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Dokumentenidentifikation DE4336498A1 27.04.1995
Titel Verfahren zur Diagnose von Nieren- und Gefäßerkrankungen
Anmelder Bender & Co. Ges.m.b.H., Wien, AT
Erfinder Kerjaschki, Dontscho, Prof. Dr., Wien, AT
Vertreter Laudien, D., Dipl.-Chem. Dr.phil.nat., Pat.-Ass., 6500 Mainz
DE-Anmeldedatum 26.10.1993
DE-Aktenzeichen 4336498
Offenlegungstag 27.04.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.04.1995
IPC-Hauptklasse C12N 5/12
IPC-Nebenklasse C07K 16/00   G01N 33/48   G01N 33/577   C12Q 1/00   A61B 5/00   
IPC additional class // C12N 5/18,C12Q 1/28  
Zusammenfassung Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen des Menschen, die sich primär oder im Zuge von generalisierten Gefäßerkrankungen sekundär in einer Schädigung der Nierenglomerula manifestieren, bei denen man eine Körperflüssigkeit auf ihren Gehalt an humanem MGS 160/170 und/oder Fragmenten davon untersucht. Monoklonale Antikörper gegen MGS 160/170 sowie Hybridomzellinien, die diese Antikörper produzieren. Immunoassay-Kits zur Durchführung des Verfahrens.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Diagnostik von Nieren- und Gefäßerkrankungen.

Die Hauptaufgabe der Niere ist die Filtration von harnpflichtigen Substanzen aus dem Plasma in den Urinraum. Dies wird bewerkstelligt durch spezialisierte Gefäßabschnitte, die Nierenglomerula, welche feinste Abzweigungen des arteriellen Gefäßsystemes darstellen. Die Filtrationsbarriere wird aus folgenden histologischen Strukturen aufgebaut: dem Endothel, welches in den Nierenglomerula große Poren aufweist, der glomerulären Basalmembran, welche wahrscheinlich die eigentliche Filtrationsbarriere mit einer Durchlaßgrenze von einem Molekulargewicht knapp unter Albumin darstellt, sowie den visceralen glomerulären Epithelzellen oder Podozyten, welche an der Außenseite in den Urinraum hinausragen und durch ihre komplexe Morphologie einen gewissen permanenten Druck in der Basalmembran aufrechterhalten, der dem Filtrationsdruck von der Plasmaseite her einen Widerstand entgegenstellt. Biochemisch weisen einzelne Bestandteile der Glomerula Gemeinsamkeiten mit Blutgefäßen und mit Endothelzellen an anderen Stellen des Organismus auf. Bei einer Reihe von Krankheiten, die das Gefäßsystem in generalisierter Form betreffen, sind daher die Nierenglomerula, die spezialisierte Gefäßabschnitte darstellen, mitbetroffen. Andererseits gibt es Gefäßschädigungen, bei denen kein Zusammenhang mit den Nierenblutgefäßen besteht.

Aufgrund der funktionellen morphologischen und pathomorphologischen Zusammenhänge - zwischen dem Gefäßsystem im allgemeinen und den Nierenglomerula und anderen Gefäßabschnitten der Niere im besonderen - ergibt sich folgende Systematik der die einzelnen Gefäßkomponenten individuell oder in Kombination betreffenden pathologischen Veränderungen, von denen die wichtigsten und am häufigsten auftretenden beispielhaft genannt seien:

Erkrankungen mit Primärmanifestation in der Niere, die sich ausschließlich oder hauptsächlich äußern in Schädigungen

  • - der glomerulären Kapillarschlingen (Filtrationsapparat),
  • - des renalen Gefäßsystems (mit konsekutiver Beeinträchtigung des glomerulären Apparates),
  • - der interstitiellen bzw. tubulären Strukturen des Nierenparenchyms.


Zu generalisierten Gefäßerkrankungen mit Beteiligung der Nieren zählen

  • - generalisierte entzündliche Gefäßerkrankungen (z. B. allergische Vaskulitiden, Wegener&min;sche Granulomatose, etc.),
  • - generalisierte metabolische Störungen (z. B. diabetische Vaskulopathie, Amyloidose, etc.).


Erkrankungen mit glomerulärer Primärmanifestation sind häufig immunologisch bedingt (z. B. die große Gruppe der Glomerulonephritiden, nichtentzündlichen glomerulären Erkrankungen, wie die Minimal Change Nephrose oder die fokale Sklerose).

Erkrankungen, die in unterschiedlichem Ausmaß das Gefäßsystem generell und die Nierenglomerula betreffen, können gleichfalls immunologischen Ursprungs sein (z. B. nekrotisierende Vaskulitiden, Wegener&min;sche Granulomatose), oder sie haben metabolische Ursachen (z. B. die diabetische Angiopathie mit Nephropathie, die generalisierte Amyloidose, oder die Schwangerschaftsgestose, das hämolytisch-urämische Syndrom).

Interstitielle und tubuläre Schädigungen umfassen z. B. die Pyelonephritis, die Analgetikanephropathie, die Gichtnephropathie und Zystennieren.

Angesichts der Schwere sowie der großen Bandbreite des klinischen Verlaufs, der Prognose und der Therapien der Erkrankungen, welche die Nierenglomerula einerseits primär und ausschließlich, andererseits im Rahmen generalisierter Gefäßerkrankungen betreffen, ist es erforderlich, eine exakte Prognose zu stellen, um die therapeutischen Maßnahmen, die Einschätzung der individuellen Prognose und letztlich auch eine wissenschaftlichen Zuordnung treffen zu können.

Als verläßlichste Diagnosemaßnahme für pathologische Zustände der Niere wird die Nierenbiopsie angesehen. Diese Maßnahme ist jedoch einerseits als invasive Technik für den Patienten mit Unannehmlichkeiten und Risken, andererseits für den diagnostizierenden Arzt mit großem Aufwand verbunden.

Es besteht daher der Bedarf nach Methoden, mit denen die verschiedenen, klinisch oft nicht genau klassifizierbaren Nierenerkrankungen auf der Grundlage von nicht-invasiven Parametern, die den Ort, den Verlauf und das Stadium pathologischer Veränderungen markieren, diagnostiziert und abgeklärt werden können, um die Zahl der Biopsien verringern bzw. diese langfristig ersetzen zu können.

Die genannten Erkrankungen, an denen die Nieren beteiligt sind, resultieren zumeist nach chronischem, therapeutisch nur schwer beeinflußbarem Verlauf in einer chronischen Niereninsuffizienz, die den Einsatz von Nierenersatztherapien (z. B. der Nierentransplantation) als lebenserhaltende Maßnahme notwendig macht. Vor allem transplantierte Patienten bedürfen einer engmaschigen Überwachung, um Komplikationen möglichst früh zu erkennen und zu behandeln und somit den Verlust des Transplantates zu vermeiden. Auch hier spielt die Nierenbiopsie noch immer die vorherrschende Rolle, obwohl das Risiko dieser Maßnahme für den Patienten relativ hoch ist.

Die Nierentransplantation stellt daher ein weiteres Indikationsgebiet dar, für das ein Bedarf an nichtinvasiven Diagnoseverfahren besteht. Hier besteht die Notwendigkeit, zwischen akuter oder chronischer Abstoßungsreaktion, Infektionen und medikamentös induzierter Schädigung, z. B. durch Cyclosporin, zumeist unter Zeitdruck, zu differenzieren.

Wie erwähnt, stellen die Nierenglomerula spezialisierte Abschnitte des Gefäßsystemes dar und können als solche von generalisierten Gefäßerkrankungen mitbetroffen werden. Tatsächlich geht eine Reihe von entzündlichen Gefäßerkrankungen mit einer Läsion der glomerulären Kapillarschlingen einher. Dies trifft insbesondere für die Gruppe der autoimmunologisch bedingten Vaskulitiden zu, deren klinischer Verlauf nicht so sehr von der generalisierten Gefäßschädigung, sondern in der Regel vom Ausmaß der Nierenbeteiligung bestimmt wird. In diese Kategorie von Krankheiten fallen z. B. der systemische Lupus erythematodes und der Wegener&min;sche Granulomatose/Periarteritis nodosa/Rapid progressive Glomerulonephritis Komplex.

Obwohl die molekularen pathogenen Mechanismen der generalisierten Gefäßschädigungen in ihren Grundzügen bekannt sind und für die klinische globale Verlaufskontrolle derzeit einige nicht invasive Monitoringverfahren erprobt werden (Cameron, 1991), ist eine exakte Abschätzung der zumeist sehr schnell einsetzenden Nierenschädigung auch bei diesen Erkrankungen nur durch die Nierenbiopsie zu erreichen.

Die Notwendigkeit der Entwicklung klinisch einsetzbarer, nicht invasiver Diagnoseverfahren besteht somit auch für diese primär vaskulären Krankheiten, die mit einer Schädigung der Glomerula einhergehen.

Ein Konzept zur Entwicklung von nicht-invasiven Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, bei denen eine Schädigung der Niere eintritt, besteht darin, Moleküle, die von den Oberflächen der den Urin produzierenden und ableitenden Zellen freigesetzt werden (z. B. durch Abstoßung von Oberflächenmolekülen durch Schädigungen der Zelle oder Zelltod), im Harn quantitativ zu bestimmen und daraus klinisch-diagnostisch relevante Rückschlüsse auf die Erkrankung abzuleiten. Diesem Konzept liegt der Umstand zugrunde, daß Urin von seiner Entstehung als Primärharn in den Glomerula bis zu seiner Ausscheidung mit einer großen Anzahl unterschiedlicher Zellmembranen in Kontakt steht, die einerseits darauf spezialisiert sind, selektiv einzelne Harnkomponenten zurückzugewinnen und die andererseits, vor allem in den ableitenden Harnwegen, eine inerte Oberfläche bieten, um eine Abgrenzung zwischen Flüssigkeit und Organismus zu ermöglichen.

Als Grad der tubulären Schädigung wurden z. B. die Mengen von ausgeschiedenem β2-Mikroglobulin (Sherman et al., 1983, Woo et al., 1981) oder Lysozym (Dyck et al., 1979) bestimmt. Als Ausdruck der direkten, morphologisch faßbaren Tubulusalteration dienen derzeit auch die Bestimmung der Lactatdehydrogenase, sowie der N-Acetyl-β-D-Glukosaminidase (NAG) (Whiting et al., 1980, 1983). Weiters wurden monoklonale Antikörper gegen zum überwiegenden Teil nicht exakt definierte, z. T. auch identifizierte Nierenantigene hergestellt und auf ihre Brauchbarkeit in nicht-invasiven Tests geprüft (Tolkoff-Rubin, 1986; Scherberich, 1989).

