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Dokumentenidentifikation DE68918867T2 16.02.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0434713
Titel Mutanten des hiv-1 Hüllproteins mit fehlenden hypervariabelen domänen.
Anmelder Chiron Corp., Emeryville, Calif., US
Erfinder HAIGWOOD, Nancy, L., Oakland, CA 94611, US
Vertreter Tauchner, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Heunemann, D., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Rauh, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Hermann, G., Dipl.-Phys. Dr.rer.nat.; Schmidt, J., Dipl.-Ing.; Jaenichen, H., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., 81675 München; von Uexküll-Güldenband-Menzel, A., Dr.phil. (Ph.D.), 82166 Gräfelfing; Weinberger, R., Dipl.-Chem.Univ. Dr.rer.nat.; Bublak, W., Dipl.-Chem. Univ., Pat.-Anwälte; Tremmel, H., Rechtsanw., 81675 München
DE-Aktenzeichen 68918867
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 21.08.1989
EP-Aktenzeichen 899099162
WO-Anmeldetag 21.08.1989
PCT-Aktenzeichen US8903605
WO-Veröffentlichungsnummer 9002568
WO-Veröffentlichungsdatum 22.03.1990
EP-Offenlegungsdatum 03.07.1991
EP date of grant 12.10.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.02.1995
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse G01N 33/569   C12N 15/49   C12N 5/10   C12N 1/19   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Analoga (Muteine) der Hüllproteine des menschlichen Immunschwächevirus-Typ-I (HIV- 1), Verfahren zur Herstellung der Analoga, die Analoga Codierende DNA-Sequenzen und Verfahren zur Verwendung der Analoga beispielsweise bei Immuntests und Impfstoff-Zusammensetzungen.

Stand der Technik

HIV-1 und ein kürzlich identifizierter, verwandter, als HIV-2 bezeichneter Virus sind als Agentien bekannt, die das erworbene Immunschwäche-Syndrom (AIDS) verursachen. Viele HIV- 1-Isolate wurden identifiziert und sequenziert. Ein auffallendes Merkmal dieser unabhängigen Isolate besteht in einer beträchtlichen genomischen und Aminosäure-Variation, die sich besonders auf das Gen für das Hüllprotein und die Hüllproteine konzentriert. Diese Variation unter den HIV-1- Isolaten hat wichtige Auswirkungen auf die AIDS-Diagnostik und potentielle Impfstoffe.

Starcich et al., Cell 45 (1986), 637-648, berichtet über die genetische Variation von fünf unabhängigen HIV-1-Isolaten, sowie die Variationen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Es wurden konservierte und variable Bereiche beobachtet.

Eine Übersicht von Coffin, Cell 46 (1986), 1-4, bezieht sich auf die Variation in dem HIV-1-Hüllprotein und den möglichen, die Variation bewirkenden Mechanismus. Coffin schlägt vor, daß die hochvariablen, als "hypervariable" Domänen bezeichneten, Domänen Epitope innerhalb der konservierten Domänen vor der Zugänglichkeit für neutralisierende Antikörper oder zellvermittelte Immunantworten abschirmen. Man schließt daraus, daß sich die Strategie für eine HIV-1-Impfung darauf richten soll, eine gegen die konservierten Bereiche des Hüllproteins gerichtete Immunantwort, trotz der Gegenwart maskierender, variabler Domänen, hervorzurufen.

Modrow et al., J. Virol. 61 (1987), 570-578, verweist ebenfalls auf den Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener HIV-1-Isolate. Zur Vorhersage von Epitopen in dem Hüllprotein wurde die Computeranalyse verwendet. Es wurde festgestellt, daß die Mehrheit der vorhergesagten Epitope in den hypervariablen Bereichen lag. Siehe beispielsweise die hier als Referenz eingeschlossene Figur 1 und Tabellen 1 & 2.

Hahn et al., Science 232 (1986), 1548-1553, offenbart die Sequenzvariationen insbesondere in dem Hüllprotein bei einer Reihe von HIV-1-Isolaten aus einem einzigen Individuum. Siehe auch Saag et al., Nature 334 (1988), 440-444; Fisher et al., Nature 334 (1988), 444-447.

Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 3198- 3202, offenbart, daß ein kurzes Peptid mit der Sequenz eines HIV-1-Isolats in der dritten hypervariablen Domäne des Hüllproteins die Fähigkeit aufwies, Isolat-spezifische neutralisierende Antikörper aus Antiseren zu absorbieren. Eine andere Gruppe wies die Fähigkeit auf, durch Immunisierung mit einem Peptid aus der gleichen Domäne, die Bildung Isolatspezifischer neutralisierender Antikörper zu induzieren. Da dieses neutralisierende Epitop in einer der hypervariblen Domänen gefunden wird, besteht eine mögliche Strategie für eine Impfung in der Herstellung eines Untereinheit-Antigens, das aus dem kritischen Epitop aus einer Vielzahl von Isolaten besteht. Siehe auch Looney et al., Science 241 (1988), 357- 359.

Goudsmit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 4478- 4482, berichtet von der neutralisierenden Fähigkeit von Antikörpern, die in mit verschiedenen HIV-1-Isolaten infizierten Schimpansen erzeugt wurden. Er berichtet auch von einem mit einer Untereinheit des Hüllproteins immunisierten Kaninchen. Von dem von Rusche et al., identifizierten Epitop wird berichtet, daß es sich um ein Isolat-spezifisches, neutralisierendes Epitop handelt, das in HIV-1 Schimpansen immundominant ist.

Größtenteils aufgrund der allgemeinen Meinung, daß Aids-Impfstoffe aus abgeschwächten oder abgetöteten Viren nicht möglich sind, konzentrierte man sich bei der Entwicklung der Impfstoffe primär auf die Untereinheits-Antigene. Verschiedene Gruppen schlugen kurze Oligopeptide aus der Domäne des Hüllproteins als geeignete Untereinheits-Antigene vor. Andere Gruppen verfolgen Lebendimpfstoffe aus rekombinantem Virus, Impfstoffe aus natürlich vorkommendem oder rekombinantem, viralem Polypeptid oder Anti-idiotypische Impfstoffe. Siehe beispielsweise Koff et al., Science 241 (1988), 426-432 (sowie darin zitierte Referenzen).

Für die Verwendung in der Diagnostik und als potentielle Impfstoffe besteht ein andauernder Bedarf für die Entwicklung neuer und besserer Analoga des HIV-1-Hüllproteins, sowie für Polypeptide, die Isolat-spezifische Immun-Interaktionen vermeiden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Analoga (Muteine) des HIV- 1-Hüllproteins, die die konstanten Domänen von gp120env oder gp160env umfassen, denen jedoch zumindest ein Epitop einer hypervariablen Domäne fehlt. Trotz der Berichte in der Literatur, die die Bedeutung der Epitope in den hypervariablen Domänen (z.B. immundominat und/oder neutralisierend) nahelegen, wurde überraschenderweise entdeckt, daß die erfindungsgemäßen Muteine als diagnostische Reagentien brauchbar sind. Diese zeigen zumindest eine gleich große oder größere Reaktivität mit gegen verschiedene Isolate gerichteten Antikörpern und als Antigene beim Erzeugen nicht- Isolat-spezifischer Antikörper durch Immunisierung eines Säugers.

In einer Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ein verbessertes HIV-1-Analogon von gp120env oder gp160env, wobei die Verbesserung die Deletion von mindestens einem Epitop innerhalb einer hypervariablen Domäne umfaßt, während die unter den HIV-1-Isolaten konservierten Domänen erhalten bleiben.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, umfassend Epitope, die Antikörper gegen HIV-1-gp120env oder -gp160env innerhalb einer Aminosäuresequenz mit der folgenden Formel binden:

C1-V1-V2-C2-V3-C3-V4-C4-V5-C5

in der:

C1 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Ser29 bis Cys130 von HIV-1-SF2,

C2 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Cys199 bis Leu291 von HIV-1-SF2,

C3 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Ser366 bis Cys387 von HIV-1-SF2,

C4 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Cys415 bis Gly456 von HTV-1-SF2,

C5 eine Aminosäuresequenz umfaßt mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Phe466 bis Arg509 oder Leu855 von HIV-1-SF2,

V1 eine Aininosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 30 Resten ist,

V2 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 50 Resten ist,

V3 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 90 Resten ist,

V4 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maxiinal etwa 30 Resten ist, und

V5 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 10 Resten ist,

mit der Maßgabe, daß mindestens eine der V-Domänen, ausgewählt aus V1, V2, V3, V4 und V5, nicht mehr als etwa ein Drittel der maximalen Zahl von Resten für die V-Domäne enthält.

Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polypeptidanalogon zu gp120env oder gp160env des menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), umfassend (a) etwa 300 bis etwa 850 Aminosäurereste in der Länge, (b) konstante Domänen, in N-terminaler zu C-terminaler Richtung, Ser29-Cys130 von HIV-1-SF2 (C1), Cys199-Leu291 von HIV-1-SF2 (C2), Ser366-Cys387 (C3), Cys415-Gly456 von HIV-1-SF2 (C4) und Phe466-Arg509 oder Phe466-Leu855 von HIV-1-SF2 (C5) oder Domänen, die im wesentlichen homolog zu C1, C2, C3, C4 oder C5 sind, und (c) dazwischenliegende Domänen, falls vorhanden, die zwischen den konstanten Domänen liegen, umfassend Sequenzen, die zwischen diesen im wesentlichen homologen konstanten Domänen im nativen HIV-1-gp120env zu finden sind, mit der Maßgabe, daß mindestens eine der zwischen den konstanten Domänen liegenden Domänen entweder fehlt oder ihr ein Epitop fehlt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Immuntest zum Nachweis von Antikörpern gegen menschliches Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), umfassend

(a) Bereitstellung einer flüssigen Probe, die auf die Gegenwart von Anti-HIV-1-Antikörpern getestet werden soll,

(b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Polypeptid, wie vorstehend beschrieben, unter Bedingungen, unter denen Anti-HIV-1-Antikörper, die in der Probe vorliegen, an ein Epitop binden können, so daß man ein mit der Probe in Kontakt befindliches Polypeptid erhält, und

(c) Nachweis eines Antikörpers, der an das mit der Probe in Kontakt befindliche Polypeptid gebunden ist.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum selektiven Erzeugen von Antikörpern gegen Epitope in den konstanten Domänen des menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1)-gp120env oder - gp160env in einem Säuger, umfassend das Verabreichen eines Polypeptids, wie vorstehend beschrieben, an diesen Säuger, wobei die Antikörper gegen dieses Polypeptid als Antwort auf diese Verabreichung hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine in einem derartigen Verfahren hilfreiche Zusammensetzung, die das vorstehend beschriebene Polypeptid in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch in einer anderen Ausführungsform eine das vorstehende Polypeptid codierende DNA- Sequenz, sowie eine Wirtszelle, umfassend die DNA-Sequenz unter der Kontrolle von Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, wobei das von der vorstehenden DNA-Sequenz codierte Polypeptid von der Wirtszelle exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung des vorstehenden Polypeptids, wobei man eine Kultur der vorstehenden Wirtszelle unter Bedingungen wachsen läßt, bei denen das von der DNA-Sequenz codierte Polypeptid exprimiert wird und man das Polypeptid aus der Kultur gewinnt.

Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 stellt ein schematisches Diagramm des gp120env Wildtyp-Gens von HIV-SF2 dar.

Figur 2 stellt die Zuordnung der Aminosäuresequenzen verschiedener HIV-1-Isolate, einschließlich SF2, dar. Die konstanten und variablen Domänen sind angegeben. Nur für die HXB2-Sequenz sind die potentiellen N-gebundenen Glycosylierungsstellen durch "[ ]" gekennzeichnet; über den Cysteinresten sind "*" angegeben.

Figur 3 stellt eine Restriktionskarte des Säuger-Expressionsvektors pSV7dARV120tpa dar.

Figur 4 stellt eine Restriktionskarte des Säuger-Expressionsvektors pCMV6ARV120tpa dar.

Figur 5 stellt eine Restriktionskarte des Hefe-Expressionsvektors pHL15 dar.

Figur 6 enthält Graphen, die das Ergebnis eines ELISA darstellen, der die Reaktivität der erfindungsgemäßen Muteine des HIV-1-Hüllproteins sowie Kontrollen gegen eine nordamerikanische Serumreihe testet.

Figur 7 enthält Graphen, die das Ergebnis eines ELISA darstellen, der die Reaktivität der erfindungsgemäßen Muteine des HIV-1 Hüllproteins sowie Kontrollen gegen eine afrikanische Serumreihe testet.

Figur 8 stellt die Ergebnisse eines ELISA dar, der Seren von Meerschweinchen verwendet, die mit den erfindungsgemäßen Muteinen des Hüllproteins oder verschiedenen Kontrollen immunisiert worden sind.

Figur 9 stellt Ergebnisse eines ELISA dar, der Seren von Ziegen verwendet, die mit den erfindungsgemäßen Muteinen des Hüllproteins oder verschiedenen Kontrollen immunisiert worden sind.

Detaillierte Beschreibung

HIV-1 ist ein bekannter Virus, von dem viele Isolate beobachtet wurden. Siehe beispielsweise Levy et al., Science 225 (1984), 840; Barre-Sinoussi et al., Science 220 (1983), 868; Popovic et al., Science 224 (1984), 497; AIDS: Papers from Science 1982-1985 (Hrsg. R. Kulstad 1986); Current Topics in AIDS (Hrsg. M. Gottlieb et al., 1987). Das Gen des HIV-1-Hüllproteins stellt ein Vorläufer-Glycoprotein mit einem MG von etwa 160 her, das als gp160 oder gp160env bezeichnet wird. Der Vorläufer wird während der Expression gespalten. Man erhält das äußere Haupt-Hüllglycoprotein gp120 (gp120env) und das Transmembranprotein gp41 (gp41env). In der Literatur wurde von verschiedenen HIV-1-Isolaten berichtet, einschließlich BH10, PV22, BRU, HXB2, WMJ1, WMJ2, WMJ3, CDC4, HTLV-IIIRF, HTLV-IIIB, Z3, Z6, Z321, MAL, NY5, ELI, JY1, LAV1A und HAT3. Für die vorliegende Erfindung ist das ursprünglich als ARV2 bezeichnete HIV-1-Isolat SF2 von besonderem Interesse. Siehe beispielsweise Levy U.S. Patent Nr. 4,716,102; Levy et al., Science 225 (1984), 84; EPO Veröffentlichungs-Nr. 181,150.

Kürzlich wurden die konservierten und hypervariablen Domänen der HIV-1-Hüllproteine beschrieben. Siehe beispielsweise Modrow et al., vorstehend. Figur 1 ist hier ein schematisches Diagramm, das die Lage der fünf hypervariablen (V1, V2, V3, V4 und V5) und der fünf konstanten Regionen (C1, C2, C3, C4 und C5) in dem Gen des Hüllproteins aus HIV-1 SF2 darstellt. Verschiedene Deletionen, die Teil einer oder eine gesamte hypervariable Domäne umfassen, sind ebenfalls dargestellt (D1, D2, D3, D4 und D5). Zwei Bereiche mit überwiegend hydrophoben Aminosäuren sind durch dunkle Schattierung gekennzeichnet, während die transmembrane Region mittels TM markiert ist. Die gp120env (Positionen 1-1527) von gp41 (Positionen 1528-2565) trennende Prozessierungsstelle sowie die Signalsequenz am N- Terminus sind gekennzeichnet.

Hypervariable Domänen sind durch sehr geringe Homologie (z.B. so gering wie 10%) unter den unabhängigen HIV-1-Isolaten charakterisiert. Ferner variiert die Länge der hypervariablen Domänen aus verschiedenen Isolaten beträchtlich. Dies ist bedingt durch die weite Verbreitung von Insertions- und Deletionsmutationen. So können diese Bereiche nicht durch Vergleich von einem Isolat mit dem nächsten über ein beträchtliches Ausmaß an Aminosäuresequenzhomologie charakterisiert werden, und man kann ihnen nur eine ungefähre Länge zuordnen. Hypervariable Domänen werden primär durch ihre Lage innerhalb des Hüllglycoproteins und ihre vermutliche Tertiärstruktur (d.h "Loops") charakterisiert. Die konservierten bzw. konstanten Domänen sowie alle 18 Cysteine des Hüllproteins sind hochkonserviert. Es wurde festgestellt, daß die Lage der hypervariablen Domänen im Verhältnis zu den umgebenden konstanten Domänen und Cysteinen unter den verschiedenen Isolaten identisch ist. Ferner scheint die Tertiärstruktur der hypervariablen Domäne hochkonserviert zu sein; z.B. weisen zwei nicht-homologe hypervariable Domänen aus verschiedenen HIV-1-Isolaten üblicherweise die gleiche dreidimensionale Konformation, wie einen exponierten "Loop", auf. So können die hypervariablen Domänen neuer HIV-1-Isolate schnell identifiziert werden mittels Sequenzieren der neuen Isolate und Sequenzvergleich mit bekannten HIV-1-Sequenzen in einer Weise, daß die konservierten Domänen und Cysteine einander zugeordnet werden. Siehe beispielsweise Modrow et al., vorstehend, und Figur 2.

Die Lage der verschiedenen konstanten und hypervariablen Domänen wird hier in Bezug auf die Sequenz und Nummerierung des HIV-1 SF2-Isolats beschrieben. Dies dient lediglich der Erleichterung; die Erfindung ist nicht nur auf HIV-1 SF2- Sequenzen enthaltende Analoga beschränkt, sondern umfaßt auch andere Analoga, die entsprechende Domänen oder Sequenzen aus anderen Isolaten verwenden. Eine Domäne des Hüllproteins aus einem anderen HIV-1-Isolat kann durch einen Fachmann leicht durch Zuordnung der konservierten Domänen und der 18 Cysteine der beiden Isolate als der SF2-Sequenz entsprechend identifiziert werden. Eine derartige Zuordnung ist in Figur 2 dargestellt. Die entsprechenden Sequenzen der 15 HIV-1-Isolate sind zugeordnet. Die Cysteinreste sind durch einen Stern markiert, und die potentiellen N-gebundenen Glycosylierungsstellen des HXB2-Isolats sind durch "[ ]" gekennzeichnet. Die Spaltstellen für das Signalpeptid und die reifen gp120env- und gp41env-Proteine sind zusammen mit den konstanten Domänen C1-C5 dargestellt. Auch spezifische Deletionen, D1-D5, sind in der Figur dargestellt.

Die konstanten Domänen des SF2-Isolats lauten wie folgt: C1, Ser29-Cys130; C2, Cys199-Leu291; C3, Ser366-Cys387; C4, Cys 415-Gly456; und C5 ist für gp120env-Analoga Phe466-Arg509 oder Phe466-Leu855 für gp160env-Analoga. Da diese Domänen unter HIV-1-Isolaten hochkonserviert sind, werden die entsprechenden Sequenzen aus sich von SF2 unterscheidenden Isolaten im wesentlichen homolog zu diesen SF2-Domänen sein; d.h. eine Aminosäuresequenzhomologie von mindestens 70-75%, mit bestimmten hochkonservierten Domänen, die mindestens etwa 80% oder sogar 85-90% Homologie aufweisen. Die in den Aminosäuresequenzen auftretenden Unterschiede in diesen konservierten Domänen sind im allgemeinen auf Punktmutationen in der Nucleinsäuresequenz zurückzuführen, im Gegensatz zu den Deletions- und Insertions-Mutationen, die die Unterschiede in den hypervariablen Domänen darstellen.

Wie in den Figuren 1 und 2 dargestellt, befinden sich die hypervariablen Domänen zwischen den konservierten Domänen C1- C5. Es umfassen jedoch nicht alle Aminosäuren in diesen dazwischenliegenden Domänen hypervariable Bereiche. Tatsächlich ist es, bedingt durch die Heterogenität in der hypervariablen Domäne unter den HIV-Isolaten, nicht möglich, allgemein genaue Grenzen der hypervariablen Domäne zu definieren. Demgemäß werden die Domänen zwischen den konstanten Domänen zur Vereinfachung der Beschreibung der vorliegenden Erfindung als variable oder "dazwischenliegende" Domänen bezeichnet. Selbstverständlich können sie hypervariable sowie weniger variable, jedoch keine hochkonservierten Sequenzen umfassen. Die erfindungsgemäßen Analoga können demgemäß schematisch mit der folgenden Formel beschrieben werden:

C1-V1-V2-C2-V3-C3-V4-C4-V5-C5 (I)

C1-C5 und V1-V5 der Formel I sind, wie vorstehend in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben, definiert. V1-V5 besteht aus den hypervariablen Bereiche enthaltenden variablen oder dazwischenliegenden Domänen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden im Vergleich zu dem nativen gp120env oder gp160env in mindestens einer dieser variablen Domänen eine Deletion enthalten. Die Deletionen werden üblicherweise mindestens etwa ein Drittel der und häufig die gesamte variable Domäne umfassen. Ferner werden vorzugsweise auch Sequenzen aus mehr als einer variablen Domäne deletiert. Die Deletion der gesamten fünf variablen Domänen ist eingeschlossen. Erfindungsgemäß kann demgemäß jede beliebige der variablen Domänen, V1-V5 irgendeine Länge von Null bis zu einer maximalen Anzahl von Aminosäuren aufweisen. Das Maximum liegt annährend bei der längsten der in HIV-1-Isolaten gefundenen derartigen Domänen. Aus mindestens einer der V- Domänen wird jedoch mindestens ein Drittel dieser maximalen Anzahl an Aminosäuren oder ein Drittel der Länge der entsprechenden Domäne aus dem homologen HIV-1-Isolat deletiert.

Da die variablen oder dazwischenliegenden Domänen der Formel I mehr als die tatsächlichen hypervariablen Domänen umfassen können, kann eine selektierte Vn-Domäne mittels der folgenden Formel ausgedrückt werden:

Sn-HVn-Sn' (II)

wobei n 1, 2, 3, 4 oder 5 ist (wie bei V1, V2 usw.), HVn eine hypervariable Domäne mit einer Länge von x Aminosäureresten ist und Sn sowie Sn' HV in der Vn-Domäne flankierende nichthypervariable Sequenzen sind, wobei die flankierenden Sequenzen eine Länge von y bzw. y' Resten aufweisen. In dem nativen Protein ist in einem ausgewählten Isolat die Summe von x, y und y' gleich der maximalen Anzahl von Resten von Vn und y und/oder y' kann Null betragen. Für die erfindungsgemäßen Analoga wird die Summe von x, y und y' irgendwo zwischen Null und der maximalen Anzahl liegen. Die tatsächlichen Werte für x, y und y' können für eine bestimmte Vn mittels Sequenzvergleich einer repräsentativen Anzahl von HIV-1-Isolaten bestimmt werden. Siehe beispielsweise Figur 2 und Modrow et al., vorstehend.

