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DIAGNOSEVERFAHREN FÜR LEBERKREBS. - Dokument DE3850962T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE3850962T2 22.12.1994
EP-Veröffentlichungsnummer 0339097
Titel DIAGNOSEVERFAHREN FÜR LEBERKREBS.
Anmelder Fuji Yakuhin Kogyo K.K., Takaoka, Toyama, JP
Erfinder INOUE, Kyoichi, Toyama-shi Toyama 930, JP;
ICHIDA, Takafumi, Toyama-shi Toyama 930, JP;
MIYAGIWA, Miki 102, Purejirusuwa, Toyama-shi Toyama 930, JP;
HAYAKAWA, Taro, Nagoya-shi, Aichi-ken, 468, JP;
KODAMA, Shuji, Takaoka-shi Toyama 933, JP;
IWATA, Kazushi, Takaoka-shi Toyama 933, JP
Vertreter Tauchner, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Heunemann, D., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Rauh, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Hermann, G., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Schmidt, J., Dipl.-Ing.; Jaenichen, H., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte; Tremmel, H., Rechtsanw., 81675 München
DE-Aktenzeichen 3850962
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 28.10.1988
EP-Aktenzeichen 889093894
WO-Anmeldetag 28.10.1988
PCT-Aktenzeichen JP8801103
WO-Veröffentlichungsnummer 8903997
WO-Veröffentlichungsdatum 05.05.1989
EP-Offenlegungsdatum 02.11.1989
EP date of grant 03.08.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.12.1994
IPC-Hauptklasse G01N 33/573
IPC-Nebenklasse G01N 33/577   G01N 33/574   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Leberkrebs durch Messung der Kollagenase- Inhibitormenge. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Durchführung der Diagnose von Leberkrebs mittels eines Sandwich-Enzym-Immuntests auf den menschlichen Kollagenase-Inhibitor unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gegen den Rinder-Kollagenase-Inhibitor (Gewebe- Inhibitoren von Metalloproteinasen: TIMP) ausgehend von der Tatsache, daß die Kollagenase-Inhibitormenge in Seren, Plasma oder synovialen Flüssigkeiten von Patienten mit Leberkrebs deutlich höher als die Kollagenase-Inhibitormenge in Seren, Plasma bzw. synovialen Flüssigkeiten von normalen Individuen ist. Der vorstehend beschriebene Enzym-Immuntest wird in einem Verfahren zur Bestimmung des Kollagenase- Inhibitors verwendet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zwei verschiedene monoclonale Antikörper verwendet werden, die an unterschiedliche antigene Determinanten des Kollagenase-Inhibitors spezifisch binden, wobei ein Antikörper an einen festen Träger gebunden und ein Antikörper mit einem Enzym markiert ist.

Technischer Hintergrund

Es ist bekannt, daß Kollagenase-Inhibitor in menschlichen und tierischen Knochen, Häuten, Zahnmark, amniotischen Flüssigkeiten, Blut und Synovialflüssigkeiten, sowie in Kulturen von Gelenk-Chondrozyten, synovialen Zellen, von verschiedenen Geweben stammenden Fibroblasten und fibrosarkomartigen Zellen vorhanden ist. Als Mittel zur Bestimmung der Kollagenase-Inhibitormenge sind bisher Verfahren bekannt gewesen, die auf der Messung seiner biologischen Aktivität beruhen. Wie von Eisen et al., in J. Lab. Clin. Med. 75 (1973), 258-263, sowie von Cawston et al., in Arthritis and Rheumatism 27 (1984) , 285-290, beschrieben ist, ist es jedoch mit den zuvor bekannten Bestimmungsverfahren unmöglich, Seren, Plasma oder Synovialflüssigkeiten auf Aktivität des Kollagenase-Inhibitors zu testen, da in solchen Flüssigkeiten die Messung störende Proteine, beispielsweise α&sub2;-Macroglobulin, vorhanden sind. Hayakawa, Iwata et al., haben bereits unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gegen den Rinder-Kollagenase- Inhibitor einen Enzym-Immun-Sandwichtest (EIA) entwickelt, ein Verfahren, mit dem der Kollagenase-Inhibitor in sehr geringen Probenmengen in einer genauen, einfachen und schnellen Weise spezifisch gemessen werden kann (japanische Patentanmeldung Nr. Sho 62-42781). In der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß sich anscheinend die in menschlichen Seren, Plasmen oder synovialflüssigkeiten vorhandene Kollagenase- Inhibitormenge im Zusammenhang mit einer Erkrankung an Leberkrebs erhöht, und es wurde festgestellt, daß es möglich ist, durch Bestimmung der Kollagenase-Inhibitormenge in Seren, Plasmen oder Synovialflüssigkeiten unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Enzym- Immuntests eine Diagnose von Leberkrebs durchzuführen.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wurde ausgehend von den vorstehend beschriebenen Erkenntnissen durchgeführt und stellt ein Verfahren zur Diagnose von Individuen auf ein Leberkrebsleiden bereit, das die Durchführung eines Enzym- Immuntests durch das Sandwich-Verfahren mittels zwei verschiedener monoclonaler Antikörper umfaßt, die an unterschiedliche antigene Determinanten des Rinder-Kollagenase- Inhibitors spezifisch binden, wobei ein Antikörper an einen Festphasen-Träger gebunden und ein Antikörper mit einem Enzym markiert ist, um die in Seren, Plasmen oder Synovialflüssigkeiten vorhandene Menge an menschlichem Kollagenase- Inhibitor zu messen, und den Vergleich der gemessenen mit der bei normalen Individuen festgestellten Menge.

BALB/c-Mäuse wurden durch intraperitoneale Verabreichung einer Lösung immunisiert, die Kollagenase-Inhibitor enthielt, der aus Kulturmedien gewonnen wurde, in denen Rinder-Zahnmark gezüchtet wurde, und die Milzzellen anschließend aus den Mäusen entfernt. Die Milzzellen wurden mit 8-Azaguanin-resistenten NS-1-Myelomzellen in einem Verhältnis von 5 : 1 gemischt und zum Erhalt von Hybridomen in 50 % Polyethylenglycol 4000 fusioniert. Die Hybridome wurden in 96 Vertiefungen enthaltenden Mikrotiterplatten aus Polystyrol verteilt, so daß 6,0 · 10&sup5; Zellen in jeder Vertiefung vorhanden waren, und anschließend in einem HAT-Kulturmedium gezüchtet. Das Kulturmedium in jeder Vertiefung wurde durch einen Festphasen-Antikörperbindungstest (ELISA) auf Herstellung von Antikörpern gegen den Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark überprüft, und die Hybridome in den als positiv getesteten Vertiefungen wurden durch das Verfahren der begrenzenden Verdünnung cloniert. Als Ergebnis wurden siebzehn monoclonale Antikörper produzierende Clone erhalten, die monoclonale Antikörper gegen den Kollagenase- Inhibitor aus Rinder-Zahnmark produzieren konnten. Jeder Hybridom-Clon wurde BALB/c-Mäusen intraperitoneal verabreicht, um monoclonale Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeiten zu erhalten. Aus den Ascitesflüssigkeiten wurden die monoclonalen Antikörper durch fraktionierendes Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionenaustausch-Chromatographie mit DEAE-Sephacel, Gelfiltration auf Sephacryl S-300- Superfine etc. gereinigt. Es wurde festgestellt, daß sämtliche siebzehn so gereinigten monoclonalen Antikörper eine spezifische Kreuzreaktion mit dem Rinder-Kollagenase- Inhibitor zeigten, und es wurde durch Western-Blotting gezeigt, daß vier von ihnen, d. h., IgG (Clon 7-6C1), IgG (Clon 7-19F6), IgG (Clon 7-21B12) und IgG (Clon 7-23G9) auch mit dem menschlichen Kollagenase-Inhibitor reagierten.