In bisher durchgeführten klinischen Versuchen hat sich allerdings gezeigt, daß die eingesetzten Markierungsmoleküle im Harn nicht repräsentativ für den Nachweis der glomerulären Schädigung sind. Ähnliches zeigt sich für die derzeit gebräuchlichen Bestimmungsmethoden der funktionellen Tubulusparameter β2-Mikroglobulin und Lysozym. Beide besitzen zur Erfassung tiefergreifender Schädigungen des Nierengewebes keine zufriedenstellende Spezifität bzw. Sensitivität.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues, klinisch relevantes Verfahren zur Diagnose von Schädigungen der glomerulären Strukturen der Niere bereitzustellen.

Für der Lösung der gestellten Aufgabe wurde von der Überlegung ausgegangen, genau definierte und präzise lokalisierte Membranproteine ableitender Harnwege, welche in genau regionalisierten Abschnitten, den glomerulären Epithelzellen, regelmäßig exprimiert werden, als für die nicht-invasive Nierendiagnostik verwertbare Parameter heranzuziehen. Solche Moleküle können im Rahmen eines nicht-invasiven Diagnoseverfahrens als Parameter für den Zustand einer Niere bei verschiedenen Krankheitsbildern dienen, indem diese für einen bestimmten Abschnitt des Harntraktes spezifischen Moleküle mit Hilfe monoklonaler Antikörper nachgewiesen und quantifiziert werden. Dadurch wird eine Aussage darüber ermöglicht, ob bei einem bestimmten Patienten eine Schädigung in diesem speziellen Nierenabschnitt vorliegt. Diese Aussage bietet die Grundlage für die den Patienten individuell entsprechende optimale Therapie.

Bisher wurden lediglich Diagnoseverfahren auf der Grundlage tubulärer Marker entwickelt und versuchsweise eingesetzt (Cordon-Cardo et al., 1984; Bander et al., 1985).

Ein Sialoglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 140 kD, das zuerst in der Ratte gefunden und "Podocalyxin" genannt wurde (Kerjaschki et al., 1984) ist ein Vertreter der Gruppe von Proteinen, die sowohl an den glomerulären Epithelzellen als auch an den Endothelzellen anderer Gefäße auftreten. Dieses Molekül entspricht dem "glomerulären Polyanion", welches aufgrund seiner histochemischen Färbbarkeit identifiziert wurde und in den Nierenglomerula die höchste Konzentration von negativ geladenen Molekülen im ganzen Organismus verursacht (Mohos und Skoza, 1969; Jones, 1969; Nolte und Ohkuma, 1969). Untersuchungen am Rattengewebe haben gezeigt, daß der Hauptbestandteil dieses sog. glomerulären Polyanions das Sialoglycoprotein "Podocalyxin" ist. Dieses stark negativ geladene Molekül scheint eine Funktion in der Aufrechterhaltung der Morphologie der glomerulären Epithelzellen einerseits und in der Kontrolle der glomerulären Permeabilität andererseits zu erfüllen. Ein Hinweis dafür ist z. B., daß in experimentellen Erkrankungen, die mit Proteinurie einhergehen, die Expression dieses Moleküls drastisch reduziert ist (Blau und Haas, 1973; Michael et al., 1970; Kerjaschki et al., 1985). Die mittels immunelektronenmikroskopischen Untersuchungen an Blutgefäßen festgestellte Lokalisierung von Podocalyxin ausschließlich an der luminalen Seite des Endothels (Horvat et al., 1986) und in höchster Konzentration an der Außenseite der glomerulären Epithelzellen (Sawada et al., 1986) dürfte in Zusammenhang mit dem Schutz der Zelloberfläche stehen.

Nachfolgende Untersuchungen haben gezeigt, daß es im Menschen ein Molekül gibt, das dieselbe Verteilung wie das Ratten-Podocalyxin aufweist und diesem ähnlich, aber nicht damit identisch ist. Es weist ein anderes Molekulargewicht (Doppelbande entsprechend 160/170 kD) im SDS-Gel auf und zeigt nach tryptischem Verdau ein anderes Peptidmuster. Weiters sind Antikörper, die gegen das menschliche bzw. Rattenmolekül gerichtet sind, nicht kreuzreaktiv. Dieses Sialoglycoprotein wurde daher, um es vom Ratten-Podocalyxin zu unterscheiden, als Major Glomerular Sialoglycoprotein (MGS 160/170) bezeichnet (Kerjaschki et al., 1986).

Von Hancock und Atkins (1983) wurde ein monoklonaler Antikörper der Bezeichnung PHM5 beschrieben, der gegen nicht definierte Nierenepithelzellantigene gerichtet ist. Dieser Antikörper zeigte eine intensive Färbung der Nierenglomerula an Paraffinschnitten von normalen menschlichen Nieren. Eine ultrastrukturelle Lokalisation oder eine biochemische Definition des Antigens wurden von Hancock und Atkins nicht beschrieben. Kerjaschki et al., 1986, haben gezeigt, daß PHM5 eine Doppelbande von ca. 160/170 kD in glomerulären Lysaten aus menschlichem Material bindet und daß der Antikörper PHM5 ultrastrukturell ein Bild liefert, das der Verteilung Rattenpodocalyxin in der Rattenniere äquivalent ist. Von Hancock und Atkins wird die Möglichkeit erwähnt, diesen Antikörper auf seine Einsetzbarkeit zur Identifizierung und Quantifizierung von Epithelialzell-Antigen zu testen. Eine etwaige Verwendbarkeit des Antikörpers PHM5 für die gezielte Diagnose von Nierenschädigungen hat sich nicht erwiesen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde erstmals festgestellt, daß das "Major Glomerular Sialoglycoprotein", im folgenden als "MGS 160/170" bezeichnet, bzw. Fragmente davon bei Schädigungen der glomerulären Strukturen der Niere im Harn und/oder im Serum nachweisbar ist. Da MGS 160/170 ein Membranprotein ist, das hinsichtlich seiner Lokalisierung in der Niere, und zwar an der Glykokalyx der Podozyten, exakt definierbar ist, kann es somit als Marker glomerulärer Läsionen herangezogen werden.

Die vorliegende Erfindung beruht somit auf der Erkenntnis, daß MGS 160/170 einerseits ein Marker für primäre, isoliert-glomeruläre Läsionen, andererseits ein Marker für Gefäßerkrankungen mit glomerulärer Beteiligung ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die sich primär oder im Zuge von generalisierten Gefäßerkrankungen sekundär in einer Schädigung der Nierenglomerula manifestieren, bei welchem Verfahren man eine Körperflüssigkeit auf ihren Gehalt an MGS 160/170 oder Fragmenten davon untersucht.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Körperflüssigkeit Harn.

Da MGS 160/170 außer an der Oberfläche glomerulärer visceraler Epithelzellen an der luminalen Seite aller Endothelzellen vorkommt, kann im Harn auftretendes MGS 160/170 entweder vom Gefäßsystem oder von den Nierenglomerula stammen. Die Untersuchung von Harn auf seinen Gehalt an MGS 160/170 dient somit einerseits zur Diagnose von Erkrankungen, die sich primär in der Niere manifestieren. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren in dieser Ausführungsform zur Diagnose der fokalen Sklerose, einer nichtentzündlichen Erkrankung, von der angenommen wird, daß sie primär die glomerulären Epithelzellen befällt. Eine weitere Einsatzmöglichkeit ist die Diagnose der Minimal Change Nephrose.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden in einem nicht selektierten Gesamtkollektiv von nichtnierentransplantierten Patienten einer nephrologischen Ambulanz im Harn von Patienten mit glomerulären Erkrankungen wie Minimal Change Nephrose und fokale Sklerose erhöhte MGS 160/170-Werte nachgewiesen.

Diese selektiv erhöhten Meßwerte für MGS 160/170 zeigen, daß MGS 160/170 als Suchtest für diese klinisch zumeist chronisch verlaufenden, sehr schwer zu diagnostizierenden fokalen Sklerosen bzw. Minimal Change Nephrosen einsetzbar ist.

MGS 160/170 wurde auch im Harn mancher Patienten mit epimembranöser Glomerulonephritis nachgewiesen, die offensichtlich eine aktive Phase dieser Erkrankung erlitten. Weiters zeigten Patienten mit IgA-Nephritis dann Ausscheidung von MGS 160/170, wenn die Erkrankung besonders aggressiv und mit massiven glomerulären Läsionen verlief.

Diese Befunde deuten darauf hin, daß die renale Ausscheidung von MGS 160/170 bei Glomerulonephritiden ein Indikator für eine floride Phase der Krankheit ist.

Unter die Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die sich primär in Schädigungen der glomerulären Strukturen der Niere manifestieren, fällt im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die Überwachung von Zuständen im Anschluß an Nierentransplantationen.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung an nierentransplantierten Patienten durchgeführten Untersuchungen haben folgendes ergeben:

  • 1. Die Konzentration von MGS 160/170 im Harn ist ein guter Indikator für eine Abstoßungsepisode. Diese äußert sich in einer globalen Verschlechterung der Nierenfunktion, die sich klinisch durch einen Anstieg des Serum-Kreatinins manifestiert.
  • 2. Die quantitative Bestimmung von MGS 160/170 im Harn ist ein verläßlicher Parameter zur Bestimmung des Therapieerfolges z. B. nach Corticoid-Therapie; es wurde festgestellt, daß die Konzentration von MGS 160/170 im Harn parallel mit der Konzentration von Serum-Kreatinin abfällt.
  • 3. In mehreren der untersuchten Patienten wurde überraschend bereits mehrere Tage bis 2 Wochen vor dem Auftreten einer klinisch manifesten Transplantatabstoßung deutlich erhöhte MGS 160/170 Konzentrationen im Harn nachgewiesen. Der Nachweis von MGS 160/170 im Harn nierentransplantierter Patienten kann somit als "Frühwarnsystem" für bevorstehende Abstoßungen dienen, bevor diese klinisch manifest werden und zu Nierenschädigungen führen können.


Das erfindungsgemäße Verfahren weist hinsichtlich der klinischen Diagnostizierbarkeit glomerulärer Schädigungen eine Spezifität auf, die es den bisher bekannten Verfahren überlegen macht.

Bei den Erkrankungen, die sich primär in einer Schädigung der glomerulären Strukturen manifestieren, wird im Harn das im wesentlichen intakte MGS 160/170 nachgewiesen.

Andererseits dient die Untersuchung von Harn auf das Vorhandensein von MGS 160/170 zur Diagnose von Schädigungen der Blutgefäße, an denen die Glomerula sekundär beteiligt sind. Beispiele für dieses Anwendung sind generalisierte Gefäßerkrankungen mit Nierenbeteiligung, z. B. Wegener&min;sche Granulomatose.

