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Dokumentenidentifikation DE4105531C2 23.02.1995
Titel 4-Aminocalcein, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung
Anmelder Kernforschungszentrum Karlsruhe GmbH, 76133 Karlsruhe, DE
Erfinder Judex, Patricia, Dr., 7505 Ettlingen, DE
DE-Anmeldedatum 22.02.1991
DE-Aktenzeichen 4105531
Offenlegungstag 27.08.1992
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 23.02.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.02.1995
Free division/divided out on the grounds of lack of unity 41433416
IPC-Hauptklasse C09B 11/28
IPC-Nebenklasse G01N 21/64   G01N 31/22   C09B 67/02  

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein 4-Aminocalcein gemäß Anspruch 1, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie eine Verwendungsmöglichkeit von Aminocalcein.

Aus der Veröffentlichung mit dem Titel "Fluorescence Techniques in the Microdetermination of Metals in Biological Materials" von Donald F. Hoelzl Wallach und Theodore L. Steck, Analytical Chemistry, Vol 35, Nr. 8, July 1963, ist Calcein, seine Verwendbarkeit zur Analyse von Zink(II)-Ionen und ein Verfahren zu seiner Herstellung bekannt. Die Autoren geben für Calcein die folgende Strukturformel an:



Diese Formel scheint die Struktur von Calcein jedoch nur unzureichend wiederzugeben. Offensichtlich enthält Calcein zwar zwei Iminodiessigsäurereste, doch können deren Stellungen nicht genau lokalisiert werden. Möglicherweise ist Calcein ein isomeres Gemisch von zweifach mit Iminodiessigsäureresten substituiertem Fluorescein.

Im folgenden wird unter Calcein ein im Xanthen-Ringsystem mit zwei Iminodiessigsäureresten substituiertes Fluorescein verstanden, wobei die Stellung der Reste offen bleibt.

Zur Analyse von Zinkionen wurden in der genannten Veröffentlichung Calceinlösungen eingesetzt. Es wurde beobachtet, daß im pH-Bereich zwischen 5,5 und 3,5 die Fluoreszenz von freiem Calcein stark abnimmt, während der Chelatkomplex des Calceins mit Zink(II)-Ionen in diesem pH-Bereich fluoresziert. Die Autoren sind jedoch der Ansicht, daß dieses Phänomen von geringem Nutzen für die Analytik ist, weil die Affinität von Calcein für Zink in diesem pH-Bereich sehr gering ist (vgl. Seite 1039, rechte Spalte). Deshalb wird vorgeschlagen, einen Calcein-Chelatkomplex mit zweiwertigem Kobalt vorzulegen. In einem solchen Komplex kann Zink das Kobalt verdrängen. Somit könnte durch Einstrahlen von Licht und Bestimmen der Intensität des Fluoreszenzlichts auf die Zink-Konzentration geschlossen werden, wenn ein solcher Kobaltkomplex verwendet wird.

Ein solches Verfahren könnte jedoch nicht reversibel durchgeführt werden. Für jede Analyse müßte ein Kobalt-Calceinkomplex vorgelegt und die zu analysierende Lösung zugegeben werden.

Aus der Veröffentlichung mit dem Titel "Immobilized Calcein for Metal Ion Preconcentration" von L. A. Saari und W. R. Seitz, Analytical Chemistry, Vol. 56, Nr. 4, April 1984 ist ein Sensor der eingangs genannten Art bekannt, bei dem Calcein durch eine chemische Reaktion an eine Matrix aus Cellulose gebunden ist. Die Matrix wird auf das Ende eines sich verzweigenden Lichtleiters aufgebracht. Ein Zweig des Lichtleiters dient der Einstrahlung von Licht einer geeigneten Wellenlänge, während mit dem anderen Zweig die emittierte Fluoreszenzstrahlung transportiert und an dessen Ende gemessen wird. Bei pH- Werten zwischen etwa 5 und 7 ist die Bindung von Übergangsmetallionen an Calcein jedoch so stark, daß die Übergangsmetallionen vollständig aus der Metallionen-Lösung extrahiert werden. Ein solcher Sensor ist unter diesen Bedingungen nicht reversibel. Um immobilisiertes Calcein in einem reversiblen Sensor zu nutzen, schlagen die Autoren vor, bei einem niedrigeren pH-Wert zu arbeiten. Bezüglich der Analyse von Zink(II)-Ionen greifen die Autoren den oben erwähnten Vorschlag auf, mit Co(II)-Ionen beladenes Calcein einzusetzen. Jedoch wäre ein solcher Sensor ebenfalls nicht reversibel.

Aufgabe der Erfindung ist, neben Calcein einen weiteren Stoff bereitzustellen, mit dessen Hilfe ein optischer Sensor hergestellt werden kann.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Stoff 4-Aminocalcein gemäß dem ersten Patentanspruch gelöst. Die weiteren Ansprüche geben ein Verfahren zur Herstellung von Aminocalcein und eine Verwendung von Aminocalcein an.

Überraschenderweise kann Aminocalcein durch die in der erstgenannten Veröffentlichung skizzierte Reaktion aus Aminofluorescein mit Iminodiessigsäure hergestellt werden, ohne daß es zur Reaktion mit der Aminogruppe des Aminofluoresceins kommt.

Aminofluorescein kann kovalent, vorzugsweise über ein bewegliches Brückenmolekül, über seine Aminogruppe an die Oberfläche von porösem Glas gebunden werden.

Hierdurch wird ein reversibler Sensor erhalten, mit dessen Hilfe Metallionen, insbesondere Zink(II)-Ionen, quantitativ nachgewiesen werden können.