Eine sehr geringe menschliche Kollagenase-Inhibitormenge (1,5 pg) konnte unter Durchführung eines Sandwich-EIAs mit zwei von vier derartigen monoclonalen Antikörpern spezifisch und genau gemessen werden, wobei IgG (Clon 7-23G9) als Festphasen-Antikörper und IgG (Clon 7-6C1) als markierter Antikörper in Form von aus ihm hergestelltem Fab' (Clon 7- 6Cl)-POD verwendet wurden. Dieses Sandwich-Verfahren wurde zur Messung der Kollagenase-Inhibitormenge in fünfzig Serumproben von normalen Individuen verwendet, wobei festgestellt wurde, daß 184 ± 30 ng Kollagenase-Inhibitor in 1 ml Serum vorhanden waren. Andererseits waren die durchschnittlichen Kollagenase-Inhibitormengen, die in einhundert Serumproben von Patienten mit Krebs der Leberzellen und in drei Proben von Patienten mit metastatischem Leberkrebs vorhanden waren, 486 ± 316 ng bzw. 1172 ± 712 ng pro ml Serum, und diese Mengen sind im Vergleich zu den in Seren von normalen Individuen festgestellten Mengen deutlich erhöht. Im Gegensatz dazu waren die durchschnittlichen Kollagenase-Inhibitormengen, die in 46 Serumproben von Patienten mit Leberzirrhose, in 45 Proben von Patienten mit chronischer aktiver Hepatitis und in 26 Proben von Patienten mit chronischer inaktiver Hepatitis vorhanden waren, 228 ± 163 ng, 233 ± 88 ng bzw. 166 ± 73 ng pro ml Serum, und zeigten somit im Vergleich zu den in Seren von normalen Individuen festgestellten Mengen keinen signifikanten Unterschied. Es ist so festgestellt worden, daß es angesichts von spezifisch erhöhten Serum-Kollagenase-Inhibitormengen bei Patienten mit Leberkrebs im Vergleich zu den Mengen bei Patienten mit anderen Leberstörungen möglich ist, durch Messung des Kollagenase-Inhibitors im Serum eines Patienten eine Diagnose auf ein Leberkrebsleiden zu stellen. Während ferner die in 26 Plasmaproben von normalen Individuen vorhandene Kollagenase-Inhibitormenge 64 ± 10 ng pro ml Plasma war, wiesen die in acht Proben von Patienten mit Krebs der Leberzellen 583 ± 447 ng pro ml Plasma auf, womit eine deutlich erhöhte Menge im Vergleich zu der im Plasma bei normalen Individuen sichtbar wird.

Das Auftreten einer erhöhten Kollagenase-Inhibitormenge im Serum oder Plasma kann nicht nur bei Patienten mit Leberkrebs, sondern auch bei Patienten mit rheumatischer Arthritis beobachtet werden. Dementsprechend ist es durch Messung des Kollagenase-Inhibitors im Serum in Kombination mit Leberfunktionstests, beispielsweise dem ZTT (Zinksulfat- Trübungstest), GOT (Glutamin-Oxalacetat-Transaminase), GPT (Glutamin-Pyruvat-Transaminase), ALP (alkalische Phosphatase), LDK (Lactat-Dehydrogenase), γ-GTP (γ-Glutamyltranspeptidase), PH (Prolin-Hydroxylase) und AFP (α- Fetoprotein), möglich, zu diagnostizieren, ob das Individuum an Leberkrebs leidet.

In dem vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäß verwendeten Enzym-Immuntest können verschiedene Materialien, beispielsweise Polystyrole, Polycarbonate, Polypropylene oder Polyvinyle, in allen Verwendungsformen, die passiv Antigene oder Antikörper adsorbieren, zur Verwendung als feste Träger in Form von Kügelchen, Microtiterplatten, Stäbchen oder Teströhrchen gewählt werden. Als Antikörper, der mit einem Enzym markiert werden soll, kann eine IgG- Fraktion verwendet werden, die durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung eines Antikörper enthaltenden Materials erhalten werden kann, wobei sie anschließend auf einem Ionenaustauschgel, beispielsweise DEAE-Sephacel, gereinigt wird, sowie ein Fab'-Fragment, das spezifisch mit einem Antigenmolekül reagiert und durch Pepsin-Spaltung des Antikörpers mit einer anschließenden Reduktion erhalten werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll, wie vorstehend beschrieben, eine Diagnose auf ein Leberkrebsleiden eines Individuums ermöglichen, indem eine quantitative Messung des menschlichen Kollagenase-Inhibitors auf der Grundlage eines Enzym-Immuntests durchgeführt wird, mittels einer Kombination aus zwei monoclonalen Antikörpern, die an unterschiedliche antigene Determinanten des Kollagenase-Inhibitors spezifisch binden, wobei ein Antikörper an einen Festphasen- Träger gebunden und ein Antikörper mit einem Enzym markiert ist, wonach das Ergebnis mit Werten für normale Individuen verglichen wird.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mittels der nachstehend beschriebenen Beispiele genauer erläutert, es versteht sich jedoch, daß diese Erfindung nicht darauf beschränkt ist.

Beispiel 1 Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen den Rinder-Kollagenase-Inhibitor (a) Herstellung des Rinder-Kollagenase-Inhibitor-Antigens

Entsprechend dem in J. Biochem. 96 (1984), 395-404, beschriebenen Verfahren wurde der Kollagenase-Inhibitor aus den Kulturmedium unter Verwendung von Con A-Sepharose-, Ultrogel AcA 44- und DE-52-Cellulose-Säulen gereinigt, nachdem er durch Züchtung des Rinder-Zahnwurzelmarks von nichtdurchgebrochenen Weisheitszähnen in Eagle-MEM-Medium (Nissui Seiyaku) erhalten worden war. Bei einer Untersuchung durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gemäß dem von Laemmli et al. in J. Mol. Biol. 80 (1973), 579-599, beschriebenen Verfahren zeigte der gereinigte Inhibitor eine einzige Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 32 000 Dalton (D).

(b) Herstellung von Antikörper produzierenden Zellen

Zwei 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden zunächst intraperitoneal mit 48 ug in 0,4 ml Emulsion aus vorstehend in (a) beschriebenem, gereinigtem Rinder-Kollagenase-Inhibitor in komplettem Freundschem Adjuvans immunisiert. Die Mäuse erhielten anschließend nach 30 Tagen eine Auffrischungsimpfung mit 84 ug des in Kochsalzlösung gelösten Rinder-Kollagenase-Inhibitors. Die Mäuse erhielten als letzte Immunisierung nach 58 Tagen eine weitere Auffrischungsimpfung durch intraperitoneale Verabreichung von 95 ug Inhibitor in 500 ul Kochsalzlösung. Am dritten Tag nach der letzten Immunisierung wurde die Milz entfernt, und die Milzzellen wurden präpariert.