Im Folgenden werden die dazwischenliegenden Domänen des SF2- Isolats beschrieben, die zu Vergleichszwecken bei der Bestimmung der entsprechenden dazwischenliegenen Domänen anderer HIV-1-Isolate verwendet werden. Siehe beispielsweise Figur 2. V1 aus SF2 weist eine Länge von etwa 24 Aminosäuren auf. Sie umfaßt Thr131 bis Asn154 und gegebenenfalls Cys155. Dieser C-terminale Cysteinrest ist einer der in gp120env auftretenden 18 hochkonservierten Cysteinreste. Die bisher aus unabhängigen HIV-1-Isolaten sequenzierten entsprechenden Domänen scheinen eine Länge von etwa 22 bis etwa 31 Aminosäureresten aufzuweisen. V2 aus SF2 erstreckt sich von Ser156 bis Ser198. Die bisher aus anderen HIV-1-Isolaten sequenzierten entsprechenden Domänen scheinen eine Länge von etwa 39 bis etwa 52 Aminosäureresten aufzuweisen. V3 von SF2 erstreckt sich von Asn292 bis etwa Glu365. Die bisher aus anderen HIV-1-Isolaten sequenzierten entsprechenden Domänen scheinen eine Länge von etwa 88 bis etwa 90 Aminosäureresten aufzuweisen. V4 aus SF2 erstreckt sich von Asn388 bis Pro414. Die entsprechenden Domänen aus anderen HIV-1-Isolaten scheinen eine Länge von etwa 28 bis etwa 33 Resten aufzuweisen. V5 aus SF2 erstreckt sich von Thr457 bis Thr463. Die entsprechenden Domänen aus anderen HIV-1-Isolaten scheinen eine Länge von etwa 10 bis etwa 11 Resten aufzuweisen.

Bei der Auswahl der zu deletierenden Bereiche der dazwischenliegenden Domänen werden vorzugsweise entweder die Hypervariabilität aufweisenden Bereiche oder Bereiche ausgewählt, die bekanntermaßen Epitope codieren, die in vivo eine signifikante Immunantwort auslösen. Beispiele derartiger Epitope in den variablen Regionen des SF2-Isolats umfassen, ohne Einschränkung, die Reste 137-158 (V1), 189-209 (V2), 300-327 (V3), 367-384 (V4) sowie die Reste 404-420 (V5). Entsprechende Epitope von anderen Isolaten sind bekannt. Modrow et al., vorstehend. Beispiele bevorzugter Deletionen in SF2, D1-D5, sind in Figur 1 und 2 dargestellt: Thr131-Asn154 (D1), Ser156-His198 (D2), Thr300-His332 (03), Asn388-Pro414 (D4) und Thr457-Thr463 (05). Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch Deletionen von mehr als einer variablen Domäne aufweisen, beispielsweise V1 und V2; V1, V2 und V3; V1, V2 und V5; V3, V4 und V5; oder V1, V2, V3, V4 und V5.

In einer bevorzugten Ausführungsform wurde aus den erfindungsgemäßen Analoga des HIV-1-Hüllproteins ein in den dazwischenliegenden Domänen auftretendes Epitop deletiert, das durch Antikörper gebunden wird, die mittels eines Säugers hergestellt werden, der mit dem bestimmten HIV-1-Isolat oder seinem nativen Hüllprotein infiziert oder immunisiert wird. Besonders bevorzugt werden die Epitope deletiert, die in einem Säuger Isolat-spezifische immundominante Antworten erzeugen. Obgleich die Anmelder nicht durch diese Theorie gebunden sind, glaubt man, daß die Deletion dieser variablen Epitope Epitope innerhalb der konservierten Domänen freilegt, die dann infolge des Fehlens der Epitope in den variablen Domänen von dem Immunsystem erkannt werden.

Im allgemeinen wird die Aminosäuresequenz der Formel I eine Länge von etwa 300 bis etwa 850 Aminosäureresten aufweisen, wobei die tatsächliche Länge nicht kritisch ist. Die Sequenz der Formel I kann in einem größeren Polypeptid, beispielsweise einem Fusionsprotein, enthalten sein. Derartige Fusionsproteine können beispielsweise eine Fusion zwischen der N-terminalen Sequenz der Superoxid-Dismutase (menschliche oder Hefe) oder der Beta-Galactosidase umfassen, wobei diese nicht-HIV-1-Sequenzen mit dem N-Terminus der C1-Domäne fusioniert sind. Alternativ können nicht-HIV-1-Sequenzen auch mit dem C-Terminus der C5-Domäne fusioniert werden. Die C1-Domäne kann auch zum Ermöglichen der Sekretion des Analogons des HIV-1-Hüllproteins aus einem das Analogon exprimierenden zellulären Wirt mit einem Signalpeptid (z.B. Hefe-Alphafaktor oder tpa-Signal) fusioniert werden.

Die erfindungsgemäßen Muteine des HIV-1-Hüllproteins können mittels jedes beliebigen Verfahrens hergestellt werden, wie direkte Peptidsynthese oder rekombinante DNA-Expression. Das bevorzugte Verfahren ist die Herstellung der Polypeptide mittels rekombinanter DNA-Techniken.

Die Methodik zur Herstellung derartiger rekombinanter Polypeptide ist auf dem Fachgebiet bekannt. Die Techniken sind in der Literatur ausführlich erklärt. Siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I & III (Hrsg. D.N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Hrsg. M.J. Gate, 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984). Die Herstellung rekombinanter HIV-1-Polypeptide ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe beispielsweise Luciw et al., Nature 312 (1984), 760; Sanchez- Pescador et al., Science 227 (1985), 484; Hahn et al., Nature 312 (1984), 167; Alizon et al., Nature 312 (1984), 757; Ratner et al., Nature 313 (1985), 636; Muesing et al., Nature 313 (1985), 450; Wain-Hobson et al., Cell 40 (1985), 9; EPO Veröffentlichungs-Nrn. 181,150; 187,041; 227,169; 230,222; und PCT Veröffentlichungs-Nrn. WO87/02038; WO87/02989; WO87/04459; WO87/04728. Verfahren zur rekombinanten Expression sind ebenfalls in der gemeinschaftlichen U.S. Patentanmeldung Seriennr. 138,894, angemeldet am 24. Dezember 1987 mit dem Titel "Human Immunodeficiency Virus (HIV) Nucleotide Sequences, Recombinant Polypeptides, and Applications Thereof" offenbart Diese Offenbarung ist hier als Referenz enthalten.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide mittels rekombinanter Verfahren muß eine die Polypeptide codierende DNA-Sequenz bereitgestellt werden. Bei einer derartigen codierenden Sequenz handelt es sich um eine DNA-Sequenz, die unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen in vivo transkribiert und in ein Polypeptid translatiert werden kann. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden bestimmt und umfassen am 5'-(Amino) Terminus das Translations-Startcodon und am 3'-(Carboxy) Terminus ein Translations-Stopcodon. Die die erfindungsgemäßen Polypeptide codierenden DNA-Sequenzen können entweder durch Konstruktion eines synthetischen Gens aus überlappenden Oligonucleotiden hergestellt werden oder mittels zielgerichteter Mutagenese einer das native HIV-1 Hüllprotein codierenden Sequenz. Siehe beispielsweise Zoller & Smith, Meth. Enzymol. 100 (1983), 468-500.

Die die erfindungsgemäßen Polypeptide codierenden DNA-Sequenzen können auf einem Replicon liegen. Bei einem Replicon handelt es sich um ein beliebiges genetisches Element (z.B. Plasmid, Cosmid, Chromosom, Virus), das in vivo bei der DNA- Replikation als autonome Einheit funktioniert, d.h. es ist unter seiner eigenen Kontrolle zur Replikation fähig. Bei Vektoren handelt es sich um Replicons wie ein Plasmid, ein Phage oder ein Cosmid mit denen eine codierende DNA-Sequenz verknüpft sein kann, so daß dieses verknüpfte Segment in vivo repliziert wird.

Anschließend wird ein zellulärer Wirt mit einem die codierende Sequenz unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen enthaltenden DNA-Konstrukt transformiert, so daß man die Expression der codierenden DNA-Sequenz zu dem gewünschten Polypeptid erhält. Zelluläre Wirte können Bakterien (z.B. E. coli, Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae oder Erwinia amylouora), Hefe (z.B. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis, S. kluyveri, Kluyveromyces lactis, Pichia oder Schizosaccharomyces), Säugerzellen (z.B. CHO Zellen, COS Zellen, 293 Zellen oder Xenopus Oocyten) und Insektenzellen (z.B. Drosophila Embryonen oder Spodoptera frugiperda) umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die transformierten zellulären Wirte können die die erfindungsgemäßen Polypeptide codierenden DNA- Konstrukte entweder auf einem extrachromosomalen Element oder in das Chromosom integriert enthalten.

Üblicherweise wird die codierende DNA-Sequenz in eine Expressions-Kassette gesetzt, die die codierende DNA-Sequenz umfaßt, welche von geeigneten regulatorischen Sequenzen flankiert wird, die die Transkriptionsinitiation und -termination innerhalb des zellulären Wirts kontrollieren. Vorzugsweise enthält die Expressions-Kassette an beiden Enden geeignete Restriktionsstellen, um eine Clonierung der Kassette in einen zur Transformation des zellulären Wirts geeigneten Vektor zu ermöglichen.

Bei den von dem zellulären Wirt erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen handelt es sich um regulatorische DNA-Bereiche, die eine codierende Sequenz flankieren. Diese sind für die Transkription einer zu der codierenden Sequenz homologen mRNA verantwortlich, die in das gewünschte Polypeptid translatiert werden kann. Die Transkriptionsinitiationssequenzen umfassen Promotorsequenzen des Wirts. Dabei handelt es sich um regulatorische DNA-Sequenzen, mit der Fähigkeit, RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (3' Richtung) liegenden codierenden Sequenz zu initiieren. Eine codierende Sequenz ist "unter der Kontrolle" von Transkriptionsinitiations- und -terminations-Sequenzen, wenn die RNA-Polymerase an die Transkriptionsinitiations-Sequenzen bindet, die codierende Sequenz in mRNA transkribiert wird, die Transkription an der Transkriptionsterminationssequenz endet, und die mRNA anschließend in das von der codierenden Sequenz codierte Polypeptid translatiert (d.h. Expression) wird.

