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Dokumentenidentifikation DE68920987T2 22.06.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0377295
Titel Rekombinante DNA enthaltende Expressionsvektoren und für Isopenicillin-N-Epimerase-(Racemase)-Aktivität kodierende DNS-Verbindungen.
Anmelder Eli Lilly and Co., Indianapolis, Ind., US
Erfinder Kovacevic, Steven, Indianapolis Indiana 46220, US;
Miller, James Robert, Indianapolis Indiana 46250, US;
Skatrud, Paul Luther, Greenwood Indiana 46142, US;
Tobin, Matthew Barry, Indianapolis Indiana 46227, US
Vertreter Spott, G., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., 80336 München; Weinmiller, J., Dipl.-Ing., 82340 Feldafing; Leißler-Gerstl, G., Pat.-Anwälte, 80336 München
DE-Aktenzeichen 68920987
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 15.12.1989
EP-Aktenzeichen 893131508
EP-Offenlegungsdatum 11.07.1990
EP date of grant 01.02.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.06.1995
IPC-Hauptklasse C12N 15/61
IPC-Nebenklasse C12N 9/90   C12N 1/21   C12N 1/15   

Beschreibung[de]

Die natürlichen Schwefel-enthaltenden β-Lactamantibiotika sind klinisch am bedeutsamsten, und die Isolierung von neuen β-Lactamverbindungen dauert nun fast sechs Jahrzente seit der Entdeckung des Penicillins durch Flemming an. Das gemeinsame Strukturmerkmal der Penicilline und Cephalosporine (einschließlich Cephamycine) ist der β-Lactamring.

Diese Antibiotika werden durch eine Vielzahl von Prokaryonten und niederen Eukaryonten gebildet. Die Penicilline, beispielhaft dargestellt durch die Verbindungen Penicillin G (Benzylpenicillin) oder Penicillin V, werden hauptsächlich durch filamentöse Pilze gebildet, von denen Penicillium chrysogenum am erwähnenswertesten ist. Die Cephalosporine, zuerst als Produkt von dem niederen Eukaryonten Cephalosporium acremonium (synonym Acremonium chrysogenum) isoliert, sind ebenfalls Metaboliten von vielen Prokaryonten, besonders aber von Streptmyces clavuligerus, S. lipmanii und S. cattleya, die ebenfalls Cephamycine und andere β-Lactame bilden, wie Oxypename (Clavulansäure) und Carbapename (Thienamycin).

Die Entwicklung zellfreier Systeme aus β-Lactam-bildenden Organismen erlaubte die Aufklärung der Biosyntheseschritte im Syntheseweg der Schwefel-enthaltenden β-Lactame (Penicilline und Cephalosporine).

Die anfänglichen Schritte bei der Bildung von Penicillinen in filamentösen Pilzen (beispielsweise P. chrysogenum) und der von Cephalosporinen und Cephamycinen, die sowohl von Prokaryonten als auch von niederen Eukaryonten gebildet werden, sind identisch.

ACV-Synthetase katalysiert die Kondensation der Aminosäurevorläufer L-α-Aminoadipat, L-Cystein und L-Valin zum Tripeptid LLD-ACV. Der nächste Schritt bildet das erste β-Lactam im Syntheseweg durch die Zyklisierung des Tripeptids unter Bildung von Isopenicillin N (IPN), dem Vorläufer aller Penicilline, Cephalosporine und Cephamycine.

Nach der Synthese von IPN divergieren die Synthesewege zu Cephalosporinen und Penicillinen. In Penicillium chrysogenum kann beispielsweise die α-Aminoadipylseitenkette von IPN gegen eine aus vielen (fast 100 bis heute) hydrophoben Seitenketten ausgetauscht werden, die vom entsprechenden Acyl-CoA stammen. Eines der geläufigsten Beispiele ist die Bildung von Penicillin G (Benzylpenicillin) aus Phenylacetyl-COA und IPN. Im Pilz C. acremonium wird jedoch die α-Aminoadipylseitenkette unter Bildung von Penicillin N isomerisiert. Der fünfgliedrige Thiazolidinring von Penicillin wird dann zum sechsgliedrigen Dihydrothiazinring "erweitert", der für die Cephalosporine charakteristisch ist. Diese Reaktion wird durch die Deacetoxycephalosporin-C-Synthetase (DAOCS) katalysiert und bildet das erste Cephalosporin im Syntheseweg, Deacetoxycephalosporin C (DAOC). Obwohl die DAOCS Aktivitäten von Cephalosporium acremonium und der grampositiven Bakterien Streptomyces clavuligerus und S. lactamdurans extensiv charakterisiert wurden, sind die verbleibenden Schritte im Syntheseweg weniger gut verstanden.

Die vorliegende Erfindung liefert ein Gen, das eine Aktivität des β-Lactambiosynthesewegs kodiert, nämlich Isopenicillin-N- Epimerase. Die Aktivität ist auch als Racemase bekannt. Die vorliegende Erfindung erweitert das Repertoire von β-Lactambiosyntheseenzymen, die überproduziert werden können. Diese Fähigkeit erleichtert die Biokonversion von Substratanaloga zu neuen β-Lactamen und eine Stammverbesserung durch eine erhöhte Gendosis.

Die vorliegende Erfindung umfaßt eine DNA Sequenz, die eine Isopenicillin-N-Epinieraseaktivität von Streptomyces clavuligerus kodiert. Die Isopenicillin-N-Epimerase (Racemase) katalysiert die Reaktion, in der Penicillin N aus Isopenicillin N gebildet wird und wird auch als Racemase bezeichnet. Das Enzym wandelt die L-αAminoadipylseitenkette von Isopenicillin N in eine D-α-Aminoadipylseitenkette um. Es wird nun mehr als Racemase und nicht mehr wie früher als Epimerase bezeichnet, da es ein Gleichgewicht zwischen den beiden Formen einzustellen scheint. Das Enzym ist sehr instabil, aber die katalysierte Reaktion ist ein entscheidender Schritt bei der Biosynthese von wichtigen Antibiotika, wie Cephalosporinen von Cephalosporium acremonium und 7α-Methoxycephalosporinen oder Cephamycinen von Streptomyces clavuligerus und S. lipmanii. Daher ist es ziemlich wichtig, die Aktivität in großen Mengen herstellen zu können.

Die DNA Verbindungen der vorliegenden Erfindung kodieren die Racemaseaktivität in einem einzigen offenen Leserahmen. Die Transkription dieses offenen Leserahmens, gefolgt von der Translation der entstehenden mRNA, ergibt eine einzige Polypeptidkette, die Racemaseaktivität besitzt. Die DNA Verbindung, die die Racemaseaktivität kodiert, wurde aus der genomischen DNA von Streptomyces clavuligerus isoliert und zur Konstruktion der rekombinanten DNA Expressionsvektoren verwendet. Vier Typen dieser Expressionsvektoren sind besonders brauchbar: Der erste steuert eine sehr starke Expression der Racemaseaktivität in E. coli, der zweite in Cephalosporium, der dritte in Penicillium und der vierte in Streptomyces.

Die von E. coli gebildete Racemaseaktivität katalysiert die Bildung von Penicillin N aus Isopenicillin N. Rohe Zellextrakte dieser erfindungsgemäßen E. coli Transformanden zeigen Racemaseaktivität. Diese E. coli Expressionsvektoren und Transformanden liefern ein effizientes Mittel zur Erlangung großer Mengen an aktiver Racemase. Die Racemase ist nicht nur zur Bildung von Penicillin N brauchbar, sondern auch zur Bildung von einzigartigen Antibiotika.

Die erfindungsgemäßen Cephalosporium Vektoren sind zum Zweck der Konstruktion von Stämmen brauchbar, die in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden können. Cephalosporium ist ein ökonomisch wichtiger Organismus, der zur Herstellung von Cephalosporinantibiotika verwendet wird. Die Transformation von Cephalosporium mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren führt zu höheren intrazellulären Mengen an Racemaseaktivität in den Transformanden. Diese Transformanden können zur Erhöhung der Effizienz und der Antibiotikumausbeute bei Industriefermentationsverfahren verwendet werden. Die Transformation von C. acremonium Stämmen, denen ein funktionelles Racemasegen fehlt, mit erfindungsgemäßen Vektoren, führt zu Transformanden, die Penicillin N synthetisieren. Penicillin N ist als Zwischenprodukt bei der Herstellung von oral absorbierbaren, klinisch wichtigen Antibiotika brauchbar.

Die erfindungsgemäßen Penicillium Vektoren sind zur Einführung von Cephalosporin-synthetisierenden Aktivitäten in Penicillium Stämme am brauchbarsten, die Penicillin in großen Mengen bilden. Die Racemaseaktivität ist brauchbar zur Bildung von Penicillin N als Vorläufer zur Umwandlung von verschiedenen Penicillinen in Cephalosporine durch Expandase, entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Aktivitäten, wie der Deacetylcephalosporin-C- synthetase (DACS, die die Bildung von Deacetylcephalosporin C aus DAOC katalysiert, eine Hydroxylierungsreaktion). Beispielsweise führt die gemeinsame Expression der Isopenicillin-N-Epimeraseaktivität und der DAOCS-Aktivität in Penicillium zur Bildung von DAOC, einem bisher unbekannten Metaboliten in Penicillium.

Die DNA Verbindungen, die die Racemaseaktivität kodieren, werden zur Konstruktion der Expressionsvektoren leicht modifiziert, die die Effizienz und Ausbeute der Fermentationen erhöhen, welche andere Organismen beinhalten, wie Paecilomyces und Streptomyces, insbesondere S. clavuligerus. Obwohl die Racemaseaktivitätkodierende DNA der vorliegenden Erfindung von S. clavuligerus isoliert wurde, kann diese DNA zur Konstruktion von Vektoren verwendet werden, die die Expression der Racemaseaktivität in einer großen Vielzahl von Wirtszellen steuern, wie dies durch die oben beschriebenen E. coli Expressionsvektoren gezeigt ist. Die für die erfindungsgemäßen E. coli-, Cephalosporium- und Penicillium-Vektoren verwendeten Konstruktionsprotokolle können zur Konstruktion von analogen Vektoren für andere Organismen befolgt werden, indem man nur, falls erforderlich, die geeigneten regulatorischen Elemente austauscht. Die erfindungsgemäßen Racemase-kodierenden DNA Verbindungen können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die zur Verbesserung der Effizienz und der Ausbeute von Fermentationen brauchbar sind, welche eine große Vielzahl von Penicillin- und Cephalosporinantibiotikum-bildenden Organismen beinhalten.