(c) Zellfusion

(I) Die verwendeten Materialien und Verfahren sind nachstehend beschrieben:

RPMI-1640-Kulturmedium: RPMI-Nr. 1640 (Difco-Laboratories), dem Natriumbicarbonat (12 mM), Natriumpyruvat (1 mM) , L-Glutamin (2 mM), Penicillin G-Natrium (50 E/ml), Streptomycinsulfat (50 ug/ml) und Amikacinsulfat (100 ug/ml) zugesetzt sind, das mit Trockeneis auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und durch einen 0,2 um Toyo-Membranfilter steril filtriert worden ist.

NS-1-Kulturmedium: vorstehend beschriebenes, sterilfiltriertes, mit 15% (Vol./Vol.) fötalem Rinderserum (M. A. Bioproducts) versetztes RPMI-1640-Kulturmedium.

PEG 4000-Lösung: 50% (Gew./Gew.) Polyethylenglycol 4000 (PEG 4000, Merck & Co., Inc.) enthaltendes, Serumfreies RPMI-1640-Kulturmedium.

Unter Verwendung einer gegen 8-Azaguanin resistenten Myelomzellinie, NS-1 (P3-NSI-1), wurde gemäß einem leicht modifizierten Verfahren von Oi et al., das in "Selected Methods in Cellular Immunology" (Hrsg. B. B. Mishell und S. M. Shiigi, W. H. Freeman and Company (1980), 351-372) beschrieben ist, eine Zellfusion durchgeführt.

(2) Die vorstehend in (b) beschriebenen Karyo- Splenocyten (100% lebensfähige Zellen) wurden in einem Verhältnis von 5 zu 1 mit Myelomzellen (100% lebensfähige Zellen) fusioniert. Zu diesem Zweck wurden die Splenocyten und die Myelomzellen in RPMI-1640-Kulturmedium getrennt gewaschen, anschließend im gleichen Medium suspendiert und zur Fusion im vorstehend beschriebenen Verhältnis vermischt. 40 ml RPMI-1640-Kulturmedium wurden in ein konisches 50 ml- Teströhrchen aus Styrolharz (Iwaki Glass) gegeben, 10 Min. mit 400 · g zentrifugiert, und der Überstand durch Absaugen vollständig verworfen. Den ausgefällten Zellen wurden 1 Min. lang tröpfchenweise unter leichtem Rühren 1,3 ml der auf 37ºC erwärmten PEG-4000-Lösung zugesetzt. Die Zellen wurden resuspendiert und eine weitere Minute durch Rühren dispergiert. Der Suspension wurden anschließend 1 Min. lang tröpfchenweise 1,3 ml des auf 37ºC erwärmten RPMI-1640- Kulturmediums zugesetzt. Nach der einmaligen Wiederholung des gleichen Verfahrens wurden die Zellen dispergiert, indem 9 ml des gleichen Kulturmediums 2 bis 3 Minuten tröpfchenweise unter kontinuierlichem Schütteln zugesetzt wurden. Die Dispersion wurde 10 Min. mit 400 · g zentrifugiert und der Überstand durch Absaugen vollständig verworfen. Den ausgefällten Zellen wurden unmittelbar anschließend 12,9 ml auf 37ºC erwärmtes NS-1-Kulturmedium zugesetzt und anschließend große Zellklumpen durch sorgfältiges Pipettieren mit einer 10 ml Pipette dispergiert. Die Dispersion wurde mit 26 ml des gleichen Kulturmediums verdünnt und in 96 Vertiefungen enthaltenden Mikrotiterplatten aus Polystyrol (Iwaki Glass) verteilt, so daß 6,0 · 10- Zellen/0,1 ml in jeder Vertiefung vorhanden waren. Die 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatten wurden in einem CO&sub2;-Inkubator vorbereitend über Nacht bei 37ºC mit 0,2 ml NS-1-Kulturmedium behandelt und das Kulturmedium wurde unmittelbar vor der Verwendung durch Absaugen daraus gewonnen. Nach dem Auftragen der Zellen wurden die Mikrotiterplattenvertiefungen bei 37ºC bei 100% Luftfeuchtigkeit in 7% CO&sub2;/93% Luft gezüchtet.

(d) Selektive Vermehrung von Hybridomen mittels eines selektiven Kulturmediums

(1) Die verwendeten Kulturmedien sind wie nachstehend beschrieben:

HAT-Selektionsmedium: vorstehend in (c) beschriebenes, mit Hypoxanthin (100 uM), Aminopterin (0,4 uM) und Thymidin (16 uM) versetztes NS-1-Kulturmedium.

HT-Kulturmedium: mit der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehend beschriebene HAT-Medium, abgesehen davon, daß Aminopterin nicht enthalten ist.

(2) Ein Tag nach Beginn der vorstehend in (c) beschriebenen Züchtung (d. h., am ersten Tag) wurden zwei Tropfen (ca. 0,1 ml) HAT-Kulturmedium mit einer Pasteur- Pipette zugesetzt. Am 2., 3., 5., 8. und 11. Tag wurde die Hälfte (0,1 ml) jedes Kulturmediums durch frisches HAT- Kulturmedium ersetzt. Am 14. Tag wurde die Hälfte jedes Kulturmediums durch frisches HT-Kulturmedium ersetzt. Danach wurde der Ersatz der Hälfte jedes Kulturmediums durch frisches HT-Kulturmedium in Abständen von 3 bis 4 Tagen wiederholt. Üblicherweise wurde in 2 bis 3 Wochen ein ausreichendes Wachstum von Hybridomen beobachtet. Sämtliche Vertiefungen, die gewachsene Hybridome enthielten, wurden auf positive Vertiefungen getestet, wobei ein Festphasen- Antikörper-Bindungstest (ELISA) verwendet wurde, wie es nachstehend unter (e) beschrieben ist. Sämtliche Kulturen, die im vorstehend beschriebenen Test positive Hybridome enthielten, wurden in eine 24 Vertiefungen aufweisende Mikrotiterplatte aus Polystyrol (Iwaki Glass) transferiert, die 1 ml HT-Kulturmedium mit 10&sup7; Maus-Thymocyten als "feeder" enthielten. Die Kulturen wurden, wie vorstehend unter (c) beschrieben, etwa eine Woche bei 37ºC in 7% CO&sub2; gezüchtet. Ein- oder zweimal während der Züchtungszeit wurden 0,5 ml des Überstands jeder Vertiefung durch 0,5 ml frisches HT-Kulturmedium ersetzt. Bei Feststellung eines ausreichenden Wachstums von Hybridomen wurden die Kulturen durch das ELISA-Verfahren erneut auf Positivität getestet und einer Clonierung unter Verwendung des Verfahrens der begrenzenden Verdünnung unterzogen, wie es nachstehend unter (f) erläutert ist. Die restliche Kultur wurde nach der Clonierung zur Herstellung einer gefrorenen Probe zur Aufbewahrung in 25 cm² Gewebekulturflaschen aus Polystyrol (Iwaki Glass) transferiert.