Mit zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide geeigneten DNA-Konstrukten transformierte zelluläre Wirte läßt man üblicherweise in clonalen Populationen unter für die Expression der interessierenden codierenden DNA-Sequenz geeigneten Bedingungen wachsen. Die geeigneten Wachstumsbedingungen sind abhängig von dem verwendeten zellulären Wirt und den verwendeten regulatorischen Transkriptions- und Translationssequenzen. Nach der Expression wird das rekombinante Polypeptid aus der Kultur mittels eines beliebigen, geeigneten Verfahrens gewonnen z.B. Gelchromatographie, Immunabsorption oder Gelelektrophorese.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können als Reagentien in Immuntests zum Nachweis der Anwesenheit von Anti-HIV-1 Antikörpern oder viralem Antigen in einer Probe verwendet werden. Beispielsweise in einem Immuntest zum Nachweis von viralem Antigen können die erfindungsgemäßen Polypeptide markiert und als kompetitierendes Antigen bei einem kompetitiven Standard ELISA oder Radioimmuntest (RIA) verwendet werden.

Immuntest-Typen unter Verwendung von Antikörpern gegen das HIV-1-Hüllprotein unterscheiden sich stark. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Verwendung der hier beschriebenen Polypeptide in jedem beliebigen Typ. Derartige Typen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe beispielsweise Immunoassay: A Practical Guide (Hrsg. P. W. Chan & M. T. Perlstein, 1987); McDougal et al., J. Immunol. Meth. 76 (1985), 171-183; U.S. Pat. Nrn. 4,629,783; 4,281,061; 4,520,113; 4,591,552; 4,134,792 (hier als Referenz eingeschlossen). Alle derartigen Immuntests weisen drei Schritte auf, unabhängig davon, ob der Testtyp homogen oder heterogen und das Meßverfahren direkt oder indirekt (z.B. Kompetition) ist. Zuerst wird eine flüssige Probe bereitgestellt, von der man annimmt, daß sie die Antikörper enthält. Diese Probe wird dann mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die es jedem der Antikörper mit einem Epitop auf dem Polypeptid ermöglicht, daran zu binden. Schließlich findet ein Nachweisschritt statt, bei dem bestimmt wird, ob irgendein Antikörper an das Polypeptid gebunden hat.

Ein bevorzugter Typ eines Anti-HIV-1-Antikörpertests ist ein heterogener Immuntest, bei dem die erfindungsgemäßen Polypeptide beispielsweise auf einem festen Träger immobilisiert werden. Der geeignete feste Träger zur Immobilisierung der Polypeptide wird in herkömmlicher auf dem Fachgebiet bekannter Weise ausgewählt. In einem üblichen Test wird die Probe, von der man annimmt, daß sie die Antikörper enthält, mit dem immobilisierten Polypeptid in Kontakt gebracht und unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Das immobilisierte Polypeptid wird dann aus der Probe abgetrennt und zum Entfernen jeglicher nicht-gebundener Antikörper gewaschen. Der Nachweisschritt kann beispielsweise so beschaffen sein, daß das gewaschene, immobilisierte Polypeptid mit einem Antikörper in Kontakt gebracht wird, der ein auf den Anti-HIV-1-Antikörpern lokalisiertes Epitop erkennt (d.h. anti-xenogen). Dieser zweite Antikörper wird in für den Nachweis geeigneter Weise markiert (z.B. radioaktiv markiert, mit einem Enzym konjugiert, Avidin/Biotin). Nach einer geeigneten Inkubation und einem Waschschritt wird das immobilisierte Polypeptid dann auf die Gegenwart eines zweiten markierten Antikörpers hin untersucht. Alternativ kann ein kompetitiver Immuntest verwendet werden, wobei ein markierter Referenz-Antikörper gegen das immobilisierte Polypeptid zusammen mit der Probe inkubiert wird, von der man annimmt, daß sie die Anti-HIV-1-Antikörper enthält. Die Gegenwart derartiger Antikörper wird durch Messen einer Verminderung oder Hemmung der Bindung des markierten Referenz-Antikörpers an das immobilisierte Polypeptid bestimmt. Siehe beispielsweise PCT Veröffentlichungs-Nr. WO87/07957.

Die zur Immundiagnose geeigneten Kits, die geeignete markierte Reagentien enthalten, werden durch Verpacken der geeigneten Materialien, einschließlich der erfindungsgemäßen Polypeptide und beliebiger, in dem Test verwendeter Antikörper zusammen mit den für den Testtyp erforderlichen verbleibenden Reagentien und Materialien beispielsweise Inkubationsmedien, Waschmedien und Mitteln zur Messung der Gegenwart des Analyt (z.B. Enzym-markierte Antikörper oder Enzymsubstrat) in geeignete Behältnisse hergestellt. Weitere, bei den erfindungsgemäßen Immuntests hilfreiche Markierungen umfassen Radioisotope und fluoreszierende Verbindungen.

Erindungsgemäße Polypeptide können in einem Säuger zur selektiven Erzeugung von Antikörpern gegen Epitope verwendet werden, die in den konstanten Domänen von gp120env oder gp 160env gefunden wurden. Beispielsweise können in einem Säuger parenteral verabreichte erfindungsgemäße Polypeptide eine Immunreaktion in dem Tier bewirken, wobei Antikörper gegen Epitope hergestellt werden, die in den konservierten Domänen gefunden werden. Derartige Antikörper können zur Herstellung eines polyclonalen Antiserums gewonnen werden. Es können auch Antikörper-herstellende Zellen zur Fusion (oder einer anderen Immortalisierungstechnik) gewonnen werden. Man erhält monoclonale Antikörper-herstellende Zellinien. Siehe beispielsweise M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); U.S. Patente Nrn. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887. Ein mittels des vorstehenden Verfahrens hergestelltes Antiserum hat den Vorteil, daß es einen hohen Antikörpertiter aufweist. Diese Antikörper sind gegen alle oder die meisten HIV-1-Isolate reaktiv. In einer ähnlichen Weise wird das Absuchen von Hybridomen auf nicht-Isolat-spezifische Antikörper durch die Eliminierung einiger oder aller immundominanten Epitope der hypervariablen Bereiche erleichtert.

Zur Erzeugung einer derartigen Antikörperreaktion werden die erfindungsgemäßen Polypeptide üblicherweise zur parenteralen Verabreichung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert. Die Formulierung derartiger Zusammensetzungen, einschließlich der Polypeptidkonzentration und der Auswahl des Trägers und anderer Komponenten ist auf dem Fachgebiet bekannt.

Ein zur parenteralen Injektion geeigneter pharmazeutisch verträglicher Träger wirkt üblicherweise nicht toxisch und nicht therapeutisch. Beispiele für derartige Träger sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringerlösung, Dextroselösung und Hanklösung. Nicht-wäßrige Träger, wie fixierte Öle, Sesamöl, Ethyloleat oder Triglyceride können auch verwendet werden. Parenterale Träger können auch in Form von Suspensionen vorliegen, die Viskositäts-steigernde Agentien enthalten, wie Natrium-Carboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Der Träger enthält üblicherweise auch kleinere Mengen von Zusätzen, wie Stoffe, die die Isotonie oder chemische Stabilität steigern. Beispiele für Puffer umfassen Phosphatpuffer, Bicarbonatpuffer und Trispuffer, während Beispiele für Konservierungsstoffe Thimerosal, m- oder c-Cresol, Formalin und Benzylalkohol umfassen. Die erfindungsgemäßen Muteine können zur parenteralen Verabreichung auch in Liposomen formuliert werden. Standardformulierungen sind entweder flüssige injizierbare oder feste Stoffe, die zur Injektion in einer geeigneten Flüssigkeit, wie einer Suspension oder Lösung aufgenommen werden können. Demgemäß kann der Träger in einer nicht-flüssigen Formulierung Dextrose, menschliches Serumalbumin, Konservierungsstoffe usw. umfassen, zu denen vor der Verabreichung steriles Wasser oder Kochsalzlösung gegeben wird.

Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Adjuvantien bekannt, die auch bei Formulierungen des erfindungsgemäßen Impfstoffs verwendet werden können; z.B. Freund Adjuvans, Avridin, Aluminiumsalze [Al(OH)&sub3;AlPO&sub4;, Al&sub2;(SO&sub4;)&sub8;), Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2;, Saponin, DDA, Plusonics, Öl in Wasser-Emulsionen (enthalten beispielsweise Avridin, Dextransulfat oder Vitamin E), Wasser in Öl-Emulsionen (enthalten beispielsweise Polysorbat 8) und Muramylpeptide (z.B. Di- und Tripeptide in Trägern wie Öl-Wasser- Emulsionen oder Liposomen). Die Auswahl des geeigneten Adjuvans und seine Konzentration in der Zusammensetzung des Impfstoffs ist auf dem Fachgebiet bekannt.

Auf dem Fachgebiet sind viele Vorschriften zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung an Tiere bekannt. Die parenterale Verabreichungsart wird bevorzugt, besonders bevorzugt ist die intramuskuläre, obgleich die Verabreichung auch intravenös erfolgen kann. Die Konzentration des Polypeptidantigens wird in der Impfstoffzusammensetzung so gewählt, daß dem als Wirt dienenden Säuger (z.B. Primat) eine zur Erzeugung von Antikörpern gegen die Epitope des Polypeptids wirksame Dosis verabreicht wird. Man hält die Dosis innerhalb relativ weiter Grenzen nicht für kritisch. Üblicherweise wird die Impfstoffzusammensetzung in einer Weise verabreicht, daß etwa 1 bis etwa 1000 ug des Polypeptidantigens in einem geeigneten Volumen des Trägers (z.B. etwa 1- 10 ml) freigesetzt werden. Vorzugsweise wird bei einer einzigen Immunisierung eine Dosis von etwa 1 bis etwa 500 ug des Polypeptidantigens freigesetzt, stark bevorzugt werden etwa 5-10 bis etwa 100-200 ug (z.B. 10-100 ug). Gegebenenfalls kann auch einige Wochen bis einige Monate nach der Anfangs- Immunisierung die Verabreichung einer zweiten Auffrischungs- Immunisierung an den Säuger bevorzugt sein. Zur Aufrechterhaltung eines hohen Antikörpertiters kann die erneute Verabreichung einer Auffrischungs-Immunisierung an den Säuger jeweils einmal nach mehren Jahren hilfreich sein.

Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung. Es ist nicht beabsichtigt, den beanspruchten Schutzbereich in irgendeiner Weise einzuschränken.

Beispiele I

Das folgende Beispiel beschreibt die Konstruktion von DNA- Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Muteine des HIV-1 SF2 Hüllproteins codieren. Die hypervariablen Bereiche und die entsprechenden Deletionen sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1 Hypervariable Bereiche und Deletionsmutanten
Hypervariable Bereiche entsprechende Deletionsmutante(n)

Die die erfindungsgemäßen Muteine codierenden DNA-Sequenzen werden mittels Mutagenese des gp120env SF2-Gens hergestellt. Die Mutagenese wurde unter Verwendung des von Zoller und Smith, Meth. Enzymol. 100 (1983), 468-500, beschriebenen, wie nachstehend beschrieben, modifizierten Verfahrens erreicht. Synthetische Primer zur DNA-Mutagenese und zum Sequenzieren (Tabelle 2) wurden mittels automatisierter Oligonucleotidsynthese auf einem Siliziumdioxidträger unter Verwendung von N,N-Diisopropyl-phosphoramidit hergestellt, wie bei Urdea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 7461-7465 beschrieben. Die Primer zum Sequenzieren wurden zur Sequenzierung mittels des Didesoxynucleotid-Kettenabbruch-Verfahrens in dem Bacteriophagen M13 entworfen, Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463. Die Primer zum Sequenzieren wurden so entworfen, daß sie zu den rekombinanten M13mp8-Matrizen komplementär waren, eine Länge von 18 Basen aufwiesen und an einer mindestens 50 Basen vom Mutationsort entfernt liegenden Position banden. Tabelle 2 gibt die zur Mutagenese, zum Absuchen und Sequenzieren verwendeten Oligomere an.