Der folgende Abschnitt liefert eine detailliertere Beschreibung der vorliegenden Erfindung. Zum Zweck der Klarheit und als Verständnishilfe der Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Ausdrücke folgendermaßen definiert.

amdS - ein Acetamidasegen, auch in den Figuren verwendet, um das Aspergillus nidulans Acetamidasegen zu bezeichnen.

amdSp - der Promotor des amdS Gens.

AmR - das Apramycinresistenz-verleihende Gen, ebenfalls verwendet, um den Apramycin-resistenten Phänotyp zu bezeichnen.

Antibiotikum - durch einen Mikroorganismus gebildete Substanz, die entweder natürlich oder begrenzt modifiziert andere Mikroorganismen oder eukaryontische Zellen im Wachstum hemmt oder tötet.

Antibiotikumbiosynthesegen - ein DNA Segment, das für eine Aktivität kodiert, die für die enzymatische Reaktion beim Umwandlungsverfahren von Primärmetaboliten in Antibiotika oder beim Umwandlungsverfahren einer antibiotischen Verbindung in eine andere antibiotische Verbindung benötigt wird.

Antibiotikum bildender Organismus - jeder Organismus, einschlieβlich aber nicht beschränkt auf Streptomyces, Bacillus, Flavobacterium, Monospora, Cephalosporium, Paecilomyces, Podospora, Penicillium und Nocardia, der entweder Antibiotika bildet oder Gene enthält, die bei Expression ein Antibiotikum bilden würden.

Antibiotikumresistenz-verleihendes Gen - DNA Segment, das eine Aktivität kodiert, die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht.

ApR - Ampicillinresistenz verleihendes Gen, ebenfalls verwendet, um den Ampicillin-resistenten Phänotyp zu bezeichnen.

bGH- ein Rinderwachstumshormon oder eine für dieses kodierende DNA

bp - ein Basenpaar einer doppelsträngigen DNA.

CAT - das Chlormaphenicolresistenz verleihende Gen, das eine Acetyltransferase kodiert.

cI857 - ein Gen, das einen temperaturempfindlichen Repressor des Lambda-PL Promotors kodiert.

cIPS - Isopenicillin-N-synthetase oder Isopenicillin-N-Synthetase kodierende DNA aus Cephalosporium acremonium.

Klonieren - Verfahren zum Einbau eines DNA Segment s in einen rekombinanten DNA Klonierungsvektor.

kodierende Sequenz - die DNA Sequenz in einem Gen, das entweder für die Aminosäuresequenz eines durch das Gen exprimierten proteins kodiert, oder im Fall von rRNA oder tRNA Genen, die RNA Sequenz der durch das Gen exprimierten rRNA oder tRNA.

Cosmid - ein rekombinanter DNA Klonierungsvektor, der in derselben Weise wie ein Plasmid in einer Wirtszelle replizieren kann, aber auch einen Phagenverpackungsmechanismus verwenden kann.

Gen - ein DNA Segment, das einen Promotor, eine Translationsaktivierungssequenz, eine kodierende Sequenz und 3'-regulatorische Sequenzen umfaßt, die zur Expressionssteuerung des Genprodukts, entweder eines Proteins (und daher notwendigerweise einer mRNA), tRNA oder rRNA positioniert sind.

Genbank - ein Satz an rekombinanten DNA Klonierungsvektoren, in die DNA Segmente kloniert wurden, die im wesentlichen die gesamte DNA eines bestimmten Organismus umfassen.

hGH - humaner Wachstumsfaktor oder die diesen kodierende DNA.

HmR - das Hygromycinresistenz verleihende Gen, ebenfalls verwender, um den Hygromycin-resistenten Phänotyp zu bezeichnen.

Hybridisierung - ein Verfahren zur Anelierung zweier einzelsträngiger DNA Moleküle unter Bildung eines doppelsträngigen DNA Moleküls, das vollständig oder unvollständig basengepaart sein kann.

IPS oder IPNS - Isopenicillin-N-Synthetase.

Isopenicillin N - hat die folgende Struktur

Isopenicillin-N-Synthetase - ein Enzym, auch bekant als Cyclase, das die Bildung von Isopenicillin N aus δ-(L-α-Aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valin katalysiert.

KmR - das Kanamycinresistenz verleihende Gen, ebenfalls verwendet, um den Kanamycin-resistenten Phänotyp zu bezeichnen.

lacI - das E. coli lacI-Gen.

lacZα - der Promotor und das α-Fragment der β-Galactosidase (lacZ) aus dem E. coli lac-Operon.

lppT - der Transkriptionsterminator des E. coli lpp-Gens.

lppP - der Promotor des E. coli lpp-Gens.

M13ori - der Replikationsursprung des Phagen M13.

mel - das Tyrosinasegen.

MCS - ein Polylinker.

mRNA- Botenribonukleinsäure.

ORI - ein Plasmid- oder Vektorreplikationsursprung, die DNA Sequenz, die als Anhaftungs- oder Startstelle für die DNA Polymerase dient.

Pen DNA - DNA von Penicillium chrysogenum.

Penicillin N - hat die im folgenden gezeigte Struktur

pIPS - das IPS Gen oder die IPS kodierende Sequenz von Penicillium chrysogenum.

pIPSp - der Promotor des IPS Gens von Penicillium chrysogenum.

pIPSt - der Transkriptionsterminator des IPS Gens von Penicillium chrysogenum.

pL - der linke Promotor des Bakteriophagen Lambda.

Promotor - eine DNA Sequenz, die die Transkription von DNA steuert oder veranlaßt.

Racemaseaktivität - eine Enzymaktivität, die die Umwandlung von Isopenicillin N in Penicillin N und umgekehrt katalysiert und durch das erfindungsgemäße Gen oder durch DNA kodiert wird, die mittels des erfindungsgemäßen Gens als Sonde identifiziert werden kann.

Rekombinanter DNA Klonierungsvektor - jedes autonom replizierende oder integrierende Agens, einschließlich aber nicht nur beschränkt au Plasmide, das ein DNA Molekül umfaßt, zu dem ein oder mehrere zusätzliche DNA Moleküle hinzugefügt werden können oder wurden.

Rekombinanter DNA Expressionsvektor - jedes autonom replizierende oder integrierende Agens, einschließlich aber nicht nur beschränkt auf Plasmide, das einen Promotor und andere regulatorische Sequenzen umfaßt, die zur Expressionssteuerung eines DNA Segments positioniert sind, das ein Polypeptid oder eine RNA von Forschungsinteresse oder kommerziellem Interesse kodiert.

Rekombinanter DNA Vektor - jeder rekombinante DNA Klonierungs- oder Expressionsvektor.

Restriktionsfragment - jedes lineare DNA Molekül, das durch die Wirkung von ein oder mehreren Enzymen erzeugt wurde.

rRNA - ribosomale Ribonukleinsäure

Empfindliche Wirtszelle - eine Wirtszelle, die in Gegenwart eines verabreichten Antibiotikums ohne einem Resistenz-verleihenden DNA Segment nicht wachsen kann oder im Wachstum gehemmt ist.

TcR - das Tetracyclinresistenz-verleihende Gen, ebenfalls verwendet, um den Tetracyclin-resistenten Phänotyp zu bezeichnen.

Transkriptionsterminator - eine DNA Sequenz, die die Transkriptionstermination von DNA durch die RNA Polymerase anzeigt.

Transfektand - eine Empfängerwirtszelle, die einer Transformation durch Phagen-DNA oder durch eine DNA, die in Phagenpartikel verpackt ist, unterzogen wurde.

Transformand - eine Empfängerwirtszelle, die einer Transformation unterzogen wurde.

Transformation - die Einführung von DNA in eine Empfängerwirtszelle, die den Genotyp ändert und zu einer Änderung in der Empfängerzelle führt.

Translationsaktivierungssequenz - eine regulatorische DNA Sequenz, die, wenn sie in mRNA transkribiert wird, die Translation von mRNA in Protein fördert.

tRNA - Transferribonukleinsäure.

trp - der Promotor und die Translationsaktivierungsequenz des Tryptophanoperons von E. coli.

Die Restriktions- und Funktionskarten, die in den Zeichnungen dargestellt sind, sind ungefähre Darstellungen der rekombinanten DNA Vektoren, die hierin diskutiert werden. Die Restriktionsstelleninformation ist nicht erschöpfend, und so können mehr Restriktionsschnittstellen einer gegebenen Art auf dem Vektor vorhanden sein, als tatsächlich in der Karte gezeigt sind.

Figur 1: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pOW390.

Figur 2: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pCZR111

Figur 3: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pOW392.

Figur 4: Ein Diagramm der β-Lactambiosynthesewege.

Figur 5: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPSJ78.

Figur 6: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLC2.

Figur 7: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPSJ77.

Figur 8: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPS51.

Figur 9: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pMLC12.

Figur 10: Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid p3SR2.

Die vorliegende Erfindung umfaßt DNA Verbindungen und rekombinante DNA Klonierungs- und Expressionsvektoren, die die Racemaseaktivität von Streptomyces clavuligerus kodieren. Insbesondere umfaßt die Erfindung eine konstruierte DNA Verbindung, die ein Protein mit Isopenicillin-N-Epimerase (Racemase) Aktivität von Streptomyces clavuligerus kodiert. Die Sequenz der S. clavuligerus Racemase-kodierenden DNA ist im folgenden zusammen mit einem Teil der DNA gezeigt, die das 3'-Ende der kodierenden Region im S. clavuligerus Genom flankiert. In der Darstellung ist nur der "Sinnstrang", oder kodierende Strang des doppelsträngigen DNA Moleküls gezeigt, und die DNA ist von links nach rechts in der 5'T 3' Orientierung dargestellt. Die Nukleotidsequenz ist nummeriert, die Nummern erscheinen links von der DNA Sequenz. Die Aminosäuresequenz der durch die DNA kodierten Racemaseaktivität ist nach der DNA Sequenz von links nach rechts in Richtung Aminoterminus T Carboxyterminus angegeben.

worin A für Desoxyadenyl steht, G für Desoxyguanyl steht, C für Desoxycytidyl steht und T für Thymidyl steht.

