PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69014042T2 27.04.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0418617
Titel Verfahren zur Herstellung von menschlichem Osteocalcin.
Anmelder Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Kurihara, Takashi, c/o Tsukuba Research Cente, Ami-machi, Inashiki-gun, Ibaraki-ken, JP
Vertreter Eitle, W., Dipl.-Ing.; Hoffmann, K., Dipl.-Ing. Dr.rer.nat.; Lehn, W., Dipl.-Ing.; Füchsle, K., Dipl.-Ing.; Hansen, B., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Brauns, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.; Görg, K., Dipl.-Ing.; Kohlmann, K., Dipl.-Ing.; Ritter und Edler von Fischern, B., Dipl.-Ing.; Kolb, H., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anwälte; Nette, A., Rechtsanw., 81925 München
DE-Aktenzeichen 69014042
Vertragsstaaten BE, DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 31.08.1990
EP-Aktenzeichen 901167544
EP-Offenlegungsdatum 27.03.1991
EP date of grant 09.11.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.04.1995
IPC-Hauptklasse C07K 1/06
IPC-Nebenklasse C07K 14/00   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanem Osteocalcin, welches eine wichtige Schlüsselfunktion im Knochenmetabolismus und im Alterungsprozeß des Menschen einnimmt.

Osteocalcin (Knochen-Gla-Protein (Bone Gla Protein): BGP) ist ein Vitamin K-abhängiges Kalzium-bindendes Protein, welches 15 bis 20 % der Nicht-Kollagenproteine des Knochen ausmacht, und von dem man annimmt, daß eine äußerst enge Beziehung sowohl zur Knochenbildung als auch zur Knochenabsorption besteht (Journal of Bone Metabolism Society of Japan 4, 56, 1986). Poser et al analysierten die Primärstruktur des humanen Osteocalcins und berichteten, daß humanes Osteocalcin eine Mischung von Glu¹&sup7;-Osteocalcin, wobei die 17-Position Glutaminsäure ist, und Gla¹&sup7;-Osteocalcin, wobei die 17- Position γ-Carboxyglutaminsäure ist, mit der unten gezeigten Aminosäuresequenz in einem Verhältnis von 91:9 darstellt (Poser, J.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 255, 8685- 8691 (1980)).

worin X einen γ-Carboxyglutaminsäurerest (Gla) oder einen Glutaminsäurerest (Glu) bedeutet.

Jedoch haben die bis heute bekannten Osteocalcine aus Rindern, Schwertfisch, Katze, Huhn, Ratte, Ziege, Schwein und Ratte alle eine γ-Carboxyglutaminsäure an der entsprechenden Stelle. Als Grund dafür nehmen Poser et al an, daß kalzifizierter Knochen älterer Menschen als Ausgangsmaterial für humanes Osteocalcin verwendet wird, und sich bei einem älter werdenden Erwachsenen die Glutaminsäure an der 17- Position in die γ-Carboxyglutaminsäure umwandelt.

Aus diesem Gesichtspunkt ist die Entwicklung eines Meßsystems für humanes Osteocalcin nicht nur klinisch für die Diagnose van Knochenkrankheiten, wie der Paget's-Krankheit, Knochenmetastase, usw., nützlich, sondern man kann auch erwarten, den Zusammenhang mit dem Alterungsprozeß durch Herstellung von Antikörpern und Antiseren, die individuell die 17-Position Gla und Glu des humanen Osteocalcins erkennen, zu untersuchen.

Es gibt jedoch keine Meßsysteme, die quantitativ humanes Gla¹&sup7;-Osteocalcin von humanem Glu¹&sup7;-Osteocalcin unterscheiden können, und es gibt auch kein humanes Osteocalcin-Meßsystem für humanes Osteocalcin durch Verwendung von humanem Osteocalcin als Standard.

Dies liegt daran, weil humanes Gla¹&sup7;-Osteocalcin und humanes Glu¹&sup7;-Osteocalcin für spezifische Antikörper- oder Antiserum- Präparationen, und auch als Standard nicht erhältlich sind.

Jüngst haben die Erfinder ein neues L-γ- Carboxyglutaminsäurederivat, dargestellt durch die im folgenden gezeigte Formel, gefunden, das zur Einführung von γ-Carboxyglutaminsäure in das Peptid-Syntheseverfahren nutzbar gemacht werden kann, und eine Patentanmeldung als japanische Patentanmeldung Nr. 54892/1988 angemeldet:

worin n 0, 1 oder 2 bedeutet.

Die Erfinder haben intensive Untersuchungen hinsichtlich eines Verfahrens zur Synthese von humanem Gla¹&sup7;-Osteocalcin durch Einführung von Gla an die 17-Position, die 21-Position und die 24-Position durchgeführt, und humanes Glu¹&sup7;- Osteocalcin mit einer chemischen Synthese durch Einführung von Gla an die 21-Position und die 24-Position entwickelt und so die vorliegende Erfindung vollendet.

In der Beschreibung haben die verwendeten Abkürzungen und Abkürzungssymbole die folgenden Bedeutungen.

1. Aminosäuren:

Ala: Alanin, Arg: Arginin, Asn: Asparagin, Asp: Asparaginsäure, Cys: Cystein, Gla: γ- Carboxyglutaminsäure, Gln: Glutamin, Glu: Glutaminsäure, Gly: Glycin, His: Histidin, Ile: Isoleucin, Leu: Leucin, Phe: Phenylalanin, Pro: Prolin, Trp: Tryptophan, Tyr: Tyrosin und Val: Valin.

In einigen Fällen können die Abkürzungen auch die entsprechenden Aminosäurereste bedeuten.

2. Schutzgruppen:

Boc: t-Butyloxycarbonyl, But: t-Butyl, Bzl: Benzyl, OBzl: Benzylester, Obut: t-Butylester, OcHex: Cyclohexylester, Br-Z: 2-Brombenzyloxycarbonyl, 4CH&sub3;.Bzl: 4-Methylbenzyl, DNP: Dinitrophenyl, MBzl: Methoxybenzyl, Cl&sub2;.Bzl: 2,6-Dichlorbenzyl, Mtr: 4- Methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl, Mts: Mesitylen-2- sulfonyl, Acm: Acetamidomethyl, Tos: p-Toluolsulfonyl, Fmoc: 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, NO&sub2;: Nitro und HCO: Formyl.

3. Reagenzien:

DCC: Dicyclohexylcarbodiimid, HOBt: 1- Hydroxybenzoltriazol, DTT: Dithiothreitol, DCM: Dichlormethan, DMF: Dimethylformamid, MeOH: Methanol, DIEA: Diisopropyletheramin, THF: Tetrahydrofuran, TFA: Trifluoressigsäure, HF: Hydrogenfluroid, CH&sub3;CN: Acetonitril, NMP: N-Methylpyrrolidon und DMSO: Dimethylsulfoxid.

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von humanem Gla¹&sup7;-Osteocalcin und humanem Glu¹&sup7;-Osteocalcin oder Salzen davon, welches die Einführung von γ- Carboxyglutaminsäure in einem synthetisches Peptidverfahren für humanes Osteocalcin unter Verwendung von geschützter L-γ- Carboxyglutaminsäure, dargestellt durch die Formel:

worin n 0, 1 oder 2 bedeutet, oder ein Salz davon, umfaßt.

Fig. 1 ist ein Diagramm des ¹H-NMR-Spektrums des im Synthesebeispiel erhaltenen optisch aktiven Isomers (II);

Fig. 2 ist ein Diagramm des ¹³C-NMR-Spektrums;

Fig. 3 ist ein Diagramm des IR-Absorptionsspektrums; und

Fig. 4 ist eine BGP-Standardkurve, ermittelt aus den in Tabelle 3 gezeigten Meßergebnissen.

Die Peptidsynthese kann mit dem Flüssigphasenverfahren oder dem Festphasenverfahren nach dem z. B. in Haruaki Yajima, Shunpei Sakakibara, herausgegeben von der biochemischen Gesellschaft von Japan, Course of Biological Experiments (I), "Chemistry of Proteins", Band 4, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin (1977), und Nobuo Izumiya et al. "Basis and Experiment of Peptid Synthesis", veröffentlicht von Maruzen K.K. (1985) erfolgen. Als Syntheseverfahren für das erfindungsgemäße human Osteocalcin ist das Festphasenverfahren bevorzugt.

Im folgenden soll das Beispiel der Synthese von humanem Gla¹&sup7;-Osteocalcin und ein Salz davon gemäß der vorliegenden Erfindung nach dem Festphasenverfahren beschrieben werden.

Zunächst wird die C-terminale Aminosäure des erwünschten Osteocalcins, nämlich Val, an ein unlösliches Harz als geschützte Aminosäure gebunden. Das Harz der geschützten Aminosäure mit einer solchen C-terminalen Aminosäure, die an das unlösliche Harz gebunden ist, ist handelsüblich erhältlich und kann als solches eingesetzt werden. Anschließend werden in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz des humanen Osteocalcins geschützte Aminosäuren der Reihe nach an den C-Terminus unter Erhalt eines geschützten Peptidharzes gebunden. Als unlösliches Harz kann z. B. jedes in diesem Bereich bekanntes eingesetzt werden, als Beispiel sei Chlormethylharz, ein Oxymethylharz, ein 4- (Oxymethyl)phenylacetamidmethylharz angegeben, und diese Harze können mit HF eliminierbar gemacht werden (im folgenden als "Pam"-Harz bezeichnet).