(e) Absuchen nach Hybridomen. die anti-Rinder-Kollagenase- Inhibitor-Antikörper produzieren können, mittels eines Festphasen-Antikörperbindungstests (ELISA)

Das im vorliegenden Beispiel verwendete Verfahren war eine geringfügige Modifikation des Verfahrens von Rennard et al., das in Anal. Biochem. 104 (1980), 205-214, beschrieben ist, das zum Nachweis der Antikörper-Produktion in Hybridomen geeignet ist. Jede Vertiefung einer 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte (Flow Laboratories, Inc.) wurde mit 0,5 bis 1,0 ug Rinder-Kollagenase-Inhibitor beschichtet, und die unbeschichtet gebliebenen Vertiefungen wurden mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Den Vertiefungen wurde ein Teil des Überstands aus den Vertiefungen zugesetzt, die Hybridome enthielten, die, wie vorstehend unter (d) erhalten, gezüchtet worden waren. Die Inkubation wurde etwa 1 Std. bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem als zweiter Antikörper Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin (Cappel Lab.), das mit Meerrettich-Peroxidase markiert war, zugesetzt worden war, wurde erneut etwa 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Tiefe der braunen Farbe, die nach Zugabe von H&sub2;O&sub2; und o-Phenylendiamin als Substrat produziert wurde, wurde mit bloßem Auge qualitativ beurteilt oder durch Messung der Absorption bei 500 nm unter Verwendung eines mit zwei Wellenlängen messenden Corona-Mikrot iterplatten- Spektrophotometers (MTP-22, Corana Electric) bestimmt.

(f) Clonierung

Zum Erhalt von Hybridomen, die monoclonale Antikörper produzieren können, muß das Clonieren im Anschluß an das vorstehend unter (d) beschriebene Verfahren gemäß dem Verfahren der begrenzenden Verdünnung durchgeführt werden, da in jeder Vertiefung zwei oder mehr Hybridomarten erzeugt werden können. Ein Clonierungs-Kulturmedium, das 10&sup7; Mausthymocytenzellen pro ml als "feeder" in NS-1 Kulturmedium enthielt, wurde hergestellt. 5, 1 bzw. 0,5 ml Hybridome/Vertiefung wurden 36, 36 bzw. 24 Vertiefungen einer 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte zugesetzt. Etwa 0,1 ml NS-1-Kulturmedium wurden am 5. und 12. Tag außerdem jeder Vertiefung zugesetzt. Etwa 14 bis 15 Tage nach der Clonierung, wenn ausreichendes Hybridomenwachstum festgestellt werden konnte, wurde mit den Züchtungsgruppen, in der mehr als 50% der Vertiefungen keine Koloniebildung zeigten, ein ELISA durchgeführt. Wenn sich nicht alle der getesteten Vertiefungen als positiv erwiesen, wurden die Kolonien in Antikörper-positiven Vertiefungen aufgelistet und von ihnen 4 bis 6 Vertiefungen, die eine einzige Kolonie bildeten, zur erneuten Clonierung ausgewählt. Schließlich wurden 17 Hybridomclone erhalten, die einen monoclonalen Antikörper gegen den Rinder-Kollagenase-Inhibitor produzieren können.

(g) Vermehrung von monoclonalen Antikörpern in vitro und in vivo

Die monoclonalen Antikörper wurden in einer üblichen Weise vermehrt. Dementsprechend konnten sie aus dem Überstand eines geeigneten Kulturmediums erhalten werden, beispielsweise des Ns-1-Kulturmediums, in dem jedes der erhaltenen Hybridome gezüchtet wurde (in vitro-Vermehrung) (Die Konzentration des Proteins des monoclonalen Antikörpers war 10 bis 100 ug/ml). Wenn eine große Antikörpermenge hergestellt werden soll, wird dagegen eine in vivo-Vermehrung, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt. Ein karzinogenes Reizmittel, "Pristane" (2, 6,10,14-Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemical), wurde in einem Volumen von 0,5 ml pro Tier intraperitoneal an Tiere (BALB/c-Mäuse) verabreicht, wobei die Tiere von dem Stamm abstammten, aus dem die Splenocyten und die Myelomzellen erhalten wurden. 1 bis 3 Wochen nach der Verabreichung wurden 1 · 10&sup7; Zellen von jedem Hybridom, wie vorstehend beschrieben, intraperitoneal verabreicht und die Ascitesflüssigkeiten, die 4 bis 7 mg/ml des monoclonalen Antikörpers enthielten, wurden nach 1 bis 2 Wochen erhalten.

(h) Isotypen von monoclonalen Antikörpern

Zunächst wurde jede der vorstehend unter (g) erhaltenen Ascitesflüssigkeiten an eine Mikrotiterplatte gebunden, die gemäß dem vorstehend beschriebenen ELISA-Verfahren mit Rinder-Kollagenase-Inhibitor beschichtet worden war. Nach Waschen mit PBS wurden Isotyp-spezifische Kaninchen-anti- Maus-Ig-Antikörper (Zymed Laboratories) zugesetzt. Nach Waschen mit PBS wurden zum Nachweis ein mit Meerrettich- Peroxidase markierter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (H + L)- Antikörper, 2,2'-Azinodi(3-ethylbenzothiazolinsulfat-6) als Substrat und anschließend Wasserstoffperoxid zugesetzt. Die Ergebnisse sind zusammen in der hier nachstehend aufgeführten Tabelle 1 dargestellt. Es wurde festgestellt, daß unter den erhaltenen monoclonalen Antikörpern gegen den Rinder-Kollagenase-Inhibitor fünfzehn Antikörper waren, die die Immunglobulinkette γ1/K enthielten, ein Antikörper enthielt γ2a/K und ein Antikörper γ2b/K.

(i) Reinigung des monoclonalen Antikörpers

Jede der vorstehend unter (g) erhaltenen Ascitesflüssigkeiten wurde mit Ammoniumsulfat (40% Sättigung) fraktioniert und anschließend zur Abtrennung einer nicht adsorbierenden Fraktion auf DEAE-Sephacel (Pharmacia) gegeben, das mit einer 40 mM 0,06 M NaCl enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH-Wert 8,0) äquilibriert worden war. Diese IgG-Fraktion wurde auf einer Sephacryl-S-300-Superfine (Pharmacia)-Säule gelfiltriert, die mit einer 50 mM 0,42 M NaCl enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4) äquilibriert worden war, wobei FCS aus dem Kulturmedium und Mausproteine abgetrennt und entfernt wurden.

Beispiel 2 Reaktivität zwischen dem Kollagenase-Inhibitor aus Rinder- Zahnmark und monoclonalen Antikörpern (a) Herstellung von Enzym-markierten monoclonalen Antikörpern (Fab'-POD-Konlugate) (1) Herstellung der Fab'-Fraktion

Die in Beispiel 1 (i) erhaltene IgG-Fraktion wurde in einer 0,1 M NaCl enthaltenden 0,1 M Acetatpufferlösung, pH- Wert 4,2, gelöst und die Lösung, wie nachstehend beschrieben, mit Pepsin gespalten. Dementsprechend wurde der Fraktion ausgehend vom darin enthaltenen IgG 2% (Gew./Gew.) Pepsin zugesetzt und das Gemisch 24 Std. bei 37ºC gespalten. Das gespaltene Produkt wurde zur Beendigung der Spaltungsreaktion mit einer 2 M Tris-Lösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Das Produkt wurde zum Erhalt einer F(ab')&sub2;-Fraktion auf einer Ultrogel-AcA-44-Säule (LKB) gelfiltriert, die mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,0) eingestellt war.

Die F(ab')&sub2;-Fraktion wurde gegen eine Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltende 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,0) dialysiert und Aminoethanthiol (MEA) zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt, um 1,5 Std. bei 37ºC eine Reduktion zu bewirken. Das Produkt wurde auf einer Ultrogel-AcA-44-Säule gelfiltriert, die mit einer 0,1 M 5 mM EDTA enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,0) äquilibriert war, um die Fab'-Fraktion zu erhalten.