Die zur Mutagenese verwendete Matrize enthielt das gesamte Plasmid pSV7dARV120tPA. Dieses enthält das mit der tPA- Signalsequenz (nachstehend beschrieben) verbundene gp120env SF2-Gen. Das Plasmid wurde an seiner einmal vorkommenden PstI- Schnittstelle linearisiert und in die einmal vorkommende PstI- Schnittstelle von M13mp8 cloniert.

Tabelle 2
Primer für die Mutagenese Primer zur DNA-Sequenzierung
Sonden zum Absuchen

Die Mutagenese von M13/pSV7dARV120tPA Rekombinanten wurde unter Verwendung gereinigter Matrizen mittels Anheften und Verlängern des geeigneten Primers durch das Klenow-Fragment der DNA Polymerase I durchgeführt. In einer einzigen Mutageneserunde wurden mittels für die Mutagenese geeigneter Primer die individuellen Deletionsmutanten D1, D2, D3 und D5 erhalten (siehe Tabelle 2). Die Deletionsmutante D4 wurde mittels des geeigneten Primers zur Mutagenese erhalten, indem die Anheftungs- und Verlängerungs-Reaktionen bei 37ºC in Gegenwart von 125 ug/ml Gen 32 Protein durchgeführt wurden. Die Kombinations-Deletionsmutante D1+D2 wurde mittels des geeigneten Primers zur Mutagenese unter Verwendung einer von der Deletionsmutante D1 stammenden Matrize erhalten.

Nach der Transfektion von JM101 Zellen (Zoller und Smith, vorstehend) ließ man die Plaques in einer Dichte von 200- 1000/Platte wachsen. Sie wurden auf Filter übertragen und mittels Hybridisierung mit dem geeigneten Mutagenese-Primer oder Sonde (siehe Tabelle 2) abgesucht.

Die DNA-Sequenz der möglichen positiven Clone wurde mittels geeigneter Primer- und Matrizen-Präparationen bestimmt. Nach der Bestätigung des mutagenisierten Locus und der flankierenden Segmente (d.h. mindestens 50 Basen) mittels DNA-Sequenzanalyse wurden die replikativen DNA-Formen (RF) mittels der Restriktionsendonuclease PstI gespalten. Der gesamte, die Deletion enthaltende Säuger-Expressionsvektor pSV7dARV120tPA wurde gewonnen. Der Vektor stellt einen frühen Promotor aus SV40 und einen Enhancer für die Expression des SF2 gp120env- Gens, eine SV40 Polyadenylierungsstelle und einen Replikationsstartpunkt aus SV40 zur Verwendung des Vektors in COS- Zellen bereit.

Nach der Gewinnung der pSV7dARV120tpa Plasmide aus dem gp120 Wildtyp oder einer Deletionsmutante, wurde das Plasmid zum Herausschneiden des gesamten mit den menschlichen tPA 5'- nichtranslatierten und Signal-Sequenzen verbundenen Gens mit SalI gespalten. Das SalI-Fragment wurde in die einmal vorkommende SalI Clonierungsstelle des zur Expression in Säugerzellen verwendeten Expressionsvektors pCMV6a subcloniert. Das erhaltene Plasmid wurde auf die korrekte Orientierung des Gens bezüglich des Promotors und der Polyadenylierungssignale überprüft. Dieses die Wildtyp gp120-Sequenzen enthaltende Plasmid wurde als pCMV6ARV120tpa bezeichnet. Falls der pSV7d- Vektor nicht direkt als Plasmid gewonnen wurde, wurde das das Gen enthaltende SalI-Fragment aus dem die Matrize für die Mutagenese enthaltenden M13-Clon in pCMV6a subcloniert.

Die Kombinations-Deletionsmutante D4-D5 wurde mittels des geeigneten D5-Mutageneseprimers unter Verwendung einer von der Deletionsmutante D4 stammenden Matrize erhalten.

Die Kombinations-Deletionsmutante pSV7d120D3-D4-D5 wurde durch Subclonierung des D4-D5 enthaltenden Bereichs erhalten. Dies erfolgte durch MstII und HindIII-Spaltung von M13pSV7d120D4-D5 und Insertion dieses 334 bp-Fragments in das MstII-HindIII gespaltene pSV7d120D3. Zur Herstellung von pCMV6a120D3-D4-D5 wurde das D3-D4-D5 enthaltende SalI-Fragment aus pSV7d120D3-D4-D5 in die SalI-Schnittstelle von pCMV6a subcloniert.

Die Kombinations-Deletionsmutante D1-D2-D5 wurde durch Subclonierung des D1-D2 enthaltenden Bereichs erhalten. Dies erfolgte durch NheI- und BglII-Spaltung von pcMV6a120D1-D2 und Insertion dieses 540 bp-Fragments in das NheI und BglII gespaltene pCMV6a120D5.

Die Kombinations-Deletionsmutante D1-D2-D3-D4-D5 wurde durch Subclonierung des den D1-D2-Bereich enthaltenden Fragments erhalten. Dies erfolgte durch NheI- und BglII-Spaltung von M13pSV7d120D1-D2 und Insertion dieses 539 bp-Fragments in das NheI und BglII gespaltene pcMv6a120D3-D4-D5.

Der Expressionsvektor pCMV6a kann durch Herausschneiden der gp120 codierenden Sequenz aus pcMV6ARV120tpa mit SalI wieder hergestellt werden. Die vorstehend beschriebenen Mutein codierenden Sequenzen können alle aus der gp120 codierenden Wildtypsequenz in pcMV6ARV120tpa, wie für pSV7dARV120tpa beschrieben, hergestellt werden. Tabelle 3 stellt alle Bezeichnungen und Deletionen der verschiedenen, gemäß der vorstehenden Vorschrift hergestellten auf M13-pSV7d und pCMV6a basierenden Vektoren dar.

Tabelle 3
Gen Version Vektor Wild-typ nicht hergestellt

pSV7dARV120tPA (Figur 3) wurde wie folgt hergestellt. Ein env-Gen wurde zur Entfernung jeder möglichen transmembranen Domäne und zur Bereitstellung eines der Prozessierungsstelle zwischen den gp120- und gp41-Domänen des gp160-Proteins folgenden Stopcodons mittels in vitro-Mutagenese modifiziert. Diese Mutagenese wurde durch Subclonieren des das env-Gen aus Clon pSV7c/env (ATCC Hinterlegungsnr. 67593) codierenden Fragments durchgeführt. Dies erfolgte durch Ausschneiden mit HindIII und XhoI (Positionen 5582 und 8460 im SF2-Clon) und Inserieren des 2.8 kb-Fragments in den zuvor mit HindIII und SalI gespaltenen M13mp19. Ein 37 bp-Oligonucleotid der folgenden Sequenz wurde zum Verändern der Sequenz an der gp120/gp41 Prozessierungsstelle in Position 7306 dahingehend verwendet, daß zwei Stopcodons und zwei Stellen für Restriktionsendonucleasen codiert werden.

Nachstehend ist die Sequenz des Wildtyp-Gens und der Mutante dargestellt:

Wildtyp-Sequenz: Prozessierungsstelle Position: Aminosäure: DNA: gp 120-Mutante: Restriktionstelle

Nach der Mutagenese wurde das Gen für die optimale Sekretion in das Medium modifiziert. Ein 268 bp XbaI-NdeI-Fragment, das die heterologen, mit dem 5'-Ende von env fusionierten 5'- nichttranslatierten- und Signal-Sequenzen des menschlichen tPA enthält, wurde aus dem nachstehend beschriebenen M13-Clon M13tpaS.NheIenv ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit einem den Rest des codierenden gp120 Bereichs codierenden 1363 bp NdeI-SalI-Fragment ligiert, das aus der vorstehend beschriebenen gp120-Mutante (Positionen 5954 und 7317) isoliert wurde. Beide Fragmente wurden in den zuvor mit XbaI und SalI gespaltenen Vektor pSV7d (nachstehend beschrieben) inseriert.

Der Expressionsvektor pSV7d kann durch Spalten von pSV7c/env mit BglII und XbaI und anschließender Ligation des gespaltenen Plasmids mit dem folgenden Linker hergestellt werden:

M13tpaS.NheIenv wurde wie folgt hergestellt. Das 5'-Ende der codierenden env-Sequenz wurde so modifiziert, daß sie mit einer heterologen Signalsequenz kombiniert wurde, von der bekannt war, daß sie eine effiziente Sekretion des homologen Gens (menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator) und der Deletionsvarianten des Gens bewirkt. Van Zonnefeld et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 4670.

Ein in einem Lambdaphagen (ATCC Hinterlegungsnr. 40143) enthaltener Bereich des HIV-1 SF2-Gens wurde mit SacI und StuI (Positionen 5555 und 6395) ausgeschnitten und in den Vektor M13mp19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-109), zwischen SacI und SmaI subcloniert. Die zielgerichtete Mutagenese mittels eines Oligonucleotids (Zoller et al., Meth. Enzymol. 100 (1983), 468-500) wurde zur Herstellung einer NheI-Schnittstelle am Übergang des natürlich vorkommenden Signalpeptids zu dem reifen Hüll-Polypeptid mittels des folgenden Oligonucleotids verwendet:

Diese Mutagenese ändert das Cytosin-5867 in ein Guanin und das Adenin-5868 in ein Cytosin. Dabei entsteht eine NheI- Schnittstelle, und das Threonin-30 Codon codiert ein Serin.

Parallel wurde das tPA-Gen in ähnlicher Weise in M13 mutagenisiert, so daß eine NheI-Schnittstelle in der Nähe des Carboxylendes des tPA-Signalpeptids entstand. Die nachstehenden Sequenzen stellen die 5'-nichttranslatierten- und Signal-Sequenzen des Wildtyp-tPA-"Leaders" und der NheI-Variante dar.

Wildtypsequenz des tPA-Signals:

5'-nichttranslatierte Sequenzen

Die NheI-Variante des tPA-Signals:

5'-nichttranslatierte Sequenzen

Nach der Mutagenese und einer Überprüfung der Sequenz wurde ein 174 bp-Fragment, das 99 bp der 5'-nichttranslatierten- und der Signal-Sequenz von tPA enthält, aus dem tPA-enthaltenden M13-Clon mittels SalI und NheI herausgeschnitten und mit dem das 5'-Ende des env-Gens enthaltenden 559 bp- Fragment fusioniert, das aus dem env-enthaltenden M13-Clon mit NheI und HindIII (aus dem M13-Polylinker stammend) herausgeschnitten wurde. Diese Fragmente wurden zwischen SalI und HindIII in M13mp18 subcloniert. Man erhält das Plasmid M13tpaS.NheIenv. Die DNA- und Aminosäuresequenz des mit dem 5'-Ende des env-Gens fusionierten tPA-Signals lautet:

tPA Signal (Aminosäure 31 des env)

Beispiel II

Dieses Beispiel beschreibt die Expression von HIV-1 env- Analoga in Säugerzellen.