Auch bei Erkrankungen, die sich sekundär in einer Schädigung der glomerulären Strukturen manifestieren, wird im Harn das im wesentlichen intakte Molekül nachgewiesen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Körperflüssigkeit eine Blutflüssigkeit, insbesondere Serum. Die Untersuchung von Serum, gegebenenfalls parallel zur Harnuntersuchung, dient vor allem zur Diagnose von generalisierten Gefäßschädigungen mit glomerulärer Beteiligung. Weiters dient die Bestimmung von MGS 160/170 zur Diagnose von überwiegend vaskulären Transplantatabstoßungen, bei denen MGS 160/170 im Serum der betroffenen Personen nachgewiesen werden kann.

Die parallele Bestimmung von MGS 160/170 im Harn und Serum, gegebenenfalls unter Einsatz von Antikörpern, die verschiedene bzw. verschieden große MGS 160/170-Fragmente erkennen, bietet die Möglichkeit, die bei bestimmten Erkrankungen erhaltenen Werte für MGS 160/170 bzw. Fragmente davon im Serum und Harn in Beziehung zueinander zu setzen. Die erhaltenen Muster können als Vorlage für eine differenzierte Diagnose von Nieren- und Gefäßerkrankungen herangezogen werden.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, mit dem anhand eines verläßlichen glomerulären Marker-Moleküls Erkrankungen mit primärer oder sekundärer glomerulärer Beteiligung spezifisch erfaßt werden können.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, gegen MGS 160/170, zum Nachweis von MGS 160/170 oder Fragmenten davon in Körperflüssigkeiten.

Beispiele für monoklonale Antikörper mit Spezifität für MGS 160/170, die zum Nachweis von MGS 160/170 im Harn und/oder Serum geeignet sind, sind die monoklonalen Antikörper, die von den Hybridomzellinien der Bezeichnung MGS(160/170)1, MGS(160/170)2 und MGS(160/170)3, die am 13. Februar 1992 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter den Hinterlegungsnummern 92 021 323 (MGS(160/170)1), 92 021 324 (MGS(160/170)2) und 92 021 325 (MGS(160/170)3) hinterlegt wurden, produziert werden.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung von anti-MGS 160/170-Antikörpern in Immunoassays zur quantitativen Bestimmung von MGS 160/170, sowie von Fragmenten davon zur weiteren Differenzierung des Ursprungs von MGS 160/170. Dieser Anwendung liegt die Überlegung zugrunde, daß MGS 160/170 im Harn entweder vom Endothel oder von den glomerulären Epithelzelloberflächen oder aus beiden Quellen stammen könnte. Die Größe der im Harn auftretenden Molekülfragmente von MGS 160/170 stellt einen Parameter dar, der es ermöglicht, hinsichtlich der Herkunft von MGS 160/170(fragmenten) zu differenzieren. Ausschließlich vom Endothel stammendes MGS 160/170 muß das Nierenfilter passiert haben, welches unter normalen Bedingungen Moleküle passieren läßt, die kleiner sind als Albumin, größeren Molekülen jedoch den Durchtritt verwehrt: MGS 160/170, das ausschließlich endothelialen Ursprungs ist, sollte somit in Form kleinerer Fragmente (< 50 kD) im Harn auftreten. Abgesehen davon ist aufgrund des endothelialen Ursprungs von MGS 160/170 zu erwarten, daß es auch im Serum des Patienten nachweisbar ist.

Andererseits ist zu erwarten, daß MGS 160/170, das im Zuge einer Nierenerkrankung von glomerulären Epithelzellen abgestoßen wurde, als im wesentlichen intaktes Molekül, das lediglich um den für die Zellmembranverankerung verantwortlichen Teil verkürzt ist, im Harn auftritt. In diesem Fall sollten im allgemeinen keine meßbaren Konzentrationen von MGS 160/170 im Serum der betroffenen Patienten nachweisbar sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde dies für Patienten mit primär glomerulären Erkrankungen (fokale Sklerose, epimembranöse Glomerulonephritis, floride IgA-Nephritis) bestätigt. Bei Patienten mit diesen primär glomerulären Erkrankungen wurden ausschließlich große Fragmente von MGS 160/170, die weit über der Nierengängigkeit liegen, im Harn gefunden. Die betroffenen Patienten wiesen auch keine meßbaren MGS 160/170-Konzentrationen im Serum auf.

Eine Methode zur Bestimmung der Größe der Bruchstücke von MGS 160/170 im Harn oder auch im Serum besteht darin, Proben des zu untersuchenden Harns oder Serums in Puffer, vorzugsweise SDS-Puffer, aufzunehmen, elektrophoretisch aufzutrennen, auf Nitrozellulose zu transferieren und mit Hilfe von Anti-MGS 160/170-Antikörpern im Western Blot zu lokalisieren. Die Größe der Moleküle wird mit Hilfe von Molekularstandards von Proteinen bekannter Größe kalibriert, wodurch eine exakte Bestimmung des Molekulargewichts der MGS 160/170-Fragmente möglich ist.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper konnten MGS 160/170-Fragmente sowohl im Serum als auch im Harn nachgewiesen werden, und zwar außer bei nierentransplantierten Patienten in Patienten, die unter dem Churg-Strauss-Weber Syndrom und unter Wegener&min;scher Granulomatose litten.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbaren Immunoassays zum Nachweis von MGS 160/170-(Fragmenten) beruhen auf Standardmethoden, die dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind und von denen ein großes Angebot zur Verfügung steht; stellvertretend für die umfangreiche Literatur auf diesem Gebiet wird auf die Übersichten von Schuurs und Van Weemen, 1977, und von Oellerich, 1984, verwiesen.

Diese Methoden basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz und einem oder mehreren Antikörpern. Einer oder mehrere der Komplexpartner ist dabei markiert, so daß das Antigen nachgewiesen und/oder quantitativ bestimmt werden kann. Die Markierung kann z. B. in Form eines gekoppelten Enzyms, Radioisotops, Metallchelats, oder einer fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder biolumineszierenden Substanz vorliegen.

Im Falle eines kompetitiven Immunoassays konkurriert das Antigen in der zu analysierenden Probe mit einer bekannten Menge von markiertem Antigen um die Bindung an die Antikörper-Bindungsstellen. Die Menge von markiertem Antigen, gebunden an den Antikörper, ist daher verkehrt proportional zur Antigenmenge in der Probe.

Bei Tests, in denen markierte Antikörper verwendet werden, ist die Menge an markiertem, gebundenem Antikörper direkt proportional zur Menge an Antigen.

Assays, die auf der Bildung eines Antikörper-Antigen- Komplexes basieren, wobei zwei Antikörper eingesetzt werden, die einander bei der Bindung an das Antigen nicht behindern, werden als "Sandwich"-Immunoassays bezeichnet.

Da monoklonale Antikörper in unbegrenzter Menge in konstanter Qualität verfügbar sind, weisen Immunoassays unter Verwendung monoklonaler Antikörper aufgrund ihrer konstanten Qualität und Reproduzierbarkeit gegenüber Assays, die sich polyklonaler Antikörper bedienen, Vorteile auf. Es werden daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt monoklonale Antikörper als Beschichtungs- und markierte Antikörper eingesetzt, wobei jedoch der Beschichtungsantikörper oder der markierte Antikörper gegebenenfalls durch polyklonale Antikörper ersetzt werden kann.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in einem Sandwich-Immunoassay, insbesondere in einem Sandwich-ELISA verwendet. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind in Sandwich-Immunoassays als Beschichtungs- und Markierungs-gekoppelte Antikörper einsetzbar.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Immunoassay-Kits, insbesondere Sandwich- Immunoassay-Kits, die monoklonale Antikörper gegen MGS 160/170 enthalten.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Sandwich-Immunoassay-Kit, vorzugsweise ein Sandwich- ELISA-Kit, in dem eine Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 den Beschichtungsantikörper und eine Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3 den markierten, vorzugsweise enzymgekoppelten Antikörper darstellt.

In den im Rahmen der erfindungsgemäß durchgeführten Versuchen hat sich in den Lagen (Beschichtungs- bzw. Markierungslage) ein Verhältnis der Antikörper von 1 : 1 als geeignet erwiesen; das Verhältnis der Antikörper innerhalb der Kombinationen ist jedoch nicht kritisch.

In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuche wurde als MGS 160/170-Standard ein Extrakt aus humanen Glomerula verwendet. Für den klinischen Routineeinsatz wird als Standard, d. h. als MGS 160/170-Präparation mit definiertem Gehalt an MGS 160/170, zweckmäßigerweise reines MGS 160/170, das vorzugsweise mittels rekombinanter Methoden hergestellt wird, eingesetzt. Rekombinantes MGS 160/170 kann hergestellt werden, indem z. B. mit Hilfe von monoklonalen anti-MGS 160/170-Antikörpern Expressions- Libraries auf Expression von MGS 160/170 gescreent werden und die positiven Klone mittels molekularbiologischen Standardmethoden kloniert und die für MGS 160/170 kodierende DNA zur Expression gebracht wird. Der Standard kann als Lyophilisat oder als Lösung vorliegen.

Ein bevorzugter Sandwich-ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem MGS 160/170 in Körperflüssigkeiten enthält als voneinander getrennte Einheiten eine oder mehrere handelsübliche ELISA-Platten; eine Kombination der Antikörper mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 (gegebenenfalls sind die ELISA-Platten mit diesen Antikörpern vorbeschichtet); eine Kombination der Antikörper mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3, die mit einem Enzym konjugiert sind (z. B. Meerrettichperoxidase), das mit einem geeigneten Substrat ein meßbares Reaktionsprodukt liefert, z. B. ein mittels ELISA-Photometer kolorimetrisch erfaßbares Produkt; das für die Enzymreaktion erforderliche Substrat; ein oder mehrere Verdünnungspuffer für die Antikörper; gegebenenfalls einen oder mehrere Waschpuffer; einen Standard, enthaltend eine definierte Menge an humanem MGS 160/170, vorzugsweise rekombinantes MGS 160/170 als Lyophilisat oder als Lösung.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Assays konnte MGS 160/170 im Harn und im Serum von Patienten mit glomerulären Schädigungen bzw. von nierentransplantierten Patienten nachgewiesen werden.

Weitere Antikörper bzw. Antikörperkombinationen, die sich aufgrund ihrer Fähigkeit, mit MGS 160/170 Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden, für die Verwendung in Immunoassays eignen, können z. B. mit Hilfe von Kompetitionsassays ermittelt werden.

Antikörper, die sich zum Nachweis kleinerer Bruchstücke von MGS 160/170, wie sie im Harn von Patienten mit generalisierten Gefäßschäden auftreten, eignen, können erhalten werden, indem z. B. Mäuse mit Antigenen aus Harn, Serum, Blutgefäßextrakten oder glomerulären Lysaten von normalen Personen oder von Personen mit einschlägigen Erkrankungen immunisiert werden und die erhaltenen Antikörper daraufhin untersucht werden, ob und welche MGS 160/170-Fragmente sie erkennen.