Die "geschützte Aminosäure" ist eine Aminosäure, bei der die funktionelle Gruppe nach einem bekannten Verfahren geschützt ist, und es sind verschiedene Arten geschützter Aminosäuren handelsüblich erhältlich. Bei Synthese von erfindungsgemäßen humanen Osteocalcin ist es bevorzugt, eine der im folgenden angegebenen geschützten Aminosäuren auszuwählen. Zunächst ist die Schutzgruppe für eine α-Aminogruppe einer Aminosäure Boc oder Fmoc. Die Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arg ist Tos, NO&sub2;, Mtr. Die Schutzgruppe für die Carboxylgruppe von Asp, Glu ist OBzl, OBut, OcHex. Die Schutzgruppe für die Mercaptogruppe von Cys ist 4CH&sub3;.Bzl, MBzl, Acm. Die Schutzgruppe der Imidazolylgruppe von His ist Tos, Dnp, Fmoc. Die Indolylschutzgruppe für Trp ist HCO oder sie kann auch nicht geschützt vorliegen. Die Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyr ist Br-Z, Cl&sub2;.Bzl, Bzl, But oder sie kann ebenfalls nicht geschützt vorliegen.

Die entsprechenden Schutzgruppen müssen je nach den Synthesebedingungen für das Peptid ausgewählt werden.

Gla an der 17-Position, der 21-Position und der 24-Position im humanen Gla¹&sup7;-Osteocalcin und Gla an der 21-Position und 24-Position im humanem Glu¹&sup7;-Osteocalcin kann als geschütztes Gla der obigen Formel (II) eingeführt werden. Die Synthese dieses geschützten Gla kann nach dem folgenden Verfahren, beschrieben in der japanischen Patentanmeldung Nr. 54892/1988, ausgeführt werden.

Optisch aktives Isomer (L-Isomer) von (XI) (II)
Schritt H&sub2;/Pd-Kohle Trennung der optischen Isomeren

D. h., zunächst wird die Reaktion zwischen N-t- Butyloxycarbonylserin (IV) und einem Benzylhalogenid unter Synthese eines Benzylesters (V) (Schritt a) ausgeführt, dann wird dieser mit p-Toluolsulfonylchlorid unter Bildung eines Sulfonatderivats (VI) (Schritt b) umgesetzt, welches seinerseits mit einer Base wie Diethylamin, usw. unter Synthese von N-t-Butyloxycarbonyldehydroalaninbenzylester (VII) (Schritt c) umgesetzt wird.

Andererseits wird durch Transesterifizierung von Dimethylmalonat (VIII), Dicycloalkylmalonat (IX) gebildet (Schritt d). Die Verbindung (IX) wird mit der Verbindung (VII), erhalten in Schritt c, in Gegenwart von Natriumhydrid als Base unter Synthese der Verbindung (X) (Schritt e) umgesetzt. Ferner wird diese Verbindung unter Herstellung eines erwünschten γ-Carboxyglutaminsäurederivats (XI) (Schritt f) reduziert. Falls erwünscht, wird die erhaltene Verbindung (XI) in die optischen Isomeren nach dem Diasteromerensalz-Verfahren unter Verwendung eines Mittels zur Trennung in die optischen Isomeren, wie z. B. Chinin, unter Herstellung eines optischaktiven Isomers (L-Isomer) (II) (Schritt g) aufgetrennt.

Der obige Schritt a kann durch Zugabe von Benzylbromid und einer Base, wie z. B. Triethylamin, zu einer Acetonlösung von t-Butyloxycarbonylserin (IV) und Erhitzen der Mischung auf eine Temperatur von Raumtemperatur bis 100ºC, vorzugsweise 40ºC bis 70ºC für 5 Stunden oder länger, vorzugsweise 20 bis 60 Stunden erfolgen. Nach Abschluß der Reaktion wird das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand in Wasser gegossen, das Produkt wird mit Ether extrahiert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck unter Erhalt der Verbindung (V) verdampft.

Der Schritt b kann durch Lösen der in Schritt a erhaltenen Verbindung (V) in einem basischen Lösungsmittel, wie z. B. Pyridin, Zugabe von p-Toluolsulfonylchlorid zur Lösung und Rühren der Mischung bei einer Temperatur von -20ºC bis 40ºC, vorzugsweise -10ºC bis 10ºC für 0,5 bis 20 Stunden, vorzugsweise 2 bis 8 Stunden erfolgen. Nach Abschluß der Reaktion wird die Reaktionsmischung zu kaltem Wasser gegeben, daraufhin wird gerührt, und die gebildeten Kristalle werden durch Filtration unter Erhalt der Verbindung (VI) gesammelt. Hier kann anstelle eines basischen Lösungsmittels eine Base und ein Lösungsmittel, wie z. B. Triethylamin und THF, verwendet werden.

Der Schritt c kann durch Lösen der erhaltenen Verbindung (VI) in einer Lösungsmittelmischung von Ethylacetat/Diethylether unter Zugabe einer Base, wie z. B. Diethylamin, zur Lösung und Rühren der Mischung bei einer Temperatur von -20ºC bis 40ºC, vorzugsweise 0ºC bis 30ºC, für 0,5 bis 20 Stunden, vorzugsweise 2 bis 6 Stunden durchgeführt werden. Nach Abschluß der Reaktion wird die Reaktionsmischung filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck unter Erhalt der Verbindung (VII) verdampft.

Der Schritt d kann durch Zugabe von Cycloalkanol und einem Katalysator, wie p-Toluolsulfonsäure, zu einer Toluollösung von Dimethylmalonat (VIII) und Rühren der Mischung unter Erhitzen bei einer Temperatur von 50 bis 200ºC, vorzugsweise 90 bis 120ºC, während gebildetes Methanol abdampft, für 5 Stunden oder länger, vorzugsweise 20 bis 60 Stunden durchgeführt werden. Nach Abschluß der Reaktion wird das Produkt mit einer Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, und anschließend wird der Rückstand unter Erhalt der Verbindung (IX) destilliert.

Der Schritt e kann durch Zugabe der Verbindung (IX) zu einer Suspension von Natriumhydrid in einem Lösungsmittel, wie z B. THF, Rühren der Mischung bei einer Temperatur von -40ºC bis 70ºC, vorzugsweise -10ºC bis 40ºC für 0,1 bis 10 Stunden, vorzugsweise 0,5 bis 2 Stunden, und anschließendem Zutropfen einer Lösung der Verbindung (VII), die im gleichen Lösungsmittel gelöst ist, und Rühren der Mischung bei einer Temperatur von -40ºC bis 70ºC, vorzugsweise -10ºC bis 25ºC, für 0,1 bis 20 Stunden, vorzugsweise 0,5 bis 10 Stunden, erfolgen. Als Lösungsmittel, das hier verwendet werden kann, kann zusätzlich zu THF, Tolul, Ethylether, Dioxan, usw. mit umfaßt sein. Nach Abschluß der Reaktion kann die Verbindung (X) gemäß üblichen Isolier- und Reinigungsverfahren, wie Extraktion, Säulenchromatographie, usw., erhalten werden.

Der Schritt f kann durch Hydrolyse der erhaltenen Verbindung (X) bei einem Wasserstoffdruck von 0,1 bis 20 kg/cm², vorzugsweise 0,5 bis 5 kg/cm² und bei einer Temperatur von 0 bis 80ºC, vorzugsweise 10 bis 40ºC für 0,1 bis 20 Stunden, vorzugsweise 0,5 bis 10 Stunden, in Gegenwart eines Katalysators in einem Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, erfolgen. Als Reduktionskatalysator, der hier verwendet werden kann, soll Palladium-Kohle, Platin-Kohle, usw. umfaßt sein. Nach Abschluß der Reaktion kann durch Abtrennung des Katalysators und Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck die Verbindung (XI) erhalten werden.

Der Schritt g kann durch Lösen der Verbindung (XI) in Ethylacetat, Zugabe eines Mittels zur Auftrennung in die optischen Isomeren zur Lösung und anschließend wiederholter Filtration und Umkristallisation mit Methanol erfolgen. Als Mittel zur Auftrennung in die optischen Isomeren, welches hier verwendet werden kann, können Alkaloide, wie Chinin, Brucin, Cinchonidin, Cinchonin, usw.; Amine wie (R)-(+)-1- Phenethylamin, (S)-(-)-1-Phenethylamin, (R)-(+)-1-(1- Naphthyl)ethylamin, (S)-(-)-1-(1-Naphthyl)ethylamin, usw.; Hydrazide, wie Tyrosinhydrazid, usw. verwendet werden. Nach der Reaktion wird das Produkt entsalzt und mit n-Hexan kristallisiert, worauf sich Filtration unter Erhalt des optisch aktiven Isomers (L-Isomer) (lI) der Verbindung (XI) anschließt.

Die Verbindung (XI) und ihr so erhaltenes optisch aktives Isomer (II) bildet Salze mit verschiedenen anorganischen Basen und organischen Basen.

Beispiele solcher Salze umfassen Alkalimetallsalze, wie Natriumsalz, Kaliumsalz, Lithiumsalz; Erdalkalimetallsalze, wie Kalziumsalz, Magnesiumsalz; Salze organischer Basen, wie Methylamin, Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Benzylamin, Pyrrolidin, Piperidin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Ornithin, Lysin und Arginin.