Im folgenden ist die durch die vorhergehende DNA Sequenz kodierte Aminosäuresequenz angegeben:

worin Ala für einen Alaninrest steht, Arg für einen Argininrest steht, Asn für einen Asparaginrest steht, Asp für einen Asparaginsäurerest steht, Cys für einen Cysteinrest steht, Gln für einen Glutaminrest steht, Glu für einen Glutaminsäurerest steht, Gly für einen Glycinrest steht, His für einen Histidinrest steht, Ile für einen Isoleucinrest steht, Leu für einen Leucinrest steht, Lys für einen Lysinrest steht, Met für einen Methioninrest steht, Phe für einen Phenylalaninrest steht, Pro für einen Prolinrest steht, Ser für einen Serinrest steht, Thr für einen Threoninrest steht, Trp für einen Tryptophanrest steht, Tyr für einen Tyrosinrest steht und Val für einen Valinrest steht.

Der Fachmann erkennt, daß die oben angegebene DNA Sequenz ein wichtiger Teil der vorliegenden Erfindung ist. Die obige Sequenz kann herkömmlich durch das modifizierte Phosphotriesterverfahren mittels vollkommen geschützter Desoxyribonukleotidbausteine synthetisiert werden. Solche synthetischen Verfahren sind in der Technik gut bekannt und können gemäß dem Verfahren von Itakura et al., 1977, Science 198:1056 und Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:5765 ausgeführt werden. Zusätzlich ist ein besonders bevorzugtes Verfahren in Hsiung et al., 1983, Nucleic Acid Research 11: 3227 und Narang et al., 1980, Methods in Enzymology 68: 90 beschrieben. Zusätzlich zu den oben angeführten manuellen Verfahren kann die DNA Sequenz mittels automatisierten DNA Synthesegeräten synthetisiert werden, wie dem Systec 1450 A oder dem ABS (Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404) 380A DNA Synthesegeräten.

Aufgrund der degenerierten Art des genetischen Codes, die daraus resultiert, daß mehr als ein Codon für die meisten Aminosäuren und das Translationsstopsignal existieren, kann die oben gezeigte Amniosäuresequenz des Racemaseenzyms von einer Vielzahl an verschiedenen DNA Sequenzen kodiert werden. Da diese alternativen DNA Sequenzen dieselbe erfindungsgemäße Aminosäuresequenz kodieren würden, umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese alternativen Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt DNA Verbindungen und rekombinante DNA Klonierungs- und Expressionsvektoren, die die Racemaseaktivität von Streptomyces clavuligerus kodieren.

Die erfindungsgemäßen für Racemaseaktivität kodierenden DNA Verbindungen wurden aus einem Stamm von Streptomyces clavuligerus isoliert. Eine Genbank der gesamten genomischen DNA des S. clavuligerus Stamms wurde konstruiert und auf das Vorkommen von Sequenzen untersucht, die zu einer Desoxyribonukleotidsonde homolog sind. Diese Sonde wurde mit dem Wissen des genetischen Codes und der bevorzugten Codonverwendung gemäß der Information konstruiert, die man über die aminoterminale Aminosequenz der S. clavuligerus Racemase erhalten hatte. Eine DNA Sequenzierung zeigte, welcher Vektor die S. clavuligerus Racemase kodierte.

Ein 3,6 kb KpnI Restriktionsfragment eines als pOW379 bezeichneten Cosmids, welches als Racemasegen enthaltend identifiziert wurde, wurde in das im Handel erhältliche Plasmid pUC19 (verdaut mit KpnI) unter Bildung von Plasmid pOW390 inseriert, das dann in E. coli K12 RR1ΔM15 Wirtszellen transformiert wurde. Die E. coli K12 RR1ΔM15/pOW390 Transformanden wurden unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18431 hinterlegt und so zum Bestandteil der Stammsammlung der Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, IL 61604 gemacht (Hinterlegungsdatum: 15. November 1988). Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pOW390 ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt.

Das Plasmid pOW390 dient als brauchbares Ausgangsmaterial zur Konstruktion von anderen erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Diese Vektoren sind insbesondere in einem Verfahren zur Herstellung von Racemaseaktivität in einer rekombinanten Wirtszelle brauchbar, wobei das Verfahren umfaßt: (1) Transformieren dieser Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Expressionsvektor, der enthält: (a) einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, und (b) eine DNA Sequenz, die Racemaseaktivität kodiert und zur Expression von diesem Promotor und der Translationsaktivierungssequenz aus positioniert ist, und (2) Kultivieren dieser in Schritt (1) transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression dieser Racemaseaktivität erlauben.

Das Plasmid pOW390 kann aus E. coli K12 RR1ΔM15/pOW390 durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren isoliert werden. Das plasmid pOW390 enthält das intakte Streptomyces clavuligerus Racemasegen, das beispielsweise aus dem Plasmid auf einem 3,6 kb KpnI Restriktionsfragment isoliert werden kann. Das Plasmid pOW390 wurde zur Konstruktion eines als pOW392 bezeichneten Plasmids als Ausgangsmaterial verwendet, das eine Expression der Racemaseaktivität in hohem Ausmaß in E. coli steuert. Um die Manipulation der für S. clavuligerus Racemase kodierenden Sequenz zu vereinfachen, wurde eine NcoI Restriktionsschnittstelle an der Position -2 bis +4 der S. clavuligerus Racemase kodierenden DNA Sequenz in Plasmid pOW392 geschaffen.

Die Schaffung dieser NcoI Stelle wurde durch M13 ortsspezifische Mutagenesetechniken ausgeführt und beinhaltete die Veränderung der DNA Basen, die das Startcodon des Racemasegens umgeben, von ACATGG zu CCATGG. Ein Fachmann erkennt, daß DNA Mutagenesetechniken herkömmlich zur Einführung von Restriktionsschnittstellen in DNA Sequenzen verwendet werden und daß in diesem Fall die kodierte Aminosäuresequenz nicht verändert wurde. Die Mutagenese und die Zwischenprodukte sind ausführlicher in Beispiel 2 beschrieben.

Das Plasmid pOW392 kann durch Insertion der für die Streptomyces calvuligerus Racemase kodierenden Sequenz in Plasmid pCZR111 (erhältlich von den NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18249, Hinterlegungsdatum: 11. August 1987) konstruiert werden, ein Expressionsvektor, der den Lambda PL Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, das cI857 temperaturempfindliche Repressorgen, ein Tetracyclinresistenz-verleihendes Gen und DNA Sequenzen umfaßt, die Vektorreplikationsfunktionen kodieren. Für eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von pOW392 siehe Beispiel 2. Der von Lambda PL stammende Promotor von Plasmid pCZR111 ist zur Expressionssteuerung des Racemasegens positioniert. Bei niedrigen Temperaturen von etwa 30ºC ist das auf Plasmid pCZR111 oder einm Derivat hiervon kodierte cI857 Protein aktiv und zur Reprimierung der Aktivität des Lambda PL Promotors fähig, aber wenn die Temperatur auf etwa 42ºC erhöht wird, wird das cI857 Protein inaktiviert und der Lambda PL Promotor steuert die Transkription von großen mRNA Mengen, die das interessierende Genprodukt kodieren. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pcZR111 ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt.

Das Plasmid pOW392 enthält dasselbe cI857 Gen, den Lambda PL Promotor und die Translationsaktivierungsequenz, wie Plasmid pCZR111, enthält aber des weiteren die kodierende Sequenz des Racemasegens von Plasmid pOW390 zur Expression ausgehend vom Lambda PL Promotor positioniert. Das 1,7 kb StyI Restriktionsfragment von Plasmid pOW390 enthält die gesamte kodierende Sequenz für die Racemase. Das Plasmid pOW392 wurde so konstruiert, daß der Lambda PL Promotor und die Translationsaktivierungsequenz von Plasmid pCZR111 zur Expressionssteuerung der Racemaseaktivität-kodierenden DNA positioniert sind. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pOW392 ist in Figur 3 der Zeichnungen dargestellt.

Bei Temperaturen von etwa 42ºC exprimiert E. coli K12 JM109/pOW392 eine Racemaseaktivität in hohem Ausmaß, das 5 % des Gesamtzellproteins erreicht. Rohe Zellextrakte von diesen E. coli K12 JM109/pOW392 Transformanden sind fähig, die Umwandlung von Isopenicillin N in Penicillin N zu katalysieren, während Zellextrakte von nicht-transformierten E. coli K12 JM109 Zellen diese Umwandlung nicht katalysieren können. Das Testverfahren und die Ergebnisse des Tests für die Umwandlungsreaktion sind in Beispiel 4 gezeigt.

Viele E. coli K12 Stämme enthalten eine endogene Penicillinaseaktivität, die wahrscheinlich durch den ampC Lokus kodiert ist. Aus diesem Grund ist es erwünscht, eine Teilreinigung des Racemasepolypeptids so zu erreichen, daß eine optimale Racemaseaktivität beobachtet wird. Für diese Zwecke kann eine Reinigung des Enzyms verwendet werden, um die endogene E. coli Penicillinaseaktivität von der gewünschten Racemaseaktivität zu trennen.

Das Plasmid pOW392 liefert ein effektives Mittel zur Bildung großer Mengen an Racemaseaktivität in E. coli. Da die Kultivierung von E. coli weniger komplex ist, als die Kultivierung von anderen Organismen, die natürlicherweise Racemase bilden, können E. coli/pOW392 Transformanden zur Herstellung von rekombinanter Racemase effizienter und ökonomischer verwendet werden, als nichtrekombinante oder "natürliche" Racemasebildner.