Figurenübersicht

Fig. 1 Lokalisation von MGS 160/170 in humanen Nierenglomerula. A: Lokalisation in den peripheren Glomerulumschlingen (Vergrößerung: 600 ×). B: Lokalisation in den glomerulären Epithelzellen (Vergrößerung: 1400 ×).

Fig. 2 Lokalisation von MGS 160/170 in humaner Plazenta.

Fig. 3 Charakterisierung der monoklonalen Antikörper im Screeningtest an Lysaten isolierter humaner Glomerula.

Fig. 4 Nachweis von MGS 160/170 in humaner Plazenta mittels Immunoblot.

Fig. 5 Bestimmung von MGS 160/170 im Harn von nierentransplantierten Patienten.

Fig. 6 Immunhistochemische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)1. A: ohne Natriumperjodat- Vorbehandlung. B: mit Natriumperjodat- Vorbehandlung.

Fig. 7 Immunhistochemische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)2.

Fig. 8 Immunhistochemische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)3. A: ohne Natriumperjodat- Vorbehandlung. B: mit Natriumperjodat- Vorbehandlung.

Fig. 9 Immunelektronenmikroskopische Lokalisation von MGS 160/170 mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)2.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1 Präparation von humanem MGS 160/170

Generell wurde die von Kerjaschki et al., 1986, publizierte Methodik angewandt. Insgesamt wurden 8 Nieren, die wegen hypernephroiden Nierenkarzinoms exstirpiert worden waren, direkt aus dem urologischen Operationssaal verarbeitet: Die Nierenrinde wurde mit Rasierklingen von der Medulla disseziert, in kleine Gewebsbröckchen zerschnitten und in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert. Das gesamte Material wurde in insgesamt 5 Batches aufgetaut, die Glomerula durch Durchpressen des Nierenrindenparenchyms durch Metallsiebe unterschiedlicher Porenweite (Kerjaschki et al., 1986) bis etwa 80-90% Reinheit angereichert. Die derart isolierten Glomerula wurden in SDS-Sample-Puffer (7.5% SDS, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 mM Dithiothreitol) durch 5 min Kochen aufgelöst, die unlöslichen Bestandteile in einer Micro- Zentrifuge (10 000 g für 15 min) abzentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert. Für die präparative SDS-Gel- Elektrophorese wurden 5-10%ige Gradientengele verwendet. Die glomerulären Lysate wurden nach der Stickstofflagerung nochmals für 1 min aufgekocht und sodann in einer Konzentration von etwa 100 µg Protein pro Slot auf 3 mm dicke SDS-Gele in einem Laemmli- Puffer-System (Laemmli, 1970) geladen. 3 mm dicke, 5-10%ige präparative SDS-Gele (nach Laemmli) wurden mit je 200 µg Protein pro Slot beladen, bei 20 mA über Nacht laufen gelassen, ein Teil des Gels mit 50% Methanol, 7% Essigsäure und 0.2% Coomassie-Blau R gefärbt und mit 25% Methanol ohne Essigsäure entfärbt und in dieser Form gelagert. Ein kleiner Streifen des Gels jeweils von der Mitte und von beiden Rändern wurde zur Lokalisation der MGS 160/170-Bande in einem Towbin- Transfer-Puffer-System (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol, pH 8.3) auf Nitrozellulose transferiert, mit radioaktiv markiertem WGA-Lectin inkubiert (Kerjaschki et al., 1984) und autoradiographiert. Nach einer exakten Markierung der WGA-aufnehmenden Banden bei 160 und 170 kD wurde das Röntgenbild mit den präparativen SDS-Gelen überlagert und die Banden in korrespondierender Position ausgeschnitten.

Die derartig exzidierten WGA-bindenden Banden, die dem humanen MGS 160/170-Molekül entsprechen, wurden in Tris-Puffer (100 mM pH 7.4) neutralisiert, nach kurzer Inkubation im gleichen Puffer mit 0.1%igem SDS eine Stunde inkubiert und dann in einer Bio-Rad-Kammer elektroeluiert. Das gesammelte, leicht blau gefärbte Eluat wurde danach auf einer PDG-6 Bio-Rad-Säule (Dimensionen 50 × 0.8 cm) entsalzt und der Puffer gegen 0.1%ige wäßrige SDS-Lösung ausgetauscht. Die blau erscheinenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert und in dieser Form gelagert, bis etwa 200 µg des eluierten Proteins vorhanden waren.

Das SDS-haltige lyophilisierte Proteinpulver nach der Elektroelution wurde in 10 ml 90%igem Aceton, 10% HCl bei -20°C über Nacht aufgenommen, wobei das Protein präzipierte und das SDS weitgehend ausgelöst wurde. Das präzipierte Protein wurde durch Zentrifugation gesammelt und in einem Stickstoffstrom getrocknet. Danach wurde das Pellet in 1 ml steriler PBS aufgenommen und zu gleichen Teilen mit komplettem Adjuvans emulgiert.

Beispiel 2 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes MGS 160/170 a) Immunisierung

Es wurden 2 Mäuse (Balb-c, 4 Wochen alt, 20 g schwer, weiblich) mit dem gereinigten Antigen nach folgendem Schema immunisiert:

1. Immunisierung:

30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in komplettem Freund&min;schem Adjuvans, subcutan.

2. Immunisierung:

30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in inkomplettem Freund&min;schem Adjuvans, subcutan, 3 Wochen nach der 1. Immunisierung.

3. Immunisierung:

30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in inkomplettem Freund&min;schem Adjuvans, 1/2 subcutan, 1/2 intramuskulär, 4 Wochen nach der 2. Immunisierung.

4. Immunisierung:

30 µg gereinigtes Antigen pro Maus in inkomplettem Freund&min;schem Adjuvans, subcutan, 1/3 intravenös, 2/3 intraperitoneal (Maus Nr. 1: 4 Wochen nach 3. Immunisierung, 3 Tage vor Fusion; Maus Nr. 2: 10 Wochen nach 3. Immunisierung, 3 Tage vor Fusion). Während dieser Zeit wurde im Abstand von jeweils 3 Wochen aus Blut aus der Schwanzvene Serum gewonnen, das in der indirekten Immunfluoreszenz an unfixierten Kryostatschnitten menschlicher Nieren (s. Beispiel 3) ausgetestet und auch zum Blotten auf SDS-glomerulären Lysaten humaner Nieren verwendet wurde.

b) Fusion

Die Zellfusion wurde durchgeführt, nachdem die Tiere einen Immunfluoreszenz-Titer von 1 : 6.400 bzw. 1 : 3.000 im Serum erreicht hatten. Zur Herstellung von Hybridomen wurde im wesentlichen die Methode von Köhler und Milstein, 1975, verwendet.

Die Milz der Maus wurde am vierten Tag nach der letzten Immunisierung steril entnommen, mechanisch zerkleinert und mit serumfreien Kulturmedium (RPMI 1640, Gibco, USA) gewaschen. Die Milzzellen wurden unter Zusatz von 50%igem 4000GK Polyäthylenglykol (Merck) in 75 mM HEPES mit X63 A8653-Myelomzellen (Verhältnis Milz- zu Myelomzellen 1 : 10) fusioniert. Die Zellmischung wurde bei 100 g 6 min lang zentrifugiert. Das Medium wurde vorsichtig mit 20 ml RPMI-Kulturmedium bei 37°C verdünnt und das Zellpellet in selektivem HAT-Medium (HATKonc von Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1 097 130; RPMI 1640, komplettiert mit 100 U/ml Natrium-Penicillin G, 100 U/ml Streptomycin und 10% FCS - mit 10-4 M Hypoxanthin, 4×10-7 M Aminopterin und 1.6×10-5 M Thymidin) resuspendiert. Aliquots der Zellsuspension wurden auf 16 96-well Mikrotiterplatten à 100 µl verteilt. Nach etwa zweiwöchigem Anwachsen der Zellen im HAT-Medium wurden die Überstände sämtlicher gelb verfärbter Vertiefungen in einem ELISA-System auf die Produktion von Maus IgG geprüft. Dafür wurden Mikrotiterplatten verwendet, die mit Schaf-anti-Maus IgG als stabiler Phase überzogen waren. Die Kulturüberstände wurden aufgetragen, und nach Inkubation und Waschen mit einem Kaninchen-anti-Maus- Peroxidase-Konjugat entwickelt.

c) Screening der Hybridom-Kulturüberstände

Für die indirekte Immunofluoreszenz wurden Anteile einer Nierenrinde eines humanen Operationspräparates in flüssigem Stickstoff eingefroren, in einem Kryostat wurden 4 µm dicke unfixierte Schnitte hergestellt, die mit den Kulturüberständen der Hybridome inkubiert wurden. Alternativ wurden Cryostatschnitte einer unfixierten humanen Placenta verwendet. Darauf erfolgte eine Inkubation mit Fluorescein-markiertem Schaf-anti- Maus IgG, und Auswertung in einem Fluoreszenzmikroskop (Fig. 1 und 2, siehe Beispiel 3).

Für die Austestung mittels Immunoblot wurden humane Glomerula isoliert, in SDS-Buffer aufgelöst, die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Danach wurden dünne Nitrozellulosestreifen zuerst in den Überständen inkubiert, danach mit Schaf-anti-Maus-Alkalische- Phosphatase Konjugat (Promega) inkubiert, und mit einem kommerziellen Chromogen (Kierkegaard and Perry) nach Vorschrift des Herstellers entwickelt (Fig. 3, siehe auch Beispiel 3).