Bei einem solchen Sensor kann auf den Einsatz von weiteren Metallionen verzichtet werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen und einer Figur näher erläutert.

Die Figur zeigt eine Meßanordnung mit einem mit Aminocalcein hergestellten Sensor.

Die Meßanordnung besteht aus einer Lichtquelle 1, aus der mit Hilfe eines Filters 2 ein monochromatischer Strahl der Wellenlänge 488 nm ausgeblendet wird. Der Strahl trifft innerhalb einer Küvette 5, die die Probelösung enthält, auf den erfindungsgemäßen Sensor 4, der auf einem optisch transparenten Medium 3, beispielsweise einer Glasplatte, mit Hilfe von Silikonkautschuk aufgebracht ist. Die entstehende Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge 508 nm wird nach Durchgang durch einen weiteren Monochromator (nicht dargestellt) mit einem geeigneten Photomultipier 6 und entsprechenden Auswerteeinrichtungen detektiert, wobei die Intensität ein Maß für die Konzentration der Metallionen darstellt.

Beispiel Herstellung von 4-Aminocalcein

7,3 g (0,02 mol) kommerziell erhältliches 4-Aminofluorescein werden in 20 ml 60%igem Ethanol gelöst. Es werden 6 ml 30%ige Natronlauge zugegeben (Lösung 1).

10,6 g (0,08 mol) Iminodiessigsäure werden in 15 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 12 ml 30%iger Natronlauge gelöst (Lösung 2).

Die Lösungen 1 und 2 werden auf 4°C gekühlt und unter Rühren vermischt.

Anschließend werden 7,5 g 37%iges Formaldehyd tropfenweise unter Rühren zugegeben, wobei die Temperatur der Reaktionsmischung unter 4°C gehalten wird.

Die Reaktionsmischung wird danach auf 70°C erwärmt und 8 Stunden bei 70°C gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird auf 1000 ml verdünnt und mit 3,5 n Salzsäure bis zum Ausfallen des Rohprodukts versetzt (pH ca. 2,5). Der Niederschlag wird abfiltriert und mit 2 l Wasser gewaschen und an der Luft trocknen gelassen.

Zur Reinigung wird das Rohprodukt in 50 ml heißem 70%igem Ethanol gelöst und sofort filtriert. Das Produkt fällt nach dem Abkühlen des Filtrats aus. Es wird abgetrennt und 3mal aus 70%igem Ethanol umkristallisiert.

Verwendungsbeispiel Herstellung eines Sensors mit Hilfe von 4-Aminocalcein

Sogenanntes "Controlled Porous Glas" (CPG) mit Poren eines mittleren Durchmessers von 770 nm (77 A) und einer spezifischen Oberfläche von 182 m²/g wird mit N-(Aminoethyl)-Aminopropyl-Triethoxysilan silanisiert (Schritt a). Hierzu werden 3,5 g CPG in 150 ml Toluol p.a. unter Rühren auf 80°C erhitzt. Die Suspension wurde mit trockenem Stickstoff gespült, bis die Reaktionstemperatur erreicht war. Nach Zugabe von 1,632 g des Silans wurde bei 80°C vier Stunden lang gerührt. Das CPG wurde abfiltriert, mit 50 ml Toluol und 100 ml Aceton gewaschen und bei 90°C vier Stunden lang getrocknet. Das physisorbierte Silan wurde durch 4-tägige Heißextraktion mit Methanol entfernt.

Die auf dem CPG chemisch fixierten Aminogruppen werden mit Thiophosgen in Phosphatpuffer pH 6,88 zu Isothiocyanatgruppen umgesetzt (Schritt b). Das nach den Schritten a und b grenzflächenmodifizierte CPG wird mit Aminocalcein zur Reaktion gebracht, wobei ein Thioharnstoffderivat entsteht (Schritt c).

Hierzu wurden 37,6 mg Aminocalcein in 5 ml Phosphatpuffer pH 8,0 gelöst. Es wurden 68,8 mg des nach Schritt b erhaltenen Produkts zugegeben und 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert, mit 500 ml bidestilliertem Wasser gewaschen und 3 Tage mit Aceton heißextrahiert.

Nachweis der Reversibilität des gemäß dem Verwendungsbeispiel erhaltenen Sensors

In einer Meßanordnung gemäß Fig. 1 wurde der erfindungsgemäße Sensor wechselweise mit einer Zn(II)-Ionen enthaltenden Lösung und mit einer Blindlösung in Kontakt gebracht. Die Blindlösung bestand aus einer Pufferlösung mit einem pH von 4,7. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:



Meßbedingungen Spaltbreite Anregung (488 nm): 1,5 nm Emission (508 nm): 3,0 nm pH-Wert der Zn-Lösung: 4,7 Nachweisgrenze (3 Sigma): 0,5 ppm Meßfehler: 3%


Anspruch[de]
  1. 1. 4-Aminocalcein der Formel



    wo zwei der Reste R jeweils einen Iminodiessigsäurerest [-CH&sub2;-N(CH&sub2;COOH)&sub2;] und die übrigen Wasserstoff bedeuten.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung von 4-Aminocalcein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 4-Aminofluorescein mit überschüssiger Iminodiessigsäure und überschüssigem Formaldehyd zu 3&min;,6&min;-Dihydroxy-2&min;,4&min;bis-[N,N&min;-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-aminofluoran (= 4-Aminocalcein) umgesetzt wird.
  3. 3. Verwendung des 4-Aminacalceins nach Anspruch 1 zur Herstellung von optischen Sensoren.






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