(2) Herstellung der Maleimid-markierten POD-Fraktion

Getrennt vom unter (1) vorstehend beschriebenen Verfahren wurde Meerrettich-Peroxidase (POD), wie nachstehend beschrieben, mit einer Maleimid-Verbindung markiert. Dazu wurde die POD in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,0) zu 10 mg/ml gelöst, und der Lösung wurden zur 30- minütigen Umsetzung bei 30ºC 25 Mol N-(ε-Maleimidocaproyloxy)succinimid (EMCS) pro Mol POD als Lösung in Dimethylformamid zugesetzt. Das Produkt wurde auf einer Sephadex G-50-Säule gelfiltriert, die mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,0) äquilibriert war, wobei eine Maleimid-markierte POD-Fraktion erhalten wurde.

(3) Herstellung einer Fab'-POD-Konjugat-Fraktion

Die vorstehend unter (1) und (2) hergestellten Fraktionen wurden so vermischt, daß äquimolare Mengen Fab' und Maleimid-markierte POD der jeweiligen Fraktionen gemischt wurden. Das Gemisch wurde anschließend mit einer 0,1 M 5 mM EDTA enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,0) zu einer sich sowohl auf Fab' als auch auf die Maleimidmarkierte POD beziehende Endkonzentration von 100 uM verdünnt. Nach einer 20-stündigen Umsetzung bei 4ºC wurden 10 Mol N-Ethylmaleimid pro Mol Fab' zugesetzt, um nicht umgesetzte Thiol-Gruppen zu blockieren. Das Produkt wurde auf einer Ultrogel-AcA-44-Säule gelfiltriert, die mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,5) äquilibriert war, um die Fab'-POD-Konjugatfraktion zu erhalten, der 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,005% Thimerosal zur Aufbewahrung bei 4ºC zugesetzt wurden.

(b) Western-Blotting

Mit dem in Beispiel 1 (a) gereinigten Kollagenase- Inhibitor aus Rinder-Zahnmark wurde eine SDS-PAGE und anschließend ein Western-Blotting gemäß dem Verfahren von Tanabe, wie in "Saibo Kogaku" (Cell Technology) 1 & 2, (1983), 1061-1068, beschrieben, unter Verwendung von im Handel erhältlichem POD-markiertem Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin und der Fab'-POD-Konjugate, die vorstehend in Beispiel 2 (a) erhalten wurden, durchgeführt, wobei Muster durch eine Enzym-Antikörper-Anfärbung erhalten wurden. Diese Muster sind in Fig. 1 dargestellt. In Fig. 1 zeigen A und B die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn eine Nitrocellulosemembran im Anschluß an das Western-Blotting mit in Beispiel 2 (a) erhaltenen Fab'-(Clon 7-3F1)-PQD- bzw. Fab' (Clon 7-21B12)-POD-Konjugaten immunologisch angefärbt wurde.

Die Zahlen 1 bis 16 zeigen ferner die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn eine Nitrocellulosemembran im Anschluß an das Western-Blotting mit jedem der nachstehend aufgeführten, gelösten monoclonalen Antikörper (sämtliche vom IgG-Typ) getränkt und anschließend erneut mit POD-markiertem Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin (Cappel Laboratories) immunologisch angefärbt wurde:

1: Clon 7-3F1

2: Clon 7-4F2

3: Clon 7-SAI

4: Clon 7-6C1

5: Clon 7-7F11

6: Clon 7-8B2

7: Clon 7-9B4

8: Clon 7-IOEII

9: Clon 7-11A5

10: Clon 7-12B6

11: Clon 7-15E8

12: Clon 7-18F3

13: Clon 7-19F6

14: Clon 7-20C2

15: Clon 7-21B12

16: Clon 7-23G9

Wie aus Fig. 1 zu ersehen ist, wurde festgestellt, daß sämtliche vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper eine Reaktivität mit dem Kollagenase-Inhibitor aus Rinder- Zahnmark aufwiesen.

Beispiel 3 Sandwich-Enzym-Immuntest (a) Herstellung von mit monoclonalen Antikörpern beschichteten Kügelchen

Gemäß dem Verfahren von Ishikawa et al., wie es in J. Immunoassay 4 (1983), 209-327, beschrieben ist, wurde der in Beispiel 1 (i) erhaltene monoclonale Antikörper in einer 0,1 M 0,1% Natriumazid enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH- Wert 7,5) gelöst. Die Lösung des monoclonalen Antikörpers wurde auf eine Konzentration von 100 ug/ml (A&sub2;&sub8;&sub0;=0,15) eingestellt, in ihr Polystyrolkügelchen (6,5 mm im Durchmesser, Precision Plastic Ball) eingeweicht und 24 Std. bei 4ºC stehengelassen. Nach der Entfernung der Lösung des monoclonalen Antikörpers wurden die Kügelchen fünfmal mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,0), die 0,1 -% BSA, 0,1 % NaCl und 0,1% Natriumazid (hier nachstehend der Kürze wegen als Puffer A bezeichnet) gewaschen und anschließend zur Aufbewahrung bei 4ºC in Puffer A getränkt.

(b) Sandwich-Test

Eine Lösung des gereinigten Kollagenase-Inhibitors oder eine einen Kollagenase-Inhibitor enthaltende Probenlösung wurden mit 1% BSA enthaltem Puffer A verdünnt und ein 300 ul Aliquot einer verdünnten Lösung in jedes Teströhrchen gegeben. Nach Zugabe eines unter (a) vorstehend hergestellten mit Antikörper beschichteten Kügelchens wurde das Teströhrchen 1 Std. bei 37ºC unter Schütteln erwärmt (erste Umsetzung) und anschließend dreimal mit jeweils 3 ml Portionen einer 10 mM 0,1 M NaCl enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,0) gewaschen. Das in Beispiel 2 (a) hergestellte Fab'-POD-Konjugat wurde mit einer 10 mM 0,1% BSA und 0,1 M NaCl enthaltenden Phosphatpufferlösung (pH- Wert 7,0) auf 20 ng/Röhrchen verdünnt und anschließend unter Schütteln 1 Std. bei 30ºC erwärmt (zweite Umsetzung). Nach Beendigung der Umsetzung wurde in der gleichen Weise wie nach Beendigung der ersten Umsetzung gewaschen. 0,3 ml eines in einer 0,1 M Acetatpufferlösung (pH-Wert 5,5) gelösten Substrats für POD, d. h., 0,0134% Tetramethylbenzidin (TMBZ), wurden zugesetzt. Nachdem außerdem 0,1 ml 0,01% Wasserstoffperoxid zugesetzt worden waren, wurde das Gemisch 1 Std. bei 30ºC unter Schütteln erwärmt (dritte Umsetzung), wonach die Umsetzung durch Zusatz von 0,6 ml 1,33 N Schwefelsäure beendet wurde. Der A&sub4;&sub5;&sub0;-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit einem Spektralphotometer gemessen und die Kollagenase-Inhibitormenge in der Probe aus einer Standardkurve bestimmt.

