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Dokumentenidentifikation DE3850574T2 27.10.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0374157
Titel NEUE KLASSE VON NIEDRIGKALORISCHEN PROTEINSÜSSSTOFFEN.
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US;
Lucky, Ltd., Seoul, KR
Erfinder KIM, Sung-Hou, Moraga, CA 94556, US;
Cho, Joong Myung, Concord, California 94521, US
Vertreter Eitle, W., Dipl.-Ing.; Lehn, W., Dipl.-Ing.; Füchsle, K., Dipl.-Ing.; Hansen, B., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Brauns, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Görg, K., Dipl.-Ing.; Kohlmann, K., Dipl.-Ing.; Kolb, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Ritter und Edler von Fischern, B., Dipl.-Ing.; Zangs, R., Dipl.-Ing.; Kindler, M., Dipl.-Chem.Univ. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte; Nette, A., Rechtsanw., 81925 München
DE-Aktenzeichen 3850574
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 31.05.1988
EP-Aktenzeichen 889055208
WO-Anmeldetag 31.05.1988
PCT-Aktenzeichen US8801825
WO-Veröffentlichungsnummer 8810265
WO-Veröffentlichungsdatum 29.12.1988
EP-Offenlegungsdatum 27.06.1990
EP date of grant 06.07.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.10.1994
IPC-Hauptklasse C07K 1/06
IPC-Nebenklasse C07K 3/04   C07K 7/10   C07K 13/00   A23L 1/236   C07H 21/04   C12N 1/20   C12P 21/02   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Proteinen als Ersatzstoffe für Zucker beim Süßen von Nahrungsmitteln und Getränken. Insbesondere betrifft die Erfindung einkettige Proteinverbindungen, die wesentlich süßer als Saccharose sind und deren Süßkraft erhalten bleibt, auch wenn sie denaturierenden Bedingungen unterworfen werden.

Hintergrund der Erfindung

Es ist bekannt, daß bestimmte Proteinverbindungen die Fähigkeit aufweisen, auf sehr wirksame Weise Zucker zu ersetzen, indem sie Nahrungsmitteln und Getränken einen süßen Geschmack verleihen. Das einfachste dieser Beispiele ist Aspartam, bei dem es sich um ein Dipeptidderivat handelt, das gegenwärtig auf dem Markt erhältlich ist. Zwei wesentlich komplexere Proteine, nämlich Monellin und Thaumatin, werden jedoch aus pflanzlichen Quellen isoliert. Thaumatin wird aus Thaumatococcus daniellii, einer westafrikanischen Pflanze mit einer dreikantig geformten Frucht am Boden isoliert. Das natürliche Proteinprodukt, Thaumatin, weist eine mittlere Süße auf, die dem 2500-fachen der Süße von Saccharose entspricht, und wird unter dem Warenzeichen Talin angeboten. Die dreidimensionale Struktur dieses Proteins ist untersucht worden, und die Ergebnisse sind von A.M. De Vos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 1406-1409, veröffentlicht worden.

Das andere Protein, das nicht glykosyliert ist, wird aus "Serendipity Berries" der westafrikanischen Pflanze Dioscoreophyllum comminisii isoliert. Die Aminosäuresequenz von Monellin ist bekannt, und die dreidimensionale Struktur dieses Proteins ist von C. Ogata et al., Nature, Bd. 328 (1987), S. 739-742, bestimmt worden. Monellin ist von Morris et al., J. Biol. Chem., Bd. 248 (1973), S. 534-539; und anderen; Cagan, Science, Bd. 181 (1973), S. 32-35; Bohak und Li, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 427 (1976) S. 153-170; Hudson und Beeman, Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 71 (1976), S. 212-220; Van der Wel und Loeve, FEBS Lett., Bd. 29 (1973), S. 181-183; Frank und Zuber, Hoppe-Seyler's Z. Physiol.

Chem., Bd. 357 (1976), S. 585-592; Morris und Cagan, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 261 (1972), S. 114-122, charakterisiert worden. US-Patent 3 998 798 beschreibt die Herstellung von natürlichem Monellin.

Die bekannte Aminosäuresequenz der A- und B-Ketten von natürlichem Monellin ist in Fig. 1 gezeigt. Es handelt sich um ein zweikettiges Peptid, wobei die eine Kette, die A-Kette, 45 Aminosäuren umfaßt, und die andere Kette, die B-Kette, 50 Aminosäuren umfaßt. Die dreidimensionale Konformation des Proteins, die in Fig. 2 gezeigt ist, ist offensichtlich wesentlich für seine Aktivität, da die Süße zerstört wird, wenn natives Monellin bei neutralem pH-Wert auf 90ºC oder auf 50ºC bei saurem pH-Wert erwärmt und anschließend abgekühlt wird.

Die dreidimensionale Konformation des Proteins, wie sie kürzlich bestimmt worden ist (siehe vorstehend), ist in Fig. 2 gezeigt. Eine 50 Aminosäuren enthaltende B-Kette ist eng verknüpft mit der A-Kette von 45 Aminosäuren, so daß zahlreiche Wechselwirkungen zwischen den Ketten bestehen. Beim Erwärmen des Proteins dissoziieren die Ketten offensichtlich in einer solchen Weise, daß sie nicht mehr in der Lage sind, wieder die richtige Konformation anzunehmen.

Es ist nun festgestellt worden, daß die Konformation dieser Proteinverbindung aufrechterhalten werden kann, indem Teile der Komponenten B und A in einem einzigen Molekül synthetisiert werden. Diese Zwangsbedingung führt zu einer Beständigkeit gegenüber einer Denaturierung und einer leichten Beibehaltung der dreidimensionalen Konformation.