Die obige Verbindung kann durch ihre IR-Absorption, ihr NMR- Spektrum und die Massenanalyse identifiziert werden. Die optische Reinheit des optischaktiven Isomers kann durch Bildung eines Diastereomers mit einer optisch aktiven Base, wie (+)-Naphthylamin, (-)-Naphthylethylamin, (+)- Phenethylamin, (-)-Phenethylamin, usw., Auftrennung dieser durch übliche Flüssigchromatographie und Berechnung des Verhältnisses beider Substanzen bestimmt werden. In diesem Fall ist es bevorzugt, einen Korrekturkoeffizienten nach denselben Verfahren auch für die racemische Mischung zu bestimmen, und hiermit den obigen Wert für die optische Reinheit zu korrigieren.

Die Konfiguration des optischaktiven γ- Carboxyglutaminsäurederivats der vorliegenden Erfindung kann durch Hydrolyse dieser Substanz in 0,1 % Phenol-haltiger 6 N Salzsäure unter vermindertem Druck bei 110ºC für 22 Stunden unter Umwandlung in Glutaminsäure und Vergleich der eluierten Position bei der HPLC des Reaktionsproduktes davon mit 2,3,4,6-tetra-O-Acetyl-β-D-glucopyranosylisothiocyanat (im folgenden als GITC bezeichnet) gemäß dem Verfahren von z. B. Futamura et al. (Journal of Chromatography, 316, 547-552 (1984)) mit dem des Reaktionsproduktes von Standart-L- Glutaminsäure, D-Glutaminsäure und GITC, bestimmt werden.

Geschützte Aminosäuren können nach üblichen Kondensationsverfahren, wie dem DCC-Verfahren, dem aktiven Esterverfahren, dem gemischten oder symmetrischen Säureanhydridverfahren, dem Carbonylimidazolverfahren, dem DCC-HOBt-Verfahren, dem Diphenylphosphorylazidverfahren, usw., unter denen das DCC-Verfahren, das DCC-HOBt-Verfahren, das symmetrische Säureanhydridverfahren bevorzugt sind, erfolgen. Diese Kodensationsreaktionen werden im allgemeinen in einem organischen Lösungsmittel, wie DCM, DMF, NMP, Chloroform, DMSO, Benzol, usw. oder einer Lösungsmittelmischung davon, jedoch vorzugsweise in DCM, DMF oder einer Lösungsmischung von diesen durchgeführt. Als Eliminierungsreagens für die Schutzgruppe der α-Aminogruppe kann z. B. TFA/DCM, HCl/Dioxan, Piperidin/DMF, usw. verwendet werden, und kann in geeigneter Weise je nach Art der Schutzgruppe ausgewählt werden. Der Fortschritt der Kondensationsreaktionen in den entsprechendem Syntheseschritten kann nach dem Verfahren von E. Kaiser et al. überwacht werden (Anal. Biochem., 34, 595 (1970)) (Ninhydrin-Reaktionsverfahren) usw.

Geschützte Peptidharze mit den erwünschten Aminosäuresequenzen werden wie oben beschrieben erhalten, und Spezifische Beispiele davon sind im folgenden gezeigt.

Das geschützte Peptidharz (Boc-Avl-Pam-Harz) kann mit einem Reagenz behandelt werden, das das Peptid vom Harz abtrennen kann, und ferner die Schutzgruppen von der Seitenkette der entsprechenden Aminosäure, z. B. HF, TFA, usw. (endgültige Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppen) unter Erhalt eines Peptids mit einer ungeschützten Mercaptogruppe am Cys, entfernt.

Durch Oxidation des Peptids in einen Puffer unter Bildung einer intramolekularen Disulfidbindung kann das Peptid erhalten werden. Insbesondere durch Lösung des Peptids mit Cystein, dessen Mercaptogruppe ungeschützt in einem Puffer bis zu einer Konzentration von 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup7; mol/l, vorzugsweise 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5; mol/l, Einstellen des pHs auf 6,0 bis 8,5, vorzugsweise 7,0 bis 8,0, und anschließendes Rühren der Lösung bei 4 bis 50ºC, vorzugsweise 4ºC bis Raumtemperatur für 4 bis 30 Stunden, kann ein humanes Roh- Osteocalcin erhalten werden. Der in dieser Reaktion zu verwendende Puffer ist bekannt und kann z. B. Ammoniumacetat, Tris.HCl, usw. umfassen. Auch kann als Beschleunigungsmittel für die Reaktion Eisen-(II)-Cyanat (Kalium-Fe-(II)-Cyanat) zugegeben werden.

Das humane, so erhaltene, Roh-Osteocalcin kann durch Isolierung durch Extration, Umkristallisation, verschiedene Chromatographietechniken (Gelfiltration, Ionenaustausch, Partition, Adsorption, Umkehrphase), Elektrophorese, Gegenstrompartition, usw. gereinigt werden, jedoch ist das Umkehrphasen HPLC-Verfahren das bei weitem am wirksamste.

Unter Verwendung von humanem BGP (humanem Gla¹&sup7;- oder Glu¹&sup7;- Osteocalcin) entsprechend der Erfindung kann die Entwicklung eines immunologischen Assay-Verfahrens auf humanes BGP realisiert werden, und durch wirksame Messung von BGP im Blutkreislauf können Informationen über den jeweiligen Krankheitszustand betreffend den Knochenmetabolismus erhalten werden. D. h. die Messung von BGP im Blutkreislauf eines Menschen wird durch ein immunologisches Assay-Verfahren, wie einem Radioimmunoassay (RIA) und dem Enzymimmunoassay (EIA) durchgeführt, die Antiserum oder einem monoklonalen Antikörper gegen Rinder-BGP oder humanem BGP, erhalten durch immunisierte Kaninchen, Mäuse oder Ziegen, verwenden, erhalten werden, da aber eine Kreuzreaktion mit Rinder-BGp eingesetzt wird, oder ein Spezifischer Antikörper für ein Fragment verwendet wird, besteht bei diesen Verfahren das Problem bei der Messung der Spezifität, insbesondere bei der Messung von nur dem intakten Molekül von 1 bis 49, oder es sollte Meßzeit oder die Empfindlichkeit verbessert werden.

Daher kann ein immunradiometrischer Assay (IRMA), der spezifisch auf humanes BGP (1 bis 49) ist, unter Anwendung des Verfahrens erhalten werden, worin erfindungsgemäßes humanes BGP (Gla¹&sup7; oder Glu¹&sup7; humanes Osteocalcin) immunisiert wird, und anti-humaner BGP-monoklonaler Antikörper der spezifisch für die Aminosäureanordnung (12 bis 33) ist und Rinder-BGP immunisiert wird unter Erhalt eines Anti-Rinder-BGP-monoklonalen Antikörpers, der spezifisch gegen die Aminosäureanordnungen bei (30 bis 49) ist.

HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPER-PRODUZIERENDEN HYBRIDOMA Schritt a: Herstellung von antihumanen BGP-monoklonale Antikörper-produzierenden Hybridoma

Das humane BGP ist ein Polypeptid von 49 Aminosäureresten mit relativ niedrigem Molekulargewicht, und zeigt daher keine ausreichende Immunogenität. Daher wird nach Kopplung an Schlüsselloch-Limpet-Hemocyanin, Rinderserumalbumin oder Schweine-Thyroglobulin unter Herstellung eines Verbundmaterials dieses mit einem geeigneten Immunoaktivator, wie z. B. den Freund'schen kompletten Adjuvans, emulgiert unter Herstellung einer Emulsion, und diese Emulsion wird einer Maus injiziert. Die eingesetzte Maus ist im allgemeinen eine Balb/c-Spezies, es kann jedoch jede Mausart verwendet werden, die normalerweise für Immunisierungsverfahren eingesetzt wird. Die Immunisierung kann durch wiederholtes Inokulieren des Abdomens der Maus mit der obigen Emulsion durch Verabreichung, hypodermisch, mehrere Male über mehrere Wochen erfolgen. Nach 3 bis 5 Tagen ab der Letztimmunisierung, wird die Milz herausgenommen und die Milzzellen angepaßt und mit einer Maus-Myelomazelle (z. B. P3-X63-Ag8-U1, NS-1, X63-Ag8.653) unter Herstellung eines Hybridoms fusioniert. Die Zellfusion erfolgt durch das PEG- Verfahren und das Screenen nach dem fusionierten Stamm erfolgt mit dem selektiven HAT-Medium. Das Screening auf Antikörperproduktion des Hybridoms erfolgt nach einem bekannten Verfahren, wie EIA, RIA und der Membranfluoreszent- Antikörpertechnik, wodurch die erwünschten Hybridoma, die spezifisch gegen humanes BGP gerichtetes Immunglobulin erzeugen, selektiert werden. Das Klonen der Hybridoma erfolgt nach bekannten Verfahren, wie dem Endverdünnungsverfahren, oder einem Verfahren, bei dem jede einzelne Zelle mit einer Glaskapillare unter dem Mikroskop aufgenommen wird, usw.

Schritt b: Herstellung von Hybridoma, die Anti-Rinder-BGP- monoklonale Antikörper produzieren.

Dieses Verfahren kann gemäß der Herstellung des monoklonalen Antikörper-produzierenden Hybridoms gegen humanes BGP angewandt werden.

HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPER

Die Herstellung von monoklonalen Antikörper aus den erhaltenen Hybridoma kann nach zwei Verfahren ausgeführt werden, von denen eines ein in vitro-System ist, worin der Antikörper als kultivierter Überstand in einer Kulturapparatur erzeugt wird, und das andere Verfahren ein in vivo-System ist, worin er in Form von Ascites im tierischen Körper, wie der Bauchhöhle einer Maus, hergestellt wird. Im in vitro-System kann das Medium durch Zugabe einer geeigneten Menge von Rinderserum zu einem üblichen Eagle's MEM, RPMI- 1640 oder Dulbecco's modifizierten Eagel's-Medium verwendet werden. Der Kulturzeitraum ist im allgemeinen 3 bis 7 Tage. Beim in vitro-Kultursystem wird nach Inokulation der Hybridomastämme in die Bauchhöhle des Säugers, wie z. B. einer Maus, der Ascites nach 4 bis 14 Tagen unter Erhalt der monoklonalen Antikörper als Ascites gesammelt. Eine große Menge von monoklonalen Antikörper kann im allgemeinen durch das in vivo-System erhalten werden.

Der monoklonale Antikörper (Ascites oder Kulturüberstand), der nach dem obigen Verfahren erhalten wurde, wird durch Kombination bekannter Verfahren, wie dem Aussalzen, der DEAE- Zellulose-Säulenchromatographie oder der Protein A-Sepharose- Säulenchromatographie, usw. gereinigt.

Die Erfinder haben einen antihumanen BGP-monoklonalen Antikörper (MBG 04F5) und einen Anti-Rind-BGP-monoklonalen Antikörper (MBG 14AX) entwickelt, und deren Eigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, daß MBG 04F5 das N- terminale Ende bis zum mittleren Teil des humanen BGP erkennt, da es sehr stark auf humanes BGP (12 bis 33) anspricht, und nicht mit dem N-terminalen und C-terminalen Fragmenten reagiert. Es wurde auch gezeigt, daß MBG 14AX das c-terminale Ende erkennt, da es sehr stark mit dem humanen BGP (30 bis 49) aber nicht mit dem N-terminalen bis mittleren Teil davon reagiert.

Als immunologisches Testverfahren für humanes BGP unter Verwendung der obigen monoklonalen Antikörper MBG 14AX und MBG 04F5 kann der RIA erwähnt werden, welches ein zweites Antikörperverfahren ist, das EIA-Verfahren vom Sandwich-Typ, der Sandwich-Typ-Fluoreszenz-Immuntest- (FIA) und das Sandwich-Typ-IRMA-Verfahren. Was das IRMA-Verfahren betrifft, wie in den Referenzbeispielen gezeigt, soll der eine Schritt aus dem IMRA-Verfahren erwähnt werden, worin eine Probe oder ein Standard-BGP, eine bestimmte Menge monoklonaler Antikörper MBG 14AX, der mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, und Polystyrolperlen, die mit dem monoklonalen Antikörper MBG 04F5 bedeckt sind, umgesetzt werden, und dann die Menge der an die Perlen gebundenen Radioaktivität gemessen wird. Während dieser Zeit ist das System, worin MBG 14AX auf Polystyrolperlen immobilisiert wird und MBG 04F5 mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, auch möglich. Ferner ist das sogenannte zweistufige IRMA-Verfahren ebenfalls möglich, worin eine Probe oder ein Standard-BGP zuerst mit Antikörper-beschichteten Perlen umgesetzt wird, und nach Entfernung der Reaktionslösung ein monoklonaler Antikörper, der mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, damit umgesetzt wird. Ferner ist auch das Umkehrreaktions- IRMA-Verfahren möglich, worin eine Probe oder ein Standard- BGP zunächst mit einem monoklonalen Antikörper, der isotopenmarkiert ist, umgesetzt wird, und anschließend mit Antikörper-beschichteten Perlen umgesetzt wird.

Hierbei kann als Träger zur Immobilisierung des Antikörpers ein Träger für einen Antigen-Antikörper verwendet werden, der im allgemeinen für Immuntest eingesetzt wird, wie z. B. Teilchen aus Glas, einem magnetischen Material oder Plastik oder kugelförmige Materialien (Perlen), Röhren und Platten. Auf diese Träger wurde ein Antikörper immobilisiert, der den N-terminalen und mittleren Teil oder C-terminalen Teil des humanen BGP physisch oder durch kovalente Bindung erkennt. Der hierbei zu verwendende Antikörper kann entweder der monoklonale Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein, da sie auf dieselbe Weise behandelt werden können.

Die Markierung mit einem radioaktiven Isotop eines Antikörpers, der den N-terminalen, mittleren oder C- terminalen Teil des humanen BGPs erkennt, kann durch Einbau eines radioaktiven Isotops, wie ¹²&sup5;I nach bekannten Verfahren, wie z. B. dem Chloramin-T-Verfahren, dem Laktoperoxidaseverfahren, dem Jodogenverfahren und dem Bolton-Hunter-Verfahren ausgeführt werden.

Ein RIA auf Basis des Doppel-Antikörperverfahrens ist entweder mit dem monoklonalen Antikörper oder mit dem polyklonalen Antikörper möglich. Das Verfahren kann zwei Methoden umfassen, von denen eines ein Verdrängungsverfahren ist, worin eine Probe oder ein Standard-BGP, ein Anti-BGP- Antikörper und humanes BGP, das mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, gleichzeitig umgesetzt werden, B/F-Abtrennung wird durch einen zweiten Antikörper durchgeführt, und Messung der Menge der an den Antikörper gebundenen Radioaktivität, und das andere ist ein Nicht-Gleichgewichtsverfahren, worin die Zugabe eines humanen BGP, der mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, für mehrere Stunden bis einen Tag verzögert ist.

Der Sandwich-EIA und der Sandwich-FIA sind im wesentlichen gleich wie das IRMA-Verfahren, unterscheiden sich jedoch von diesem in der Verwendung einer Enzymmarkierung oder einer Fluoreszenz-Substanz-Markierung anstelle einer Isotopen- Markierung.

Ein Antikörper zur Markierung kann durch Reinigung bis zum IgG verwendet werden, und er wird als Markierungssubstanz wie er vorliegt verwendet, oder er wird eingesetzt nach Verdau mit Pepsin zu F(ab')&sub2; oder Reduktion mit 2-Mercaptoethanol zu Fab'.

Als Enzym zur Markierung kann alkalische Phosphatase, β-D- Glactoxidase, Peroxidase und Glukoseoxidase verwendet werden.

Für die Fluoreszenzmarkierung kann eine fluoreszierende Substanz, wie Fluorescein, Fluoreceinisocyanat, Fluoresceinisothiocyanat und Rhodamin verwendet werden, und es ist auch möglich, ein Verfahren anzuwenden, in dem ein Europiumion als Markierung eingesetzt wird.

Im einstufigen IRMA-Verfahren, wie im Referenzbeispiel gezeigt, wurde gezeigt, daß nur intaktes BGP (1 bis 49) gemessen wird, so daß das Problem der Spezifität beim üblichen RIA überwunden werden kann. Daher ist man der Meinung, daß das Meßsystem in der Lage ist, Daten für die klinische Bewertung des Knochenmetabolismus zur Verfügung zu stellen.

BEISPIELE

Die Erfindung wird in Einzelheiten durch die folgenden Beispiele beschrieben, sie soll jedoch nicht durch diese Beispiele eingeschränkt sein.

SYNTHESEBEISPIELE Schritt a: Synthese der Verbindung (V)

Zu 200 ml eine Acetonlösung von 25 g N-t- Butyloxycarbonylserin (IV) wurden 26,8 g Benzylbromid und 16,9 g Triethylamin gegeben, und die Mischung wurde unter Rückfluß und Rühren 2 Tage erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck unter Verdampfung des Lösungsmittels eingeengt, und Wasser und Diethylether wurden zum Rückstand gegeben, worauf sich heftiges Schütteln und Abtrennung der Flüssigkeit anschloß. Der Ether wurde zweimal mit Wasser, anschließend einmal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen. Die Etherschicht wurde abgetrennt, getrocknet, und der Ether wurde dann unter vermindertem Druck unter Erhalt von 30,3 g einer öligen Verbindung (V) (Ausbeute 97,8 %) verdampft.

Schritt b: Synthese der Verbindung (VI)

Zu einer Lösung von 31 g der Verbindung (V) aus Schritt a, gelöst in 100 ml Pyridin, wurden 23 g p-Toluolsulfonylchlorid zugegeben, und nach Rühren bei 0ºC für 3 Stunden, wurden ferner 2,3 g p-Toluolsulfonylchlorid zugegeben, worauf 4 Stunden weitergerührt wurde. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser gegossen, die Mischung wurde gerührt, und die gebildeten weißen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt unter Erhalt von 37,4 g der Verbindung (VI) (Ausbeute: 79,3 %).

Schritt c: Synthese der Verbindung (VII)

Zu einer Lösung von 37,4 g der Verbindung (VI) aus Schritt b, gelöst in 200 ml einer Lösungsmischung von Ethylacetat/Diethether (1:1), wurde langsam 17,2 ml Diethylamin zugetropft und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf 0ºC gekühlt, filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck unter Erhalt von 23,0 g einer öligen Verbindung (VII) (Ausbeute: 99,3 %) eingedampft.

Schritt d: Synthese der Verbindung (IX)

Zu 250 ml einer Toluollösung von 33 g Dimethylmalonat (VIII) wurden 75 g Cyclohexanol und 1,25 g p- Toluolsulfonsäuremonohydrat gegeben, und die Mischung wurde unter Rückfluß und Rühren 42 Stunden erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zweimal mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, zweimal mit Wasser und weitere zweimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde destilliert, und die Destillate zwischen 128 bis 130ºC wurden durch Abtrennung unter Erhalt von 49,7 g einer öligen Verbindung (IX) (Ausbeute: 74,2 %) gesammelt.