(c) Absuchen auf monoclonale Antikörper zur Verwendung im Sandwich-Test

Zum Absuchen auf Kombinationen von monoclonalen Antikörpern, mit denen die Messung des Kollagenase-Inhibitors möglich ist, wurde ein Fab'-POD-Konjugat von jedem der nachstehend beschriebenen, durch das in Beispiel 1 (i) verwendete Verfahren gereinigten monoclonalen Antikörper hergestellt: Clon 7-3F1, 7-6C1, 7-19F6 und 7-21B12. Unter Verwendung von 1 ng gereinigtem Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark pro Röhrchen wurde ein quantitativer Sandwich-Test gemäß dem in Beispiel 3 (b) verwendeten Verfahren mit jedem der nachstehend aufgeführten monoclonalen Antikörper als feste Phase durchgeführt: Clon 7-3F1, 7-4F2, 7- 5A1, 7-6C1, 7-7F11, 7-8B2, 7-9B4, 7-10E11, 7-11A5, 7-12B6, 7-15E8, 7-18F3, 7-19F6, 7-20C2, 7-21B12 und 7-23G9. Die erhaltenen A&sub4;&sub5;&sub0;-Werte sind nachstehend in Tabelle 2 dargestellt. Es soll angemerkt werden, daß die in Tabelle 2 angegebenen A&sub4;&sub5;&sub0;-Werte erhalten wurden, indem die Werte für den Sandwich-Test, in dem kein Kollagenase-Inhibitor zugesetzt wurde, von denen des Sandwich-Tests, in dem 1 ng Probe zugesetzt wurde, abgezogen wurden. Es wurde festgestellt, daß alle vier verschiedenen, vorstehend beschriebenen Fab' POD-Konjugate A&sub4;&sub5;&sub0;-Werte zeigten, die bei jedem der sechs verschiedenen Festphasenantikörper nicht niedriger als 2 waren: 7-4F2, 7-11AS, 7-12B6, 7-18F3, 7-20C2 und 7-23G9. Ein quantitativer Sandwich-Test wurde ferner unter Verwendung von verschiedenen Kollagenase-Inhibitormengen aus Rinder- Zahnmark für jede dieser 24 Kombinationen durchgeführt. Die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn das Fab' (Clon 7-6C1)- POD-Konjugat in Kombination mit dem Antikörper von Clon 7- 23G9 als feste Phase verwendet wurde, sind in Fig. 2 dargestellt. Wie es in Fig. 2 dargestellt ist, wurde eine lineare Beziehung zwischen der zugesetzten Kollagenase-Inhibitormenge aus Rinder-Zahnmark und der A&sub4;&sub5;&sub0; erhalten, wobei die Nachweisempfindlichkeiten etwa 1 pg (32 pro Mol) pro Röhrchen waren. Eine solche Linearität wurde nicht nur bei den vorstehend beschriebenen Kombinationen beobachtet, wodurch etabliert wurde, daß der quantitative Sandwich-Test mit jeder der Kombinationen möglich ist.

Beispiel 4 Identifizierung des Kollagenase-Inhibitors in menschlichem Serum (a) Herstellung einer Affinitätssäule

Gemäß dem Verfahren, wie es von Axen et al. in Nature 214 (1967), 1302-1304, und von Cuatrecasas et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61 (1968), 636-643, beschrieben ist, wurde der in Beispiel 1 (i) erhaltene, gereinigte monoclonale Antikörper unter Verwendung von Bromcyan auf einem Sepharose 4B-Träger als Ligand immobilisiert. Das erhaltene Antikörper-Sepharose 4B-Gel (0,3 ml) wurde anschließend in eine Glassäule gefüllt und vor der Verwendung mit einer 30 mM 0,1 M NaCl und 5 mM CaCl&sub2; enthaltenden Tris-HCl- Pufferlösung (pH-Wert 8,0) äquilibriert.

(b) Säulenaffinitätschromatographie des Kollagenase- Inhibitors aus menschlichem Serum

Menschliches Serum (1 ml) wurde gegen eine 30 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,0), die 0,1 M NaCl und 5 mM Cacl&sub2; enthielt, dialysiert und anschließend auf eine gemäß der in (a) vorstehend beschriebenen Weise hergestellte Sepharose 4B-Säule, die den Antikörperclon 7-21B12 enthielt, aufgebracht. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer, wie vorstehend beschrieben, gewaschen, um die "nicht adsorbierende Fraktion" zu erhalten. Sie wurde anschließend mit einer 30 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), die 2 M NaCl enthielt, und anschließend mit einer 0,2 M Glycin-NaQH- Pufferlösung (pH-Wert 10,5), die 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen, um die "gewaschene Fraktion" zu erhalten. Das an der Säule adsorbierte Protein wurde schließlich mit einer 0,2 M Glycin-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 2,0) eluiert, um die "eluierte Fraktion" zu erhalten. Die so erhaltene eluierte Fraktion wurde gegen eine 30 mM 0,1 M NaCl und 5 mM CaCl&sub2; -enthaltende Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) dialysiert und anschließend über eine Sepharose 4B-Säule, die den Antikörperclon 7-21B12 enthielt, erneut einer Affinitätschromatographie unterzogen, wobei das gleiche Verfahren, wie vorstehend beschrieben, wiederholt wurde, wodurch der Kollagenase-Inhibitor in der eluierten Fraktion erhalten wurde. Um zu testen, ob die monoclonalen Antikörper gegen den Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark mit dem Kollagenase-Inhibitor aus menschlichem Serum reagieren, wurde die vorstehend beschriebene eluierte Fraktion einer SDS-PAGE und anschließend einem Western-Blotting unterworfen. Fig. 3 stellt die Ergebnisse dar, die erhalten wurden, wenn eine Nitrozellulosemembran im Anschluß an das Western- Blotting mit einem Fab'-POD-Konjugat immunologisch angefärbt wird, das aus einem der nachstehend aufgeführten monoclonalen Antikörper hergestellt wurde: 1. Clon 7-3F1, 2. Clon 7- 6C1, 3. Clon 7-19F6, 4. Clon 7-21B12 und 5. Clon 7-23G9. Wie in Fig. 3 dargestellt, wurde festgestellt, daß Kollagenaseinhibitoren, die mit dem monoclonalen Antikörper gegen den Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark reagieren, in menschlichem Serum vorhanden sind. Es wurde außerdem festgestellt, daß das Molekulargewicht jedes dieser Kollagenase-Inhibitoren dem in Beispiel 1 (a) erhaltenen Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark entspricht (32 000 D).

Beispiel 5 Quantitative Bestimmung des Kollagenase-Inhibitors in menschlichem Serum durch den Sandwich-Test (a) Herstellung der Standardkurve

Ein Screening wurde durchgeführt, um die am besten geeignete Kombination aus monoclonalen Antikörpern zur Durchführung eines Sandwich-Tests auf den menschlichen Kollagenase- Inhibitor zu finden. Dementsprechend wurden, wie in Beispiel 3 (c) dargestellt, 24 Kombinationen zwischen vier verschiedenen Fab'-POD-Konjugaten, d. h., Fab'(7-3F1) - POD, Fab' (7-6C1)-POD, Fab' (7-19F6)-POD und Fab'(7-21B12)- POD, und 6 verschiedenen monoclonalen Antikörpern als Festphasen-Antikörper, d. h., die Clone 7-4F2, 7-11A5, 7- 12B6, 7-18F3, 7-20C2 und 7-23G9, auf die abgesucht, mit denen eine quantitative Bestimmung von Kollagenaseinhibitoren im menschlichen Serum, das in der gleichen, vorstehend in Beispiel 4 (b) beschriebenen Weise durch Säulenchromatographie behandelt worden war, möglich ist. Als Ergebnis wurden bei Verwendung des Kollagenase-Inhibitors aus menschlichem Serum als Antigen keine A&sub4;&sub5;&sub0;-Signale für die meisten verwendeten Kombinationen nachgewiesen. Es wurde jedoch festgestellt, daß ein quantitativer Sandwich-Test mit der Kombination des Antikörperclons 7-23G9 als Festphasen- Antikörper und Fab'(Clon 7-6C1)-POD als Konjugat möglich ist. Eine Standardkurve wurde unter Durchführung des quantitativen Sandwich-Tests gemäß dem Verfahren, wie es in Beispiel 3 (c) beschrieben ist, mit verschiedenen Mengen an zugesetztem Kollagenase-Inhibitor aus menschlichem Serum unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Kombination erstellt. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Wie in Fig. 4 dargestellt, gibt es eine lineare Beziehung zwischen der zugesetzten Kollagenaseinhibitormenge aus menschlichem Serum und der A&sub4;&sub5;&sub0;, womit festgestellt wurde, daß die quantitative Bestimmung des menschlichen Kollagenase-Inhibitors möglich ist. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Nachweisempfindlichkeit mit etwa 10 pg (320 pro Mol) pro Röhrchen zehnmal niedriger als die für den Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark (d. h., 1 pg pro Röhrchen) war.

