie 2D55A, welche einen monoklonalen Antikörper mit höchster Affinität für MA erzeugte, bei der Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRl, Ibaraki-ken, JAPAN) unter dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Zugriffs-Nummer FERM BP-2564.

(4) Lagerung von Zellen

Jede Kultur-Flüssigkeit aus den schließlich ausgewählten Zell- Linien wurde in ein Zentrifugiergefäß überführt. Nach dem Zentrifugieren bei 800 g für 7 min wurden die überstehenden Kultur-Flüssigkeiten mittels eines Aspirators entfernt. Die Zellen am Boden wurden in einer Lösung von FCS in Dimethylsulfoxid (DMSO) von 9 : 1 suspendiert. Die Suspension wurde auf einen Gehalt von 5 x 10&sup6; Zellen pro 1 ml eingestellt. Nach einfrieren der Suspension bei - 80º C wurde die gefrorene Suspension in flüssigen Stickstoff überführt, was eine Überführung in einen Lagerzustand für eine lange Zeitspanne ergibt.

(5) Reinigung von Antikörper

Durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Protein-A- Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology) wurde monoklonaler Antikörper aus der überstehenden Kultur-Flüssigkeit gereinigt. Es wurde durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestätigt, daß der gereinigte, monoklonale Antikörper IgG war, bestehend aus H-Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 und L-Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 20.000.

(6) Vergleich von Antikörper-Affinität für verschiedene Haptene

Bei dem gereinigten, monoklonalen Antikörper, der durch die Zell-Linie 2D55A gebildet worden war, wurde der ELISA durchgeführt. Als Festphasen-Antlgen wurde MA-BSA verwendet, und der Assay wurde bei 4 Haptenen von MA, ABMA, AP und ABAP durchgeführt. Die übrigen Bedingungen für den Assay waren dieselben wie diejenigen des zuvor beschriebenen ELISA. Diese Haptene wurden hinsichtlich der für eine 50 %ige Reduzierung des relativen Absorptionsvermögens bei 492 nm erforderlichen Konzentration miteinander verglichen. AP zeigte die höchste Konzentration und die Konzentration nahm dann ab in der Reihenfolge ABMA, ABAP und MA. AP erforderte die Konzentration um etwa 100-fach derjenigen von MA, um 50 %ige Reduzierung des relativen Absorptionsvermögens bei 492 nm zu bewirken. Dies heißt, das gezeigt wurde, daß durch Verwendung von AP-KLH als Immunogen der Antikörper mit der höchsten Affinität für MA aus den 4 zuvor beschriebenen Haptenen gebildet werden konnte.


Anspruch[de]

1. Immunogen, das die Fähigkeit der Induzierung der Produktion eines Antikörpers hat, der hohe Affinität für Methamphetamin aufweist und Amphetamin, eine Alkylkette als Spacer, gebunden an die Aminogruppe des Amphetamins, und ein an die funktionelle Gruppe gebundenes Protein umfaßt.

2. Immunogen nach Anspruch 1, welches aus einem Amphetaminderivat und dem an das Amphetaminderivat gebundenen Protein besteht, wobei das Amphetaminderivat die folgende Struktur- Formel besitzt:

worin n eine ganze Zahl darstellt, wobei das Protein an das Amphetaminderivat über die endständige Aminogruppe in dem Amphetaminderivat gebunden ist.

3. Immunogen nach Anspruch 2, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt.

4. Immunogen nach Anspruch 1, welches aus an Protein gebundenem Aminobutylamphetamin besteht.

5. Immunogen nach Anspruch 1, worin dieses Protein irgendeines von Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Gammaglobulinen, erhalten aus Hühnern, und Rinderserumalbumin ist.

6. Antikörper, der hohe Affinität für Methamphetamin hat, wobei dieser Antikörper aus Serum eines Tieres, das mit einem Immunogen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 sensibilisiert worden ist, erhalten wurde.

7. Antikörper nach Anspruch 6, worin dieses Immunogen ein Immunogen, wie in Anspruch 4 beansprucht, ist.

8. Hybridom, das die Fähigkeit der Produktion eines monoklonalen Antikörpers mit hoher Affinität für das Methamphetamin hat, welches durch die Verschmelzung von Milzzellen aus einem Tier, das mit einem Immunogen nach Anspruch 1 sensibilisiert wurde, und Myelom-Zellen hergestellt wurde.

9. Hybridom nach Anspruch 8, erhalten unter Verwendung von Milzzellen von einem mit einem Immunogen nach Anspruch 4 sensibilisierten Tier.

10. Hybridom nach Anspruch 8 mit der Zugangsnummer: FERM BP-2564.

11. Monoklonaler Antikörper, hergestellt mit einem Hybridom nach Anspruch 8.

12. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, der ein IgG ist.







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