Offenbarung der Erfindung

Mit der Erfindung werden einkettige Formen der süßen Proteinsubstanz Monellin bereitgestellt, die in der Lage sind, ihre dreidimensionale Konformation unter Bedingungen beizubehalten, die normalerweise das native Protein denaturieren. Diese Formen behalten ihren süßen Geschmack, der wesentlich intensiver ist als der von Saccharose, selbst nach Erwärmen auf 100ºC bei einem sauren pH-Wert. Die Substanz eignet sich also zum Süßen von Nahrungsmitteln und Getränken unter Einschluß von mit Kohlensäure versetzten Getränken, die Temperaturen ausgesetzt werden, die über der Umgebungstemperatur liegen.

Gemäß einem Aspekt richtet sich die Erfindung auf eine einkettige Proteinverbindung mit einer Süßkraft von mindestens dem 50-fachen, vorzugsweise dem 100-fachen und insbesondere dem 1000-fachen der Süßkraft von Saccharose, bezogen auf das Gewicht. Die Verbindung weist die Formel B-C-A auf, worin B weitgehend äquivalent zu den Resten 1 bis 46 der B- Kette des nativen Monellins ist und durch den C-Terminus mit C verbunden ist. C ist ein kovalenter Linker, der wiederum an den N-Terminus eines Peptids gebunden ist, das weitgehend äquivalent zu den Resten 6 bis 45 der A-Kette des nativen Monellins ist. Der kovalente Linker C muß ungefähr die Länge eines 3 bis 10 α-Aminosäuren umfassenden Peptids aufweisen, eine ausreichend hydrophile Beschaffenheit besitzen, um auf der Außenseite des Moleküls zu bleiben, und physiologisch verträglich sein. Wenn der kovalente Linker selbst ein Peptid ist, dann handelt es sich bei der Substanz um ein einkettiges Protein, das unter Anwendung automatischer Synthesemethoden hergestellt werden kann, oder das aus einem synthetischen Gen unter Anwendung rekombinanter Techniken oder nach anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden kann.

Da auch rekombinante Methoden angewandt werden können, umfaßt die Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt DNA-Sequenzen, die das Protein codieren, Expressionsvektoren, die diese Sequenzen enthalten, Mikroorganismen oder andere Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert sind, und Verfahren zur Herstellung des Proteins unter Verwendung dieser Materialien. Die Erfindung umfaßt auch nützliche Zwischenstoffe bei der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz der A- und der B-Kette des nativen Proteins.

Fig. 2 ist eine Darstellung der dreidimensionalen Konformation des nativen Proteins.

Fig. 3 zeigt die Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen einkettigen Proteins und die Nucleotidsequenz eines synthetischen Gens, das zur Synthese des einkettigen Proteins geeignet ist.

Ausführungsformen der Erfindung

Die erfindungsgemäße Proteinverbindung, die sich als Süßstoff eignet, besteht im wesentlichen aus einem Peptidanteil, der weitgehend äquivalent zur Sequenz der Reste 1 bis 45 der B-Kette von nativem Monellin ist, verknüpft über den C-Terminus durch einen kovalenten Linker mit dem N-Terminus eines Peptids, das weitgehend äquivalent zur Sequenz der Reste 6 bis 45 der A-Kette von nativem Monellin ist. Mit "weitgehend äquivalent" ist ein Peptid gemeint, das, im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verbindungen, zu einer Substanz führt, die eine Süßkraft von mindestens dem 50-fachen der Süßkraft von Saccharose besitzt, und das mindestens 80% Homologie mit dem Peptid aufweist, das durch die Reste 1 bis 46 der B-Kette dargestellt wird, oder dem Peptid, das durch die Reste 6 bis 45 der A-Kette dargestellt wird. Mindestens 90% Homologie sind bevorzugt, insbesondere unter Einschluß konservativer Substitutionen.

Die Homologie wird nach Standardverfahren berechnet, die die Ausrichtung von zwei zu vergleichenden Sequenzen, so daß eine maximale Anzahl an Übereinstimmungen auftritt, und die Berechnung des Prozentsatzes der Übereinstimmungen umfaßt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Substanzen also ein Peptid mit der Aminosäuresequenz der Reste 1 bis 46 der nativen B-Kette von Monellin, verknüpft (durch einen Linker) mit einem Peptid mit einer Primärstruktur, die durch die Reste 6 bis 45 der nativen A-Kette von Monellin dargestellt wird. Dazu weitgehend äquivalente Substanzen umfassen Substanzen, bei denen einer oder mehrere der Reste der nativen Sequenz deletiert sind, durch eine verschiedene Aminosäure substituiert sind oder bei denen eine oder mehrere verschiedene Aminosäuren inseriert sind.

Bevorzugte Substitutionen sind Substitutionen, die konservativ sind, d. h., bei denen ein Rest durch einen anderen Rest des gleichen allgemeinen Typs ersetzt ist. Wie allgemein bekannt ist, können natürlich auftretende Aminosäuren als sauer, basisch, neutral und polar oder neutral und unpolar klassifiziert werden. Ferner sind drei der codierten Aminosäuren aromatisch. Es ist im allgemeinen bevorzugt, daß Peptide, die sich von der nativen Sequenz unterscheiden, Substitutionen enthalten, die aus der gleichen Gruppe stammen wie die ersetzte Aminosäure. Im allgemeinen sind also die basischen Aminosäuren Lys, Arg und His gegeneinander austauschbar; die sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure sind gegeneinander austauschbar; die neutralen polarem Aminosäuren Ser, Thr, Cys, Gln und Asn sind gegeneinander austauschbar; die unpolaren aliphatischen Aminosäuren Gly, Ala, Val, Ile und Leu sind gegeneinander austauschbar; und die aromatischen Aminosäuren Phe, Trp und Thr sind gegeneinander austauschbar. Prolin ist eine unpolare neutrale Aminosäure, sie führt jedoch zu Schwierigkeiten verbunden, und zwar aufgrund ihres Einflusses auf die Konformation, und Substitutionen durch oder für Prolin sind nicht bevorzugt, mit der Ausnahme, wenn gleiche oder ähnliche Konformationen erzielt werden können. Außerdem scheinen, obwohl sie zu verschiedenen Kategorien gehören, Ala, Gly und Ser gegeneinander austauschbar zu sein, und Cys paßt zusätzlich in diese Gruppe. Einige Substitutionen durch Aminosäuren aus anderen Klassen können zweckmäßig sein, um den süßen Geschmack zu modifizieren.

Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß Substitutionen durch Aminosäuren, die nicht durch das Gen codiert werden, ebenfalls durchgeführt werden können. Alternative Reste umfassen z. B. die omega-Aminosäuren der Formel H&sub2;N(CH&sub2;)nCOOH, worin n einen Wert von 2 bis 6 hat. Diese Verbindungen sind natürliche, unpolare Aminosäuren, wie auch Sarcosin (Sar), tert.-Butylalanin (t-BuA), tert.-Butylglycin (tert.-BuG), N-Methyl-Ile (N-MeIle) und Norleucin (Nle). Phenylglycin kann z. B. für Trp, Tyr oder Phe als aromatische neutrale Aminosäure substituiert werden; Citrullin (Cit) und Methioninsulfoxid (MSO) sind polar, jedoch neutral, Cyclohexylalanin (Cha) ist neutral und unpolar, Cysteinsäure (Cya) ist sauer, und Ornithin (Orn) ist basisch. Die Konformations-beeinflussenden Eigenschaften von Prolinresten können erhalten werden, wenn einer oder mehrere dieser Reste durch Hydroxyprolin (Hyp) substituiert werden.

Ferner können eine oder mehrere der Peptidverknüpfungen in den den B- oder A-Peptiden entsprechenden Abschnitten der erfindungsgemäßen Substanzen durch andere Arten von Verknüpfungen ersetzt werden, die die gleichen allgemeinen Eigenschaften aufrechterhalten, wie -CH&sub2;NH-, -CH&sub2;S-, -CH&sub2;CH&sub2;-, -CH=CH-, -COCH&sub2;-, -CH(OH)CH&sub2;- und -CH&sub2;SO-, und zwar gemäß dem Fachmann bekannten Methoden; vgl. z.B: A.F. Spatola, Vega Data, Bd. 1(3) (1983), "Peptide Backbone Modifications"; A.F. Spatola, in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", B. Weinstein (Herausg.), Marcel Dekker, New York (1983), S. 273; J.S. Morley, Trans. Pharm. Sci. (1980), S. 463-468. Diese Substitutionen können durchgeführt werden, solange das resultierende "Protein" physiologisch verträglich ist.

Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß, wenn die Proteinausführungsformen der Erfindung rekombinant als intrazelluläre Proteine hergestellt werden, ein N-terminaler Methioninrest im Endprodukt beibehalten werden kann. Die Abspaltung dieses N-terminalen Methionins unter Freisetzung der nativen Sequenz kann vollständig sein oder nicht.

Die erfindungsgemäßen kovalenten Linker weisen im allgemeinen eine Länge auf, die äquivalent zu der Länge ist, die durch ein Peptid mit 3 bis 10 Aminosäureresten und vorzugsweise mit 6 bis 8 Aminosäureresten erzeugt wird, und sie müssen physiologisch verträglich sein. "Physiologisch verträglich" bedeutet nicht-toxisch und frei von unerwünschten Nebenwirkungen. Der kovalente Linker sollte eine hydrophile Beschaffenheit und eine Länge aufweisen, die es erlauben, daß der kovalente Linker sich im äußeren Abschnitts des Moleküls aufhält und die native Konformation nicht stört. Eine bevorzugte kovalente Peptidlinkersequenz ist nachstehend gezeigt:

Tyr-Glu-Asn-Glu-Arg-Glu-Ile-Lys.

Eine besonders bevorzugte Gruppe von kovalenten Linkern, die durch c dargestellt werden, umfassen eine Peptidsequenz, die 3 bis 10 und vorzugsweise 6 bis 8 Reste enthält, mit der Formel

A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10

worin jeder der Reste A1-A10 einen Aminosäurerest darstellt oder fehlen kann, wobei jedoch mindestens drei der Reste A1-A10 Aminosäurereste sein müssen. In einer besonders bevorzugten Gruppe von Ausführungsformen fehlen A9 und A10; A2, A4 und A6 sind saure Aminosäuren; A5 und A8 sind basische Aminosäuren; A3 ist eine polare/neutrale Aminosäure und A1 und A7 sind unpolare Aminosäuren. In einem besonders bevorzugten Satz von Ausführungsformen fehlen A9 und A10, A1 ist Tyr oder Phe, A2 ist Glu oder Asp, A3 ist Asn oder Gln, A4 ist Glu oder Asp, A5 ist Arg, His oder Lys, A6 ist Glu oder Asp, A7 ist Ile, Val oder Leu und A8 ist Arg, Lys oder His.

Sofern nichts anderes angegeben ist, liegen die Aminosäurereste, ob sie durch ein Gen codiert werden oder nicht-codierte Analoga sind, in der L-Konfiguration vor. Es können jedoch zwei derartige Reste und vorzugsweise ein Rest durch das D-Isomer substituiert werden.

