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Dokumentenidentifikation DE69011650T2 16.03.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0436684
Titel ANIONAUSTAUSCHER.
Anmelder Pharmacia Biosystems AB, Uppsala, SE
Erfinder ENGSTRÖM, Björn, S-852 46 Sundsvall, SE
Vertreter Kraus, W., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Weisert, A., Dipl.-Ing. Dr.-Ing., Pat.-Anwälte; Nielsen, F., Dr., Rechtsanw., 80539 München
DE-Aktenzeichen 69011650
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 14.06.1990
EP-Aktenzeichen 909101644
WO-Anmeldetag 14.06.1990
PCT-Aktenzeichen SE9000415
WO-Veröffentlichungsnummer 9100145
WO-Veröffentlichungsdatum 10.01.1991
EP-Offenlegungsdatum 17.07.1991
EP date of grant 17.08.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.03.1995
IPC-Hauptklasse B01J 39/06
IPC-Nebenklasse B01J 41/06   B01D 15/04   G01N 30/48   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft das Gebiet der chromatographischen Trennung und betrifft insbesondere einen neuen Typ von Anionenaustauschern, welche zwei positive Ladungen in einer Entfernung von zwei Atomen voneinander in einer Struktur, in der der Schutz der Ladungen minimiert ist, enthalten. Die speziell betreffenden Ionenaustauscher sind solche, die zwei quaternäre Aminogruppen enthalten.

Ionenaustauschchromatographie - eine Technik, bei der eine Probe durch eine Matrix, die immobilisierte geladene Gruppen enthält, die Probenkomponenten mit der entgegengesetzten Ladung binden, geleitet wird - wird unter anderem zur Trennung von Biomolekülen, wie beispielsweise Proteine, Peptide und Nukleinsäure, verwendet. Obwohl dies eines der ältesten Trennverfahren ist, ist es weiterhin eine der Grundtechniken für moderne biochemische Trennverfahren. Soweit Anionenaustauscher betroffen sind, d.h. Ionenaustauscher, die positiv geladene Gruppen enthalten, sind die als solche Austauscher verwendeten Substanzen in erster Linie Amine, die an eine feste Phase irgendeiner Art gebunden sind, um so entweder die geladenen Gruppen selbst oder um Gruppen, die in einer speziellen Umgebung mit einer Ladung versehen werden können, zu bilden. Primäre, sekundäre und tertiäre Aminofunktionen werden als schwache Anionenaustauschergruppen klassifiziert, wohingegen quaternäre Aminofunktionen als starke Aminoaustauschergruppen klassifiziert werden. Jedoch spiegelt die Verwendung dieser Ausdrücke "schwach" und "stark" keine qualitative Bewertung der Funktion des Ionenaustauschers wider; sie bezieht sich eher auf die Tatsache, daß ein "starker" Ionenaustauscher über einen breiteren pH-Bereich geladen wird. In einigen praktischen Anwendungen ist ein schwacher Ionenaustauscher gegenüber einem starken zu bevorzugen und umgekehrt. Als Beispiele von Anionenaustauschern, die im Handel seit vielen Jahren erhältlich sind, können DEAE Sephadex und QAE Sephadex (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden), die Diethylaminoethyl- bzw. quarternäre Aminoethylgruppen als funktionelle Gruppen enthalten, erwähnt werden. Ionenaustauscher, die Aminogruppen enthalten, sind ebenfalls in einer großen Anzahl von Publikationen beschrieben, vergleiche beispielsweise WO 89/04203 und EP-167 488.