Schritt e: Synthese der Verbindung (X)

Zu 150 ml einer THF-Suspension von 3,32 g 60%igem Natriumhydrid in Mineralöl wurde langsam eine Lösung von 22,8 g der in Schritt d erhaltenen Verbindung (IX), gelöst in THF, unter Kühlung auf 5ºC zugetropft. Nach Beendigung der Schaumbildung wurde die Mischung bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Dann wurde eine Lösung von 23 g der Verbindung (VII) aus Schritt c, gelöst in THF, zur vorhergehenden Reaktionsmischung unter Eiskühlung zugetropft, und die Mischung wurde eine Stunde gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 0,1 N Zitronensäure unter Eiskühlung versetzt, und die Mischung wurde mit Diethylether extrahiert. Die Etherschicht wurde mit Wasser, anschließend mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen und nach Trocknung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft. Zum Rückstand wurden Acetonitril und n-Hexan, um eine Extraktion zu bewirken, zugegeben, und die Acetonitrilschicht wurde abgetrennt, worauf sich Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck anschloß. Der Rückstand wurde über Kieselgel- Säulenchromatographie mit Diethylether/n-Hexan 2:5) unter Erhalt von 32,7 g einer öligen Verbindung (X) (Ausbeute: 72,5 %) gereinigt.

Schritt f: Synthese der Verbindung (XI)

Zu einer Lösung von 28,8 g der Verbindung (X) aus Schritt e, gelöst in 300 ml Ethanol, wurden 1,5 g 5%iges Palladium- Kohlen zugegeben, und die Mischung wurde bei einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde der Katalysator entfernt und das Ethanol unter vermindertem Druck unter Erhalt von 23,0 g einer öligen Verbindung (XI) (Ausbeute: 95,7 %) verdampft.

Fab-Massenanalyse [M + H]&spplus;

Gefunden: 456

Berechnet: 456

Schritt g: Optische Isomerentrennung der Verbindung (XI)

Die in Schritt f erhaltene Verbindung (XI) (23,0 g wurde in 100 ml Ethylacetat gelöst, es wurden 200 ml einer Ethylacetatlösung von 17,1 g Chinin zur Lösung gegeben, und die Mischung wurde geschüttelt und bei Raumtemperatur 3 Tage stehengelassen. Die gebildeten Kristalle wurden durch Filtration unter Erhalt von 21,8 g eines L-γ- Carboxyglutaminsäurederivat-Chininsalzes mit einer optischen Reinheit von 39,2 % als weiße Nadeln (Ausbeute: 53,0 %) gesammelt. Diese wurden weiter drei Male wiederholt mit Methanol umkristallisiert, worauf sich eine Suspendierung in Ethylacetat und Entsalzen in 1 N Zitronensäure anschloß. Die organische Schicht wurde mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen, getrocknet, und dann wurde das Ethylacetat unter vermindertem Druck verdampft. Zum Rückstand wurde n-Hexan gegeben, und die gebildeten weißen Kristall wurden durch Filtration unter Erhalt von 4,79 g eines L-γ- Carboxyglutaminsäurederivats (II) mit einer optischen Reinheit von 98,2 % (Ausbeute: 20,6 %) gesammelt.

Die NMR-Spektren der erhaltenen optischaktiven Isomeren (II) sind in Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt, und das IR- Absorptionsspektrum ist in Fig. 3 gezeigt.

Elementaranalyse (als C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub7;NO&sub8;)

C H N

Gefunden: 60,70 8,42 3,00

Berechnet: 60,64 8,19 3,08

Fab-Massenanalyse [M + H]&spplus;

Gefunden: 456

Berechnet: 456

Optische Drehung [α]D= -4,9º (C 1,05, Methanol)

EXPERIMENTELLES BEISPIEL 1: Testverfahren für die optische Reinheit

Das Chininsalz des optische aktiven Isomers (II) aus dem obigen Synthesebeispiel (46,8 mg) wurde in Ethylacetat suspendiert und mit 1 N Zitronensäure entsalzt. Die organische Schicht wurde mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen und getrocknet. Die Verdampfung des Ethylacetats unter vermindertem Druck ergab 27,5 mg eines freien γ-Carboxyglutaminsäurederivats (im folgenden Probe (a) genannt). Diese ganze Menge wurde in 2,8 ml Dichlormethan gelöst und zur erhaltenen Lösung wurden 14,2 mg 2-Chlor-1- methylpyridiniumjodid, 8,2 ul R-(+)-1-(α-Naphthyl)ethylamin und 26,6 ul n-Butylamin gegeben, und die Reaktion wurde bei 40ºC 2 Stunden durchgeführt. Nach Abschluß der Reaktion wurden die gebildeten Diastereomerfraktionen durch Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Die Fraktionen wurden mit Ethylacetat eluiert, und anschließend der durch Verdampfung unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand durch HPLC mit den folgenden Bedingungen analysiert:

Analysebedingungen

Säule: Ricrosolve Si60, 5 um ∅ 4,6 x 250 mm (Merck)

Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan = 1 : 3

Flußrate: 1 ml/min

Detektion: UV 254 nm

Säulentemperatur: 30ºC

Rechnereinheit: Chromatopack C-R3A (Shimazu Seisakusho)

Ebenso wurden für 11,2 mg der Racematmischung (XI) der obigen Verbindung Diastereomere mit 3,3 ul R-(+)-1-(α- Naphthyl)ethylamin in ähnlicher Weise synthetisiert und durch HPLC unter den gleichen Bedingungen wie oben erwähnt analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.

Diastereomer-Acyl-Verbindungen Peak-Fläche L*1 D*1 Probe (a) Racemische Mischung *1 (Konfiguration der Diastereomer-Acyl- Komponentenseitenkette: Bestimmt durch experimentelles Beispiel 2)

Die optische Reinheit wurde mit der folgenden Formel bestimmt.

Optische Reinheit (%) = (2x - 1) x 100,

worin

x = L-Fläche der Probe (a)/L-Fläche der Probe (a) + D-Fläche der Probe (a) x L-Fläche der razemischen Mischung/D-Fläche der razemischen Mischung

Die optische Reinheit des obigen optisch aktiven Isomers (L- Isomer) (II) wurde zu 97,2 % bestimmt.

EXPERIMENTELLES BEISPIEL 2: Bestimmung der optischen Isomeren

1 mg des optisch aktiven Isomers (II) wurde mit 0,1 % Phenolhaltiger 6 N Salzsäure unter vermindertem Druck bei 110ºC 22 Stunden hydrolysiert. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Salzsäure verflüchtigt und der Rückstand in 5 ml 0,1 N Salzsäure gelöst. Zu 30 ul der Lösung wurden 30 ul von 50 mg/l Triethylaminacetonitrillösung und 60 ul von 10 mg/ml GITC-Acetonitrillösung zugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten durchgeführt. Die gleichen Verfahren wurden ebenfalls für 1 mg der Standard-L- Glutaminsäure und D-Glutaminsäure und der Blindprobe durchgeführt. Die erhaltenen Lösungen wurden durch Umkehrphasen-HPLC analysiert.

Analyseparameter

Säule: YMC-R, 5 um ∅ 4,6 x 250 mm (Yamamura Kagaku)

Mobile Phase: A - 0,1 % Phosphorsäure B - Acetonitril

Konzentrationsgradient: A/B = 100/10 T 50/50, eluiert nach einem linearen Konzentrationsgradienten über 30 Minuten

Detektion: UV 250 nm

Säulentemperatur: Raumtemperatur

Datenverarbeitung: Chromatopack C-R3A (Shimazu Seisakusho)

Die Analyse erfolgt in der Reihenfolge: L-Glutaminsäure- Reaktionsmischung, D-Glutaminsäure-Reaktionsmischung, optisch aktives Isomer (II)-Reaktionsmischung, D-Glutaminsäure- Reaktionsmischung + optischaktives Isomer (II)- Reaktionsmischung und Blindprobe. Die relativen Retentionszeiten der gebildeten Diastereomere im Chromatogramm waren: L-Glutaminsäure < D- Glutaminsäurediastereomer, und man fand, daß das optischaktive Diastereomer in der L-Glutaminsäure angereichert war.

Aus den obigen Ergebnissen wurde das optischaktive Isomer (II) als das L-Isomer identifiziert.

BEISPIEL 1

Synthese von humanem Gla¹&sup7;-Osteocalcin, dargestellt durch die Formel:

(1) Einführung von Pro an der 48-Position in das Boc-Val- Pam-Harz 1) Entfernung der Schutzgruppen und Neutralisation:

Eine Menge von 0,746 g Boc-Val-Pam-Harz (0,67 mmol/g) wurde zweimal mit DCM gewaschen. Zum Harz wurden 8 ml 33%ige TFE (Trifluoressigsäure)Lösung (Lösungsmittel: DCM) gegeben und nach Rühren für 80 Sekunden wurde die Mischung filtriert. Ferner wurden 80 ml 50%ige TFE-Lösung (Lösungsmittel DCM) zugegeben und nach Rühren für 18,5 Minuten wurde die Mischung unter Eliminierung der Boc-Gruppen filtriert. Das erhaltene Harz wurde anschließend mit den unten aufgeführten Lösungsmitteln behandelt, wobei nach jeder Behandlung filtriert wurde.