Alternative Linker umfassen beliebige kovalente verknüpfende Gruppen, die eine geeignete Länge, wie sie vorstehend beschrieben wurde, eine geeignete hydrophile Beschaffenheit und physiologische Verträglichkeit aufweisen. Zum Beispiel können auch Polyethylenglykololigomere der Formel HO(CX&sub2;CX&sub2;O)nHf worin jedes X unabhängig H oder eine gesättigte oder ungesättigte Hydrocarbylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und worin n den Wert 3-10 und vorzugsweise 6-8 hat, verwendet werden. Die Oxidation einer der endständigen Hydroxylgruppen führt zu einer Carboxylgruppe zur Bildung eines Amids mit dem N-Terminus der A-Kette; die Verknüpfung an die B-Kette erfolgt durch eine Esterbindung mit der verbleibenden Hydroxylgruppe des Polyethylenglykols. Eine Reihe kovalenter Linker mit der korrekten Funktionalität, hydrophilen Beschaffenheit und Länge können bereitgestellt und verwendet werden, um eine kovalente Verknüpfung des C-Terminus der B-Kette mit dem N-Terminus der A-Kette zu bewirken. Eine Reihe kovalenter Linker ist im Handel z. B. von Pierce Chemical Company erhältlich.

Die B- und A-Peptide der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie der C-Linkerabschnitt, wenn es sich dabei auch um ein Peptid handelt, können unter Anwendung standardisierter automatisierter Peptidsynthesetechniken synthetisiert werden, und zwar entweder manuell oder in Syntheseautomaten, wie denen, die von Applied Biosystems (Foster City, California) oder Biosearch (San Rafael, California) vertrieben werden. Mit der C-terminalen Aminosäure in geschützter Form derivatisierte Harze sind im Handel erhältlich. Für die Synthese des A-Ketten-Abschnitts werden Harze, die mit Prolin derivatisiert sind, bevorzugt; für den B-Anschnitt werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform Harze verwendet, die mit Ile derivatisiert sind. Die folgenden Aminosäuren werden unter Anwendung von Standardtechniken zur Synthese von Peptiden bis zur gewünschten Länge addiert. Die A- und B-Ketten können jeweils als Ganzes oder als Fragmente synthetisiert werden, die dann miteinander und anschließend mit dem kovalenten Linker verknüpft werden, um die erfindungsgemäßen Substanzen zu erhalten.

Wenn sie unter Anwendung rekombinanter Techniken hergestellt werden, wird eine DNA-Sequenz, die für den gewünschten Peptidabschnitt und in einigen Fällen für das Peptid voller Länge codiert, unter Anwendung standardisierter automatischer Techniken synthetisiert. Diese DNA wird in geeignete Expressionsvektoren ligiert, und diese Vektoren werden zur Transformation geeigneter Wirte verwendet. Eine Reihe von Expressionsvektor/Wirtszelle-Systemen können genutzt werden, unter Einschluß sowohl prokaryontischer als auch eukaryontischer Kultursysteme.

Prokaryonten werden meistens durch verschiedene Stämme von E. coli vertreten. Andere mikrobielle Stämme können jedoch ebenfalls verwendet werden, wie Bacilli, wie z. B. Bacillus subtilis, verschiedene Spezies von Pseudomonas oder andere Bakterienstämme. In derartigen prokaryontischen Systemen werden Plasmidvektoren, die Replikationsursprünge und Steuersequenzen, die aus einer Spezies stammen, die mit dem Wirt kompatibel ist, verwendet. Zum Beispiel wird E. coli typischerweise mit Derivaten von pBR322, einem aus einer E. coli-Spezies von Bolivar et al., Gene, Bd. 2 (1977), S. 95, isolierten Plasmid, transformiert. Üblicherweise verwendete prokaryontische Steuersequenzen, die hier so definiert sind, daß sie Promotoren zur Transkriptionsinitiation gegebenenfalls mit einem Operator zusammen mit Ribosombindungsstellensequenzen enthalten, umfassen üblicherweise verwendete Promotoren, wie β-Lactamase (Penicillinase), Lactose-Promotorsysteme (lac) (Chang et al., Nature, Bd. 198 (1977), S.

1056), das Tryptophan-Promotorsystem (trp), (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057) und den aus dem lambda-Phagen abgeleiteten PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Shimatake et al., Nature, Bd. 292 (1981), S. 128). Es kann jedoch ein beliebiges, mit Prokaryonten kompatibles Promotorsystem verwendet werden.

Die für die erfindungsgemäßen eukaryontischen Systeme geeigneten Expressionssysteme umfassen Promotoren, die aus geeigneten eukaryontischen Genen stammen. Eine Klasse von Promotoren, die in Hefe geeignet sind, umfassen z. B. Promotoren zur Synthese von glykolytischen Enzymen unter Einschluß des Alkohol-Dehydrogenase-1-Promotors, des Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Promotors (Holland & Holland, J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 2596), des α-Faktor-Promotors (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 5330), des gal-Promotors (Johnston und Davis, Mol. Cell. Biol., Bd. 4 (1984), S. 1440) und der Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 2073). Weitere Promotoren umfassen die Promotoren für das Enolasegen (M.J. Holland et al., J. Biol. Chem., Bd. 256 (1981), S. 1385) oder das aus YEp13 erhaltene Leu2-Gen (J. Broach et al., Gene, Bd. 8 (1978), S. 121).

Geeignete Säugerpromotoren umfassen die frühen und späten Promotoren aus SV40 (Fiere et al., Nature, Bd. 273 (1978), S. 113) oder andere virale Promotoren, wie die, die aus dem Polyomavirus, dem Adenovirus II, dem Rinder-Papilloma-Virus oder dem Affensarkomvirus abgeleitet wurden. Geeignete Verstärker aus Viren oder Säugern wurden vorstehend zitiert. Für den Fall, daß Pflanzenzellen als Expressionssystem verwendet werden, eignet sich der Nopalin-Synthese-Promotor (A. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., Bd. 1 (1982), S. 561).

Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Einsatz von Calciumchlorid, wie sie von S.N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 69 (1972), S. 2110, beschrieben wurde, oder die RbCl-Methode, die von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Press, S. 254, beschrieben wurde, werden für Prokaryonten oder andere Zellen, die erhebliche Zellwandbarrieren aufweisen, angewandt. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (C.H. Shaw et al., Gene, Bd. 23 (1983), S. 315) wird für bestimmte Pflanzenzellen angewandt. Für Säugerzellen ohne derartige Zellwände wird die Calciumphosphatfällungsmethode von Graham und van der Eb, Virology, Bd. 52 (1978), S. 546, bevorzugt. Transformationen in Hefe werden gemäß dem Verfahren von P. Van Solingen et al., J. Bacter., Bd. 130 (1977), S. 946 und C.L. Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 3829, durchgeführt.

Im allgemeinen wird das System nach der Konstruktion eines geeigneten Expressionssystems in einen geeigneten Wirt transfiziert, und erfolgreiche Transformanten werden durch Marker selektiert, die auf den Expressionsvektoren enthalten sind. Erfolgreich transformierte Kolonien werden anschließend gezüchtet, um das gewünschte Protein herzustellen. Es wird bevorzugt, daß ein Promotor verwendet wird, der durch Regulation der Bedingungen in der Umgebung gesteuert werden kann, so daß die Zellen unter Bedingungen gezüchtet werden können, unter denen das für das erfindungsgemäße gewünschte Protein codierende Gen nicht exprimiert wird. Dann kann die Herstellung des Proteins durch eine geeignete Beeinflussung der Bedingungen induziert werden. Wenn z. B. der trp-Promotor in E. coli verwendet wird, dann werden die Zellen in Gegenwart von Tryptophan gezüchtet, und die Expression wird durch eine Verringerung der Tryptophankonzentration oder durch Zugabe eines Tryptophananalogons, wie Indolylessigsäure, induziert. Wenn sich das Gen unter der Steuerung des PL-Promotors befindet, dann werden die Zellen bei relativ niedriger Temperatur, wie etwa 35ºC, bis zu einer geeigneten Zelldichte gezüchtet, und die Temperatur wird dann erhöht, um diesen Promotor zu aktivieren. Wenn das Protein in bakteriellen Wirtszellen als reifes intrazelluläres Protein hergestellt wird, dann kann das N-terminale Methionin abgespalten werden oder nicht abgespalten werden. In Säugersystemen z. B. erlaubt die Verwendung des Metallothioneinpromotors die Induktion durch Zugabe von Schwermetallen oder Glucokortikoiden. Diese Anleitung wird bevorzugt, um die vorzeitige Anreicherung von Protein zu verhindern, die für das Wachstum der Zellen schädlich sein kann.

Das Protein kann auch in abgesonderter Form durch Konstruktion von Vektoren hergestellt werden, wobei dem B-Peptid ein Signalpeptid vorangeht, das in dem entsprechenden Wirt arbeitet.

Das Protein wird aus dem Medium oder aus den Zellen unter Anwendung geeigneter Techniken gewonnen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, und es wird z. B. durch Ionenaustauschchromatographie, Ammoniumsulfatfällung, Gelpermeationschromatographie und dergl. gereinigt. Die erfindungsgemäßen süßenden Verbindungen können auch verwendet werden, um für sie selbst immunospezifische Antikörper zu erzeugen, die zur Reinigung der Verbindungen aus synthetischen Medien oder Biokulturmedium nützlich sind. Diese Antikörper können mit Hilfe von Standardimmunisierungstechniken durch Mischen der Verbindung mit geeigneten Trägern und Injektion der Zubereitungen in Vertebratenwirte, typischerweise Kaninchen oder andere Säugerwirte, hergestellt werden. Die Antiseren oder gereinigten Antikörper können dann mit festen Trägern konjugiert werden, um Immunoaffinitätssäulen für die Reinigung der gewünschten Materialien bereitzustellen. Die erfindungsgemäße Proteinsubstanz der Formel B-C-A kann, wie immer sie hergestellt wurde, als süßender Bestandteil in Nahrungsmitteln und Getränken verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen Substanzen eine Süßkraft aufweisen, die mindestens der 100-fachen Süßkraft von Saccharose entspricht, können kleine Mengen verwendet werden, um den Geschmack von Säften, mit Kohlensäure versetzten Getränken oder anderen alkoholfreien Getränken zu ergänzen. Die Süßstoffe können auch als Zuckerersatzstoffe in Heißgetränken, wie Kaffee oder Tee, verwendet werden, da die Konformation bei erhöhten Temperaturen erhalten bleibt. Diese Materialien können auch zum Süßen von Tiernahrungsmitteln verwendet werden.

Für diejenigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verbindungen, die durch DNA-Sequenzen codiert werden, können die Materialien in situ durch transfizierte Mikroorganismen, eukaryontische Zellinien oder Pflanzen hergestellt werden. Zum Beispiel können Expressionssysteme, die das Gen enthalten, das für die gewünschte Substanz codiert, in den Kulturorganismus transfiziert werden, der zur Herstellung von Yoghurt, Wein, Bier und dergl. verwendet wird, und der Süßstoff wird bei der Herstellung des gewünschten Produkts gebildet. Außerdem können in Pflanzen arbeitende Expressionssysteme, die das Gen, das für die erfindungsgemäßen Verbindungen codiert, enthalten, verwendet werden, um Explantate oder Pflanzenprotoplasten zu transfizieren, und diese können dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden, die dann genetisch zur Bildung von süßeren Formen von Früchten oder pflanzlichen Produkten fähig sind.

Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als Süßstoffprodukte verwendet werden, werden sie typischerweise durch Zugabe einer Flüssigkeit oder eines Pulvers gestreckt, wobei die erfindungsgemäße Verbindung etwa 0,1 bis 99 Gew.-% der Zusammensetzung ausmacht. Geeignete Streckungsmittel umfassen z. B. inerte Pulver, wie Cellulose, und können außerdem nützliche Bestandteile, wie Antioxidantien, Konservierungsmittel, Proteaseinhibitoren und dergl., enthalten.