(b) Quantitative Bestimmung des Kollagenase-Inhibitors in Seren von Patienten

Unter Verwendung der vorstehend in (a) spezifizierten Kombination von monoclonalen Antikörpern wurden mit einem Sandwich-Test 95 Serumproben von normalen Individuen, 100 von Patienten mit Krebs der Leberzellen und drei mit metastatischem Leberkrebs auf darin enthaltene Kollagenaseinhibitoren quantitativ getestet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3-1, 3-2 bzw. 3-3 dargestellt. In diesem Sandwich- Test wurde der in Beispiel 4 (b) gereinigte Kollagenaseinhibitor des menschlichen Serums als Antigen zur Herstellung der Standardkurve verwendet. Diese Messung wurde mit den Serumproben durchgeführt, die 1600fach mit 1% BSA enthaltendem Puffer A verdünnt worden waren. Die in den Tabellen 3-1 und 3-2 angegebenen Werte sind als Durchschnittswerte zweier Experimente angegeben. Wie aus den Tabellen 3-2 und 3-3 zu ersehen ist, waren die erhöhten Durchschnittsmengen Kollagenase-Inhibitor, die in 1 ml Serum von Patienten mit Krebs der Leberzellen und denen mit metastatischem Leberkrebs vorhanden waren, 3,22 ± 2,10 ug bzw.

7,81 ± 3,87 ug, während aus der Tabelle 3-1 zu entnehmen ist, daß sie bei normalen Individuen 1,59 ± 0,37 ug waren. 46, 45 und 26 Serumproben von Patienten mit Leberzirrhose, chronischer aktiver Hepatitis bzw. chronischer inaktiver Hepatitis wurden durch das Sandwich-Verfahren quantitativ getestet, und die von den jeweiligen Proben erhaltenen Werte sind in den Tabellen 4-1, 4-2 und 4-3 dargestellt. Daraus ergeben sich durchschnittliche Mengen Kollagenase-Inhibitor in Seren von Patienten mit Leberzirrhose, chronischer aktiver Hepatitis bzw. chronischer inaktiver Hepatitis von 1,52 ± 1,08 ug, 1,55 ± 0,58 ug bzw. 1,10 ± 0,48 ug, wobei sämtliche Proben keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kollagenase-Inhibitormenge im Serum von normalen Individuen zeigten.

Beispiel 6 Reinigung des Kollagenase-Inhibitors aus menschlichem Serum

Wie vorstehend beschrieben, ist in der zuletzt in Beispiel 4 (b) erhaltenen eluierten Fraktion ein Kollagenase-inhibitor enthalten, der mit monoclonalen Antikörpern gegen den Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark reagieren kann (vgl. Fig. 3). Es wurde jedoch beobachtet, daß darin neben dem Kollagenase-Inhibitor mehrere Proteine vorhanden sind, die mit den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörpern nicht reagieren. Ausgehend von dieser Beobachtung wurde die eluierte Fraktion durch eine mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) äquilibrierten AcA-44-Säule gelfiltriert, um den Kollagenase- Inhibitor von anderen Proteinen zu trennen, wodurch der Kollagenase-Inhibitor des menschlichen Serums gereinigt wurde. Fig. 5 zeigt die jeweiligen SDS-PAGE-Muster für den erhaltenen Kollagenase-Inhibitor des Serums (1), den Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark (2) als Kontrolle und Molekulargewichtsmarker (3). Wie aus Fig. 5 zu ersehen ist, wurde festgestellt, daß das Molekulargewicht des Kollagenase-Inhibitors des menschlichen Serums dem des Kollagenase-Inhibitors aus Rinder-Zahnmark (d. h., 32 000 D) entspricht.

Beispiel 7 Herstellung von Standardkurven durch den Sandwich-Test auf den Kollagenase-Inhibitor von gereinigtem menschlichem Serum

Eine Standardkurve wurde unter quantitativer Durchführung des Sandwich-Tests mit verschiedenen Mengen zugesetztem, in Beispiel 6 erhaltenem, gereinigtem Kollagenase-Inhibitor aus menschlichem Serum unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Kombination aus monoclonalen Antikörpern hergestellt, wie es in Beispiel 5 (a) beschrieben ist. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Wie aus Fig. 6 zu entnehmen ist, gibt es eine lineare Beziehung zwischen der zugesetzten Kollagenaseinhibitormenge aus menschlichem Serum und der A&sub4;&sub5;&sub0;, wobei die Nachweisempfindlichkeit 1,5 pg (48 pro Mol) pro Röhrchen ist. Es wurde festgestellt, daß diese Nachweisempfindlichkeit 6,7 Mal höher als bei der in Beispiel 5 (a) hergestellten Standardkurve und 1,5 Mal niedriger als bei der für den Kollagenase-Inhibitor aus Rinder-Zahnmark war, wie es in Beispiel 3 (c) beschrieben ist.

Beispiel 8 Diagnose von Leberkrebs durch Messung des Kollagenase- Inhibitors in menschlichen Seren oder Plasmen durch den Sandwich-Test (a) Quantitative Bestimmung des Kollagenase-Inhibitors in Seren von Patienten mit Leberschäden

Unter Verwendung der Kombination aus monoclonalen Antikörpern, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurden mit einem Sandwich-Test 50 Serumproben von normalen Individuen, 100 von Patienten mit Krebs der Leberzellen und drei von Patienten mit metastatischem Leberkrebs auf darin enthaltene Kollagenase-Inhibitoren quantitativ getestet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5-1, 5-2 bzw. 5-3 dargestellt. In diesem Sandwich-Test wurde der in Beispiel 6 gereinigte Kollagenase-Inhibitor des menschlichen Serums als Antigen zur Herstellung der Standardkurve verwendet. Diese Messung wurde mit Serumproben durchgeführt, die 1600fach mit 1% BSA enthaltendem Puffer A verdünnt worden waren. Die in den Tabellen 5-1, 5-2 und 5-3 angegebenen Werte werden als Durchschnittswerte zweier Experimente angegeben. Wie den Tabellen 5-2 und 5-3 entnommen werden kann, waren die erhöhten, durchschnittlichen Kollagenase-inhibitormengen, die in 1 ml Serum von Patienten mit Krebs der Leberzellen und denen mit metastatischem Leberkrebs vorhanden waren, 484 ± 316 ng bzw. 1171 ± 712 ng, während aus der Tabelle 5-1 zu entnehmen ist, daß sie bei normalen Individuen 184 ± 31 g waren. 46, 45 und 26 Serumproben von Patienten mit Leberzirrhose, chronischer aktiver Hepatitis bzw. chronischer inaktiver Hepatitis wurden durch das Sandwich-Verfahren quantitativ getestet, und die von den jeweiligen Proben erhaltenen Werte sind in den Tabellen 6-1, 6-2 und 6-3 dargestellt. Wie in diesen Tabellen dargestellt ist, waren die durchschnittlichen Kollagenase-Inhibitormengen in Seren von Patienten mit Leberzirrhose, chronischer aktiver Hepatitis bzw. chronischer inaktiver Hepatitis 228 ± 163 ng, 233 ± 88 ng bzw. 166 ± 73 ng, wobei alle keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kollagenase-Inhibitormenge im Serum von normalen Individuen zeigten.