Die Racemase kann zur Herstellung von Penicillin N aus Isopenicillin N in einem zellfreien System verwendet werden, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Penicillin ist nicht nur ein brauchbares Antibiotikum, sondern kann auch als Ausgangsmaterial zur Herstellung von wichtigen Antibiotika, wie Cephalexin oder anderen Cephalosporinen verwendet werden (siehe US-A 4 307 192). Die vielleicht bedeutendste Verwendung der Racemase ist die Verwendung des Enyzms zur Umwandlung von anderen Penicillinen als Isopenicillin N in neue Antibiotikaderivate. Beispielsweise könnte man Cephamycin C als Substrat für die Racemase verwenden, was die Reaktion in die entgegengesetzte Richtung zu der in natürlichen Biosynthesewegen katalysiert, um ein L-Aminoadipoylderivat zu erzeugen, das dann als Substrat zur Bildung von 7-Aminocephalosporan säure dienen könnte, einem Ausgangsmaterial für semisynthetische Cephalosporine.

Zell freie Extrakte von Penicillin- und Cephalosporin-bildenden Organismen können zur Synthese von unnatürlichen (nicht in der Natur gebildeten) β-Lactamen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen E. coli Expressionsvektoren liefern ein günstiges und effizientes Verfahren zur Erlangung von Racemaseaktivität, die in vitro zur Modifizierung von Penicillinen unter Bildung neuer Antibiotika oder Antibiotikakernstrukturen verwendet werden kann.

Das Plasmid pOW392 ist zur Expressionssteuerung der Racemaseaktivität in E. coli nicht nur wegen der hohen Expressionsmengen, die erreicht werden, wenn das Plasmid verwendet wird, sondern auch aufgrund des auf dem Plasmid vorhandenen Selektionsmarkers besonders bevorzugt. Viele rekombinante DNA Vektoren kodieren eine β-Lactamase, so daß die den Vektor enthaltenden Zellen in Gegenwart von bestimmten β-Lactamantibiotika, wie Ampicillin, wachsen können. Falls man jedoch einen zellfreien Extrakt zu Konstruktionszwecken von β-Lactamen verwenden will, will man nicht, daß der Extrakt eine β-Lactamaseaktivität enthält. Daher kodiert das Plasmid pOW392 keine β-Lactamase als Selektionsmarker, sondern verwendet ein Tetracyclinresistenz verleihendes Gen, das ein Protein kodiert, welches nicht mit β-Lactamen reagiert.

Die erfindungsgemäßen Racemaseexpressionsvektoren sind jedoch nicht auf einen bestimmten Selektionsmarker beschränkt. Der Fachmann erkennt, daß viele Selektionsmarker zur Verwendung auf Racemaseexpressionsvektoren geeignet sind. Solche Selektionsmarker beinhalten beispielsweise Gene, die Kanamycinresistenz verleihen, Gene, die Chloramphenicolresistenz verleihen, oder andere Antibiotikumresistenz verleihenden Gene.

Die Suche nach unnatürlichen Penicillinen, die als Substrat für die Racemase dienen, kann durch eine Suche nach mutierten Racemaseenzymen vervollständigt werden, die andere Penicilline als Substrate annehmen. Die vorliegende Erfindung liefert ein Ausgangsmaterial für eine solche Suche nach einer mutierten Racemase und umfaßt DNA Verbindungen, die durch Mutagenese der für Racemase kodierenden Sequenz abgeleitet sind. E. coli ist ein bevorzugter Wirt für Mutationsklonierungsexperimente und die erfindungsgemäßen E. coli Expressionsvektoren können leicht durch in der Technik bekannte Verfahren mutiert werden, wie beispielsweise durch Behandlung mit Strahlung (Röntgen oder UV) oder chemischen Mutagenen (wie Ethylmethansulfonat, Nitrosoguanidin oder Methylmethansulfonat) oder ortsspezifische Mutagenese, um mutierte Enzyme zu erhalten, die unnatürliche Penicilline als Substrate erkennen.

Der Fachmann erkennt, daß es einem die vorliegende Erfindung erlaubt, die Codons für das Racemasegen nach Belieben zu verändern. Mit der gegebenen DNA Sequenz für das Racemasegen werden dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet, um mutierte Racemaseenzyme herzustellen, die sich vom natürlichen Racemaseenzym an jeder Position der Aminosäurereste unterscheiden. Solche mutierten Enzyme würden durch die mutierten für Racemase kodierenden Sequenzen kodiert werden, einschließlich Sequenzen, in denen Aminosäurecodons bezüglich der natürlichen für Racemase kodierenden Sequenz deletiert oder inseriert wurden. Solche mutierten Enzyme liegen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, da man sogar bei absolut unmöglicher Vorhersage, ob eine gegebene Mutation die Aktivität der kodierten Racemase zerstören wird, nur die mutierte Sequenz exprimieren muß, um die Wirkung auf die Racemaseaktivität zu überprüfen.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die hierin beispielhaft dargestellten bestimmten Vektoren beschränkt. Stattdessen umfaßt die vorliegende Erfindung DNA Verbindungen, die die Racemaseaktivität von Streptomyces clavuligerus kodieren. Die DNA Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die die Expression der Racemaseaktivität in jeder Wirtszelle steuern, in der der Expressionsvektor repliziert oder integriert und in der der Promotor und die Translationsaktivierungssequenz funktionsfähig sind.

Daher umfaßt die vorliegende Erfindung jedes E. coli Expressionsplasmid oder jeden E. coli Expressionsvektor, welche die Expression der Racemaseaktivität in E. coli steuern. So umfaßt die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren, die die Expression der Racemaseaktivität steuern und ein in E. coli funktionsfähiges Replikon verwenden, wie beispielsweise ein Replikon von Plasmiden, wie pBR322, pACYC184, F, ColV-K94, R1, R6-5 oder R100. Die vorliegende Erfindung ist nicht nur auf Plasmidvektoren beschränkt, da die vorliegende Erfindung auch Expressionsvektoren umfaßt, die Racemaseaktivität exprimieren und Integration oder virale Replikation verwenden, die für die Replikation und Erhaltung in der Zelle sorgen.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf bestimmte Promotoren und Translationsaktivierungssequenzen zur Expressionssteuerung der für Racemaseaktivität kodierenden DNA beschränkt. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung jedes Promotors und jeder Translationsaktivierungssequenz, die in E. coli funktioniert und zur Expression der Racemaseaktivität in E. coli verwendet wird.

Viele in E. coli funktionsfähige Promotoren und Translationsaktivierungssequenzen sind bekannt und zur Expressionssteuerung der Racemaseaktivität in E. coli geeignet. Solche Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen beinhalten unter anderem die Promotoren und Translationsaktivierungssequenzen von lpp, lac, trp, tac, Lambda PL und Lambda PR.

Zusätzlich können Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen von anderen Organismen mit den vorliegenden für Racemaseaktivität kodierenden DNA Verbindungen unter Bildung von Expressionsvektoren ligiert werden, die die Expression der Isopenicillin-N-Epimeraseaktivität in Wirtszellen steuern, in denen die Aktivierungssequenzen funktionieren. Obwohl E. coli der am besten zur Racemaseproduktion und anschließende Reinigung für die in vitro Verwendung geeignete Wirt ist, sind Vektoren, die die Expression der Isopenicillin-N-Epimeraseaktivität in anderen Wirtszellen als E. coli steuern, ebenfalls brauchbar, insbesondere zum Zweck der Erhöhung der Antibiotikum-bildenden Fähigkeit und Effizienz eines gegebenen Mikroorgansimus.

Eine Vielzahl an Organismen bilden β-Lactamantibiotika. Die folgende Tabelle zeigt eine nicht vollständige Liste von β-Lactamantibiotika-bildenden Organismen.

Tabelle I β-Lactamantibiotika-bildende Organismen
Organismus Antibiotikum Agrobacterium Arachnomyces minimus Anixiopsis peruviana Cephalosporium acremonium purpurascens polyaleurum chrysogenum curtipes Chromobacterium Emericellopsis terricola minima synnematicola glabra mirabilis salmosynnemata Flavobacterium Gluconobacter Nocardia lactamadurans uniformis Paecilomyces carneus persicinus Penicillium chrysogenum Serratia Spiroidium fuscum verschiedene β-Lactame Penicilline und Cephalosporine Cephamycin C Nocardicin verschiedene Penicilline und andere β-Lactame
Streptomyces antibioticus argenteolus cattleya chartreusis cinnamonensis clavuligerus fimbriatus flavovirens flavus fulvoviridis griseus halstedi heteromorphus hygroscopicus lipmanii olivaceus panayensis pluracidomyceticus rochei sioyaensis sp. OA-6129 sp. KC-6643 tokunomensis viridochromogenes wadayamensis Clavulansäure Asparenomycin A, MM4550 und MM13902 Thienamycin SF 1623 und Cephamycin A und B PA-32413-I, Cephamycin C, A16886A, Penicilline, Cephalosporine, Clavulansäure und andere Clavame C2081X Deacetoxycephalosporin C 7-Methoxycephalosporin C, A16884 Epithienamycin F Pluracidomycin A OA-6129A Carpetimycin A Asparenomycin A WS-3442-D

Einige der vorangehenden β-Lactamantibiotikum-bildenden Organismen werden in der pharmazeutischen Industrie zum Zweck der Antibiotikumproduktion verwendet. Die Antibiotikum-bildende Fähigkeit dieser Organismen kann erhöht werden und durch Erhöhung der intrazellulären Konzentration der Antibiotikumbiosyntheseenzyme während der Fermentation effizienter gemacht werden. Die erfindungsgemäßen für Racemaseaktivität kodierenden DNA Verbindungen können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die bei einer Transformation in eine geeignete Wirtszelle die intrazelluläre Konzentration der Racemaseaktivität der transformierten Wirtszelle erhöhen und hierbei die Antibiotikum-bildende Fähigkeit und Effizienz dieser Zelle erhöhen, vorausgesetzt, daß die Wirtszelle ein β-Lactamantibiotikum über eine Zwischenreaktion bildet, die eine Racemaseaktivität beinhaltet.