Sofern nicht anders angegeben, wurden für alle ELISA-Versuche die folgenden Puffer verwendet:

Beschichtungspuffer: Carbonat-Bicarbonat Puffer, pH 9.6

Waschpuffer: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7.4 mit 0.05% Tween 20

Blocking-Solution: PBS mit 2.5% Rinderserumalbumin (BSA)

Substratlösung: O-Phenylen-Diamin (Fluka, 40 mg in 100 ml Citratpuffer, pH 6.0)

Stopp-Lösung: 8 N Schwefelsäure

96 well-Mikrotiterplatten: Immunoplate/Maxisorb, Nunc, Dänemark)

MicroELISA: Zum Beschichten der Platten wurden 100 µl Kaninchen-anti-Maus IgG pro Vertiefung (5 µg/ml) verwendet. Inkubation: 3 h bei Raumtemperatur. Die Platten wurden 5 × mit Waschpuffer gewaschen und 1 h lang mit 200 µl/Vertiefung Blocking-Solution blockiert. Nach neuerlichem Waschen wurden die Vertiefungen mit 50 µl Zellüberstand 1 h bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 100 µl eines Peroxidasegekoppelten Kaninchenantikörpers gegen Maus- Immunglobuline (Jackxell, Rabbit anti-MouseIgG(H+L), Verdünnung 1 : 4000 in PBS) 1 h lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten wurden 100 µl Substratlösung in die Vertiefungen hinzugefügt und nach 5 min die Reaktion mit 50 µl Stopp-Lösung gestoppt. Die Absorption der Lösung wurde in einem Dynatech-ELISA- Reader bei einer Wellenlänge von 492 nm (Referenzfilter: 630 nm) gemessen. Die positiven Überstände wurden danach in der indirekten Immunfluoreszenz an humanen Nierenschnitten einerseits und an Immunblots von glomerulären Lysaten (siehe oben) andererseits ausgetestet. Nur jene Hybridome, die sowohl in der Immunfluoreszenz als auch in der Immunoblot-Methode positiv waren (insgesamt 4), wurden weiter verfolgt. Sie wurden in neue 96-Well Platten auseinandergesetzt und, wie oben beschrieben, auf Antikörperproduktion getestet.

d) Klonierung der Hybridome

Die positiven Kulturen wurden nach der Methode der limitierenden Verdünnung ("limiting dilution") kloniert. Dabei wurde derart verdünnt, daß 100 µl Kulturmedium 1 Zelle enthielten. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden mit je 100 µl dieser Zellsuspension, gemischt mit Thymuszellen, beschickt. Die Kulturüberstände wurden mittels ELISA und Indirekte Immunfluoreszenz, wie oben beschrieben, getestet. Die positiven Klone (4) der einzelnen Kulturen wurden ein zweites Mal kloniert, aufgezüchtet, getestet und eingefroren oder zur Produktion von Antikörpern in vivo verwendet. Insgesamt konnten vier verschiedene Klone aus der zweiten Zellfusion (Maus Nr. 2) hergestellt werden, die für die weiteren Versuche verwendet wurden. Die Klone wurden mit mgs(160/170)1, mgs(160/170)2, mgs(160/170)3 und mgs(160/170)4 bezeichnet.

e) Produktion monoklonaler Antikörper

Die monoklonalen Antikörper wurden in größerer Menge im Aszites von Balb-c-Mäusen, die 10 Tage vorher mit 0.5 ml Pristan (Sigma) vorbehandelt worden waren, produziert. Dabei wurden von den Hybridomkulturen je ca. 10&sup7; Zellen intraperitoneal in die Mäuse injiziert. Nach 10 bis ca. 14 Tagen wurde die Aszitesflüssigkeit entnommen und eine Titerbestimmung der Antikörper mittels indirekter Immunfluoreszenz durchgeführt.

Weiters wurden sämtliche Zellinien in ein im wesentlichen proteinfreies Medium mit Nutridoma (Boehringer Mannheim) gebracht und die Überstände mit Ammoniumsulfat gefällt. Zur IgG-Fällung wurden die Nutridoma-Zellüberstände mit gleichen Volumina von gesättigtem Ammoniumsulfat gemischt und 1 h bei Zimmertemperatur leicht gerührt. Die Suspension wurde bei 3000 g 10 min lang zentrifugiert und das Pellet wurde in PBS gelöst und 48 h lang gegen PBS dialysiert. Die Proteinkonzentration der Antikörper-Lösung wurde bei 280 nm Absorption gemessen. Die monoklonalen Antikörper wurden mit Natriumazid in einer Endkonzentration von 0.1 M bei 4°C, oder ohne Azid in flüssigem Stickstoff gelagert.

Beispiel 3 Charakterisierung der monoklonalen Antikörper und ihre Verwendung zur Etablierung eines Sandwich-ELISA-Systems a) Indirekte Immunfluoreszenz

Zu Screeningzwecken und zur Charakterisierung der monoklonalen Antikörper wurden Gefrierschnitte von normalem humanem Nierengewebe von Hypernephrom-Nieren oder Nierenbiopsien hergestellt. Die Schnitte (4 µm) wurden 10 min bei -20°C in Aceton fixiert und mit 10 µl des Zellüberstandes oder der Aszitesflüssigkeit (verdünnt in PBS) inkubiert. Nach dem Spülen mit PBS wurden sie mit Fluoreszein-Isothiozyanat-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus IgG (FITC, 1 : 100 verdünnt) inkubiert, gewaschen und in einem Leitz- Fluoreszenzmikroskop untersucht. Fig. 1 zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 in humanen Nierenglomerula. In A ist die ausschließliche Lokalisation des Antigens in den peripheren Glomerulumschlingen deutlich sichtbar (Vergrößerung 600×). B zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 an einem 1/2 µm dicken Gefrierschnitt eines normalen humanen Glomerulums. In diesen hochauflösenden Präparationen wird die Lokalisation von MGS 160/170 bevorzugt an den glomerulären Epithelzellen und deren Fußfortsätzen (Pfeilspitzen) sichtbar. CL: Kapillarlichtung. Vergrößerung 1400×.

Ergänzend zur Immunfluoreszenz an humaner Niere wurden die Antikörper auch an humaner Lunge, Herz, Magen, Duodenum, Nabelschnur und Placenta ausgetestet. Auch an diesen Gewebsschnitten zeigte sich die charakteristische Lokalisation von MGS 160/170 an den Gefäßendothelien. Fig. 2 zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 an einem unfixierten Gefrierschnitt von menschlicher Plazenta. Das Antigen befindet sich ausschließlich in relativ hoher Konzentration in den Blutgefäßen und hier wiederum an den Kapillaroberflächen. Eine Kreuzreaktion mit Rattengewebe, insbesondere Rattennieren, wurde durch die indirekte Immunfluoreszenzmethode ausgeschlossen. Die Antikörpertiter der monoklonalen Antikörper anti- mgs(160/170)1-4 (Aszites) fielen in einen Bereich größer 1 : 100 000. Neben den Zellüberständen, Nutridoma, sowie der Ascitesflüssigkeit wurde das durch Ammoniumsulfatfällung aus Nutridoma gewonnene und an Biotin gekoppelte anti-mgs(160/170)1-4 IgG in der Immunfluoreszenz untersucht. Die biotinylierten Antikörper wurden für einen Kompetitionstest zur Epitopbestimmung an Nierenschnitten verwendet. (Die Biotinylierung wurde durchgeführt, wie unter d) angegeben.)

b) Western Blot

Nitrozellulose-Transfers humaner glomerulärer Proteine (Kerjaschki et al., 1986, siehe auch Beispiel 2c) oder in SDS-Sample Puffer aufgelöste Placentaproteine wurden zuerst 1 h lang mit 2% Trockenmilchpulver in PBS, Tween 20 inkubiert. Die Streifen wurden dann zuerst mit Mausaszites (Verdünnung 1 : 6000), darauf mit Alkalischer-Phosphatase-konjugiertem Kaninchen-anti- Maus IgG (Promega, Verdünnung 1 : 7500) inkubiert und mit Nitroblau-Tetrazolium-Bromchlorindolylphosphat Farbreagens (Kierkegaard and Perry, Verdünnung 1 : 1 : 20) entwickelt.

Alle monoklonalen Antikörper erkannten eine Doppelbande mit 160/170 kD Molekulargewicht. Fig. 3 zeigt die Charakterisierung der monoklonalen Antikörper im Screeningtest an Lysaten von isolierten humanen Glomerula. Jeder einzelne Streifen repräsentiert einen separaten monoklonalen Antikörperüberstand. Die mit MGS 1 bis MGS 4 bezeichneten Antikörper zeigen, wie die Überstände von zahlreichen anderen Klonen auch, Spezifität für eine Doppelbande bei 160/170 kD. Fig. 4 zeigt den Nachweis von MGS 160/170 in humaner Plazenta mittels Immunoblot mit den monoklonalen Antikörpern mgs(160/170)1 (A) und mgs(160/170)2 (B). C ist eine Kontrolle, in welcher der erste Antikörper ausgelassen wurde. Sowohl in A und B zeigt sich, daß die monoklonalen Antikörper ausschließlich die Doppelbande von einem Molekulargewicht von 160/170 kD erkennen. Humane Plazenta ist somit ein zweites verläßliches, in großen Mengen zu erhaltendes humanes Gewebe, in welchem MGS 160/170 enthalten ist.

c) Bestimmung der Antikörper-Subklasse

Die Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde mit der Ouchterlony Immundiffusion in 1% Agarose/PBS mit den konzentrierten Überständen und Subklassen-spezifischen Antisera (Sigma) durchgeführt.

Die monoklonalen Antikörper mgs( 160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)4 gehören zur Subklasse der IgG1, mgs(160/170)3 zur Subklasse IgG2.

d) Bestimmung der Epitop-Spezifität

Zur Bestimmung der Epitope, die von den Antikörpern erkannt werden, wurden die vier Antikörper biotinyliert und mittels indirekter Immunfluoreszenz und ELISA charakterisiert. Die Biotinylierung der 4 verschiedenen monoklonalen Antikörper erfolgte an N-OH- Succinimidobiotin (Fa. Sigma). Dazu wurden 10 mg des Biotins in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst und 100 ml der Lösung pro 1 mg IgG (dialysiert gegen 100 mM NaHCO&sub3;, pH 8.0) mit dem Antikörper gemischt. Die Antikörper-Biotin-Suspension inkubierte 2 h unter Lichtschutz bei Raumtemperatur und wurde dann gegen 100 mM NaHCO&sub3;, anschließend gegen PBS dialysiert.

i) Immunfluoreszenz

Die Kompetition der biotinylierten mit den nicht markierten Antikörpern erfolgte an Gefrierschnitten normaler humaner Niere. Die Schnitte wurden zuerst mit unmarkiertem Streptavidin (Verdünnung 1 : 100) inkubiert, um freies Biotin abzublocken, und wurden dann mit jeweils einzelnen unmarkierten monoklonalen Antikörpern inkubiert (Aszites 1 : 100). Nach dem Spülen mit PBS wurden die Schnitte mit den verschiedenen biotinylierten Antikörpern inkubiert (1 : 50). Nach neuerlichem Spülen wurden die Schnitte mit Fluoreszin-Isothiozyanat-konjugiertem Avidin (Verdünnung 1 : 100) inkubiert, gewaschen und in einem Leitz Fluoreszenzmikroskop untersucht. Diese Untersuchung ergab, daß jeder der vier monoklonalen Antikörper sich selbst inhibiert, mgs(160/170)1 und mgs(160/170)4 inhibieren einander gegenseitig, erkennen also möglicherweise dasselbe Epitop. Da es in der Fluoreszenz selten zu einer vollständigen Inhibition kommt und für mgs(160/170)2 die Inhibition durch sich selbst und durch die anderen Antikörper unvollständig war, konnte für diesen Antikörper keine definitive Aussage gemacht werden.

ii) ELISA

Der Versuch im ELISA wurde zunächst analog zur Immunfluoreszenz durchgeführt. 96-well- Mikrotiterplatten wurden mit geringen Antigenmengen beschichtet (Tween 20 Glomerulumlysat 1 : 200 verdünnt) und mit den einzelnen monoklonalen Antikörpern (Aszites 1 : 100) inkubiert. Nach dem Waschen der Platten wurden diese mit den einzelnen biotinylierten Antikörpern inkubiert. Das Ergebnis deckte sich mit dem Ergebnis der Immunfluoreszenz: mgs( 160/170)1 und mgs(160/170)4 erkennen offenbar dieselben oder überlappende Stellen des Antigens, mgs(160/170)2 wird durch die anderen Antikörper nur sehr schwach inhibiert, mgs(160/170)3 erkennt ein von den anderen verschiedenes Epitop.