In allen Formen der chromatographischen Trenntechniken ist es zwingend, daß man die bestmögliche Trennung/Auflösung der Probenkomponenten in ihre einzelnen Komponenten oder einzelnen Gruppen von Komponenten erreicht. Die Auflösung ist eine Funktion von im allgemeinen der Effizienz und der Selektivität der verwendeten Säule. Diese Faktoren werden in erster Linie durch die Eigenschaften der Trennmatrix in Kombination mit der Geometrie der Säule bestimmt. So stellen diese Faktoren feste Parameter des Systems dar. Andere Faktoren, die die Auflösung beeinflussen, sind beispielsweise die Probenladung, die Fließgeschwindigkeit, die Temperatur, der pH-Wert, die Gradienten etc., die so für eine gegebene Säule für jede gegebene Trennsituation optimiert werden müssen. Während der vergangenen Jahre war es ein Trend, daß Bemühungen hinsichtlich des Erhalts einer erhöhten Effizienz und begleitend einer erhöhten Auflösung gemacht wurden, indem ein Säulenpackmaterial mit kleinerer Teilchengröße verwendet wurde. Andererseits scheint, daß sehr wenig Arbeit für Bemühungen mit dem Ziel zur Verbesserung der Selektivität der Ionenaustauscher aufgewendet wurde. Einer der Faktoren, der die Selektivität beeinflußt, ist die Struktur der geladenen Gruppe, die an die Matrix befestigt wurde.

Eine weitere wichtige Eigenschaft von Ionenaustauschern ist ihre Ionenaustauschkapazität; im Falle, daß die Ionen der mobilen Phase kleine monovalente Ionen sind, ist diese Kapazität gleich der Anzahl der Ladungen in der Matrix. Ein kleines Ion kann durch die Oberflächenschicht, die durch die geladenen Substituenten gebildet wird, dringen und erreicht beispielsweise so auch Ladungen, die tiefer im Inneren enger Poren liegen. Aber wenn eine Bindung an Biomoleküle eintritt, ist die Situation anders. Die Faktoren, die die Menge eines Proteins, das an einen Ionenaustauscher gebunden werden kann, bestimmen, sind nicht nur die Anzahl der Ladungen auf dem Gel, sondern auch die Art, wie die Ladungen auf der Matrixoberfläche freigelegt sind, was mit sich bringt, daß die Porosität der Matrix und die Struktur der Ionenaustauschergruppe von entscheidender Bedeutung sind. Natürlich haben auch die Ladungseigenschaften des Proteins Einfluß auf den Grad der Bindung. Es wurde nun gefunden, daß die Selektivität und Kapazität der starken Anionenaustauscher beträchtlich durch Einführen funktioneller Gruppen, deren Ladungen paarweise angeordnet sind, verbessert werden kann, wobei die Ladungen in einer speziellen Struktur angeordnet sind, worin sie auf optimale Weise gegenüber dem umgebenden Medium infolge einer Minimierung der Ladungsabschirmung freigelegt sind.

Die erfindungsgemäß betrachteten Gruppen besitzen die Struktur

wobei das charakteristische Merkmal hier ist, daß die zwei geladenen Stickstoffatome in einer Entfernung von zwei Atomen voneinander angeordnet sind. In den Strukturen (1), (2) und (3) bilden die Stickstoffatome ferner einen Teil einer cyclischen Struktur. Durch Wahl der Strukturen (1) und (3) auf den Ionenaustauschern minimiert man die durch sterische Hinderung bedingte störende Wechselwirkung mit Probenmolekülen in einer Lösung bei Kontakt mit dem Ionenaustauscher.

Was die Wahl der Trägermatrix zur Bindung der funktionellen Gruppe betrifft, so ist dies ein Punkt, der nicht Gegenstand der Erfindung ist; der Fachmann kann das Konzept der Erfindung auf eine große Anzahl von Trägermatrices, die zur Verwendung in chromatographischen Trennverfahren beschrieben wurden, anwenden, und daraus kann er eine mit den gewünschten Eigenschaften hinsichtlich der anderen Trennparameter auswählen. Beispiele für solche Matrices sind unter anderem Gele aus Polysacchariden, beispielsweise Dextran, Stärke, Cellulose und Agarose, gegebenenfalls nach Vernetzung zum Zweck der Erhöhung der Steifigkeit des Materials und somit zur Verbesserung seiner Eigenschaften bei Kompression und Fließfluß. Andere Beispiele sind Trägermatrices auf der Basis von Polystyrol-Divinylbenzol, Kieselgel und Acrylaten.