DCM (3x , jeweils für 30 Sekunden)

10 % DIEA/DNF (2x, jeweils eine Minute)

DMF (5x, jeweils 30 Sekunden)

2) Herstellung von Boc-Pro-symmetrischem Säureanhydrid:

Nach Lösung von 2 mmol Boc-Pro in 3 ml DCM wurden 2 ml einer 0,5 M DCC-Lösung (Lösungsmittel: DCM) zugegeben und die Reaktion 8 Minuten durchgeführt, wobei das symmetrische Säureanhydrid gebildet wurde. Nach Entfernung des als Nebenprodukt gebildeten Dicyclohexylharnstoffes durch Filtration wurden 4 ml DMF zugegeben, woran sich die Verdampfung des DCMs in der Reaktionsmischung anschloß.

3) Kondensationsreaktion:

Die DMF-Lösung des Boc-Pro-symmetrischen Säureanhydrids aus 2) wurde zu dem unter 1) hergestellten Val-Pam-Harz zugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 18 Minuten fortgesetzt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit DCM fünfmal gewaschen.

(2) Einführung der entsprechenden Aminosäuren an die 47-1- Positionen:

In ähnlicher Weise wie in (1) beschrieben, wurde Boc- Pro-Val-Pam der Reihe nach mit den geschützten Aminosäuren entsprechend den jeweiligen Aminosäuren von der 47-Position bis zur 1-Position des humanen Gla¹&sup7;- Oesteocalcins gekoppelt. Tabelle 1 zeigt die geschützten Aminosäuren, Syntheseverfahren, usw. die in den jeweiligen Reaktionsschritten verwendet werden.

Betreffend den Synthese Zyklus bedeutet in der Tabelle das Verfahren (1) Entfernung der Schutzgruppen, das Verfahren (2) Neutralisierung und das Verfahren (3) Kondensation, die entsprechend den folgenden Verfahren durchgeführt werden.

Verfahren (1)

1) Entfernung der Schutzgruppen mit 33 % TFE (Lösungsmittel: DCM) für 80 Sekunden;

2) Entfernung der Schutzgruppen mit 50 % TFE (Lösungsmittel: DCM) für 18,5 Minuten;

3) Waschen mit DCM, 3x, jeweils für 30 Sekunden;

4) Neutralisieren mit 10 % DIEA/DMF, 2x, jeweils für 1 Minute;

5) Waschen mit DMF, 5x, jeweils für 30 Sekunden;

6) Kondensationsreaktion für 18 Minuten;

7) Waschen mit DCM, 5x, jeweils für 30 Sekunden.

Verfahren (2)

1) - 5): wie oben in Verfahren (1);

6) Kondensationsreaktion für 26 Minuten;

7) wie in Verfahren (1).

Verfahren (3)

1) - 5): wie in Verfahren (1);

6) Kondensationsreaktion für 43 Minuten;

7) Waschen mit DMF, 3x, jeweils für 30 Sekunden;

8) Neutralisation mit 10 % DIEA/DMF für 45 Sekunden;

9) Waschen mit DMF für 30 Sekunden;

10) Waschen mit DCM, 3x, jeweils für 30 Sekunden;

11) Kondensationsreaktion für 42 Minuten;

12) Waschen mit DMF für 30 Sekunden;

13) Waschen mit DCM, 5x, jeweils für 30 Sekunden.

Betreffend die Synthese des symmetrischen Säureanhydrids oder HOBt-Esters bedeuten ebenfalls Verfahren (1), Verfahren (2), Verfahren (3), Verfahren (4) und Verfahren (5) die Synthese des symmetrischen Säureanhydris oder HOBt-Esters nach den folgenden Verfahren.

Verfahren (1)

Nach Lösung von 2 mmol Boc-Aminosäure in 3 ml DCM wurden 2 ml 0,5 M DCC-Lösung (Lösungsmittel: DCM) zugegeben, und die Reaktion 8 Minuten unter Bildung eines symmetrischen Säureanhydrids fortgesetzt. Nach Entfernung des als Nebenprodukt entstandenen Dicyclohexylharnstoffes durch Filtration, wurden 4 ml DMF zugegeben und anschließend wurde DCM in der Reaktionsmischung verdampft.

Verfahren (2)

Nach Lösung von 2 mmol Boc-Aminosäure in 3 ml DCM wurden 2 ml 0,5 M DCC-Lösung (Lösungsmittel: DCM) zugegeben, und die Reaktion 8 Minuten unter Bildung eines symmetrischen Säureanhydrids fortgesetzt. Nach Entfernung des als Nebenprodukt gebildeten Dicyclohexylharnstoffes durch Filtration, wurden 1 ml DMF zugegeben und das DCM in der Reaktionsmischung verdampft.

Verfahren (3)

Nach Lösung von 2 mmol Boc-Aminosäure in 0,3 ml DMF und 0,2 ml DCM, wurden 2 ml 0,5 M DCC-Lösung (Lösungsmittel: DCM) zugegeben, und die Reaktion 8 Minuten unter Bildung eines symmetrischen Säureanhydrids fortgesetzt. Nach Entfernung des als Nebenprodukt gebildeten Dicyclohexylharnstoffes durch Filtration, wurden 4 ml DMF zugegeben und anschließend wurde das DCM in der Reaktionsmischung verdampft.

Verfahren (4)

Nach Zugabe von 4 ml 0,5 M HOBt und 0,3 ml DCM zu 2 mmol Boc- Aminosäure zur Lösung wurden 4 ml 0,5 M DCC-Lösung (Lösungsmittel: DCM) zur Lösung gegeben, und die Reaktion 33 Minuten unter Bildung eines HOBt-Esters durchgeführt. Nachdem das Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wurden, wurden die 3 ml DCM im Reaktionsansatz verdampft. Die Herstellung des HOBt-Esters nach diesem Verfahren wurde zweimal für einen Rest durchgeführt.

Verfahren (5)

Nach Zugabe von 4 ml 0,5 M HOBt und 1,5 ml DCM zu 2 mmol der hierin zu lösenden Boc-Aminosäure wurden 4 ml 0,5 M DCC- Lösung (Lösungsmittel: DCM) zur Lösung zugegeben, und die Reaktion wurde unter Bildung eines HOBt-Esters fortgesetzt. Nach Entfernung des Nebenprodukts Dicyclohexylharnstoffes durch Filtration, wurden die 3 ml DCM in der Reaktionsmischung verdampft. Die Herstellung des HOBt-Esters nach diesem Verfahren wurde zweimal für einen Rest durchgeführt.

Nach Einführung der Aininosäure an die 1-Position wurden 20 ml einer 33%igen TFE-Lösung (Lösungsmittel: DCM) zum Harzpeptid gegeben, und die Mischung wurde 80 Sekunden geführt und dann filtriert. Ferner wurden 20 ml 50%ige TFE-Lösung (Lösungsmittel: DCM) zugegeben, und die Mischung wurde 18,5 Minuten gerührt und unter Eliminierung der Boc-Gruppen filtriert. Das erhaltene Harz wurde der Reihe nach mit den folgenden Lösungsmitteln behandelt und nach jeder Behandlung filtriert:

DCM (3x , jeweils für 30 Sekunden)

10 % DIEA/DCM (2x, jeweils eine Minute)

DCM (5x, jeweils 30 Sekunden).

Anschließend wurde das vorliegende Harzpeptid unter vermindertem Druck für einen Tag und eine Nacht unter Erhalt eines trockenen Harzpeptids getrocknet.

TABELLE 1
Position der Aminosäure Geschützte Aminosäure Synthesezyklus Synthese des symmetrischen Säureanhydrids oder HOBt-Esters Kopplungsnummer Boc-Gly Boc-Tyr(Br-Z) Boc-Phe Boc-Arg(Tos) Boc-Ala Boc-Glu(OBzl) Boc-Gln Boc-Ile Boc-His(Tos) Boc-Asp(OBzl) Boc-Leu Boc-Cys(4CH&sub3;Bzl) Boc-Pro Boc-Asn Boc-Gla(OcHex)&sub2; Boc-Val Verfahren
TABELLE 1 (Fortsetzung)
Position der Aminosäure Geschützte Aminosäure Synthesezyklus Synthese des symmetrischen Säureanhydrids oder HOBt-Esters Kopplungsnummer Boc-Gla Boc-Arg Boc-Arg(Tos) Boc-Pro Boc-Gla(OcHex)&sub2; Boc-Leu Boc-Asp(OBzl) Boc-Tyr(Br-Z) Boc-Val Boc-Ala Boc-Gly Boc-Trp Boc-Gln Verfahren

(3) Zersetzung mit HF:

Ein Teil (815 mg) des getrockneten Harzpeptids wurde gewogen, in einen Reaktor (aus Teflon) zur HF- Zersetzung eingebracht, es wurden 2 ml Anisol zugegeben, und man ließ die Mischung über Nacht unter Schwellung des Harzes stehen. Der obige Reaktor mit einem hierin eingebrachten Rührer wurde in eine HF- Zersetzungsvorrichtung montiert (Peptid Research Institute), in ein Trocken-Eis-Methanol-Bad eingebracht, und es wurden 18 ml HF in den Reaktor eingeleitet. Die Mischung wurde in einem Eisbad bei 0ºC eine Stunde gerührt. Das HF wurde langsam unter vermindertem Druck verdampft. Nach 3 Stunden wurde der Reaktor abgebaut und das zersetzte Harzpeptidprodukt aus dem Reaktor unter Verwendung von wasserfreiem Diethylether entnommen und mit wasserfreiem Diethylether gewaschen. Das zersetzte Harzpeptidprodukt wurde zu 50 ml 30%iger Essigsäure unter Lösung des nicht-geschützten Peptids gegeben. Dieses war zuvor in die Essigsäureform zum Zwecke des Ionenaustauschs überführt worden und über eine Dowex 1 x 2- Ionenaustausch-Harzsäule gegeben worden. Die Fraktionen, die als solche durchtraten, wurden zu Wasser gegeben, um die Säurekonzentration auf 1 N einzustellen, worauf sich die Lyophilisierung unter Erhalt von 475 mg humanen Gla¹&sup7;-Rohosteocalcins vom reduzierten Typ anschloß.