Es ergab sich somit, daß von den vier monoklonalen Antikörpern drei verschiedene Epitope erkannt werden. mgs(160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)3 eigneten sich, wenn sie einzeln verwendet wurden, besser für das Beschichten der Platten und als Detektionssystem als mgs(160/170)4. Wird mgs(160/170)4 sowohl als Beschichtungsantikörper als auch als markierter Antikörper verwendet, wurden deutlich niedrigere Extinktionen als bei derselben Versuchsanordnung mit den anderen Antikörpern erhalten. Es konnte gezeigt werden, daß mgs(160/170)4 auch bei Kombination mit anderen Antikörpern zu schwächeren Ergebnissen führt. Diese Beobachtungen stehen in Einklang mit den Ergebnissen der Kompetitionstests, nach denen mgs(160/170)4 dasselbe Epitop zu erkennen scheint wie mgs(160/170)1 und vermutlich insgesamt an weniger Antigenstellen bindet.

Beispiel 4 a) Entwicklung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Sandwich-ELISA) zum Nachweis von humanem MGS 160/170 im Harn

Der Assay wurde als sog. "zweistufiger" Assay entwickelt. Dabei handelt es sich um eine Methode, in der an die Inkubation der Probe ein Waschschritt angeschlossen und die Inkubation mit dem Antikörper- Enzymkonjugat getrennt durchgeführt wird. (Diese Methode hat den Vorteil, daß mögliche Störfaktoren für die Immunreaktion, wie z. B. der niedrige pH-Wert einiger Proben (der pH-Wert der Harnproben liegt zwischen 6.0 und 7.5), minimiert werden können. Im Fall der Anwendung einer "einstufigen" Methode könnten sich diese Faktoren negativ auf die Immunreaktion des Peroxidase-Konjugats auswirken.)

In Vorversuchen zur Optimierung des ELISA wurde die Konzentration des Beschichtungsantikörpers variiert, ebenso die Inkubationszeit für die Immunreaktion. Zweier- und Mehrfachkombinationen der Antikörper führten zu unterschiedlich starken Signalen im ELISA:

Es zeigte sich, daß die Kombination aus mgs(160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)3 sowohl als Festphasenantikörpersystem (Beschichtung) als auch als Detektionssystem zu höheren Extinktionen als einzelne Antikörper oder Kombinationen von zwei Antikörpern führte, wobei sogar stärkere Signale als mit polyklonalem Kaninchenantikörper bei geringerem Hintergrund erhalten wurden. Für die weitere Entwicklung wurde eine Testanordnung gewählt, in der paarweise zwei Antikörper zum Beschichten der Platte und zwei als Peroxidase-gekoppelte Antikörper verwendet werden. Es konnten dadurch bei niedrigem Hintergrund ausreichend hohe Extinktionen erzielt werden. Das Signal konnte im Vergleich zu dem bei Testanordnungen mit nur einem Antikörper in einem der zwei Lagen deutlich verstärkt werden. Für die paarweise Anordnung wurden die drei Antikörper mgs(160/170)1, mgs(160/170)2 und mgs(160/170)3 verwendet. Der Antikörper mgs(160/170)1 wird zweimal, einerseits als Beschichtungs-, andererseits auch als markierter Antikörper eingesetzt (in verschiedenen Versuchsanordnungen konnte gezeigt werden, daß mgs(160/170)1 eine hohe Avidität besitzt). Die Wahl der Antikörper in dieser Kombination führte zu den besten Ergebnissen.

Aus Versuchen zeigte sich, daß Beschichtungs- und markierte Antikörperpaare auch für die jeweils andere Lage verwendet werden können. Aufgrund der Ergebnisse, daß mgs(160/170)1 und mgs(160/170)4 offenbar gleiche Stellen des Antigens erkennen, eignen sich die beiden Antikörper allein nicht für einen Assay. Es stellte sich jedoch heraus, daß mgs(160/170)4 zusammen mit mgs( 160/170)3 als Beschichtungsantikörper in Kombination mit dem Antikörper-Paar mgs(160/170)1/mgs(160/170)2 als markierte Antikörper zu guten Ergebnissen führt. Da diese Variante jedoch insgesamt schwächere Resultate lieferte, wurde die Variante, in der das Paar mgs(160/170)1/mgs(160/170)3 als markierte Antikörper und das Paar mgs( 160/170)1/mgs( 160/170)2 als Beschichtungsantikörper eingesetzt werden, für die weiteren Versuche verwendet.

In Vorversuchen wurde die Konzentration des Beschichtungsantikörpers von 1 : 500 bis zu 1 : 32 000 variiert, ebenso die Inkubationszeit für die Immunreaktion von 1/2 bis 3 h. Die besten Ergebnisse konnten bei einer Verdünnung der Beschichtungsantikörper zwischen 1 : 2000 und 1 : 4000 erzielt werden. Für die Dauer der Immunreaktion bewährte sich jeweils 1 Stunde, die Verlängerung der Inkubationszeit führte zu keiner entscheidenden Verbesserung der Resultate. (Verdünnung des Konjugates um 2 Verdünnungsstufen auf 1 : 800 statt 1 : 200, dafür Entwicklungszeit 20 statt 5 min.)

Das Verhältnis der Antikörper zueinander in den Lagen (Beschichtung und Detektion) betrug jeweils 1 : 1.

Der optimierte Assay für die Bestimmung von humanem MGS 160/170 im Harn wurde wie folgt durchgeführt:

96-well-Mikrotiterplatten wurden mit einer Kombination der beiden monoklonalen Antikörper mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 in einer Verdünnung von 1 : 3.000 in Beschichtungspuffer beschichtet (über Nacht bei 4°C; 100 µl/Vertiefung). Die Platten wurden 5 mal gewaschen und die verbleibenden Bindungsstellen mit 200 µl Blocking-Solution 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach einem weiteren Waschzyklus wurden die einzelnen Standards in die Vertiefungen der vertikalen Reihen 1 und 2 pipettiert. Als Standardlösung wurde ein Detergensextrakt aus humanen Glomerula (Tween 20) hergestellt. Zur Ermittlung der Standardkurve wurden 8 Standardverdünnungen herangezogen. Die Konzentrationsunterschiede der einzelnen Standards liegen im Bereich von 2.5 µl des konzentrierten Glomerulumextraktes (Standard 1 = 0.5, Standard 2 = 1, Standard 3 = 2.5, Standard 4 = 5, Standard 5 = 7.5, Standard 6 = 10, Standard 7 = 12.5, Standard 8 = 15 µl des Glomerulumextraktes auf 100 µl PBS). Für jeden Standard wurde eine externe Vorverdünnung vorbereitet und das Volumen von je 100 µl direkt in die beiden Vertiefungen pipettiert (Doppelbestimmung). In die übrigen Vertiefungen (für Leerwert, Negativkontrolle und Harnproben; jeweils Doppelbestimmung) wurden gleiche Volumina von 100 µl gefüllt. Die Harnproben wurden unverdünnt im ELISA ausgetestet. Die Inkubationszeit für die Proben betrug 1 h bei 37°C. Nach 5maligem Waschen der Platten wurden die Vertiefungen mit jeweils 100 µl der Peroxidasegekoppelten Antikörper mgs( 160/170)1 und mgs( 160/170)3 1 h lang bei 37°C inkubiert. (Die Kopplung der Antikörper erfolgte mit Meerrettich-Peroxidase (Boehringer Mannheim) und wurde nach der von Wilson und Nakane (1978) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Platten wurden daraufhin 5× gewaschen, Substratlösung hinzugefügt (200 µl/Vertiefung) und die Reaktion nach 4 min mit 100 µ1 Stopp-Lösung (1M H&sub2;SO&sub4;) gestoppt. Die Absorption der Proben wurde durch einen ELISA-Reader (Dynatech) bei einer Wellenlänge von 492 nm (Referenz 630 nm) bestimmt. Die MGS 160/170-Konzentration der Proben wurden anhand der Standardkurve berechnet. Sie erlaubt eine quantitative Bestimmung von MGS 160/170 im Harn in einem Konzentrationsbereich zwischen 0.5 und 15 Einheiten. 1 µl des Glomerulumextraktes wurde als eine MGS 160/170-Einheit definiert. Zeigte eine Probe die gleiche Extinktion, die man für den Standard 8 (15 µl Detergensextrakt) fand, betrug somit die Konzentration 15 MGS 160/170-Einheiten. Die Angabe in MGS 160/170-Einheiten ermöglicht die Aussage über den relativen MGS 160/170-Gehalt der Proben; die Einheiten können auf reines MGS 160/170 umgerechnet werden.

Die Genauigkeit des Harn-Assays wurde überprüft, indem zwei Harnproben mit 6 bzw. 12 MGS 160/170-Einheiten in verschiedenen Tests analysiert wurden. Die Intra-Assay- Variationskoeffizienten betrugen 6.29 bzw. 6.3%; die Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 13.97 bzw. 6.57. Die Linearität der Standardkurven wurde bestimmt, indem die Verdünnungsreihen des Glomerulumextraktes (Konzentrationen zwischen 0.5 und 15 µl=Einheiten) untersucht und die lineare Regression der experimentell bestimmten Werte gegenüber den erwarteten Werten berechnet wurde. Die Korrelationskoeffizienten für die Kurve lagen in allen Tests zwischen 0.97 und 0.99.

Die Wiederfindung des MGS 160/170-Standards (Tween 20-Glomerulumextraktes) wurde untersucht, indem dem Harn von 3 gesunden Normalpersonen der Kontrollgruppe der Extrakt in zwei verschiedenen Konzentrationen (10 bzw. 15 µl) zugesetzt wurde. Da die Harne der Normalpersonen nur ganz minimale Extinktionen (0.001-0.08) aufweisen, die geringfügig über dem Leerwert liegen, wurde ein Durchschnittsleerwert vor der Berechnung der Wiederfindung von den Extinktionen abgezogen. Die durchschnittliche Wiederfindung wurde mit 85% (Bereich 52-104%) berechnet.

b) Prüfung des monoklonalen Antikörpers PHM5 auf seine Fähigkeit, MGS 160/170 bzw. Fragmente davon nachzuweisen

Im gleichen Ansatz wurde der monoklonale Antikörper PHM5 (Hancock und Atkins, 1983) auf seine Einsatzfähigkeit in einem ELISA-Testsystem geprüft. Zu diesem Zweck wurden steigende Konzentrationen von 5 µg/ml bis 10 mg/ml als stabile Phase auf Mikrotiterplatten aufgetragen und danach ein ELISA-Assay, genau wie unter a) beschrieben, aufgesetzt. Mit keinem der Antikörper und in keiner Konzentration des Standards konnte nachgewiesen werden, daß der immobilisierte monoklonale Antikörper PHM5 in der Lage ist, MGS 160/170 aus der Standardlösung zu binden. Die Experimente wurden von der Standardlösung (glomeruläres Lysat) auch auf MGS 160/170-haltige Harne ausgetestet, die vorher mit dem unter a) beschriebenen Testsystem bestätigt worden waren. Auch in diesem Fall zeigte sich, daß PHM5 nicht in der Lage ist, MGS zu binden. Dies deutet darauf hin, daß PHM5 gegen ein Epitop von MGS 160/170 gerichtet ist, welches in den Fragmenten, die im Harn auftreten, nicht repräsentiert ist.