(b) Quantitative Bestimmung des Kollagenase-Inhibitors in Plasmen von Patienten mit Leberschäden

Gemäß dem Verfahren von Ludlam und Cash, Br. J. Haematol. 33 (1976), 239-247, wurde Plasma aus Blutproben von normalen Individuen und von Patienten mit Krebs der Leberzellen gewonnen. Das so gewonnene Plasma ist der Überstand, der durch 60-minütige Zentrifugation mit 1900 · g bei 4ºC von gekühltem, mit EDTA, Prostaglandin E&sub1; und Theophyllin versetztem Blut erhalten wird, wobei die Blutplättchen in der ausgefällten Fraktion unzersetzt erhalten bleiben.

Die so erhaltenen 26 Plasmaproben von normalen Individuen und acht von Patienten mit Krebs der Leberzellen wurden mit einem Sandwich-Test unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie vorstehend unter (a) beschrieben, quantitativ auf den darin enthaltenen Kollagenase-Inhibitor getestet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 7 dargestellt. Wie aus der Tabelle 7 zu entnehmen ist, betrugen die erhöhten durchschnittlichen Kollagenase-Inhibitormengen, die in 1 ml Plasma von Patienten mit Krebs der Leberzellen vorhanden waren, 583 ± 447 ng, während sie bei normalen Individuen 64 ± 10 ng waren.

(c) Bestätigung der spezifischen Reaktivität zwischen dem monoclonalen Antikörper und dem Kollagenase-Inhibitor

Wie in Beispiel 4 (b) gezeigt wurde, zeigten die beiden im Sandwich-Test verwendeten monoclonalen Antikörper (Clon 7-6C1 und Clon 7-23G9) eine Reaktivität mit dem menschlichen Kollagenase-Inhibitor. Es wurde ein Test durchgeführt, um nachzuweisen, daß diese monoclonalen Antikörper mit dem Kollagenase-Inhibitor in solchen Systemen wie Seren, Plasmen und Synovialflüssigkeiten, in denen verschiedene, in hohen Konzentrationen gelöste Proteine vorhanden sind, spezifisch reagieren. Die Seren von normalen Individuen und von Patienten mit Leberkrebs wurden fünffach mit einer 30 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,0), die 0,1 M NaCl und 5 mM CaCl&sub2; enthielt, verdünnt und anschließend auf eine Sepharose 4B-Säule mit dem immobilisierten Clon 7-23G9 (Antikörper als Festphase für den Sandwich-Test) aufgetragen, die wie in Beispiel 4 (a) beschrieben hergestellt wurde, um die eluierte Fraktion gemäß der in Beispiel 4 (b) beschriebenen Weise zu erhalten. Nach der Durchführung einer SDS-PAGE mit einem anschließenden Western-Blot wurde die eluierte Fraktion mit dem Fab' (Clon 7-6C1)-POD-Konjugat, einem markierten Antikörper für den Sandwich-Test, immunologisch gefärbt. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. Wie aus Fig. 7 zu ersehen ist, zeigte sich in allen Fällen eine einzelne Bande (1: gereinigter Kollagenase-Inhibitor aus menschlichem Serum, 2: Seren von normalen Individuen und 3: Seren von Patienten mit Leberkrebs). Es wurde so gezeigt, daß der Kollagenase-Inhibitor im erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren gemäß dem Sandwich-Test äußerst spezifisch bestimmt wird.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung zu entnehmen ist, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die Diagnose von Leberkrebs in kurzer Zeit mit hoher Empfindlichkeit einfach durchzuführen.

Tabelle 1
Clon-Nr. Subklasse/Kette
Tabelle 2
Festphasen Antikörper Konjugat
Tabelle 3-1
Seren von normalen Individuen Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 3-2
Seren von Patienten mit Krebs der Leberzellen Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 3-3
Seren von Patienten mit metastatischem Leberkrebs Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 4-1
Seren von Patienten mit Leberzirrhose Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 4-2
Seren von Patienten mit chronischer aktiver Hepatitis Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 4-3
Seren von Patienten mit chronischer inaktiver Hepatitis Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 5-1
Seren von normalen Individuen Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 5-2
Seren von Patienten mit Krebs der Leberzellen Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 5-3
Seren von Patienten mit metastatischem Leberkrebs Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 6-1
Seren von Patienten mit Leberzirrhose Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 6-2
Seren von Patienten mit chronischer aktiver Hepatitis Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 6-3
Seren von Patienten mit chronischer inaktiver Hepatitis Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert
Tabelle 7
Plasmen von normalen Individuen Plasmen von Patienten mit Krebs der Leberzellen Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Proben Nr. Kollagenase-Inhibitor Durchschnittswert Durchschnitt

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 stellt Muster von Western-Blots des einer SDS- PAGE unterzogenen Kollagenase-Inhibitors aus Rinder-Zahnmark dar, die mit verschiedenen monoclonalen Antikörpern erhalten wurden,

Fig. 2 stellt eine Standardkurve des Kollagenaseinhibitors aus Rinder-Zahnmark dar, die mit einem Testsystem aus einem Festphasen-7-23G9-Antikörper-Fab'-(7-6C1)-POD- Konjugat hergestellt wurde,

Fig. 3 stellt immunologisch gefärbte Muster dar, die durch SDS-PAGE des Kollagenase-Inhibitors aus menschlichem Serum und anschließendem Western-Blotting erhalten wurden,

Fig. 4 stellt eine Standardkurve für den Kollagenaseinhibitor aus menschlichem Serum dar, die mit einem Testsystem aus einem Festphasen-7-23G9-Antikörper-Fab'-(7- 6C1)-POD-Konjugat hergestellt wurde,

Fig. 5 stellt SDS-PAGE-Muster des aus menschlichen Seren gereinigten Kollagenase-Inhibitors dar,

Fig. 6 stellt eine Standardkurve dar, die durch einen Sandwich-Test auf den gereinigten Kollagenase-Inhibitor aus menschlichem Serum hergestellt wurde, und

Fig. 7 stellt Western-Blot-Muster dar, die erhalten wurden, wenn mit der eluierten Fraktion, die nach dem Durchfluß von menschlichen Seren durch eine Affinitätssäule mit gebundenem IgG (7-23G9)-Antikörper erhalten wurde, eine SDS-PAGE mit einer anschließenden Verwendung des Fab'(7- 6C1)-POD-Konjugats durchgeführt wurde.


Anspruch[de]

Verfahren zur Bereitstellung von Daten für die Diagnose von Leberkrebs, dadurch gekennzeichnet, daß enzym-immunologisch die in Seren, Plasmen oder synovialen Flüssigkeiten vorhandene Kollagenase-Inhibitormenge mittels eines Sandwich-Tests gemessen wird, wobei zwei verschiedene, monoclonale Antikörper verwendet werden, die spezifisch an verschiedene, antigene Determinanten des Kollagenase- Inhibitors binden, und die gemessene Menge mit der für normale Patienten verglichen wird.







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