(4) Bildung der Disulfidbrücke durch Luftoxidation:

287 mg des aus (3) erhaltenen humanen Rohosteocalcins vom reduzierten Typ, wurden in 0,1 M Ammoniumacetatlösung (pH 8,5) gelöst, und es wurden 100 Äquivalente DTT zugegeben, worauf sich eine Reduktion bei 40ºC für 5 Stunden anschloß. Mit dieser Reduktionsreaktion wird das Dimer, das durch die Oxidation der Mercaptogruppe gebildet wird, in sein Monomer zurückgeführt.

Die Reaktionsmischung wurde auf pH 4,0 zur Zugabe von Essigsäure eingestellt und anschließend zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands wurden die Präzipitate durch Zugabe von 30%iger Essigsäure gelöst. Dann wurden DTT und Salze durch Gelchromatographie unter Verwendung von Sephadex G25 (Pharmacia) entfernt. Anschließend wurden die das reduzierte humane Gla¹&sup7;-Rohosteocalcin enthaltende Fraktionen allmählich zu 0,1 M Ammoniumacetatlösung (pH 7,5) unter Konstanthaltung des pHs zugetropft. Die Peptidkonzentration wurde hierbei auf 1,5 x 10&supmin;&sup6; M eingestellt. Nach Bildung einer Disulfidbrücke durch Rühren bei Raumtemperatur für 15 Tage wurde die Reaktionsmischung auf eine Säule mit Octadecylsilika (ODs-Säule, ∅ 2 x 30 cm) adsorbiert, mit 0,1 % TFE gewaschen, und anschließend wurde das Peptid mit 60 % Acetonitrillösung eluiert. Nach Verdampfung des Acetonitrils unter vermindertem Druck wurde der Rückstand unter Erhalt von humanem Gla¹&sup7;- Rohosteocalcin lyophilisiert. Die Disulfidbildungsreaktion wurde mit dem bekannten Elmann-Test unter Verwendung von 5,5-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure) überwacht, und das letztendlich erhaltene Reaktionsprodukt hat ein Oxidationsverhältnis von 95 %.

(5) Reinigung von humanen Gla¹&sup7;-Osteocalcin durch Umkehrphasen-HPLC:

Das humane Gla¹&sup7;-Rohosteocalcin aus (4) wurde in 30 % Essigsäure (10 mg/ml) gelöst und durch HPLC mit isokratischer Elution gereinigt. Die verwendete Säule war YMC-D (XMC, ∅ 2 x 30 cm) und die eingesetzten Elutionsmittel waren A eine Lösung von Wasser (100) - 10 % TFE (1) und eine Lösung B von Wasser (40) - Acetonitril (60) - 10 % TFE (1), und die Elution wurden unter den Bedingungen von A (48) - B (52) durchgeführt. Die Zahlen innerhalb der Klammern bedeuten Volumenverhältnisse. Die dem humanen Gla¹&sup7;-Osteocalcinentsprechenden Fraktionen wurden abgetrennt und unter Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert.

Ferner wurde das weiße Pulver in 30 % Essigsäure (10 mg/ml) gelöst und in gleicher Weise wie oben beschrieben gereinigt. Als Elutionsmittel wurde A/B = 51/49 eingesetzt. Humanes Gla¹&sup7;-Osteocalcin enthaltende Fraktionen wurden abgetrennt und unter Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert.

Das nach nochmaliger Reinigung erhaltene weiße Pulver wurde wiederum in 30%iger Essigsäure (10 mg/ml) gelöst, und es wurde weiter unter denselben Bedingungen wie bei der nochmaligen Reinigung gereinigt. Die Fraktionen, die dem humanen Gla¹&sup7;-Osteocalcin entsprachen, wurden gesammelt und unter Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert. Dieses Produkt wurde in 30%iger Essigsäure gelöst, über Sephadex G25- Säulenchromatographie entsalzt, dann wurde Wasser zu den humanen Gla¹&sup7;-Osteocalcinfraktionen zur Einstellung der Essigsäurekonzentration auf 1 N zugegeben, worauf sich Lyophilisation anschloß, unter Erhalt von 6,6 mg des erwünschten humanen Gla¹&sup7;- Osteocalcins.

(6) Strukturidentifizierung und Reinheitstest von gereinigtem humanen Gal¹&sup7;-Osteocalcin:

Die Analysewerte der Aminosäuren des gereinigten humanen Gla¹&sup7;-Osteocalcins sind in Tabelle 2 gezeigt. Dieses Produkt (100 uh) wurde in 1 % NH&sub4;HCO&sub3; gelöst und bei 25ºC zwei Stunden unter Zugabe von 1/10 Äquivalent Trypsin-TPCK (Worsinton) verdaut. Als Ergebnis der Messung des verdauten Produkts durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Meßbedingungen (1) wurden drei Haupt-Peaks bei 18,9 Minuten, 47,6 Minuten und 66,8 Minuten im Chromatogramm aufgezeichnet, und aus den Ergebnissen der Aminosäureanalyse und der Fab- Massenanalyse wurde gefunden, daß sie den Peptiden entsprechend den 45- bis 49-Positionen, 20- bis 43- Positionen und 1- bis 19-Positionen des humanen Gla¹&sup7;- Osteocalcins entsprechen.

TABELLE 2 Aminosäurezusammensetzung von gereinigtem humanem Gla¹&sup7;- Osteocalcin
Aminosäure Molverhältnis Aminosäurenummer Gla* Asx** Glx*** Gly Ala Cys**** Val Ile Leu Tyr Phe His Arg Pro Trp* * Hydrolysiert mit 2,5 N NaOH, 110ºC, 22 Stunden

** Asn und Asp

*** Gln und Glu hydrolysiert mit 2,5 N NaOH, 110ºC, 22 Stunden

**** Quantifiziert als S-Carboxymethylcystein

Meßbedingungen (1):

Säule: YMC-R, (∅ 4,6 x 250 mm)

Flußrate: 1 ml/min

Elutionsmittel: Lösung A (Wasser:Acetonitril:10%ige TFE = 100:0:1),

Lösung B (Wasser:Acetonitril:10%ige TFE = 40:60:1)

Konzentrationsgradient: A/B = 80/20 (0 Minuten) T 45/55 (70 Minuten) T 0/100 (70 Minuten) T 0/100 (73 Minuten)

Meßwellenlänge: 220 nm

Andererseits wurde das humane gereinigte Gla¹&sup7;-Osteocalcin einem Reinigungstest durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Meßbedingungen (2) unterworfen.

Meßbedingungen (2):

Säule: YMC-R, (∅ 4,6 x 250 mm)

Flußrate: 1 ml/min

Elutionsmittel: Lösung A (Wasser:Acetonitril:10%ige TFE = 100:0:1),

Lösung B (Wasser:Acetonitril:10%ige TFE = 40:60:1)

Konzentrationsgradient: A/B = 100/0 (0 Minuten) T 100/0 (5 Minuten) T 0/100 (35 Minuten) T 0/100 (40 Minuten)

Meßwellenlänge: 220 nm

Als Ergebnis wurde eine einzelne starke Absorption, herrührend von einem Peptid mit einer Retentionszeit von 30,7 Minuten, gefunden, und dieses war das erfindungsgemäße humane Gla¹&sup7;-Osteocalcin.

BEISPIEL 2

Synthese von humanem Gla¹&sup7;-Osteocalcin, dargestellt durch die Formel:

Die Festphasensynthese wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung von Boc-Glu(OBzl) anstelle von Boc-Gla(OcHex)&sub2; bei der Einführung der Aminosäure an die 17-Position unter Erhalt eines geschützten Peptidharzes. Ein Teil (500 mg) des geschützten Harzes wurde mit HF auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 zersetzt. Das humane Glu¹&sup7;-Rohosteocalcin vom reduzierten Typ wurde oxidiert, und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gereinigt unter Erhalt von 3,2 mg humanem Glu¹&sup7;-Osteocalcin.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Einführung von Gla leichter bei humanen Gla¹&sup7;-Osteocalcin und humanem Glu¹&sup7;- Osteocalcin erfolgen, wodurch eine chemische Synthese möglich wird.