Die Synthese der erfindungsgemäßen Ionenaustauscher wird entweder durch Einführen der reaktiven Gruppen in die gewählte Matrix, wobei die Gruppen entweder mit der Ionenaustauschergruppe oder einem Derivat davon umgesetzt werden, oder durch direkte Reaktion eines reaktiven Derivats der Ionenaustauschergruppe mit der Matrix durchgeführt.

Die Kopplung wird mit Hilfe eines sogenannten Spacers durchgeführt, der an einem seiner Enden an die Matrix gebunden wird und am anderen Ende an das Reagens, das eine der vorstehenden Strukturen (1) bis (4) ergibt. Eine solche Kopplung des Spacers an das Gel einerseits und an das Reagens andererseits wird mittels irgendeines der zahlreichen für Kopplungen dieses Typs und technologischen Zusammenhangs entwickelten Verfahren, insbesondere auf den Gebieten der Affinitätschromatographie, durchgeführt; Beispiele für solche Verfahren sind die CNBr-, Epoxid-, Cyanat-, Hydrazid- und Sulfonylkopplung, womit nur einige aus einer großen Anzahl erwähnt sind. Die Verwendung von Spacern zur Freilegung von funktionellen Gruppen auf einer Matrix ist ebenfalls ein sehr gut bekanntes Verfahren auf diesem technologischen Gebiet und bildet keinen Teil der Erfindung.

Die gegenwärtig bevorzugte Struktur ist die Struktur Nr. (1), die in den bisher durchgeführten Versuchen die besten Ergebnisse ergeben hat. Über den Spacer wird eines der Stickstoffatome des 1,4-Diazobicyclo[2,2,2]octans (DABCO) Moleküls an die Matrix gekoppelt und somit quaternisiert, wonach das andere Stickstoffatom durch Methylieren quaternisiert wird. Alternativ wird monomethyliertes DABCO direkt über den Spacer an die Matrix gekoppelt.

Die Erfindung betrifft so einen Anionenaustauscher für die chromatographische Trennung, wobei der Anionenaustauscher die Struktur

P-S-A

besitzt, worin P ein unlöslicher Träger, bevorzugt in Form getrennter Teilchen, wie beispielsweise kugelförmige Teilchen, des auf diesem technischen Gebiet bekannten Typs mit einem Teilchendurchmesser von beispielsweise 1 bis 500 um ist.

S ist ein sogenannter Spacer, d.h. eine Molekülkette, die mit den Probenmolekülen auf keine Weise, die das Trennverfahren stört, wechselwirkt, aber die Exposition der geladenen Struktur auf der Teilchenoberfläche fördert. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, daß eine bestimmte Menge an hydrophoben Gruppierungen bei dem Trennverfahren verwendet wird, kann der Spacer natürlich auf an sich bekannte Weise hyrophob gemacht werden.

A ist ein geladener Ligand, der zwei quaternäre Aminogruppen in einer Entfernung von zwei Atomen voneinander enthält, insbesondere die folgenden:

Die Erfindung wird anhand der folgenden nicht beschränkenden Beispiele näher erläutert, die sowohl die Synthese der Ionenaustauscher als auch die Verwendung dieser Ionenaustauscher im chromatographischen Trennverfahren beschreiben.