Beispiele

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, jedoch ihren Schutzumfang nicht beschränken.

Beispiel 1 Herstellung des synthetischen Gens

Das Protein mit der Aminosäuresequenz, die in Fig. 3 gezeigt ist, wird durch eine DNA-Sequenz codiert, die dort gezeigt ist. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, codieren die Nucleotide 1-141 die Reste 1-45 der nativen B- Kette, denen ein Met codierendes ATG-Startcodon vorausgeht. Die Nucleotide 142-165 codieren den verknüpfenden "C"-Anteil von 8 Aminosäuren, und die Nucleotide 166-285 codieren die Reste 6-45 des nativen A-Proteins.

Dieses synthetische Gen wurde aus den nachstehenden Oligomeren hergestellt, die unter Verwendung eines Syntheseautomaten Applied Biosystems 380B synthetisiert wurden.

Die Oligomere wurden durch Harnstoff-Polyacrylamidgel-Elektrophorese isoliert und gereinigt, indem sie durch eine Sep-pak-C18-Säule (Whatman) geleitet wurden. Sie wurden anelliert und ligiert, wie es nachstehend gezeigt ist:

wobei man das synthetische Gen von Fig. 3 erhielt, das von den Stellen NdeI und SalI eingeschlossen wird.

Zur Ligation wurde jedes Oligomere 45 Minuten bei 37ºC in einem Reaktionsgemisch von 30 ul mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl, pH- Wert: 8,0, 10 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT, 1 millimolar ATP und 5 Einheiten T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert. Die Reaktionsgemische wurden vereinigt, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in einer Speed-Vac-Vorrichtung getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 50 ul destilliertes Wasser gelöst, und 7 ul Ligationspuffer (0,2 in Tris-HCl, pH-Wert: 7,5, 0,1 m MgCl&sub2;, 0,1 m DTT) wurden zugegeben. Die Lösung wurde in ein 95ºC warmes Wasserbad gestellt und langsam über Nacht auf Raumtemperatur gekühlt. Zu dem Gemisch wurden 7 ul von 10 millimolar ATP, 40 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolab Inc.) und 2 ul Wasser gegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt, getrocknet und in 85 ul Wasser wieder aufgelöst. Das ligierte Oligomergemisch wurde mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und SalI (New England Biolabs, Inc.) behandelt, und das 290 Basenpaare umfassende Fragment wurde durch Elektrophorese mit einem 7%-igen Polyacrylamidgel isoliert. Die Bande wurde elektroeluiert und unter Verwendung einer Elutip-D-Säule (S&S Co.) gereinigt.

M13mp19RF wurde zur Klonierung des synthetischen Monellingens verwendet. M13mp19RF wurde mit XbaI/SalI (New England Biolabs, Inc.) geschnitten, und das große Fragment wurde isoliert und gereinigt. Ein synthetischer XbaI-NdeI-Adapter

wurde gereinigt, und das mit NdeI/SalI verdaute, anellierte, synthetische Monellin-DNA-Fragment, das vorstehend hergestellt wurde, wurde mit dem mit XbaI/SalI behandelten M13mp19RF und dem XbaI/NdeI-Adapter in 10 ul von 20 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,5, 10 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT, 200 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Inc.) gemischt und über Nacht bei 4ºC inkubiert, wobei man M13mp19 MON-IRF erhielt. Das Ligationsgemisch wurde in Wirtszellen transformiert, indem 5 ul Ligationsgemisch zu 200 ul kompetenten E. coli JM101-Zellen (J. Messing, Methods in Enzymology, Bd. 101 (1983), S. 20-78) gegeben wurden. Die gewünschte Sequenz wurde durch Didesoxysequenzierung bestätigt (T. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1985), S. 5463-5467).

Beispiel 2 Herstellung eines Expressionsvektors

Das 293 bp umfassende synthetische NdeI/SalI-Gen wurde aus M13mp19 MON-IRF isoliert und gereinigt. Ein im Handel erhältlicher Vektor, nämlich pDR720, der den trp-Promotor/Operator enthält (Pharmacia, Inc.; Katalog-Nr. 27-4930-01) wurde mit SmaI/PvuII verdaut, und die stumpfen Enden wurden ligiert, wobei man ptrp322 erhielt. Der Vektor ptrp322 wurde mit HpaI/SalI verdaut, und ein 2,5 kb großes Fragment wurde isoliert. Ein synthetischer HpaI/NdeI-Adapter,

wurde unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten Applied Biosystems Modell 380B synthetisiert. Die Ligationsreaktion des 293 bp umfassenden synthetischen Monellin-Gens, des mit HpaI/SaII behandelten Vektors ptrp322 und des synthetischen HpaI/NdeI-Adapters wurde in Gegenwart von 10 ul an 20 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,5, 10 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT und 200 Einheiten T4-DNA-Ligase (N.E. Biolabs, Inc.) bei 14ºC über Nacht durchgeführt, wobei man ptrp322H MON-1 erhielt. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli W3110 (ATCC 27325) transformiert, und Ampicillin-resistente Klone wurden aufgenommen.