Ein Vektor, der die intrazelluläre Konzentration an Racemaseaktivität einer gegebenen Wirtszelle erhöht, in die der Vektor transformiert wurde, benötigt die folgenden Elemente: 1) eine erfindungsgemäße für Racemaseaktivität kodierende DNA Verbindung und 2) einen Promotor und eine Translationsaktivierungssequenz, die nicht nur in der zu transformierenden Wirtszelle funktionieren, sondern auch in der richtigen Orientierung und Stellung zur Expressionssteuerung der für Racemaseaktivität kodierenden DNA positioniert sind. Natürlich können nur dann stabile Transformanden erhalten werden, wenn der Vektor entweder als extrachromosomales Element oder integriert in die genomische DNA in der Wirtszelle repliziert. Daher könnte ein bevorzugter Vektor Sequenzen enthalten, die spezifisch die Replikation oder Integration des Vektors in der Wirtszelle steuern. Das Vorkommen von solchen spezifischen Replikations- oder Integrationssequenzen ist nicht unbedingt erforderlich, da eine unspezifische Integration auftreten kann, wenn die DNA in eine Wirtszelle eingeführt wird. Ein Racemaseexpressionsvektor könnte auch ein Antibiotikumresistenz verleihendes Gen oder ein anderes Element enthalten, das ein Mittel zur Selektion auf Wirtszellen liefert, die den Vektor enthalten, solche Selektionselemente sind aber weder notwendig noch erwünscht, wenn der Vektor in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert.

Durch die Bereitstellung der kodierenden Sequenz des Racemasegens von Streptomyces clavuligerus liefert die vorliegende Erfindung Racemaseexpressionsvektoren für jeden Oragnismus, der für eine Transformation zugänglich ist. Die oben beschriebenen E. coli Racemaseexpressionsvektoren stellen die große Vielzahl an erfindungsgemäßen Expressionsvektoren dar. Jedoch sind viele der erfindungsgemäß bevorzugten Vektoren entworfen worden, um die Expression der Racemase in einer ein β-Lactamantibiotikum bildenden Zelle zu steuern (einschließlich Penicilline und Cephalosporine).

Die erfindungsgemäßen Penicillium Vektoren sind für die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Vektoren beispielsgemäß, die zur Erhöhung der Antibiotikumsausbeute von einer solchen β-Lactamantibiotikum-bildenden Zelle oder zur Veränderung des normalerweise von der Zelle gebildeten Antibiotikums verwendet werden können. Ein solcher beispielsgemäßer Vektor, als Plasmid pPSJ78 bezeichnet, enthält den Promotor und die Translationsaktivierungssequenz des Isopenicillin-N-Synthetasegens (IPNS) von Penicillium zur Expressionssteuerung der erfindungsgemäßen für Racemase kodierenden Sequenz positioniert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPSJ78 ist in Figur 5 der Zeichnungen angegeben.

Das Konstruktionsprotokoll für Plasmid pPSJ78 und einer Vielzahl an brauchbaren Zwischenprodukten ist in Beispiel 4 beschrieben. Der erste Schritt bei der Konstruktion von pPSJ78 ist der Verdau von Plasmid pOW392 mit dem Restriktionsenzym EcoRI, das das Plasmid einmal schneidet. Die entstehende lineare DNA wird dann partiell mit dem Restriktionsenzym NcoI so verdaut, daß das 500 bp EcoRI-NcoI Fragment, das den natürlichen Promotor und die natürliche Translationsaktivierungssequenz von Streptomyces clavuligerus enthält, entfernt wird. An dessen Stelle wird das 925 bp EcoRI-Ncol Fragment von Plasmid pLC2 inseriert (erhältlich von der American Type Culture Collection als ATCC 53334, Hinterlegungsdatum 20. November 1985), das den Promotor und die Translationsaktivierungssequenz der Isopenicillin-N-Synthetase von Penicillium chrysogenum enthält. Das entstehende Plasmid wird ppSJ77 genannt (Figur 7) . Der letzte Schritt bei der Konstruktion von Plasmid pPSJ78 ist die Insertion eines 5,65 kb EcoRI Fragments, das das Aspergillus nidulans Acetamidasegen von Plasmid pPS51 enthält, in das EcoRI-verdaute pPSJ77. Das Acetamidasegen funktioniert als Selektionsmarker in Penicillium.

Die Racemaseexpressionsvektoren, die das Acetamidasegen enthalten, sind als Vektoren zur Insertion von Genen in Penicillium chrysogenum brauchbar, da kein spezieller Empfängerstamm, wie ein Auxotropher, aufgrund der natürlichen Unfähigkeit von P. chrysogenum auf Acetamid als einzige Stickstoffquelle zu wachsen, konstruiert werden muß. Transformationssysteme, die auf Komplementation von auxotrophen Markern durch ein Gen auf dem transformierenden Plasmid basieren, zeigen diesen Vorteil nicht. Häufig sind pleiotrope Mutationen mit der Einführung eines auxotrophen Markers in einen P. chrysogenum Stamm assoziiert, der für die Penicillinproduktion hoch entwickelt wurde. Solche Mutationen führen gewöhnlich zu einer geringeren Penicillinproduktion (MacDonald et al., 1963, J. Gen. Microbiol. 33: 365-374).

Die oben und in den Beispielen beschriebenen Vektoren sind vor allem für die große Vielzahl von Racemaseexpressionsvektoren beispielsgemäß, die durch die Erfindung geliefert werden. Die EP-A 0 281 391, offengelegt am 7. September 1988, beschreibt die 5' und 3' regulatorischen Signale des Expandase-Hydrolase-Gens aus Cephalosporium acremonium. Diese Signale können mit der erfindungsgemäßen für Racemase kodierenden Sequenz unter Bildung von erfindungsgemäßen Racemaseexpressionsvektoren kombiniert werden, die insbesondere zur Verwendung in Cephalosporium brauchbar sind. Die EP-A 0 200 425 vom 10. Dezember 1986 beschreibt Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen des IPNS Gens von Cephalosporium acremonium, die mit der erfindungsgemäßen für Racemase kodierenden Sequenz von Streptomyces clavuligerus unter Bildung eines rekombinanten Racemasegens fusioniert werden können, das die Expression (wenn es in einen Expressionsvektor eingebaut wird und der Vektor in Cephalosporium eingeführt wird) der für Racemase kodierenden Sequenz von S. calvuligerus in Cephalosporium steuert. Die erfindungsgemäßen Racemaseexpressionsvektoren sind für die Erhöhung der intrazellulären Konzentration der Racemaseaktivität in jeder Zelle brauchbar, insbesondere von β-Lactamantibiotikum-bildenden Zellen. Das Plasmid pOW390 umfaßt die kodierende Sequenz des Racemasegens von Streptomyces clavuligerus, so daß das Plasmid pOW390 zur Konstruktion von Vektoren zur Kopiezahlerhöhung des Racemasegens und daher zur Erhöhung der intrazellulären Konzentration des Enzyms verwendet werden kann. Da die erfindungsgemäße für Racemase kodierende Sequenz aus einer Streptomvces Wirtszelle isoliert wurde, ist die für Racemase kodierende Sequenz besonders gut für die Verwendung in Expressionsvektoren geeignet, die zur Steuerung einer Expression der Racemaseaktivität in hohem Ausmaß in Streptomyces Wirtszellen entworfen wurden. Die Literatur ist voll mit Techniken zur Konstruktion von Streptomyces Expressionsvektoren und zur Transformation von Streptomvces Wirtszellen. Siehe beispielsweise Garcia-Dominguez et al., 1987, Applied and Environmental Microbiology 53 (6): 1376-1381. Die erfindungsgemäße für Racemase kodierende Sequenz kann leicht in einen Expressionsvektor eingebaut werden, der einen Promotor und ein Replikon von Streptomyces enthält. Für eine solche Verwendung ist eine Vielzahl an bekannten Promotoren und Replikons von Streptomyces erhältlich. Die Tabelle II ist eine veranschaulichende aber keine vollständige Liste von Streptomyces Plasmiden, aus denen Streptomyces Replikons erhalten werden können. Der Fachmann erkennt, daß so lange die Replikationsfunktion nicht zerstört wird, die gesamten in der Tabelle aufgeführten Plasmide oder Teile davon zur Konstruktion von Vektoren verwendet werden können, die das erfindungsgemäße Racemasegen enthalten. Der Plasmid- enthaltende Wirt und die Hinterlegungsnummer sind ebenfalls in der Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II Streptoymces Plasmide
Hinterlegungsnummer Plasmid Wirt Streptomyces coelicolor Streptomyces ambofaciens Streptomyces espinosis Streptomyces lividans Streptomyces virginiae Streptomyces granuloruber

¹ National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Post Office Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB98DG, Scotland, United Kingdom.

²American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852.

Die erfindungsgemäße für Racemase kodierende Sequenz von Streptomyces clavuligerus kann auch unter die Kontrolle der Transkriptions- und Translationsaktivierungssequenzen gestellt werden, die von anderen Streptomyces Stämmen stammen, wie auch von Penicillium, Cephalosporium oder anderen Wirtszellen, um ein rekombinantes Racemasegen zu konstruieren, das für den gegebenen Organismus verwendet werden kann.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, sollen ihren Schutzumfang aber nicht beschränken.

Beispiel 1 A. Kultivierung von E. coli K12 RR1ΔM15/pOW390

Lyophilisierte E. coli K12 RR1ΔM15/pOW390 können von den Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, IL 61604 unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18431 erhalten werden (Hinterlegungsdatum: 15. November 1988) und direkt als "Kultur" im anschließend beschriebenen Verfahren verwendet werden.

Ein Liter TY Medium (8g Trypton, 5 g NaCl und 5 g Hefeextrakt pro Liter), das 100 ug/ml enthält, wird mit einer Kultur von E. coli K12 RR1ΔM15/pOW390 beimpft und unter Belüftung bei 37ºC über Nacht (15-18 Stunden) inkubiert. Die entstehende Kultur wird als Quelle für Plasmid pOW390 verwendet

B. Isolierung von Plasmid pOW390

Die in Beipsiel 1A hergestellte Kultur wird bei 5 200 U/min für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der entstehende Überstand wird verworfen. Das Zellpellet wird in 28 ml einer Lösung aus 25 % Saccharose und 50 mM EDTA resuspendiert. Etwa 1 ml einer Lösung aus 20 mg/ml Lysozym in 50 % Glycerin und 0,25 M Tris-HCl pH = 8,0 und etwa 1,5 ml 0,5 M EDTA pH = 8,0 werden zugegeben und mit der Zellsuspension vermischt. Das entstehende Gemisch wird für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Drei ml Lyselösung (hergestellt durch Mischen von 3 ml 10 % Triton X-100, 75 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 7 ml Wasser) werden zu den Lysozymbehandelten Zellen unter sanftem Mischen gegeben. Die entstehende Lösung wird für weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert.