ARBEITSBEISPIELE 1. Synthese des Ionenaustauschers auf einer Agarosematrix I. (a) Diaminkopplung an Agarosematrix mit anschließender Ouaternisierungsstufe

250 ml Wasser, 145 g Natriumhydroxid in fester Form, 65 g Natriumsulfat und 2 g Natriumborhydrid wurden unter Rühren zu einem vernetzten Agarosegel (500 ml, gequollen in Wasser) gegeben. Die Temperatur wurde auf 50ºC erhöht, wonach 700 ml Allylglycidylether zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde über Nacht bei 50ºC gerührt. Das Gel wurde auf einem Glasfilter mit Wasser und dann mit Ethanol und schließlich erneut mit Wasser gewaschen. Dann wurde das so erhaltene Gel auf einem Glasfilter abgesaugt bis der erste Riß in dem Gelbett sichtbar wurde. Von diesem Gel wurden dann 100 g entnommen, die zusammen mit Natriumacetat (NaOAc.3H&sub2;0, 3 g) zu 50 ml Wasser gegeben wurden. Brom wurde zugesetzt bis die Farbe gelb blieb, wonach der Überschuß an Brom durch Zugabe von Natriumformiat beseitigt wurde.

0,2 mol des gewählten Amins wurden dem Gemisch zugesetzt, und die Synthese ließ man dann über Nacht bei 45ºC ablaufen. Das Gel wurde mit Wasser, Essigsäure/Wasser und dann erneut mit Wasser gewaschen.

Danach wurde das Gel (25 g) fünfmal mit 100 ml Ethanol und dann fünfmal mit Acetonitril gewaschen, wonach es in 50 ml Acetonitril überführt wurde. Die Temperatur wurde auf 30ºC eingestellt, und 1 ml Methyliodid wurde zugesetzt. Danach ließ man die Synthese, an der nun die Quaternisierung des zweiten Stickstoffatoms beteiligt war, über Nacht ablaufen, wonach das Gel zuerst mit Wasser, dann mit Ethanol und schließlich mit Wasser gewaschen wurde.

I. (b) Monomethylierung des Diamins und anschließende Kopplung an eine Agarosematrix

56,1 g DABCO wurden in 200 ml Acetonitril aufgelöst, wonach 71 g Methyliodid unter Rühren und in einer solchen Geschwindigkeit, daß die Temperatur 35ºC nicht überschritt (etwa 30 Minuten), zugesetzt wurde. Ein Präzipitat wurde gebildet, wenn die letzten Tropfen Methyliodid zugesetzt wurden. Die Reaktion ließ man nun über Nacht bei 30ºC ablaufen. Das Präzipitat, das aus dimethyliertem DABCO bestand, wurde abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation in einem zylinderförmigen Verdampfer entfernt, und die restliche Kristallmasse (146 g) wurde aus 730 ml Isopropanol rekristallisiert. Die Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 103,3 g, und der Schmelzpunkt lag innerhalb eines Bereichs von 204 bis 208ºC.

6,06 g Monomethyl-DABCO (siehe vorstehend) wurden zu 15 ml vernetztem Agarosegel gegeben, das gemäß Beispiel I (a) allyliert und bromiert worden war. Das Reaktionsgemisch ließ man dann bei 30ºC stehen, wobei dessen pH-Wert bei 10,5 mittels eines pH-Stats gehalten wurde. Danach wurde das Gel mit Wasser und dann mit Essigsäure/Wasser und dann erneut mit Wasser gewaschen.

II. Kopplung von Monomethyl-DABCO (Me-DABCO) an eine Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix

23 ml eines hydroxylierten Polystyrol/Divinylbenzol-Gels wurden mit 175 ml einer 10% NaOH-Lösung, die 0,03% Natriumborhydrid enthielt, gewaschen. Das Gel wurde zu 9,2 ml der alkalischen Lösung gegeben, und dann wurden 27,6 ml Allylglycidylether zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 45ºC gerührt, wonach das Gel zuerst mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen wurde. 10 g Brom, 6 ml Wasser und 0,38 g Natriumacetat (NaOAc.3H&sub2;0) wurden zu dem wie vorstehend beschrieben hergestellten Gel zugesetzt, bis die Farbe gelb blieb. Überschüssiges Brom wurde durch Umsetzen mit zugesetztem festen Natriumformiat entfernt. Dann wurden 6,06 g Monomethyl-DABCO zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 30ºC unter der Kontrolle eines auf pH 11,0 eingestellten pH-Stats gerührt. Das Gel wurde mit Wasser dann mit Essigsäure/Wasser und schließlich erneut mit Wasser gewaschen.