Beispiel 3 Herstellung von B-C-A

Eine über Nacht gezüchtete Kultur von 50 ul ptrp322H MON-1 in W3110 mit Luria-Brühe wurde in 5 ml M9-Medium mit einem Gehalt an 0,4% Casaminsäure, 10 ug/ml Vitamin B1, 40 ug/ml Ampicillin überimpft und bei 37ºC in einem temperaturgesteuerten Schüttelinkubator gezüchtet, bis OD650nm einen Wert von etwa 0,5 erreichte. Dann wurden 0,1 mg Indolylacrylsäure zu dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration von 50 ug/ml gegeben, und das Gemisch wurde weiter für etwa 8 Stunden inkubiert. Die gezüchteten Zellen wurden 5 Minuten bei 2500 U/min in einer Beckman-Zentrifuge J6 pelletiert. Laemmli-Protein-Sammelpuffer wurde zu dem Zellpellet gegeben. Anschließend wurde 5 Minuten auf 95ºC erwärmt, und das Protein wurde auf ein 15%-iges Laemmli SDS-Polyacrylamidgel (Laeinmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680-685) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 2,5 Stunden bei 300 durchgeführt. Das Gel wurde mit Coomassie-Brilliantblaufarbstoffangefärbt und zeigte ein Produkt mit dem richtigen Molekulargewicht. Das exprimierte Produkt wurde isoliert, und es wurde gezeigt, daß es einen süßen Geschmack aufwies.

Das Produkt wurde in Wasser gelöst und 5 Minuten auf 100ºC erwärmt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, und der Geschmack der Lösung wurde erneut festgestellt. Der süße Geschmack blieb nach dem Erwärmen und Abkühlen bestehen.

Beispiel 4 Reinigung von B-C-A

Die gezüchteten Zellen wurden in einem Puffer mit einem Gehalt an 0,01 m Natriumphosphat, pH-Wert: 7,2, 7 millimolar β-Mercaptoethanol, 1 millimolar EDTA, 25 ug/ml PMSF-Proteaseinhibitor mit Ultraschall behandelt. Die Probe wurde 15 Minuten bei 10 000 U/min in einem Sorvall SS34- Rotor bei 4ºC zentrifugiert. Der Extrakt wurde mit Puffer verdünnt. Die Probe wurde auf eine Sephadex CM-25-Säule aufgetragen, die mit 0,01 m Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,2 vorher äquilibriert worden war. Die Säule wurde 3 Stunden mit dem gleichen Puffer gewaschen. Das einkettige Monellin-Analogon wurde mit 0,01 m Phosphatpuffer plus 0,1 in NaCl eluiert. Nach Dialyse gegen Wasser wurde die Reinheit des Proteins durch Gelelektrophorese bestimmt. Gegebenenfalls wurde das Protein weiter mit Hilfe einer Affinitätssäule mit Sepharose C1-4B, die mit polyklonalen Monellin-Antikörpern beladen war, gereinigt.

Beispiel 5 Herstellung von alternativen B-C-As

Gemäß den vorstehenden Verfahren wurden modifizierte DNA-Sequenzen mit verschiedenen "C"-Verknüpfungssequenzen (zwischen den Nucleotiden 141 und 166 von Fig. 3) hergestellt, wie sie nachstehend angegeben sind.

Tyr-Glu-Asn-Arg-Glu-Asp-Ile-Lys,

Tyr-Ala-Ser-Asp-Lys und

Glu-Asp-Tyr-Lys-Thr-Arg.

Die verwendeten Codons waren die gleichen Codons, wie sie für das Konstrukt angegeben sind, das in Fig. 4 gezeigt ist.

Beispiel 6 Untersuchung der Süße

Die Süße des Produkts wurde unter Verwendung eines üblichen Geschmackstests bewertet. Ein Vergleich zur Süße von Saccharose wurde durch geeignete Verdünnungen auf der Grundlage des Gewichts durchgeführt. Erfindungsgemäße Verbindungen weisen mindestens die gleiche Süße wie Saccharose auf, wenn sie im Vergleich dazu etwa 1000-fach verdünnt sind.

In einem typischen Test wurden wäßrige Zuckerlösungen mit 1, 10, 25 und 50 mg/ml als Standardlösungen verwendet. Das minimale Gewicht der Testverbindung, die zu Wasser gegeben werden kann, so daß es für eine Testperson noch süß schmeckt, wird mit dem entsprechenden minimalen Gewicht an Saccharose verglichen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen erfordern nur die Zugabe einer Menge an Material, die etwa 100-fach geringer ist als bei Saccharose, z. B. 60 ug/ml Proteinlösung war so süß wie 50 mg/ml Zucker ("Lucky Supermarket's Lady Lee brand sugar").

Die Stabilität unter verschiedenen pH-Bedingungen wurde durch Auflösen von natürlichem Monellin (Worthington) und dem Produkt von Beispiel 4 in einer Konzentration von 100 ug/ml bei pH-Werten von 2, 4 und 6,3 gemessen. Jede Probe wurde 15 Minuten auf 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100ºC erwärmt. Anschließend ließ man sie auf Raumtemperatur abkühlen, bevor der Geschmack untersucht wurde. Der wichtigste Unterschied bestand darin, daß natürliches Monellin seine Süße verliert, wenn es bei einem pH-Wert von 2 auf 50ºC erwärmt und anschließend auf Raumtemperatur für den Geschmackstest abgekühlt wird, während das Produkt seine Süße selbst nach 5-minütigem Erwärmen auf 100ºC wiedergewann.


Anspruch[de]

1. Einkettige Proteinverbindung der Formel B-C-A mit süßen Eigenschaften, die mindestens dem 50-fachen der süßen Eigenschaften von Saccharose, bezogen auf das Gewicht, entsprechen,

worin B einen Peptidabschnitt darstellt, der weitgehend äquivalent zu den Resten 1-46 der B-Kette von nativem Monellin ist;

C ein hydrophiler, physiologisch verträglicher, kovalenter Linker ist, der in der Lage ist, eine Abstandslänge bereitzustellen, die einem Peptid mit 3 bis 10 Aminosäuren äquivalent ist; und

A ein Peptid darstellt, das weitgehend äquivalent zu den Resten 6- 45 der A-Kette von nativem Monellin ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die B-Kette folgende Sequenz aufweist:

oder in der das Met am Anfang fehlt.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin die A-Kette folgende Sequenz aufweist:

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin C ein hydrophiles oligomeres ist, das 9-30 Atome im verknüpfenden Segment enthält.