Die das vollständige env-Gen codierende DNA mit der daran fusionierten tPA-Signalsequenz wurde aus dem Plasmid pSV7dARV120tpa mittels der Restriktionsendonuclease SalI herausgeschnitten. Diese wurde in die einmal vorkommende SalI- Schnittstelle des Säuger-Expressionsvektors pCMV6a inseriert. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde auf die korrekte Orientierung des Gens bezüglich des Promotors und der Polyadenylierungssignahe überprüft (siehe Beipiel I). Das erhaltene Plasmid pCMV6ARV120tPa und das Plasmid psV7dARV120tpa wurden zur Überprüfung der Expression und Sekretion von gp120 in das Medium in COS-7-Zellen transfiziert. In diesen Zellen war pCMV6ARV120tpa im Vergleich zu dem Expressionsplasmid pSV7dARV120tpa bei der Expression von gp120 mindestens 50mal effizienter.

Permanente Zellinien wurden wie folgt isoliert:

Menschliche 293-Nierenzellen wurden in einer Dichte von 50- 70% Konfluenz in DME ausplattiert. Dieses wurde ergänzt durch Glutamin (292 mg/l), Natriumpyruvat (110 mg/l), Glucose (4.5 g/l), Penicillin (1000 U/l), Streptomycin (1000 U/l), 3.7 g/l Natriumbicarbonat und fetales Kalbsserum (10% V/V). Die Zellen wurden 6 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 10% CO&sub2; einer Calciumphosphat-Copräzipitation gemäß Standardtechniken ausgesetzt, unter Verwendung von jeweils 10 ug des HIV-env Expressionsplasmids pCMV6ARV120tpa (Wildtyp oder Deletionsmutante) und eines den selektierbaren Marker Neomycin-Resistenz codierenden Plasmids pSV2neo (Ref). Die Zellen wurden gewaschen und einem 3 bis 4-minütigen Schock in 15% DMSO oder Glycerol enthaltender HEPES-gepufferter Kochsalzlösung ausgesetzt. Das Wachstumsmedium (vorstehend beschrieben) wurde über 48 Stunden ausgetauscht. Mit Trypsin behandelte Zellen wurden in einer geringeren Dichte auf 400 ug/ml G418 (Sigma) enthaltendem, wie vorstehend ergänztem DME erneut ausplattiert. Die Kolonien wuchsen innerhalb von einer Woche bis zehn Tagen zu dem Stadium, in dem 100 Zellen pro Focus vorliegen. Diese Kolonien wurden individuell auf 96 Vertiefungen enthaltende Platten übertragen. Durch Testen des konditionierten Zellmediums mittels des nachstehend beschriebenen ELISA wurden die Clone auf die gp120-Herstellung überprüft. Die positiven Clone wurden in T75-Flaschen vermehrt, Aliquots der Zellen eingefroren und die Zellüberstände zur weiteren Charakterisierung gesammelt z. B. CD4 Bindung.

Alternativ wurden mit einer Dichte von 50-70% Konfluenz ausplattierte CHO dhfr-Zellen mittels Calciumphosphat-Copräzipitation unter Verwendung von jeweils 10 ug des Plasmids pCMV6ARV120tpa (oder dem analogen Deletionsmutanten-Expressionsvektor) und des den selektierbaren Marker dhfr codierenden Plasmids pAd-dhfr cotransfiziert. Nach der Behandlung mit Copräzipitations- und Schock-Lösungen, wie vorstehend beschrieben, wurden die Zellen 48 Stunden in durch Glutamin (292 mg/l), Natriumpyruvat (110 mg/l), Natriumbicarbonat (3.7 g/l), Glucose (4.5 g/l), Penicillin (1000 U/l), Streptomycin (1000 U/l), Prolin (150 mg/l) und fetales Kalbsserum (10%) ergänztem Ham F12 inkubiert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion in einer Dichte von etwa einem Zehntel in ergänztem, wie vorstehend für F12 beschrieben, DME ausplattiert, außer, daß das fetale Kalbsserum durch dialysiertes fetales Kalbsserum (10%) ersetzt wurde. Die Kolonien wurden nach etwa 2 Wochen individuell auf 96 Vertiefungen übertragen, und anschließend mittels des ELISA-Tests dahingehend überprüft, ob gp120 in das Medium sekretiert wird. Positive Clone wurden, wie vorstehend beschrieben, vermehrt.

Zum Nachweis von gp120 oder gp120-Mutanten mit Deletionen in dem hypervariablen Bereich in den Überständen von COS-, CHO- oder 293-Zellen, wurde konditioniertes Medium mittels eines für gp120-Sequenzen spezifischen ELISA getestet. Mittels Standardtechniken wurden vereinigte, menschliche durch Behandlung mit Psoralen inaktivierte, HIV-positive Seren über Staphylococcus Protein A Sepharose affinitätsgereinigt. 96 Vertiefungen enthaltende Immunlon 1 ELISA-Platten wurden mit diesem Serum in einer Konzentration von 5 ug/ml in PBS beschichtet. Die Platten wurden 12 Stunden bis 2 Monate bei 4ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten, wie für den Titrations-ELISA (Beispiel IV) beschrieben, gewaschen. Die Proben und Standards (einschließlich des gereinigten rekombinanten HIV-1 gp120env aus Hefe) wurden in zweifachen Verdünnungsreihen unter Verwendung des für den Titrations-ELISA beschriebenen Verdünnungspuffers auf die Platte gegeben. Der Nachweisbereich liegt bei 100 ng/ml bis 200 pg/ml. Die Proben wurden 12 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die Proben wurden abgesaugt und die Platten wie vorstehend gewaschen. Die Proben wurden dann mit Kaninchenserum in einer geeigneten Verdünnung 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, das aus mit einem rekombinanten SF2 gp120env Analogon (üblicherweise eine 1:100 Verdünnung von über Protein A Sepharose affinitätsgereinigtem Serum in Verdünnungslösung) immunisierten Kaninchen stammte und anschließend gewaschen. Die Farbentwicklung erfolgte, wie bei dem Titrations-ELISA beschrieben, mit ABTS. Die Platten wurden gelesen, wie beschrieben. Die gp120-Menge in jeder Probe wurde mittels einer von dem Standard auf der gleichen Platte stammenden Standardkurve bestimmt. Der Test wurde durch den Nachweis überprüft, daß HIV-infizierte HUT 78-Zellen (infiziertes Zellysat) ein positives Signal ergaben, während nicht-infizierte Zellysate negativ waren.

Beispiel III

Dieses Beispiel beschreibt die erfindungsgemäße, rekombinante Herstellung der Muteine in Hefewirten.

Das zur Herstellung des Hefe-Expressionsvektors verwendete Ausgangsplasmid war das Plasmid pJS150. Dieses Plasmid ähnelt dem Plasmid pBS24.1/SOD-SF2env4-5 (U.S. Anm.Nr. 138,894, angemeldet am 24. Dezember 1987, vorstehend). Der Hefepromotor und die codierenden HIV-Sequenzen, die zwischen den einmal vorkommenden BamHI und SalI-Schnittstellen liegen, wurden durch einen Hefe-ADH2/GAPDH-Promotor und einen Bereich der das Hüllprotein codierenden Sequenz aus einem HIV-1-Isolat aus Zaire ersetzt. Zusätzlich wurde die sich in dem Plasmidvektorbereich befindene NheI-Restriktionsstelle durch Schneiden mit NheI, S1 Nuclease-Behandlung und anschließender Ligation zerstört.

Das Plasmid pJS150 wurde mit dem Restriktionsenzym NcoI gespalten, das direkt hinter dem stromabwärts vom ADH2/GAPDH- Promotor liegenden Translationsinitiations-Codon ATG (ebenso wie an anderen Schnittstellen des Vektors) schneidet. Die Fragmente wurden mit einem NcoI/NheI-Adaptor der folgenden Sequenz ligiert:

Nach der Ligation wurden die DNA-Sequenzen mit BamHI und NheI gespalten. Man erhält ein 1.2 kb BamHI-NheI-Fragment, das den ADH2/GAPDH-Promotor und unmittelbar stromabwärts ein überhängendes NheI-Ende aufweist. Dieses Fragment wurde mittels Gelelektrophorese isoliert und als Fragment A bezeichnet.

In einer zweiten Spaltung wurde das Plasmid pJS150 mit BamHI und SalI geschnitten. Man erhält einen linearisierten DNA- Vektor von 13 kb. Dieses DNA-Fragment wurde ebenfalls mittels Gelelektrophorese gereinigt und als Fragment B bezeichnet.

Ein drittes DNA-Fragment, das die das gp120D3-Mutein codierende Sequenz enthält, wurde mittels einer NheI-SalI-Spaltung aus pCMV6a120D3 (Tabelle 3 in Beispiel I) isoliert. Das annährend 1.2 kb große codierende Fragment wurde dann aus einem Gel isoliert und als Fragment C bezeichnet.

Die drei Fragmente (A, B, und C) wurden dann miteinander ligiert und das erhaltene Ligationsgemisch zur Transformation des E. coli-Stamms HB101 verwendet. Es wurde auf Ampicillinresistenz selektiert. Ein alle drei Fragmente in der korrekten Orientierung enthaltendes Plasmid ist in Figur 5 dargestellt. Dieser D3 Hefe-Expressionsvektor wurde als pHL15 bezeichnet. Expressionsvektoren für weitere Muteine wurden ebenfalls mittels Clonieren der Mutein codierenden Sequenz aus den auf pCMV6a basierenden Vektoren (Beispiel I, Tabelle 3) in den NheI/SalI gespaltenen pHL15 konstruiert, wobei die D3 codierende Sequenz ersetzt wird. Die Deletionen und entsprechenden Vektoren, die hergestellt wurden, sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4
Deletion Vektor

Die vorstehend beschriebenen Hefe-Expressionsvektoren wurden zur Transformation des Stamms Saccharomyces cerevisiae JSC308 (ATCC Hinterlegungsnr. 20879, hinterlegt am 5. Mai 1988) verwendet. Es wurde auf Uracil-Prototrophie selektiert. Uracil-prototrophe Transformanten wurden dann zur Isolierung von Leucin-Prototophen (als Ergebnis einer in vivo Plasmidamplifikation) auf Leucin selektiven Platten ausgestrichen. Die Expression der Deletionsmuteine wurde erreicht, indem eine Impfkultur der Leucin-Prototrophen in Leucin selektivem Medium angezogen und dann mit Hefeextrakt, Pepton und Glucose enthaltendem Vollmedium auf etwa 10 l verdünnt wurde. Als Kohlenstoffquelle wurden je nach Einschätzung, entweder 2 oder 4% Glucose in den Medien verwendet.

Die Muteine wurden wie folgt gereinigt. Gefrorene Hefezellen wurden aufgetaut und in einem Volumen Lysepuffer (0.001 M PMSF, 0.001 M EDTA, 0.15 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl pH 8.0) suspendiert und 1 Volumen mit Säure gewaschene Glasperlen zugegeben. Die Zellen wurden 10 Minuten bei 3000 Upm in einem nicht-kontinuierlichen System mittels einer 300 ml Glaseinheit einer Dyno-Mühle aufgeschlossen. Die Ummantelung wurde mittels einer -20ºC Ethylenglycollösung gekühlt. Die Glasperlen werden dekantiert, indem man das Gemisch 3 Minuten auf Eis absitzen läßt. Der Zellextrakt wurde gewonnen und 35 Minuten bei 18000 Upm (39200 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Präzipitat (Pellet 1), wie nachstehend beschrieben, weiter behandelt.