III. Synthese des Me-DABCO Ionenaustauschers auf einer mit Dextran behandelten Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix zur Trennung von DNA-Fragmenten Allylierung

15 g eines nicht porösen hydroxylierten 3 um Polystyrol/Divinylbenzol-Gels wurden mit 114 ml einer filtrierten 10% NaOH-Lösung, die 0,03% Natriumborhydrid enthielt, gewaschen. Das Gel wurde dann zu der vorstehend genannten alkalischen Lösung gegeben; 36 ml Allylglycidylether wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 45ºC gerührt. Das Gel wurde dann mit Wasser, anschließend mit Ethanol und schließlich mit Wasser gewaschen.

Bromierung und Dextrankopplung

3 g des vorstehend allylierten Gels wurden zusammen mit 0,1 g Natriumacetat (NaOAc.3H&sub2;O) zu 10 ml Wasser gegeben, wonach unter Rühren Bromwasser zugesetzt wurde, bis eine stabile gelbe Farbe erhalten wurde. Überschüssiges Brom wurde mit Natriumformiat entfernt, und das Gel wurde dann mit Wasser gewaschen und bis zur Trockene auf einem Glasfilter abgesaugt. Als nächstes wurde das Gel zu einer Lösung von 1,9 g Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 in 5 ml Wasser gegeben, wonach 0,34 g Natriumhydroxid und 0,02 g Natriumborhydrid nach einer Stunde Rühren bei 40ºC zugesetzt wurden. Danach wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei 40ºC unter Rühren stehengelassen. Das Gel wurde dann mit Wasser gewaschen.

Allylierung des Dextran-gekoppelten Gels

Nach der Dextrankopplung wurden 3 g des Gels mit 2,5 ml Wasser, 0,87 g Natriumhydroxid, 0,39 g Natriumsulfat und 0,01 g Natriumborhydrid vermischt. Danach wurden 4,2 ml Allylglycidylether bei 50ºC unter heftigem Rühren zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht stehengelassen, wonach das Gel zuerst mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen wurde.

Bromierung und Kopplung von DABCO

Die Bromierung wurde, wie vorstehend unter der Überschrift "Bromierung und Dextrankopplung" beschrieben, durchgeführt, und danach wurden 3 g Gel zu 2 ml Wasser gegeben, und 0,7 g DABCO wurden zugesetzt. Nach Rühren über Nacht bei 45ºC wurde das Gel mit Wasser gewaschen.

Methylierung des DABCO-gekoppelten Gels

3 g des vorstehenden Gels wurden dreimal mit Ethanol und dann dreimal mit Acetonitril gewaschen. Es wurde dann auf einem Glasfilter bis zur Trockene abgesaugt. Danach wurde das Gel zu 3 ml Acetonitril gegeben, 0,5 ml Methyliodid wurden bei 30ºC zugesetzt, und das Gemisch wurde dann bei dieser Temperatur über Nacht stehengelassen. Das so erhaltene Gel wurd einmal mit Acetonitril, dreimal mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen.