Der Zelldebris wird durch Zentrifugation bei 17 000 U/min für etwa 45 Minuten bei 4ºC entfernt. Etwa 28,6 g CsCl und 1 ml einer 5 mg/ml Ethidiumbromidlösung werden zu den 30 ml Überstand gegeben. Dann wird das Volumen mit Wasser auf 40 ml eingestellt und die Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen dekantiert. Das Röhrchen wird zugeschmolzen und die Lösung wird bei 49 500 U/min für 18 Stunden zentrifugiert. Die entstehende Plasmidbande, durch ultraviolettes Licht sichtbargemacht, wird isoliert, mit Cscl-gesättigtem Isopropanol unter Entfernung des Ethidiumbromids extrahiert und gegen dreimal gewechselten 20 Volumina TE Puffer (10 mM Tris-HCl pH = 7,5 und 1 mM EDTA) dialysiert. Das Dialysat wird gesammelt, dann werden zwei Volumina Ethanol und 0,05 Volumina 3 M Natriumacetatlösung zugegeben. Das Ethanolgemisch wird auf -20ºC abgekühlt und die Plasmid DNA wird durch zentrifugation bei 10 000 U/min für 30 Minuten bei -10ºC pelletiert. Das entstehende Pellet wird in 1 ml TE Puffer resuspendiert und dann mit einem gleichen Volumen eines Phenol : Chloroform Gemisches (1:1, V/V) extrahiert. Die DNA in der wäßrigen Phase wird durch die Zugabe von 0,1 Volumina 3 M NaOAc und 2 Volumina Ethanol, gefolgt von einer Inkubation bei -20ºC für 30 Minuten und einer zentrifugation bei 15 000 U/min für 20 Minuten gewonnen. Das entstehende DNA Pellet wird zuerst mit 70 % Ethanol und dann mit 100 % Ethanol gewaschen und dann getrocknet.

Die durch dieses Verfahren erhaltenen 1,5 mg an Plasmid pOW390 DNA werden in 1,5 ml 0,1fachem TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pOW390 ist in Figur 1 der Zeichnungen dargestellt.

Beispiel 2 Konstruktion von Plasmid pOW392 A. Konstruktion von Plasmid mOW390

Es können unter Verwendung von unterschiedlichen Verfahren und Gensequenzquellen identische Plasmidkonstrukte erzielt werden. Das Plasmid mOW390 wird konstruiert durch Ligation des 0,9 kb StyI-BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pOW390, das wie später unter B. beschrieben hergestellt wird, mit dem HincII-BamHI- verdauten M13 Vektor in der replikativen Form (RF), der wie später unter C. beschrieben hergestellt wird. Das 0,9 kb StyI-BamHI Fragment enthält einen großen Teil des Racemasegens, einschließlich des 5'-Endes aber nicht des 3'-Endes. Das StyI Ende wird "aufgefüllt", um es stumpfendig zu machen, wobei das Ende für die Ligation mit dem stumpfendigen HincII-Ende passend gemacht wird. Der Plasmid pOW390 Klon leitet sich von Cosmid pOW379 ab, das aus einer genomischen Cosmidbank von Streptomyces clavuligerus stammt. Das Cosmid pOW379 wurde durch Hybridisierung mittels einer "hypothetischen" DNA Sonde identifiziert, die auf der Grundlage der aminoterminalen Amionosäuresequenz der gereinigten S. clavuligerus Racemase und der Codonverwendung dieser Art entworfen wurde. Der gewünschte M13 Phagenklon kann mittels der "hypothetischen" Sonde in einem Plaquehybridisierungsverfahren oder durch Restriktionsanalyse identifiziert werden. Aufgrund der vorliegenden Erfindung kann jedoch die Konstruktion von mOW390 stark vereinfacht werden, da vor allem das Plasmid pOW390 als Quelle für das S. clavuligerus Racemasegen verwendet werden kann. Das von M13 stammende Plasmid mOW390 ist ein brauchbares Zwischenprodukt bei der ortspezifischen Mutagenese, die zur Schaffung einer NcoI Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende der kodierenden Sequenz der S. clavuligerus Racemase ausgeführt wird.

B. Isolierung des 0,9 kb BamHI-StyI Restriktionsfragments von Plasmid pOW390

Etwa 25 ug der wie in Beispiel 1B hergestellten Plasmid pOW390 DNA werden in 25 ul 0,lfach TE Puffer zu 40 ul 10fach StyI Puffer (1,0 M Nacl, 500 mM Tris-Hcl pH = 8,0 und 100 mM MgCl&sub2;), 335 ul Glas-destilliertem Wasser und 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym StyI gegeben und vermischt. Falls nichts anderes angegeben ist, werden die Restriktionsenzyme von New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverley, MA 01915 bezogen. Die Einheitendefinition hierin entspricht der speziellen Einheitendefinition des Herstellers. Die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert. Die StyI Enden werden durch das Verfahren von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seiten 113-114 stumpfendig gemacht ("aufgefüllt"). Die Reaktion wird dann mit Phenol und Chloroform extrahiert und die StyI-verdaute Plasmid pOW390 DNA wird mit 0,3 M NaOAc und Ethanol gefällt und dann in 45 ul 1fach BamHI Puffer (100 mM Nacl, 10 mM Tris-HCl PH = 7,5, 10 mM MgCl&sub2;) resuspendiert. Fünf ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BamHI werden zugegeben und das Gemisch wird bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird dann mit Phenol und Chloroform extrahiert, und das BamHI-StyI (stumpfendig)-verdaute Plasmid pOW390 wird mit 0,3 M NaOAc und Ethanol gefällt und dann in 9 ul H&sub2;O resuspendiert.Etwa 1 ul Auftragspuffer (25 % V/V Glycerin, 0,05 % G/V Bromphenolblau und 0,05 % Xylencyanol) wird zur DNA Lösung gegeben, die dann auf einem 1 %igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen wird, bis das gewünschte 0,9 kb BamHI-StyI Restriktionsfragment deutlich von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist.

Die DNA wird nach der Elektrophorese durch Färben des Gels in einer verdünnten Ethidiumbromidlösung (0,5 ug/ml) und Aussetzen des gefärbten Gels gegenüber langwelligem UV-Licht sichtbargemacht. Nach der Lokalisierung der Fragmente macht man einen kleinen Schnitt in das Gel vor dem 0,9 kb Fragment und gibt ein Stück Schleicher und Schuell DEAE Membran (Keene, NH 03431) in den Schnitt. Bei weiterer Elektrophorese bindet die DNA nicht-kovalent an die DEAE Membran.

Nachdem das gewünschte Fragment an die DEAE Membran gebunden ist, wird die Membran entfernt und mit Niedrigsalzpuffer (100 mM Nacl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris-Hcl pH = 8,0) gewaschen. Als nächstes wird die Membran in ein kleines Röhrchen gesteckt, in Hochsalzpuffer (1 M Nacl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris-Hcl pH = 8) getaucht und dann bei 65ºC für 10 Minuten inkubiert, um die DNA vom DEAE Papier zu entfernen. Nach der 65ºC Inkubation wird der Inkubationspuffer gesammelt, und die Membran wird mit Hochsalzpuffer gewaschen. Die Waschlösung wird mit dem Inkubationspuffer vor dem Gewinnen der gewünschten Fragmente vereinigt.

Das Volumen der Hochsalz-DNA-Lösung wird so eingestellt, daß die NaCl Konzentration 0,25 M beträgt und dann werden drei Volumina kaltes, absolutes Ethanol zu der Lösung gegeben. Die entstehende Lösung wird gemischt und für 10-20 Minuten auf Eis gestellt. Die Lösung wird dann bei 15 000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert. Nach einer weiteren Fällung zur Entfernung des restlichen Salzes wird das DNA Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet, in 20 ul TE Puffer resupendiert und enthält das gewünschte Restriktionsfragment. Etwa 0,2 ug des 0,9 kb Fragments werden erhalten.

C. Herstellung der BamHI-HincII-verdauten M13mp18 RF Vektor-DNA und Konstruktion des Plasmids mOW390

Etwa 2,5 ug M13mpl8 RF DNA (erhältlich von New England Biolabs (NEB)) werden in 100 ul BamHI Puffer mit 1 ul ( 20 Einheiten) Restriktionsenzym BamHI für 90 Minuten bei 37ºC verdaut. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol:Chloroform extrahiert und die DNA in der wäßrigen Phase wird durch Ethanolfällung konzentriert.

Der BamHI-verdaute M13mp18 wird in 100 ul HincII Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 7,4, 7 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT) mit 1 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym HincII für 90 Minuten bei 37ºC resuspendiert. Die Reaktion wird wie oben extrahiert und gefällt und in 20 ul 0,1fachem TE Puffer resuspendiert und enthält 2 ug des gewünschten BamHI-HincII-verdauten Vektors. Das andere BamHI-HincII Fragment ist nur 10 bp lang und wird nicht gefällt. Es stört die Ligation nicht.

Zwei ul des 0,9 kb BamHI-StyI Restriktionsfragments von Plasmid pOW390 vom obigen Abschnitt B. und 1 ul des BamHI-HincII- verdauten Vektors M13mp18 werden in einer 20 ul umfassenden Reaktion ligiert, die die DNA Fragmente, 2 ul 10fach Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 und 100 mM MgCl&sub2;), 2 ul 5 mM ATP, 1 ul 6 ug/ul RSA, 12 ul Glas-destilliertes Wasser und 1 ul (1 Weiss-Einheit) T4 DNA Ligase (NEB) enthält. Die "aufgefüllten" StyI Enden sind mit den stumpfen HincII Enden ligierbar. Die Reaktion wird für 18 Stunden bei 15ºC inkubiert. Die ligierte DNA enthält das gewünschte Plasmid mOW390 zusammen mit anderen Ligationsprodukten.