Es wurde auch die Fähigkeit von PHM5 geprüft, auf über immobilisierte monoklonale Antikörper gereinigtes MGS 160/170 als zweiter Detektionsantikörper zu fungieren. Auch hier wurde gefunden, daß bei keiner Konzentration eine meßbare Bindung von PHM5 an das immobilisierte MGS 160/170 aus den Standardlösungen bzw. den Fragmenten aus MGS 160/170-positiven Harnen zustande kam.

Daraus kann geschlossen werden, daß der monoklonale Antikörper PHM5 nicht in der Lage ist, MGS 160/170 zu erkennen und sich somit nicht für einen Einsatz in einem ELISA-Assay eignet.

Beispiel 5 Entwicklung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Sandwich-ELISA) zum Nachweis von MGS 160/170 im Serum

Für die quantitative Bestimmung von MGS 160/170 im Humanserum wurden Vorversuche zur Optimierung der Versuchsbedingungen durchgeführt. Es wurde gefunden, daß der für den Nachweis von MGS 160/170 im Harn entwickelte Test auch für den Nachweis dieses Moleküls im Serum zufriedenstellende Resultate ergibt.

Um den Einfluß der Serumproteine auf die Spezifität und Sensitivität des Serum-ELISA zu klären, wurden Standardverdünnugsreihen in unterschiedlichen Medien angefertigt. Dabei wurden jeweils gleiche Standardmengen (hergestellt von glomerulären Lysaten, wie oben in Beispiel 4 beschrieben) in PBS, oder in PBS mit 7% BSA, oder in Serum von klinisch gesunden Probanden aufgelöst. Es zeigte sich, daß die Extinktionen der Standards in 7% BSA in allen Konzentrationen durchwegs um 35% höher lagen als die des Standards in PBS, hingegen betrugen die Extinktionen nur etwa 50% der im Verdünnungsmedium PBS erreichten Werte, wenn Serum zur Verdünnung benutzt wurde (d. h. die Wiederfindung betrug durchschnittlich 50%).

Zur Beurteilung der Anwendbarkeit des Tests wurden 42 Serumproben von 38 gesunden Personen auf deren Gehalt an MGS 160/170 untersucht. Die Proben von 35 gesunden Probanden enthielten keine meßbaren Mengen des Antigens. Dagegen enthielten die Sera von drei Personen MGS 160/170 in relativ hoher Konzentration (5-15 "Harn-Einheiten"/100 ml Serum). Diese Personen hatten zum Zeitpunkt der Blutabnahme einen grippalen Infekt (2×) bzw. eine inzipiente Borelliose (1×).

Zusammenfassend ergab sich aus den Vorversuchen, daß die Ergebnisse gut reproduzierbar und die Intra- bzw. Interassayvarianz gering waren. Daher wurde für die Bestimmung von MGS 160/170 im Serum die Testanordnung zur Bestimmung im Harn übernommen.

Beispiel 6 Bestimmung von MGS 160/170 als diagnostischer Parameter a) Bestimmung von MGS 160/170 im Harn von Normalpersonen

Es wurden Harnproben von 20 Normalpersonen mit Hilfe des in Beispiel 4 beschriebenen Harn-Sandwich-ELISAs untersucht. Die Extinktionen lagen in einem vernachlässigbar niedrigen Bereich zwischen 0.05 und 0.10, so daß angenommen werden konnte, daß MGS 160/170 bei gesunden Normalpersonen im Harn nicht vorkommt. (Für die Untersuchung der Harnproben von Nierenpatienten variierten die MGS 160/170-Mengen zwischen 0 und 30 MGS 160/170-Einheiten.)

Bei der Auswertung der Testergebnisse wurde das Schwergewicht auf die im ELISA stark positiven (> 5 MGS 160/170-Einheiten) Patienten gelegt, weil diese Gruppe im Hinblick auf die klinische Fragestellung am relevantesten schien.

b) Bestimmung von MGS 160/170 im Harn und im Serum von nierentransplantierten Patienten

Bei einem Teil der Patienten wurden im Western Blot MGS 160/170-Fragmente von relativ hohem Molekulargewicht (ca. 150 kD, bestimmt mittels SDS-PAGE bzw. Immunoblotting) nachgewiesen, wobei diese Patienten negative Serumwerte zeigten. In der zweiten Patientengruppe wurde sowohl im Serum als auch im Harn MGS 160/170 nachgewiesen, außerdem wurden im Harn Fragmente von MGS 160/170 (um 70 kD, bestimmt mittels Immunoblotting) nachgewiesen.

Alle untersuchten Patienten wurden einer Nierenbiopsie unterworfen, mit deren Hilfe aufgrund des histologischen Bildes eine Abstoßungsepisode eindeutig erkennbar ist. Bei Feststellung einer Abstoßungsepisode erfolgte eine Behandlung mit Corticoiden, die im allgemeinen zu einem Abklingen der Transplantatabstoßung führt (die Angabe der Behandlungszeitpunkte bezieht sich auf die Meßzeitpunkte der MGS 160/170-Konzentration). Während der Beobachtungsperiode wurden parallel zu MGS 160/170 (bestimmt mittels ELISA, wie in Beispiel 4 beschrieben) die Kreatinin-Werte bestimmt, deren Ansteigen im Serum eine Abstoßungsepisode anzeigt. Der Verlauf der Beobachtungsperiode ist in Fig. 5A bis 5D dargestellt (die Kreatininwerte sind in mg/dl angegeben; der Gehalt an MGS 160/170 in MGS 160/170-Einheiten, dividiert durch 5).

  • A: Patient 1, 67 Jahre alt, Nierentransplantation 5 Jahre zurückliegend. Es wurden im dargestellten Zeitraum 6 Harnproben untersucht, zu dem in der Figur bezeichneten Zeitpunkt (offene Vierecke) wurde 6-Methylprednisolon (Urbason, Hoechst) verabreicht. Es zeigte sich, daß die 3. Probe, die auf MGS 160/170 untersucht wurde, nach der Cortisontherapie kein MGS 160/170 enthielt und die 6. Probe bei normalem Kreatininwert einen deutlich geringeren Gehalt an MGS 160/170 aufwies. Zum Zeitpunkt 5 wurde auch das Serum des Patienten auf MGS 160/170 getestet; das Ergebnis war negativ. Während der Beobachtungsdauer trat keine Infektion auf. Die Molekulargewichtsbestimmung zeigte ausschließlich hochmolekulares MGS 160/170.
  • B: Patient 2, 55 Jahre alt, Nierentransplantation drei Monate und eine Woche zurückliegend. Es wurden im dargestellten Zeitraum 8 Harnproben untersucht, zu den in der Figur bezeichneten Zeitpunkten (offene Vierecke) wurde Urbason verabreicht. Es traten bei dem Patienten vier Transplantatverwerfungen und eine Cytomegalieinfektion auf; es wurde daher zu den mit gefüllten Vierecken bezeichneten Zeitpunkten eine antivirale Therapie vorgenommen. Eine einen Tag nach der ersten Messung durchgeführte Biopsie der Transplantatniere zeigte eine akute vaskuläre Transplantatabstoßung. Es zeigte sich, daß bei Verschlechterung der Nierenfunktion und bei Erhöhung der Kreatininwerte die Konzentration von MGS 160/170 anstieg. Nach Cortisontherapie und nach antiviraler Therapie sanken die Werte ab. Zum Zeitpunkt 4 wurde außerdem ein Serum-ELISA durchgeführt, der einen Gehalt von MGS 160/170 entsprechend 6.0 ELISA- Einheiten ergab. Die Molekulargewichtsbestimmung zeigte ausschließlich hochmolekulares MGS 160/170.
  • C: Patient 3, 38 Jahre alt, Nierentransplantation knappe drei Jahre zurückliegend. Es wurden im dargestellten Zeitraum 5 Harnproben untersucht, zu den in der Figur mit offenen Vierecken bezeichneten Zeitpunkten wurde Urbason verabreicht. Die Proben waren während der Abstoßungsreaktionen (erhöhte Kreatininwerte) im ELISA deutlich MGS 160/170-positiv. Während des Beobachtungszeitraumes trat keine virale oder bakterielle Infektion auf.
  • D: Patient 4, 41 Jahre alt, Nierentransplantation 14 Monate zurückliegend. Es wurden im dargestellten Zeitraum 7 Harnproben untersucht, zu den in der Figur mit offenen Vierecken bezeichneten Zeitpunkten wurde Urbason verabreicht. Die Proben 1 und 2, mit denen erhöhte Kreatininwerte korrelierten, waren im ELISA positiv, die 3. Probe bei weniger erhöhten Kreatininwerten war ebenfalls im ELISA positiv. Ab diesem Zeitpunkt wurde eine immunsuppressive Therapie vorgenommen, indem zusätzlich zu Cyclosporin A Imurek (Azathioprin-Natrium, Wellcome) und Prednisolon (Chemie Linz) verabreicht wurde, daraufhin wurden ein Absinken der Kreatininwerte und negative Ergebnisse im ELISA beobachtet. Zum Zeitpunkt 3 wurde im Serum-ELISA ein Gehalt von MGS 160/170 entsprechend 1.3 ELISA-Einheiten nachgewiesen. Die Molekulargewichtsbestimmung zeigte neben hochmolekularem MGS 160/170 auch Fragmente mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kD.

c) Bestimmung von MGS 160/170 im Harn und im Serum von nicht-transplantierten Nierenpatienten

In diesem Beispiel wurden insgesamt 28 Patienten, die nicht nierentransplantiert waren und deren Hauptsymptom eine Proteinurie darstellte, dem Kollektiv von 20 nierengesunden Probanden, die keine nachweisbaren Konzentrationen MGS 160/170 im Harn aufwiesen, gegenübergestellt.