IV. Synthese des Ionenaustauschers mit Ligand 3 auf einer Agarosematrix

Das vernetzte Agarosegel wurde gemäß Beispiel 1 allyliert. 50 g des allylierten Gels wurden mit Ethanol und dann mit Aceton gewaschen, und dann schließlich wurde Benzol in das Gel gewaschen. Dann wurde das Gel bis zur Trockene abgesaugt und zu 25 ml Benzol gegeben, wonach Brom bis zum Erhalt einer permanenten gelben Farbe zugesetzt wurde. Nach 30 Minuten wurde überschüssiges Brom durch Reaktion mit Natriumformiat, das in Form einer wäßrigen Lösung zugesetzt worden war, entfernt. Das Gel wurde mit Acetonitril gewaschen, bis zur Trockene abgesaugt und in 25 ml Acetonitril aufgeschlämmt. Danach wurde 8,6 g Piperazin zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 50ºC unter Rühren stehengelassen. Es wurde dann mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen. Dann wurde das Gel mit 100 ml 0,1 M Natriumhydroxid und mit Wasser gewaschen, bis die Waschflüssigkeit neutral war. Danach wurde mit Ethanol gewaschen und schließlich mit Acetonitril behandelt. Nach Absaugen bis zur Trockene wurde das Gel in 25 ml Acetonitril aufgeschlämmt, und nach Zugabe von 4 ml Methyliodid wurde das Gemisch über Nacht bei 30ºC gerührt. Das Gel wurde mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen und war dann gebrauchsfertig.

V. Charakterisierung der Selektivität der Ionenaustauscher

Mit einem Testgemisch aus

Transferrin 10 mg/ml

Ovalbumin 20 mg/ml

β-Lactoglobulin 20 mg/ml

wurde die Selektivität der hergestellten Ionenaustauscher durch Bestimmen des Unterschieds im Elutionsvolumen Ve geteilt durch das Leervolumen Vo,(Ve,m - Ve,n)/Vo, wobei m und n aufeinanderfolgende Zahlen, die den Peaks des Chromatogramms zugeordnet wurden, bezeichnen, charakterisiert.

Säule: HR 10/10 (Pharmacia AB); Volumen 7,85 ml

Probenladung: 0,31 mg Protein/ml Gel

Puffer A: 20 mM Piperazin pH 6,0

Puffer B: Puffer A + 0,6 M NaCl

Fließgeschwindigkeit: 100 cm/h

Gradient: 0 - 75% Puffer B/15 Säulenvolumina (120 ml)

Das vorstehend aufgeführte Testgemisch ergab 5 Peaks bei Elution mit einem starken Anionenaustauscher bei pH 6,0. Das Gemisch enthält Proteine unterschiedlicher Größe, und in der Realität unterscheiden sich die Vo-Werte für jedes der verschiedenen Proteine so stark, daß sie bei verschiedenen Volumina eluiert werden würden, selbst wenn keines von ihnen durch Ionenaustauscher-Wechselwirkungen zurückgehalten werden würde. Dies ist ein Phänomen der Gelfiltration. Jedoch würden alle Proteine innerhalb eines Säulenvolumens eluiert werden. In den Testreihen wurde Vo hinsichtlich dieses Effekts nicht korrigiert, weil in Vergleichen auf der gleichen Trägermatrix der Vo-Fehler der gleiche für jedes Protein auf den verschiedenen Ionenaustauschern ist. Zur Vereinfachung wird Vo als das Gesamtvolumen der Säule angenommen.

Zum Vergleich sind auch die entsprechenden Werte, die mit Ionenaustauschern aus dem Stand der Technik, Q Sepharose High Performance und Mono Q (Pharmacia LKB Biotechnology), erhalten wurden, wobei diese Ionenaustauscher die funktionelle Gruppe

besitzen.

Tabelle I Ergebnisse aus den Trennungen, die auf Ionenaustauschern auf Agarosebasis gemäß Beispiel 1 durchgeführt wurden.
Ligand Konz.des Liganden auf dem Gel mmol/ml Gel Kapazität für Br&supmin; mmol/ml
Tabelle 2 Ergebnisse aus den Trennungen, die auf Ionenaustauschern auf Polystyrol/DVB-Basis durchgeführt wurden.
Ligand Konz.des Liganden auf dem Gel mmol/ml Gel Kapazität für Br&supmin; mmol/ml

Aus den Tabellen 1 und 2 geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Ionenaustauscher eine bessere Selektivität als Ionenaustauscher aus dem Stand der Technik besitzen und daß der höchste Grad an Selektivität mit dem Liganden (1) erhalten wird.