Es werden kompetente E. coli Kl2 JM109 ("Epicurean ColiR") von Stratagene (3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121) bezogen und mit einem das Plasmid mOW390 enthaltenden Ligationsreaktionsgemisch im wesentlichen gemäß den Anweisungen des Herstellers transformiert, außer daß die DNA in einem Volumen von 20 ul vorliegt und keine Verdünnung in Medium oder eine Expressionszeit notwendig ist. Nach der Transformation werden die zellen in 1, 10, 20, 40 und 50 ul Proben in sterile 13 x 100 mm Glasröhrchen verteilt, die 0,25 ml/Röhrchen E. coli K12 JM109 in der logarithmischen Wachstumsphase enthalten. Zu diesen Röhrchen werden 3 ml Überschichtungsagar gegeben (L-Medium mit 0,8 % Agar, das bei 45ºC geschmolzen gehalten wird). Das Zellen-Überschichtungsagar-Gemisch wird dann auf L-Agarplatten ausplattiert, die 40 ug/ml 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) und 0,1 M Isopropylthio-β-galactosid (IPTG) enthalten, und die Platten werden bei 37ºC über Nacht inkubiert. (Für ausführlichere Beschreibungen und Erklärungen der M13 Verfahren siehe M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual, Betheda Research Laboratories (BRL), Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD 20877.) Die Transformanden werden durch Insertionsinaktivierung der β-Galactosidaseaktivität (farbloser Plaquephänotyp) und Restriktionsenzymanalyse der replikativen DNA Form (RF) identifiziert. Für Screeningzwecke werden klare Plaques mit einer Pasteurpipette aus der Plattenüberschichtung ausgestochen und in 3 ml pro Plaque einer E. coli K12 JM109 Kultur in der frühen logarithmischen Wachstumsphase überführt. Die Kulturen werden 6 bis 18 Stunden bei 37ºC mit Belüftung inkubiert.

Nach dieser Inkubation werden 1,5 ml jeder Kultur in getrennten 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäßen pelletiert. Die Überstände werden in frische Röhrchen dekantiert und bei 4ºC gelagert, um als Quelle für das Phagenimpfgut zu dienen. Die replikative Form der DNA wird aus den Zellpellets im wesentlichen gemäß dem alkalischen Plasmidisolierungsverfahren von Birnboim und Doly, 1979, Nuc. Acid Resp 7(6): 1513-1523 mit folgenden Ausnahmen präpariert. Das Verfahren wird so erweitert, daß 1,5fache Volumina der Lösungen I, II und III verwendet werden und das klare Lysat einmal mit einem gleichen Volumen CHCl&sub3; extrahiert wird. Die DNA wird dann durch die Zugabe von 0,4 Volumina Isopropanol und einer Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten gefällt. Die DNA wird durch zentrifugation gewonnen und dann mit Ethanol aus 0,3 M NaOAc gefällt. Die aus einzelnen Plaques isolierte DNA wird auf das Vorkommen einer Insertion durch einen EcoRI-HindIII Restriktionsverdau analysiert. Die Orientierung des Fragments ist durch die kompatiblen Enden (BamHI-BamHI, "aufgefüllte" StyI-HincII) vorbestimmt. Durch dieses Verfahren werden E. coli K12 LJM109/mOW390 Zellen identifiziert und diese Zellen werden dann als Quelle für das Plasmid mOW390 zur ortsspezifischen Mutagenese wie im folgenden beschrieben verwendet.

D. Herstellung von einzelsträngiger Plasmid mOW390 DNA und ortsspezifische Mutagenese zur Konstruktion von Plasmid mOW391

Eine 10 ml Kultur von E. coli K12 JN109 wird in der frühen logarithmischen Wachstumsphase mit 200 ul Phagenstammlösung (hergestellt in Beispiel 2C) beimpft und 18 Stunden bei 37ºC mit Belüftung inkubiert. Die Kultur wird zentrifugiert und der entstehende Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wird erneut in ein frisches Röhrchen dekantiert. Ein ml einer Lösung aus 25 % Polyethylenglycol (Molekulargewicht etwa 3 350) in 3 M Nacl wird zum Überstand gegeben, der dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Das entstehende Gemisch wird für 30 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert. Das durch die Zentrifugation erhaltene Pellet enthält das einzelsträngige Plasmid mOW390 und wird in 400 ul TE Puffer resuspendiert. Die Lösung wird zuerst mit CHCl&sub3; und dann mit TE- gesättigtem Phenol extrahiert. Das Phenol läßt man mit der wäßrigen Phase für 15 Minuten in Kontakt. Die Lösung wird dann zweimal mit einem Gemisch aus TE-gesättigtem Phenol : CHCl&sub3; (1:1, V/V) und zweimal mit CHCl&sub3; alleine extrahiert. Die DNA wird dann aus 0,3 M NaOAc gefällt, durch Zentrifugation gewonnen und das entstehende Pellet wird in 100 ul 0,1fachem TE Puffer resuspendiert. Diese Lösung besteht aus 5 ug einzelsträngiger Plasmid mOW390 DNA.

E. Mutagenese

Die bei der Mutagenese (und den anschließenden Hybridisierungen zur Detektion der gewünschten Phagen) verwendeten einzelsträngigen DNA Fragmente werden mit Ausnahme des M13 Universalprimers (ein 15-mer), der von BRL bezogen wird, auf einem automatisierten DNA Synthesegerät synthetisiert. Die Mutagenesefragmente werden folgendermaßen bezeichnet: (1) RACEATG, eine 40 Nukleotide lange einzelsträngige DNA, die zur Racemase-kodierenden Sequenz im Plasmid mOW390 bis auf eine Base homolog ist, wobei die Fehlbasenpaarung (unterstrichen) eine NcoI Restriktionsschnittstelle bei etwa Position 1 der für Racemase kodierenden Sequenz, mit folgender DNA Sequenz bildet:

(2) RACE-17, eine 17 Nukleotide lange einzelsträngige DNA, die lediglich ein Unterabschnitt von RACEATG mit folgender Sequenz ist:

Die 5'-Enden von etwa 100 pmol von RACEATG werden in einem Reaktionsgemisch phosphoryliert, das enthält einzelsträngige DNA in einer Konzentration von 1 pmol/ul, 10 ul 10fach Ligasepuffer, 10 ul 0,1 mM Adenosintriphosphat (ATP), 10 ul 0,1 M DTT, 65 ul Glas-destilliertes Wasser und 1 ul (10 Richardson-Einheiten) der T4 Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, (BMB) 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250). Das Reaktionsgemisch wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert, wonach zusätzlich 1 ul Enzym zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird dann für weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und dann wird die Reaktion durch eine fünfminütige Inkubation auf 68ºC gestoppt. Die 5'-Enden von etwa 40 pmol M13 Universalprimer werden in einem analogen Reaktionsgemisch von 40 ul phosphoryliert, das dieselbe Enzymmenge enthält.

Die einzelsträngige Plasmid mOW390 DNA wird im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Adelman et al., 1983, DNA 2(3): 183-193 mutagenisiert, wie dies später beschrieben ist. Die Anelierungsreaktion wird ausgeführt durch Zugabe von 500 Nanogramm (in 15 ul 0,1 fachem TE Puffer) einzelsträngiger Plasmid mOW390 DNA zu 8 ul 10fach Anelierungspuffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl), 4 41 (4 pmol) phosphoryliertem RACEATG, 4 ul (4 pmol) phosphoryliertem M13 Universalsequenzierungsprimer und 50 ul Wasser und einer Inkubation des Gemisches bei 80ºC für 2 Minuten, dann bei 55ºC für 5 Minuten und schließlich bei Raumtemperatur für 5 Minuten.

Die Extensionsreaktion wird durch Zugabe von 120 ul des folgenden Gemisches zur Lösung anelierter DNA ausgeführt: 20 ul 10fach Klenow-Ligase-Puffer (100 mM Tris-Hcl pH = 7,5, 1 mM EDTA und 500 mM Nacl), 20 ul 0,1 M DTT, 20 ul einer Lösung von jeweils 6,25 mM dGTP, dATP, TTP und dCTP, 20 ul 5 mM ATP, 120 ul Wasser, 3 ul (3 Weisseinheiten, BMB) Ligase und 2,5 ul (12,5 Einheiten) Klenowenzym (BMB). Das Extensionsreaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde, dann bei 37ºC für 4 Stunden und schließlich bei 14ºC für 18 Stunden inkubiert.

Das Extensionsreaktionsgemisch wird einmal mit CHCl&sub3; extrahiert und die DNA wird mit Ethanol und NaOAc gefällt und durch Zentrifugation gewonnen. Das DNA Pellet wird in 400 ul 1fach S1 Puffer (0,3 M NaCl und 3 mM Zn(OAc)&sub2;) resuspendiert. Die Hälfte der DNA Lösung wird als Reserve bei -20ºC aufbewahrt, und die andere Hälfte wird in fünf 1,5 ml Röhrchen aliquotiert. Zu vier dieser Röhrchen wird 1 ul S1 Nuklease (BMB) gegeben, die auf 200 30- Minuteneinheiten pro ul verdünnt wurde. Die Reaktionen werden bei Raumtemperatur für jeweils 5, 10, 15 und 20 Minuten inkubiert. Die Reaktionen werden gestoppt, indem man zuerst 5-10 ug tRNA zum Reaktionsgemisch als Träger gibt und dann mit einem TE-gesättigtem Phenol-CHCl&sub3; Gemisch (1:1, V/V) extrahiert. Die nicht mit S1 behandelte Probe (Negativkontrolle) wird ebenfalls extrahiert. Die DNA in der wäßrigen Phase wird durch Ethanolfällung konzentriert und dürch Zentrifugation gewonnen. Die DNA Pellets werden jeweils in 20 ul Wasser resuspendiert.

Zehn ul von jeder dieser entstehenden S1-behandelten DNA Lösungen werden zur Transformation von E. coli K12 JM109 im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 2B beschriebenen Verfahren verwendet, außer daß die Platten weder X-Gal noch IPTG enthalten. Die gewünschten Transformanden werden durch Hybridisierung des radioaktiv markierten Oligonukleotids RACE-17 mit der Plasmid DNA identifiziert, die wie unten beschrieben auf Nitrocellulosefilter geblottet ist.