Die Meßwerte dieser Patienten fielen durch relativ hohe Konzentrationen von MGS 160/170 im Harn auf. Nierenbioptisch wurden festgestellt: epimembranöse Glomerulonephritis, agressiv verlaufende IgA-Nephritis, fokale Sklerose, chronische Glomerulonephritis, Membrano-proliferative Glomerulonephritis, Vaskulitis/Glomerulonephritis (Churg-Strauss-Weber) diagnostiziert. Im Western Blot wurden die Harne der Patienten auf die Größe der MGS 160/170 Fragmente untersucht; es wurde in allen Patienten gefunden, daß nur sehr große Bestandteile von MGS 160/170 auftraten (um 150 kD in Immunoblots). Die Größe der Fragmente weist darauf hin, daß die Quelle für das im Harn nachgewiesene Molekül die glomerulären Epithelzellen sind. Im Serum zeigten die Patienten mit dem Churg- Strauss-Weber Syndrom neben positiven Harnwerten auch im Serum meßbare Konzentrationen von MGS 160/170. Das Ergebnis der Untersuchungen ist in der Tabelle angeführt.

Im unselektierten Gesamtkollektiv von nichtnierentransplantierten Patienten einer nephrologischen Ambulanz, in welchem Gefäßkrankheiten ausgeschlossen wurden, konnte MGS 160/170 im Harn nur im Zusammenhang mit glomerulären Erkrankungen nachgewiesen werden.

Beispiel 7 Lokalisierung von MGS 160/170 in Gewebsschnitten a) Immunhistochemische Lokalisation von MGS 160/170 im Gewebe

Für den immunhistochemischen Nachweis von MGS 160/170 wurde die indirekte Immun-Peroxidase-Methode verwendet:

Paraffinschnitte von Formaldehyd-fixierten humanen Nieren wurden wie folgt aufgearbeitet:

Xylol: 2×5 min

Absoluter Alkohol: 5 min

Blockierung der endogenen Peroxidase (96 ml Methanol + 3 ml H&sub2;O&sub2;): 15 min

Tris pH 7.2, 50 mM: 3 × zwei min

Protease (Typ 10 Sigma, Pronase): 3 Einheiten, 10 min

Waschen in Tris: 3×2 min

Erster Antikörper: Monoklonaler Antikörper mgs(160/170)3 oder mgs(160/170)2 oder mgs(160/170)1, (Verdünnung 1 : 200, von Nutridoma-Überstand, 1 Stunde)

Waschen in Tris: 3×2 min

Zweiter Antikörper: Peroxidase-konjugiertes Kaninchen anti-Maus IgG (1 : 100, 30 min) Waschen in Tris: 3×2 min

Chromogen: Diaminobenzidin-Medium (5 min)

Wässern: 5 min

Hämalaun: 1 min

Wässern: 5 min

Aufsteigende Alkoholreihe und Einbettung.

Fig. 6 zeigt:

A: Immunhistochemischer Nachweis von MGS 160/170 mittels Antikörper mgs(160/170)1 in einem Paraffinschnitt einer normalen menschlichen Niere mittels indirekter Immunperoxydase. Die Glomerula sind massiv markiert, die interstitiellen Blutgefäße in geringerem Ausmaße. Vergrößerung 280×.

B: Paraffinschnitt durch die gleiche Niere, welche mit Natriumperjodat vorbehandelt wurde und danach mit dem monoklonalen Antikörper mgs(160/170)1 inkubiert wurde. Die Natriumperjodat-Vorbehandlung unterdrückt vollständig die Bindung dieses monoklonalen Antikörpers, der somit als Zuckerreste-abhängig definiert werden kann. Vergrößerung 280×.

Fig. 7 zeigt die Lokalisation von MGS 160/170 in einer menschlichen Niere im Paraffinschnitt, ebenso wie in Fig. 6. In diesem Fall wurde der monoklonale Antikörper mgs(160/170)2 verwendet, welcher sowohl ohne als auch mit Vorbehandlung mit Natriumperjodat in gleicher Intensität die Glomerula anfärbt. Es kann daher geschlossen werden, daß dieser monoklonale Antikörper unabhängig von der Zuckerkomponente des MGS 160/170 Moleküls bindet.

Fig. 8 zeigt ein Beispiel der immunhistochemischen Färbung von humaner Niere im Paraffinschnitt mittels monoklonalem Antikörper mgs(160/170)3 ohne (A) und mit (B) Vorbehandlung mit Natriumperjodat. In dieser hochauflösenden Aufnahme wird die Oberflächenmarkierung der glomerulären Epithelzellen und das Nachzeichnen der peripheren Kapillarschlingen deutlich. Vergrößerung 1200×.

Mit dieser Methode ergibt sich eine sehr charakteristische Verteilung von MGS 160/170 im Nierengewebe: die glomerulären Epithelzellen sind stark positiv, die Endothelzellen der interstitiellen Kapillaren sind gleichfalls positiv. Alle anderen Strukturen weisen keine spezifische Markierung auf. Die Färbung ist bei Antikörper mgs(160/170)3 und mgs(160/170)1 besonders stark, mgs(160/170)2 etwas schwächer ausgeprägt. (Bei Weglassen des Proteaseverdaus, erhöht sich der Hintergrund leicht, das Signal, insbesondere in den Glomerula, ist jedoch mit den Antikörpern mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3 und etwas schwächer auch mit mgs(160/170)2 deutlich ablesbar.

Es zeigt sich somit, daß sämtliche der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gegen MGS 160/170 auch für den immunhistochemischen Nachweis am humanen Material in Routine-Histopathologie- Schnitten als Marker für Endothelzellen und für viscerale glomeruläre Epithelzellen einsetzbar sind.

b) Immunelektronenmikroskopische Lokalisation von MGS 160/170 an ultradünnen Gefrierschnitten normaler menschlicher Nieren

Fig. 9 zeigt die immunelektronenmikroskopische Lokalisation von MGS 160/170 an ultradünnen Gefrierschnitten normaler menschlicher Nieren mittels einer indirekten Goldmethode, unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers mgs(160/170)2 und einer affinitätsgereinigten Kaninchen-anti Maus IgG-Brücke, gefolgt von einem Ziegen-Anti-Kaninchen-Goldkonjugat (Kerjaschki et al., 1989; Tokuyasu, 1989). MGS 160/170 wird mit dieser Methode ausschließlich an der Oberfläche der glomerulären Epithelzellen und der Endothelzellen lokalisiert. An der Basis der Fußfortsätze in der Kontaktfläche zur Basalmembran ist keine Markierung erkennbar. A: Vergrößerung 35 000×. B: 50 000×.

Literatur

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Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen des Menschen, die sich primär oder im Zuge von generalisierten Gefäßerkrankungen sekundär in einer Schädigung der Nierenglomerula manifestieren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Körperflüssigkeit auf ihren Gehalt an humanem MGS 160/170 und/oder Fragmenten davon untersucht.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Diagnose von Glomerulonephritiden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Überwachung von Zuständen im Anschluß an eine Nierentransplantation.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Harn ist.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Serum ist.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung von Serum zusätzlich zur Untersuchung von Harn durchführt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem die Größe der Fragmente von MGS 160/170 im Serum und/oder im Harn untersucht.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gehalt an MGS 160/170 oder Fragmenten davon aufgrund der Bindung an einen oder mehrere Antikörper bestimmt.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gehalt an MGS 160/170 oder Fragmenten davon aufgrund der Bindung an einen oder mehrere monoklonale Antikörper bestimmt.
  10. 10. Monoklonaler Antikörper gegen humanes MGS 160/170 der Bezeichnung mgs(160/170)1, der von der Hybridomzellinie MGS(160/170)1 produziert wird.
  11. 11. Monoklonaler Antikörper gegen humanes MGS 160/170 der Bezeichnung mgs(160/170)2, der von der Hybridomzellinie MGS(160/170)2 produziert wird.
  12. 12. Monoklonaler Antikörper gegen humanes MGS 160/170 der Bezeichnung mgs(160/170)3, der von der Mybridomzellinie MGS(160/170)3 produziert wird.
  13. 13. Hybridomzellinie der Bezeichnung MGS(160/170)1, hinterlegt bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 92021323.
  14. 14. Hybridomzellinie der Bezeichnung MGS(160/170)2, hinterlegt bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 92021324.
  15. 15. Hybridomzellinie der Bezeichnung MGS(160/170)3, hinterlegt bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 92021325.
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern in Kontakt bringt und die Bildung eines binären oder ternären Komplexes zwischen MGS 160/170 und dem bzw. den Antikörper(n) bestimmt.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe
    1. a) mit einer trägergebundenen Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 in Kontakt bringt;
    2. b) die in Schritt a) erhaltende Reaktionsmischung, die bei positiver Reaktion einen Komplex zwischen MGS 160/170 und den Antikörpern enthält, mit einer Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3 in Kontakt bringt, wobei die in diesem Schritt eingesetzten Antikörper eine meßbare Markierung aufweisen;
    3. c) die Menge des in Schritt b) gebildeten Antikörper/MGS160/170/Antikörper-Komplexes durch Messung der Markierung, gegebenenfalls nach Reaktion mit einem geeigneten Substrat, bestimmt.
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe
    1. a) mit einer trägergebundenen Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3 in Kontakt bringt;
    2. b) die in Schritt a) erhaltende Reaktionsmischung, die bei positiver Reaktion einen Komplex zwischen MGS 160/170 und den Antikörpern enthält, mit einer Kombination von mgs(160/170)1 und mgs(160/170)2 in Kontakt bringt, wobei die in diesem Schritt eingesetzten Antikörper eine meßbare Markierung aufweisen;
    3. c) die Menge des in Schritt b) gebildeten Antikörper/MGS 160/170/Antikörper-Komplexes durch Messung der Markierung, gegebenenfalls nach Reaktion mit einem geeigneten Substrat, bestimmt.
  19. 19. Sandwich-ELISA-Kit zur Bestimmung von humanem MGS 160/170 in Körperflüssigkeiten, enthaltend als voneinander getrennte Einheiten
    1. a) eine oder mehrere ELISA-Platten;
    2. b) eine Kombination der Antikörper mgs(160/170)1
  20. und mgs(160/170)2;
    1. c) eine Kombination der Antikörper mgs(160/170)1 und mgs(160/170)3, die mit einem Enzym konjugiert sind, das mit einem geeigneten Substrat ein meßbares Reaktionsprodukt liefert;
    2. d) das für die Enzymreaktion erforderliche Substrat;
    3. e) ein oder mehrere Verdünnungspuffer für die Antikörper;
    4. f) gegebenenfalls einen oder mehrere Waschpuffer;
    5. g) eine Präparation, enthaltend eine definierte Menge an humanem MGS 160/170, vorzugsweise rekombinantes MGS 160/170 als Lyophilisat oder als Lösung.
  21. 20. Verwendung der Antikörper mgs(160/170)1, mgs(160/170)2, oder mgs(160/170)3 zur immunhistochemischen oder immunelektronenmikroskopischen Lokalisierung von MGS 160/170 in menschlichen Gewebsproben.






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