REFERENZBEISPIEL Herstellung eines Test-Kits auf humanes BGP unter Verwendung von humanem BGP (a) Herstellung von Anti-Rind-BGP-monoklonalen Antikörper

Nach Herstellung eines gebundenen Produktes aus einem Rind-BGP, das aus Rinderknochen extrahiert wurde und auf eine Reinheit von 95 % oder höher gereinigt wurde, und einem Schweinethyroglobulin, wurde eine Emulsion mit einem Freund'schen kompletten Adjuvans hergestellt, und damit Mäuse immunisiert (Balb/c-Spezies). Nach Bestätigung des Auftretens von Antikörper gegen Rinder- BGP im Blut der Mäuse wurde eine Suspension unter Verwendung der entnommenen Milz hergestellt. Daraufhin wurden 1 bis 5 x 10&sup8; Milzzellen mit 2 bis 10 x 10&sup7; Mausmyelomazellen (P3-X63-Ag8-U1) unter den in der Literatur beschriebenen Bedingungen (Galfre C., Milstein C., Methods Enzymol. 1981; 73: 3-46) fusioniert. Die Hybridoma wurden in einem modifizierten Dulbecco's-Eagle-Medium, enthaltend 10 % Rinderserum, kultiviert, und die Generation der Anti-Rind-BGP- Antikörper wurde untersucht. Antikörper-bildende Hybridoma wurden unter Prüfung der Erzeugung von Anti- Rind-BGP-Antikörper kultiviert. Das Klonieren von Antikörper-bildenden Hybridoma wurde zweimal oder mehr unter Erhalt von Klonen wiederholt. Nach dem Verfahren der Inokulierung kultivierter Hybridoma in die Bauchhöhle von Mäusen (Balb/c-Spezies) und der Gewinnung von Ascites nach 2 Wochen wurde eine große Menge monoklonalen Antikörpers erhalten.

2. Herstellung von antihumanen BGP-monoklonalen Antikörper

Nach Herstellung eines gebundenen Produkts von humanem Gla¹&sup7;-Osteocalcin mit einer Reinheit von 95 % oder mehr, erhalten durch chemische Synthese und Reinigung nach dem Verfahren von Beispiel 1, mit einem Schweinethyroglobulin, wurde ein Hybridom auf dieselbe Weise wie für das Anti-Rind-BGP-monoklonalen Antikörper nach obigem Verfahren 1 erhalten, und es wurden große Mengen von antihumanen BGP-monoklonalen Antikörper nach den Acitesverfahren gewonnen.

3. Herstellung von mit antihumanen BGP-monoklonalen Antikörper überzogenen Polystyrolperlen

Perlen aus Polystyrol (Durchmesser: 6,3 mm) wurden in eine gereinigte IgG-Fraktionslösung von Mausascites mit antihumanen BGP-monoklonalen Antikörper, hergestellt mit einer Konzentration von 16 ug/ml unter Verwendung von 0,3 ml 0,1 mol Bicarbonatpuffers (pH 9,6) pro Perle eingetaucht, und man ließ bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Anschließend wurden die Perlen mit einem Phosphatpuffer, der 0,1 % Tween 20 (Warenzeichen) enthielt, gewaschen und im Vakuum getrocknet.

4. Herstellung von Anti-Rind-BGP-monoklonalen Antikörper, markiert mit ¹²&sup5;J (Jod)

Gemäß der Literatur (Greenwood FC, Hunter WM, Glover JS., Biochem. J, 1963; 89: 114-123) wurden die IgG- Fraktion aus dem Anti-Rind-BGP-monoklonalen Antikörper, gewonnen aus dem Mousascites, mit ¹²&sup5;J nach dem Chloramin-T-Verfahren markiert.

5. Messung von humanen BGP

Entsprechend dem sogenannten Sandwich-radioaktiven Immunassayverfahren, worin die Messung durch die Deckung eines festen Substrats mit einem monoklonalen Antikörper A und Markierung eines monoklonalen Antikörpers B mit ¹²&sup5;J durchgeführt wird, wurde die Bestimmung des humanen BGPs durchgeführt. D. h. in einem Plastikröhrchen wurden 25 ul eines Lösung, enthaltend verschiedene Konzentrationen humanem BGPs, eingebracht, und anschließend 200 ug ¹²&sup5;J-markierten Anti-Rind-BGP-monoklonalen Antikörpers zugegeben, und ferner wurden eine Polystyrolperle, die mit dem antihumanen BGP-monoklonalen Antikörper bedeckt war, eingebracht, es wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden geschüttelt. Danach wurde die Reaktionsmischung abgesaugt, die Perlen mit 2 ml gereinigtem Wasser dreimal gewaschen. Die Dosis der Radioaktivität von ¹²&sup5;J-markierten Anti-Rind-BGP-Antikörper, der an die Perlen gebunden war, wurde mit einem Gammazähler vom Well-Typ gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Schließlich wurde die Reaktivitätsdosis (cpm) gegen den Logarithmus der humanen BGP-Konzentration einer Lösung in einem Teströhrchen gegen den Logarithmus um eine Dosis-abhängige Kurve zu erstellen, aufzutragen. Die erhaltene Kurve ist in Fig. 4 gezeigt. Falls eine unbekannte Probe auf diese Weise gemessen wird, kann die Konzentration davon aus der Dosisabhängigen Kurve abgeleitet werden.

Wenn BGP-Konzentrationen im Serum von 66 normalen Menschen gemessen werden, zeigten die Ergebnisse, daß der Bereich von 3,1 ng/ml (Mittel - 2 Standardabweichung) bis 12,7 ng/ml (Mittel + 2 Standardabweichung), mit einem mittleren Wert von 6,2 ng/ml in einer logarithmischen Verteilung erhalten wurden.

TABELLE 3
Counts (cpm) Teströhrchen Nr. Inhalt des Teströhrchens BGP-Konzentration (ng/ml) Gefunden Mittel Gesamtcount Standard-BGP ng/ml ungekannte Probe

Die Bedeutungen der Abkürzugnen in Tabelle 3 sind wie folgt:

Gesamtcount: Count (cpm) von ¹²&sup5;J-markiertem Anti-BGP- monoklonalen Antikörper, der in jedes Teströhrchen zugegeben wurde.

B-Bo: Count (cpm) von Anti-BGP-monoklonalen Antikörpber B-Komplex, gebunden durch insulubilisierten monoklonalen Antikörper A.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von humanem Gla¹&sup7;-Osteocalcin und humanem Glu¹&sup7;-Osteocalcin oder Salzen davon, welches das Einführen von γ-Carboxyglutaminsäure in einem Peptid-Syntheseverfahren für humanes Osteocalcin unter Verwendung einer geschützten L-γ-Caroxyglutaminsäure, dargestellt durch die Formel:

worin n 0, 1 oder 2 darstellt oder ein Salz davon, umfaßt.

2. Verfahren zur Herstellung von humanem Osteocalcin nach Anspruch 1, worin das Peptidsyntheseverfahren ein Festphasenverfahren ist.

3. Verfahren zur Herstellung von humanem Osteocalcin nach Anspruch 1, worin das humane Gla¹&sup7;-Osteocalcin und das humane Glu¹&sup7;-Osteocalcin die folgenden chemischen Formeln haben

4. Verfahren zur Herstellung von humanem Osteocalcin nach Anspruch 1, worin das Salz des humanen Gla¹&sup7;- Osteocalcins oder humanen Glu¹&sup7;-Osteocalcins ein Salz eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer organischen Base ist.

5. Verfahren zur Herstellung humanen Osteocalcins nach Anspruch 4, worin das Salz ausgewählt ist aus Natriumsalz, Kaliumsalz, Lithiumsalz, Kalziumsalz, Magnesiumsalz, einem Salz von Methylamin, Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Benzylamin, Pyrrolidin, Piperidin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Ornithin, Lysin und Arginin.

6. Verfahren zur Herstellung von humanen Osteocalcin nach Anspruch 2, worin das Festphasenverfahren das Binden von Valin an die C-terminale Aminosäure des erwünschten Osteocalcins an ein unlösliches Harz als geschützte Aminosäure; Binden einer geschützten Aminosäure der Reihe nach vom C-terminalen Ende unter Bildung einer geschützten Peptidkette; Behandlung der geschützten Peptidkette mit einem Reagens, welches die Seitenkettenschutzgruppen der entsprechenden Aminosäuren eliminiert; Eliminieren der Seitenkettenschutzgruppen der entsprechenden Aminosäuren unter Erhalt eines Peptids mit der Mercaptogruppe des Cysteins, welche ungeschützt vorliegt; Oxidieren des Peptids in einem Puffer unter Bildung einer intramolekularen Disulfidbindung unter Erhalt eines humanen Rohosteocalcins und anschließende Reinigung des humanen Rohosteocalcins umfaßt.

7. Verfahren zur Herstellung von humanen Osteocalcin nach Anspruch 6, worin das unlösliche Harz ausgewählt ist aus einem Chlormethylharz, einem Oxymethylharz und einem 4- (Oxymethyl)phenylacetamidmethylharz.

8. Verfahren zur Herstellung von humanen Osteocalcin nach Anspruch 7, worin das geschützte Peptid die folgende Formel hat:

9. Verfahren zur Herstellung von humanem Osteocalcin nach Anspruch 6, worin die Oxidationsreaktion des Peptids in einem Puffer durchgeführt wird unter Lösen von humanem Rohosteocalcin mit der freigesetzten Mercaptogruppe des Cys in einem Puffer bei einer Konzentration von 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup7; mol/l, Einstellung des pHs auf 6,0 bis 8,5 und anschließendem Rühren der Lösung bei 4 bis 50ºC für 4 bis 30 Stunden.

10. Verfahren zur Herstellung von humanem Osteocalcin nach Anspruch 6, worin die Reinigung durch Extraktion, Umkristallisation, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Partitionschromatographie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Elektrophorese oder Gegenstrompartition durchgeführt wird.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com