5. Verbindung nach Anspruch 4, worin C die Formel

A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10

aufweist, worin jeder der Rest A1-A3 einen Aminosäurerest darstellt und jeder der Reste A4-A10 einen Aminosäurerest darstellt oder nicht vorhanden ist, und worin ein Großteil der Aminosäurereste hydrophil ist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, worin die Aminosäurereste unter solchen Aminosäureresten ausgewählt sind, die von DNA codiert werden.

7. Verbindung nach Anspruch 5, worin A2, A4 und A6 saure Aminosäuren sind; A5 und A8 basische Aminosäuren sind; A3 eine polare neutrale Aminosäure ist; und A1 und A7 unpolare Aminosäuren sind und A9 und A10 fehlen.

8. Verbindung nach Anspruch 7, worin C die Formel Tyr-Glu-Asn-Glu- Arg-Glu-Ile-Lys aufweist.

9. Verbindung nach Anspruch 1, worin der kovalente Linker den B- und A-Ketten von Monellin im wesentlichen die native Konformation verleiht.

10. Verbindung nach Anspruch 1, die immunoreaktiv mit Antikörpern ist, die gegen Monellin erzeugt wurden.

11. Verbindung nach Anspruch 1, die immunoreaktiv mit Antikörpern ist, die gegen Thaumatin erzeugt wurden.

12. Verfahren, um Lebensmittelzusammensetzungen einen süßen Geschmack zu verleihen, daß das Einverleiben einer die Süße verstärkenden Menge der Verbindung nach Anspruch 1 in die Zusammensetzungen umfaßt.

13. Verfahren zur Stabilisierung der dreidimensionalen Konformation der B- und der A-Kette von Monellin, das das kovalente Binden einer Sequenz, die weitgehend äquivalent zu den Resten 1-46 der nativen B-Kette ist, an eine Sequenz, die weitgehend äquivalent zu den Resten 6-50 der nativen A-Kette ist, durch einen kovalenten Linker, der hydrophil, physiologisch verträglich und in seiner Länge einem Peptid mit 3-10 Aminosäuren äquivalent ist, umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem kovalenten Linker um ein Peptid handelt.

15. Synthetische oder rekombinante DNA, die für die Verbindung nach Anspruch 6 codiert.

16. Zur Expression der DNA nach Anspruch 15 wirksames Expressionssystem, das eine erste DNA umfaßt, die für eine Verbindung der Formel B- C-A codiert, die süße Eigenschaften aufweist, die mindestens dem 50-fachen der süßen Eigenschaften von Saccharose, bezogen auf das Gewicht, entsprechen,

worin B einen Peptidanteil darstellt, der weitgehend äquivalent zu den Resten 1-46 der B-Kette von nativem Monellin ist;

C ein Peptid von 3-10 Aminosäuren ist, die durch DNA codiert werden, und

A ein Peptid darstellt, das weitgehend äquivalent zu den Resten 6- 45 der A-Kette von nativem Monellin ist,

funktionell verknüpft an eine zweite DNA-Sequenz, die einen Promotor umfaßt, der in einem kompatiblen Wirt arbeitet, umfaßt.

17. Zur Herstellung einer Verbindung der Formel B-C-A mit süßen Eigenschaften, die mindestens dem 50-fachen der süßen Eigenschaften von Saccharose, bezogen auf das Gewicht, entsprechen, fähige Zelle,

worin B einen Peptidanteil darstellt, der weitgehend äquivalent zu den Resten 1-45 der B-Kette von nativem Monellin ist;

C ein Peptid von 3-10 Aminosäuren ist, die von DNA codiert werden; und

A ein Peptid darstellt, das weitgehend äquivalent zu den Resten 6- 45 der A-Kette von nativem Monellin ist,

wobei die Zelle mit einem Expressionssystem nach Anspruch 16 transformiert worden ist.

18. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel B-C-A mit süßen Eigenschaften, die mindestens dem 50-fachen der süßen Eigenschaften von Saccharose, bezogen auf das Gewicht, entsprechen,

worin B einen Peptidanteil darstellt, der weitgehend äquivalent zu den Resten 1-46 der B-Kette von nativem Monellin ist;

C ein Peptid mit 3-10 Aminosäuren ist, die von DNA codiert werden, und

A ein Peptid darstellt, das weitgehend äquivalent zu den Resten 6- 45 der A-Kette von nativem Monellin ist, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

Züchten von Zellen nach Anspruch 17,

Aussetzen der Zellen den Bedingungen, die eine Funktion des Expressionssystems begünstigen, und

Gewinnung der Verbindungen aus der Kultur.

19. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel B-C-A mit süßen Eigenschaften, die mindestens dem 50-fachen der süßen Eigenschaften von Saccharose, bezogen auf das Gewicht, entsprechen,

worin B ein Peptidanteil darstellt, der weitgehend äquivalent zu den Resten 1-46 der B-Kette von nativem Monellin ist;

C ein hydrophiler physiologisch verträglicher kovalenter Linker ist, der in der Lage ist, eine Abstandslänge bereitzustellen, die äquivalent zu einem Peptid mit 3-10 Aminosäuren, die von DNA codiert werden, ist; und

A ein Peptid darstellt, das weitgehend äquivalent zu den Resten 6- 45 der A-Kette von nativem Monellin ist, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

a) Herstellung geschützter Peptide, die an feste Träger gebunden sind, wobei das eine Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie für B angegeben wurde, und das andere Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie für A angegeben wurde,

b) Entfernen des festen Trägers von den Peptiden und Entfernen der Schutzgruppen von den Peptiden; und

c) Verknüpfen der Peptide B und A mit dem kovalenten Linker C, um B-C-A zu erhalten.







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