Das Pellet 1 wurde in 4 Volumen Tris-HCl-Puffer resuspendiert (0.01 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.01 M NaCl, 0.001 M PMSF, 1 ug/ml Pepstatin, 0.001 M EDTA, 0.1% SDS) und 1 Stunde bei 4ºC unter Schütteln extrahiert. Die Lösung wurde 15 Minuten bei 6300 x g zentrifugiert. Die unlösliche Fraktion (Pellet 2) wurde in 4 Volumen (360 ml) PBS resuspendiert (pro Liter: 0.2 g KCl, 0.2 g KH&sub2;PO&sub4;, 8.0 g NaCl, 2.9 g Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O), 0.1% SDS, 0.001 M EDTA, 0.001 M PMSF, 1 ug/ml Pepstatin und 15 Minuten bei 6300 x g zentrifugiert. Dieses Pellet (Pellet 3) wurde in 4 Volumen PBS, 0.2% SDS, 0.001 M EDTA, 0.001 M PMSF, 1 ug/ml Pepstatin suspendiert und 12 Stunden bei 4ºC unter Schütteln auf einem Röhrchen-Schüttler extrahiert. Die Lösung wurde dann 15 Minuten bei 6300 x g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird zur weiteren Reinigung, wie nachstehend beschrieben, gewonnen. (Das Pellet kann nochmals extrahiert werden, indem es in 4 Volumen 2.3% SDS, 5% Beta-Mercaptoethanol resuspendiert und 5 Minuten gekocht wird. Nach dem Kochen wird die Lösung 15 Minuten bei 6300 x g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion wird zur weiteren Reinigung gewonnen).

Die lösliche Fraktion wurde mittels einer Fällung mit 30% Ammoniumsulfat bei 4ºC konzentriert. Das Pellet (Pellet 4) wurde dann in 2.3% SDS, 5% Beta-Mercaptoethanol resuspendiert und auf einer ACA 34 oder ACA 54 (LKB Products) Gelfiltrationssäule (in Abhängigkeit von der Muteingröße) chromatographiert. Die Säule wurde bei Raumtemperatur mit PBS, 0.1% SDS equilibriert. Die Chromatographie wurde in der gleichen Lösung mit einer Durchflußrate von 0.3 ml/Min. entwickelt. Gegebenenfalls wurden vereinigte Fraktionen mittels Vakuumdialyse mit einem Spectrapor #2 (Ausschluß bei MG von 12-14K) konzentriert.

Beispiel IV

Dieses Beispiel beschreibt einen Immuntest für Anti-HIV-Antikörper unter Verwendung von HIV-1 env-Analoga.

96 Vertiefungen enthaltende Immunlon-1 Immuntestplatten werden mit gp120-Antigen beschichtet, indem über mindestens 12 Stunden und weniger als 60 Tage pro Vertiefung 100 ul 2 ug pro ml in Hefe hergestelltes, gereinigtes Antigen (Env SF2- Wildtyp, env HTLV-Wildtyp, env Zr6 Wildtyp, env SF2-D3, env SF2-D1-D2, env SF2-D3-D4-D5, env SF2-D1-D2-D3-D4-D5) enthaltende 50 mM Boratlösung, pH 9.2 bei 4ºC verteilt wurde. Die Beschichtung wird von der Platte abgesaugt, und diese 6 mal durch Eintauchen in eine 0.137 M NaCl (0.8%), 0.05% Triton-X-100 enthaltende Lösung gewaschen. Die Platte wird trocken getupft und pro Vertiefung 100 ul Natriumphosphat, 0.1% Casein, 1 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0.5 M NaCl, 0.01% Thimerosal, pH7.5 (Verdünnungslösung) zugesetzt.

Die zu testenden Seren werden für die Analyse vorbereitet, indem 5 ul Testserum (aus HIV-positiven und normalen Menschen oder aus immunisierten Tieren) in 500 ul der vorstehenden Verdünnungslösung (1/100 Verdünnung V/V) verdünnt werden. Die Lösung in den oberen Vertiefungen wird abgesaugt und 150 ul verdünntes Testserum zugesetzt. Mittels einer auf 50 ul eingestellten Multikanalpipette wurden Verdünnungen jede Reihe herunter durchgeführt, wobei jedes Mal 50 ul entnommen werden (1/3 Verdünnung V/V). Die Platten werden dann 1 Stunde bei 37ºC, in Plastikfolie eingewickelt, inkubiert. Die Proben werden dann abgesaugt und 6-mal wie vorstehend gewaschen. Anschließend werden pro Vertiefung 100 ul mit Meerrettich- Peroxidase (Tago 2733 Lot 330102) konjugiertes, 1/2000 mit Verdünnungslösung verdünntes Anti-menschliches IgG aus der Ziege zugesetzt. Die Platten werden dann 30 Minuten bei 37ºC, mit Plastikfolie bedeckt, inkubiert. Die Lösung wird wieder abgesaugt und 6-mal wie vorstehend gewaschen. Es werden pro Vertiefung 100 ul Farbentwicklungslösung zugesetzt [100 ul ABTS Stammlösung (15 mg/ml 2, 2'-Azino-di-(3 ethyl-benzthiazolensulfonsäure), Sigma A-1888, in Wasser bei 4ºC im Dunkeln gelagert), plus 3.3 ul 30%iges Wasserstoffperoxid in 10 ml Citratpuffer (10.5 g Citronensäure pro Liter, pH 4.0 mit NaOH eingestellt)]. Die ABTS-Lösung wird frühestens 10 Minuten vor der Anwendung hergestellt. Die Lösung soll mit Citratpuffer hergestellt werden, der Raumtemperatur aufweist. Die Platten werden im Dunkeln 30 Minuten bei 37ºC, in Plastikfolie eingewickelt, inkubiert. Die Reaktion wird mit 50 ul 10%igem Natrium-Dodecylsulfat pro Vertiefung abgestoppt.

Die Platten werden bei 415 nm mit einer Referenzwellenlänge von 600 nm gelesen. Die Titer werden aus den Rohdaten wie folgt bestimmt: die Absorption (lineare Achse) wird gegen den Verdünnungsfaktor (log Achse) auf halblogarithmischem Papier oder mittels eines Computerprogramms aufgetragen.

In den Testseren sind Standard-Referenzseren als positive Kontrollen enthalten. Zur Titration der menschlichen Seren wurde das HIV-positive Serum 20058 aus dem "Interstate Panel" verwendet; für die Ziegenseren wurde ein durch Immunisierung mit env SF2-Wildtyp entwickeltes Ziegenserum, Referenz O2GTO97.2 verwendet; und zur Titration von Meerschweinchenseren wurde ein in ähnlicher Weise durch Immunisierung mit env SF2-Wildtyp erhaltenes Standard-Referenz-Meerschweinchenserum, Referenz +GpSeren 1935/77, verwendet. Aus den mittels des ELISA-Lesegeräts erhaltenen Werten wurde ein Wert für die Absorption gewählt, der im linearen Bereich der Standardkurve (positive Kontrolle) halbmaximal für jede Platte ist (OD&sub5;&sub0;)(zwischen 0.5 und 0.7). Es wurde der durchschnittliche Titer dieser Standards auf der Platte bestimmt. Der durchschnittliche Titer wurde durch den "Referenztiter" dieser Spezies und Antigenplatte geteilt. Der erhaltene Wert ist der "Korrekturfaktor". Zum Erhalt der korrigierten, normalisierten Titer wurden die Titer der Testseren durch den Korrekturfaktor geteilt.

Eine Reihe ausgewählter menschlicher Seren wurde zur Bestimmung ihrer Titer mit allen rekombinanten Antigenen, einschließlich der Deletionsmuteine env SF2-D1-2, env SF2-D3, env SF2-D1-2-3-4-5 und env SF2-D3-4-5 getestet. Die Ergebnisse sind in Figur 6 (nordamerikanische Serumreihe) und Figur 7 (afrikanische Serumreihe) zusammengefaßt. Die Graphen zeigen, daß bei diesen Serumproben das rekombinante Antigen env SF2-D1-2 ebenso wirksam oder wirksamer beim Nachweis von Seren ist wie der env SF2-Wildtyp. Die rekombinanten Antigene env SF2-D3, env SF2-D3-4-5 und env SF2-D1-2-3-4-5 sind ebenso wirksam wie env HTLVIII-Wildtyp oder env Zr6-Wildtyp.

Beispiel V

Dieses Beispiel beschreibt die Immunisierung von Säugern mit rekombinanten Muteinen des hypervariablen Bereichs und den Nachweis der Immunantworten dieser Tiere als Reaktion auf diese Injektionen. Aus Hefe gereinigte rekombinante env-Antigene wurden zur Herstellung von Anti-HIV Antikörpern mit sehr hohem Titer in Versuchstieren verwendet. Bei Ziegen und Meerschweinchen waren die Titer der erhaltenen Seren vergleichbar, unabhängig davon, ob das Immunogen ein env SF2- Wildtyp oder ein env SF2 hypervariables Mutein war.

Immunisierung von Meerschweinchen

Zur Untersuchung, ob mit aus Hefe stammenden env SF2-Muteinen immunisierte Meerschweinchen zu einer starken Immunantwort fähig waren, wurden diese Tiere mit verschiedenen Muteinen und Kontrollantigenen immunisiert.

Für jedes Antigen wurden 6 Hartley Meerschweinchen in Abständen von 3 Wochen mit 50 ug jedes Antigens gemischt mit 50 ug Adjuvans (siehe nachstehend) mittels insgesamt sieben Injektionen in den Fußballen immunisiert. Zum Zeitpunkt jeder Injektion wurden Blutproben entnommen (Vorblut bei der 1. Injektion). Das Serum wurde mittels Titration in dem vorstehend in Beispiel IV beschriebenen ELISA auf die Herstellung von gegen das immunisierende Antigen und heterologe env- Antigene gerichteten Antikörpern überprüft.

Antigene:

Env SF2-D3

Env SF2-D-1-2-3-4-5

Env SF2-D3-4-5

Env HTLVIII Wildtyp

Adjuvans:

Muramyl-tripeptid-phosphatidyl Ethanolamin in Squalen-Tween.

Impfstoff:

Zum Erhalt des korrekten Volumens und Dosierung wird das Adjuvans mit einem korrekten Volumen 10x Squalen-Tween (Träger) zu einer Endkonzentration von 1x (4% Squalen, 0.008% Tween-20), dem Antigen und PBS gemischt (jeweils 50 ug Antigen und Adjuvans in 100 ul Injektionsvolumen pro Tier). Das Gemisch wird 5 Minuten auf 45ºC erwärmt. Das warme Gemisch wird 6-mal in eine 23 ga. Nadel eingesaugt und wieder herausgedrückt. Dabei wird darauf geachtet, daß das Einführen von Luft in das Gemisch vermieden wird. Die Injektion in die Tiere erfolgt sofort. Falls für das Injektionsverfahren mehr als 5 Minuten benötigt werden, muß die Emulsion alle paar Minuten durch Schütteln mit der Hand erneut gemischt werden.