In Vergleichstests, die den vorstehend beschriebenen analog waren, wurde die Selektivität an Strukturen untersucht, an denen zwei quaternäre Stickstoffatome in Entfernungen von drei oder mehr Atomen voneinander angeordnet sind. Die Selektivität verschlechtert sich mit zunehmenden Entfernungen zwischen den Stickstoffatomen, und ferner zeigen die Ergebnisse klar, daß die Konformation der Moleküle in den Liganden 1 und 2 Eigenschaften verleiht die erfindungsgemäß optimal sind.

VI. Untersuchung der Proteinbindungskapazität

Die Messung der Proteinbindungskapazität des am stärksten selektiven Liganden (siehe vorstehend, Ligand 1) wurde an einer Agarosematrix durchgeführt und mit dem Ligand aus dem Stand der Technik (0) verglichen. Sowohl die statischen wie auch die dynamischen Kapazitäten wurden gemessen - die zuerst genannte durch Aufzeichnen der Adsorptionsisotherme für Rinderserumalbumin (RSA) und die letztere durch Plotten von Kurven des Austretens des Proteins aus den gepackten Säulen. Das Gel (0,3 ml, 30%) wurde in Reagensgläser eingefüllt. Variierende Mengen an RSA-Lösung (200 mg/ml) wurden der Gelaufschlämmung zugesetzt, wonach das Volumen durch Zugabe von Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5) auf 0,4 ml eingestellt wurde. Die Reagensgläser wurden zwei Stunden lang geschüttelt, und dann wurde nach Zentrifugation die Absorption bei 280 nm zur Bestimmung der RSA-Konzentration in dem Überstand gemessen. Die Menge des gebundenen Proteins wurde als Differenz zwischen der Gesamtmenge an zugesetzten Proteinen minus der Menge in Lösung im Gleichgewicht berechnet.

Die Ergebnisse zeigten, daß die maximale Aufnahme 62,6 mg/ml mit dem Liganden aus dem Stand der Technik (0) betrug und mit dem Liganden (1) 86,3 mg/ml betrug. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß im Falle von (0) die Anzahl der Liganden 0,16 mmol/ml Gel betrug, wohingegen im Falle von (1) die Anzahl 0,12 mmol/ml Gel betrug. Trotz dieser Tatsache war die statische Proteinbindungskapazität um 38% höher.

Zur Untersuchung der dynamischen Proteinbindungskapazität wurde 1 g Gel in jede der zwei HR 5/5 Säulen (Pharmacia AB) gepackt, wonach die Bodenzahl für den Fall einer 1% Acetonlösung als Probe mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 10 cm/Stunde gemessen wurde. Die Kurven des Austretens des Proteins wurden mittels Pumpen durch jede Säule einer Lösung aus RSA (5 mg/ml in Tris/HCl, pH 7,5; 0,1 M NaCl) erhalten, bis ein Protein auftauchte.

Die Säuleneffizienz war N = 6370/m für (0) und N = 6630/m für (1). Im Falle von (0) wurde ein Auftauchen des Proteins bemerkt, wenn 5,8 ml Proteinlösung durch die Säule gepumpt worden waren, wohingegen im Falle von (1) ein Proteinauftauchen nach 10,1 ml auftrat. Dies bedeutet, daß mit dem erfindungsgemäßen Liganden die dynamische Kapazität um 74% höher war als mit dem Liganden aus dem Stand der Technik. In diesem Versuch ergab erneut die Beziehung der Ligandenkonzentration (0,16 gegen 0,12) tatsächlich einen Vorteil für das Gel aus dem Stand der Technik. Trotz dieser Umstände war die Kapazität des erfindungsgemäßen Ionenaustauschers deutlich besser.