Kontrolle:

Kontrolltiere erhalten das in dem Träger enthaltene Adjuvans.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse des ELISA sind in Figur 8 zusammengefaßt. Daraus geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Muteine bei der Erzeugung hoher Antikörpertiter ebenso wirksam sind wie das Wildtyp-Hüllprotein. Mit den Seren aus den Meerschweinchen wurde auch ein Standard-Virus-Neutralisations-Test durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Aus den Daten geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Deletionsmutanten eine signifikante Menge neutralisierender Antikörper erzeugen können.

Tabelle 5 Virusneutralisation durch Meerschweinchen-Seren
Antigen Tier Nummer ELISA Titer/env SF2 Neutralisation Titer HIV-SF2 Env SF2 D3 (COOH-Hälfte) Env SF2 D(3-5) (vollständige Länge)

Immunisierung von Ziegen

Zur Überprüfung, ob mit aus Hefe stammenden env SF2-Muteinen immunisierte Ziegen zu einer starken Immunantwort fähig waren, wurden diese Tiere mit verschiedenen Muteinen und Kontrollantigenen immunisiert.

Für jedes Antigen wurden zwei Ziegen in Abständen von 3 Wochen mit insgesamt 6 Injektionen intramuskulär mit 1 mg je Erstinjektion (vollständiges Freund Adjuvans) und 0.5 mg je Auffrischungsinjektion (unvollständiges Freund Adjuvans) immunisiert. Zum Zeitpunkt jeder Injektion wurden Blutproben entnommen (Vorblut bei der 1. Injektion). Die Seren wurden mittels Titration in dem vorstehend in Beispiel IV beschriebenen ELISA auf die Herstellung von gegen das immunisierende Antigen und heterologe env-Antigene gerichteten Antikörpern überprüft.

Antigene: Env SF2-D3 Lot 3064/1a

Env SF2-D1-a2-3-4-5 Lot 3064/5a

Env HTLVIII Wildtyp Lot 3064/15a

Adjuvans: vollstandiges und unvollständiges Freund Adjuvans.

Impfstoff:

0.5 ml Antigen (1 mg) werden mit 0.5 ml vollständigem Freund Adjuvans gemischt, mittels Standardverfahren emulgiert und injiziert. Zum Auffrischen werden 0.5 ml Antigen (0.5 mg) mit 0.5 ml unvollständigem Freund Adjuvans gemischt, emulgiert und injiziert.

Kontrolle:

Kontrolltiere erhalten das im Träger enthaltene Adjuvans.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse des ELISA sind in Figur 9 zusammengefaßt. Daraus geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Muteine bezüglich der erzeugten Antikörpermengen mindestens ebenso wirksam sind, wie die Wildtyp-Polypeptide.

Hinterlegung der biologischen Materialien

Die in E.coli HB101 enthaltenen Vektoren pCMV6ARv120tpa und pHL15 wurden am 13. September 1988 bei der "American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt. Sie werden dort gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinsichtlich der Hinterlegung von Mikroorganismen aufbewahrt. Die Hinterlegungsnummer für die Hinterlegung von pCMV6ARV120tpa ist 67792 und die für pHL15 ist 67793.

Diese Hinterlegungen werden dem Fachmann zur Verfügung gestellt, womit jedoch weder zugestanden wird, daß diese Hinterlegungen zum Ausführen der vorliegenden Erfindung notwendig sind, noch, daß unter Berücksichtigung der vorliegenden Offenbarung äquivalente Ausführungsformen außerhalb des Fachkönnens liegen. Die Verfügbarkeit dieser Hinterlegungen stellt nicht die Vergabe einer Lizenz (z.B. zur Herstellung, zum Gebrauch oder in Verkehr bringen der hinterlegten Materialien) für dieses oder ein anderes Patent dar. Die Nucleinsäuresequenzen der hinterlegten Materialien sind durch Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung aufgenommen und sind im Falle von Unstimmigkeiten mit den hier beschriebenen Sequenzen maßgeblich.

Obgleich die vorstehende Erfindung durch Beispiele und Darstellungen detailliert beschrieben wurde, ist offensichtlich, daß Modifikationen und Änderungen innerhalb des Bereichs der angefügten Patentansprüche ausgeführt werden können.


Anspruch[de]

1. gp120env- oder gp160env-Polypeptid vom menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), umfassend die unter den HIV-1-Isolaten konservierten Domänen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Epitop einer hypervariablen Domäne des Polypeptids deletiert ist.

2. Polypeptid, umfassend Epitope, die Antikörper gegen HIV- 1-gp120env oder -gp160env innerhalb einer Aminosäuresequenz mit der folgenden Formel binden:

C1-V1-V2-C2-V3-C3-V4-C4-V5-C5

in der:

C1 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Ser29 bis Cys130 von HIV-1-SF2,

C2 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Cys199 bis Leu291 von HIV-1-SF2,

C3 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Ser366 bis Cys387 von HIV-1-SF2,

C4 eine Aminosäuresequenz ist mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Cys415 bis Gly456 von HIV-1-SF2,

C5 eine Aminosäuresequenz umfaßt mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % zu Phe466 bis Arg509 oder Leu855 von HIV-1-SF2,

V1 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 30 Resten ist,

V2 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 50 Resten ist,

V3 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 90 Resten ist,

V4 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 30 Resten ist, und

V5 eine Aminosäuresequenz von 0 bis maximal etwa 10 Resten ist,

mit der Maßgabe, daß mindestens eine der V-Domänen, ausgewählt aus V1, V2, V3, V4 und V5, nicht mehr als etwa ein Drittel der maximalen Zahl von Resten für die V-Domäne enthält.

3. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei:

V1, falls vorhanden, eine HIV-1-Sequenz umfaßt, die sich von den C-Termini von C1 bis zu einem Cystein entsprechend dem konservierten Cys 155 von HIV-1-SF2 erstreckt,

V2, falls vorhanden, eine HIV-1-Sequenz umfaßt, die sich von den C-Termini Cys von V1 bis zu den N-Termini von C2 erstreckt,

V3, falls vorhanden, eine HIV-1-Sequenz umfaßt, die sich von den C-Termini von C2 bis zu den N-Termini von C3 erstreckt,

V4, falls vorhanden, eine HIV-1-Sequenz umfaßt, die sich von den C-Termini von C3 bis zu den N-Termini von C4 erstreckt, und

V5, falls vorhanden, eine HTV-1-Sequenz umfaßt, die sich von den C-Termini von C4 bis zu den N-Termini von C5 erstreckt,

mit der Maßgabe, daß für die ausgewählte V-Domäne, die nicht mehr als ein Drittel der maximalen Reste aufweist, wenn die HIV-1-Sequenz vorhanden ist, der HIV-1-Sequenz ein Epitop fehlt.

4. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählte V-Domäne V1 ist.

5. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählte V-Domäne V2 ist.

6. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählte V-Domäne V3 ist.

7. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählte V-Domäne V4 ist.

8. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählte V-Domäne V5 ist.

9. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählten V-Domänen V1 und V2 sind.

10. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählten V-Domänen V1, V2 und V3 sind.

11. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählten V-Domänen V1, V2 und V5 sind.

12. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählten V-Domänen V3, V4 und V5 sind.

13. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die ausgewählten V-Domänen V1, V2, V3, V4 und V5 sind.

14. Polypeptidanalog zu gp120env oder gp160env des menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), umfassend (a) etwa 300 bis etwa 850 Aminosäurereste in der Länge, (b) konstante Domönen, in der Richtung N-Termini zu C-Termini, Ser29-Cys130 von HIV-1-SF2 (C1), Cys199-Leu291 von HIV-1-SF2 (C2), Ser366-Cys387 (C3), Cys415-Gly456 (C4) von HIV-1-SF2 und Phe 466-Arg509 oder Phe466-Leu855 von HIV-1-SF2 (C5) oder Domänen, die im wesentlichen homolog zu C1, C2, C3, C4 oder C5 sind, und (c) dazwischenliegende Domänen, falls vorhanden, die zwischen den konstanten Domänen liegen, umfassend Sequenzen, die zwischen diesen konstanten Domänen im nativen HIV-1- gp120env zu finden sind, mit der Maßgabe, daß mindestens eine der zwischen den konstanten Domänen liegenden Domänen entweder fehlt oder ihr ein Epitop fehlt.

15. Polypeptid nach Anspruch 14, wobei das fehlende Epitop ein neutralisierendes Epitop ist.

16. Polypeptid nach Anspruch 14, wobei die dazwischenliegenden Domänen HIV-1-SF2-Sequenzen sind.

17. Polypeptid nach Anspruch 16, umfassend ein HIV-1-SF2- gp120env-Deletionsmutein, wobei C5 Phe466-Arg509 ist und mindestens eine Deletion ausgewählt ist aus:

(a) Thr131-Asn154,

(b) Ser156-Ser198,

(c) Thr300-His332,

(d) Asn388-Pro414 und

(e) Thr457-Thr463;

oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz-Homologie von mindestens etwa 70 bis 75 % dazu.

18. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletion Thr131- Asn154 umfaßt.

19. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletion Ser156- His198 umfaßt.

20. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletion Thr300- His332 umfaßt.

21. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletion Asn388- Pro414 umfaßt.

22. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletion Thr457- Thr463 umfaßt.

23. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletionen Thr131-Asn154 und Ser156-His198 umfassen.

24. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletionen Thr131-Asn154, Ser156-His198 und Thr457-Thr463 umfassen.

25. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletionen Thr300-His332, Asn388-Pro414 und Thr457-Thr463 umfassen.

26. Polypeptid nach Anspruch 17, wobei die Deletionen Thr131-Asn154, Ser156-His198, Thr300-His332, Asn388- Pro414 und Thr457-Thr463 umfassen.

27. Immuntest zum Nachweis von Antikörpern gegen menschliches Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1), umfassend

(a) Bereitstellung einer flüssigen Probe, die auf die Gegenwart von anti-HIV-1-Antikörpern getestet werden soll,

(b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 unter Bedingungen, unter denen anti-HIV- 1-Antikörper, die in der Probe vorliegen, an ein Epitop binden können, so daß man ein mit der Probe in Kontakt befindliches Polypeptid erhält, und

(c) Nachweis eines Antikörpers, der an das mit der Probe in Kontakt befindliche Polypeptid gebunden ist.

28. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung eines Säugers.

29. Mittel, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

30. Mittel nach Anspruch 29, das ferner ein Adjuvans umfaßt.

31. DNA-Sequenz, die ein Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.

32. Wirtszelle, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 31 unter der Kontrolle von Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, wobei das von der DNA-Sequenz codierte Polypeptid von der Wirtszelle exprimiert wird.

33. Wirtszelle nach Anspruch 32, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

34. Wirtszelle nach Anspruch 32, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.

35. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Analogons eines menschlichen Immundefiziensvirus-Typ-I (HIV-1)- Hüllproteins, wobei man eine Kultur der Wirtszelle nach Anspruch 32 unter Bedingungen züchtet, bei denen das von der DNA-Sequenz codierte Polypeptid exprimiert wird, und das Polypeptid aus der Kultur gewinnt.







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