VII. Untersuchung der Peptidtrenneigenschaften

Gele gemäß Beispiel 1, d.h. mit Agarosematrices, wurden in HR 10/10 Säulen gepackt und mit einer 20 ul Probe, die in jedem Fall 1 mg/ml eines Gemisches aus ACTH und Tetrapeptid Val-Gly-Asp-Glu enthielt, getestet. Puffer A: 20 mM Tris pH 7,1; Puffer B: Puffer A + 0,1 M NaCl. Fließgeschwindigkeit 1 ml/min.

Elution: Puffer A für 5 Minuten, dann linearer Gradient 0 bis 40% B über einen Zeitraum von 30 Minuten.

Detektion: UV 215 nm.

Mit dem Ionenaustauscher aus dem Stand der Technik (0) wurden die Peptide im gleichen Peak eluiert, wenn das Gemisch auf der Säule aufgebracht wurde. Die Peptide getrennt gaben die Elutionsvolumina von 24,4 bzw. 24,8 ml. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Ionenaustauschers Ligand (1) wurde eine Grundlinientrennung erhalten, und, wenn die Peptide getrennt laufengelassen wurden, betrugen die Elutionsvolumina, die in diesem Fall erhalten wurden, 27,3 bzw. 30,6 ml.

VIII. Trennung von DNA-Fragmenten

Der Legand (1) wurde an eine nicht poröse 3 um Polystyrol/DVB-Matrix (hergestellt gemäß Beispiel III) gebunden und in eine 5x30 mm Säule gepackt, wonach ein Vergleich mit einer GenPak-FAX (Waters), eines im Handel erhältlichen Produkts, das speziell für diesen Trenntyp entwickelt worden war, durchgeführt wurde. Die Probe war DNA aus dem Bakteriophagen φ X174 (Pharmacia LKB Biotechnology), die mit dem Restriktionsenzym HaeIII (Pharmacia LKB Biotechnology) behandelt worden war. Im Falle von GenPak-FAX (P) wurde die Trennung gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren durchgeführt:

Puffer A: 20 mM Tris/HCl pH 8,5

Puffer B: A + 1,0 NaCl

Säule: 4,6x100 mm

Im Falle von Ligand (1) wurde eine 5x30 mm Säule und die folgenden Puffer verwendet:

Puffer A: 20 mM Tris/HCl pH 8,3 + 0,8 M NaCl

Puffer B: 20 mM Tris/HCl pH 8,3 + 1,5 M NaCl

Es ist zu betonen, daß die Versuchsbedingungen nicht vollständig vergleichbar sind, aber trotzdem ist darauf hinzuweisen, daß deutlich verbesserte Trennergebnisse mit dem erfindungsgemäßen Ionenaustauscher (U), verglichen mit dem Ionenaustauscher aus dem Stand der Technik (P), erhalten wurden; dies geht aus den nachstehenden Daten hervor, die die (Ve,m - Ve,n)/Vo-Werte beider Säulen darstellen, wobei m und n aufeinanderfolgende Zahlen der Peaks in dem Chromatogramm sind.

*) Im Falle von GenPack-Fax wurden die Peaks 6 und 7 nicht getrennt.


Anspruch[de]

1. Ionenaustauscher für die chromatographische Trennung mit der Struktur:

P-S-A

worin

P ein unlöslicher Träger,

S ein Spacer, und

A ein funktioneller Ligand ist,

dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand zwei quaternäre Aminogruppen in einer Entfernung von zwei Atomen voneinander umfaßt.

2. Ionenaustauscher nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der funktionelle Ligand A eine der folgenden Strukturen besitzt:

3. Ionenaustauscher nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Gruppe A die Struktur:

besitzt.

4. Ionenaustauscher nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Gruppe die Struktur:

besitzt.

5. Ionenaustauscher nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Teilchen aus vernetzter Agarose oder aus einer Polystyrol- Divinylbenzol-Matrix besteht.







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