Nach der Plaquebildung werden die Platten bei 4ºC für 1 Stunde inkubiert, um die Agarüberschichtung aushärten zu lassen. Die Nitrocellulosefilter werden auf den Rasen von jeweils zwei Platten der negativ Kontrolle, der 10 Minuten mit S1 behandelten Reihe und der 20 Minuten mit S1 behandelten Reihe gelegt, die 50- 200 Plaques enthalten. Der Kontakt zwischen dem Filter und der Rasenoberfläche wird für 1 Minute aufrechterhalten, wonach die Nitrocellulosefilter mittels gesättigten 3 MM Chr Filterpapieren (Whatman LabSales, Inc. P.O. Box 1359, Hillsboro, Oregon 97123- 1359) mit 0,1 N NaOH-1,5 M Nacl für 5 Minuten und dann mit 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,0)-3 M Nacl für 5 Minuten behandelt werden. Die Nitrocellulosefilter werden luftgetrocknet und dann im Vakuum bei 80ºC für 30 Minuten eingebacken.

Die Nitrocellulosefilter werden für 5 Minuten bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 6fach SSC (20fach SSC ist 3 M Nacl und 0,3 M Natriumcitrat), 10fach Denhardt's Lösung (0,2 g Polyvinylpyrolidon, 0,2 g Rinderserumalbumin und 0,2 g Ficoll pro 100 ml Wasser), 0,1 % NaPPi, 0,1 % SDS und 10 ug/ml denaturierter chromosomaler E. coli DNA prähybridisiert. Die Filter werden dann in einer Lösung aus 6fach SSC, 10fach Denhardt's Lösung 0,1 % NaPPi und 1 pmol/5 ml ³²P-RACE-17 hybridisiert. Der ³²P-RACE-17 wird durch Phosphorylierung der 5'-Enden von 100 pmol RACE-17 im wesentlichen gemäß dem vorher in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt, außer daß 70 pmol gamma-³²P-ATP (New England Nuclear (NEN), 549 Albany Street, Boston, MA, 02118, Katalognummer NEG- 002A) anstatt nicht radioaktivem ATP verwendet werden. Nach der Hybridisierung werden die Filter zweimal für 5 Minuten pro Waschschritt im Überschuß mit 6fach SSC bei Raumtemperatur, dann bei 52ºC im Überschuß mit 6fach SSC für 20 Minuten pro Waschschritt gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und für 2 Stunden bei -70ºC mit einem Quanta IIIR Verstärkerschirm (DuPont, Instrument Produkts, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) autoradiographiert. Die gewünschten Mutanten, jene, die die zur Sequenz von RACE-17 komplementären Sequenzen enthalten, belichten den Film aufgrund der Bindung des radioaktiven Oligomers an die auf dem Filter gebundene Plasmid DNA. Die Identität einer korrekten Mutante, als Plasmid mOW391 bezeichnet, wird durch Restriktionsanalyse der RF DNA bestätigt, welche im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 2C beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.

F. Abschließende Konstruktion von Plasmid pOW392

Die RF DNA von Plasmid mOW391 enthält die für Racemase kodierende Sequenz auf dem NcoI-BamHI Restriktionsfragment, das zur Konstruktion des E. coli Expressionsplasmids pOW392 verwendet wurde.

Die DNA in der replikativen Form aus E. coli K12 JM 109, die mit Plasmid mOW391 infiziert sind, wird im wensentlichen gemäß dem in Beispiel 2C beschriebenen Verfahren isoliert. Etwa 10 ug der RF DNA der Plasmid mOW391 DNA werden mit den Restriktionsenzymen BamHI ( 10 Einheiten) und NcoI ( 10 Einheiten) in einer Reaktion verdaut, die die DNA in 1fachem ReactR 3 Puffer enthält (500 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 100 mM MgCl&sub2;, 1 M Nacl, Bethesda Research Laboratories, P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877). Nach einer Inkubation für 90 Minuten bei 37ºC wird das Reaktionsgemisch einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und das 0,9 kb BamHI-NcoI Fragment wird im wesentlichen gemäß Beispiel 2B isoliert.

Das Plasmid pCZR111 ist aus E. coli K12 JM109 von der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18249 erhältlich (Hinterlegungsdatum: 11. August 1987). Es kann im wesentlichen gemäß Beispiel 1 isoliert werden, außer daß 15 ug/ml Tetracyclin statt 100 ug/ml Ampicillin im Kulturmedium enthalten sind. Eine Restriktions- und Funktionskarte von pCZR111 ist in Figur 2 gezeigt.

Der Vektor wird durch Verdauen des Plasmids pCZR111 mit XbaI und BamHI erzeugt. Etwa 1 ul XbaI ( 10 Einheiten) wird zu 10 ul Plasmid pCZR111 ( 10 ug) und 5 ul 10fach XbaI Puffer (500 mM Tris-HCl pH = 8,0, 100 mM MgCl&sub2; und 500 mM NaCl) gegeben. Nach einer Inkubation bei 37ºC für 90 Minuten werden 0,5 ul 5 M Nacl und 1 ul BamHI ( 10 Einheiten) zugegeben und die Inkubation wird für weitere 90 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann einer Agarosegelektrophorese unterzogen und das 5,75 kb XbaI-BamHI Vektorfragment wird im wesentlichen gemäß Beispiel 2B isoliert.

Es kann ein als Zwischenstufe benötigtes Plamsid hergestellt werden, indem man das 0,9 kb BamHI-NcoI Fragment von mOW391, das 5,75 kb XbaI-BamHI Vektorfragment von pCZR111 und ein doppelsträngiges XbaI-NcoI Restriktionsfragment, das durch das Phosphotriesterverfahren synthetisiert wurde, unter Bildung des als zwischenstufe benötigten 6,7 kb Plasmids ligiert. Das doppelsträngige DNA Fragment hat die folgende Sequenz:

Das Ligationsgemisch wird im wesentlichen gemäß Beispiel 2C in E. coli K12 JM109 transformiert und die aus den Transformanden isolierte Plasmid DNA wird durch Restriktionsverdau analysiert, um das Vorkommen der korrekten Insertionen zu bestätigen.

Um den Expressionsvektor zu vervollständigen, wird ein 2 kb BamHI Fragment im wesentlichen gemäß dem Beispiel 2B aus Plasmid pOW390 isoliert. Dieses 2 kb BamHI Fragment enthält die 3' kodierende Region des Racemasegens. Der vervollständigte Vektor enthält daher die gesamte kodierende Region des Racemasegens.

Das 2 kb BamHI Fragment (2,5 ul, 0,5 ug) wird in den BamHI verdauten als Zwischenstufe benötigten Plasmidvektor im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 2C beschriebenen Verfahren unter Bildung des gewünschten Plasmids pOW392 ligiert. Eine Restriktions- und Funktionskarte ist in Figur 3 der Zeichnungen dargestellt.

Die das gewünschte Plasmid pOW392 enthaltende Ligationsreaktion wird in kompetente E. coli K12 RR1ΔM15 transformiert (NRRL B-15440, Hinterlegungsdatum: 27. Mai 1983). Teile des Transformationsgemisches werden auf L-Agarplatten ausplattiert, die Tetracyclin (15 ug/ml) enthalten. Die Platten werden bei 37ºC für 18 Stunden inkubiert. Die Tetracyclin-resistenten Transformanden werden weiter durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA zur Identifizierung der gewünschten Plasmid pOW392 Transformanden gescreent. Die Plasmid DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Birnboim und Doly aus 3 ml Kulturen isoliert, das oben für die Präparation der RF DNA aus Phagen M13-infizierten E. coli K12 JM109 Zellpellets beschrieben ist. Die Plasmid pOW392 DNA von einem Transformanden wird im wesentlichen gemäß dem in

Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Verwendung in anschließenden Konstruktionen präpariert. Das Plasmid wird dann in E. coli K12 LJM109 transformiert, die von Stratagene bezogen werden.

Beispiel 3 Test auf von E. coli gebildete Racemaseaktivität A. Kultivierung von E. coli K12 JM109/DOW392 zur Expression der Racemaseaktivität.

Ein E. coli K12 JM109/pOW392 Transformand wird bei 30ºC über Nacht in 500 ml L-Medium (enthält 15 ug/ml Tetracyclin) in einem Rundschüpttler angezogen Die Zellen werden durch die Zugabe von 100 ml der Übernachtkultur zu 900 ml 15 ug/ml Tetracyclin enthaltendem frischem Medium in einem 2,8 l Fernbachkolben 1:10 verdünnt und eine weitere Stunde bei 30ºC unter gleichen Bedingungen inkubiert. Die Temperatur des belüftenden Schüttlers wird dann auf 42ºC erhöht und die Inkubation für weitere 6,5 Stunden fortgesetzt. Der temperaturempfindliche cI857 Repressor des Lambda PL Promotors, der zur Expressionssteuerung der Racemase auf dem Plasmid pOW392 positioniert ist, wird bei 42ºC inaktiviert und erlaubt so die Expression der Racemase. Nach der Induktion werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und als bevorzugte Quelle der von E. coli gebildeten Racemaseaktivität verwendet.

B. Demonstration der Isopenicillin-N-Epimerase (Racemase) Aktivität in den E. coli K12 JM109/pOW392 Zellen, die bei 42ºC angezogen wurden

Fünf Gramm der induzierten, pelletierten E. coli werden mit 10 ml Aufschlußpuffer (10 mM Natriumpyrophosphat-HCl, pH = 8,0 in 5 M Harnstoff, 20 % Glycerin und 0,1 mM Dithiotreit (DTT)) gemischt. Falls die Zellmenge nach der Zentrifugation weniger als 5 Gramm beträgt, wird das Verhältnis der Zellen zu Puffer beibehalten.

Die Zellsuspension wird dann in einem Eis-Ethanolbad auf 2ºC abgekühlt und bei voller Leistung für 20 Sekunden ultrabeschallt. Das Abkühlen und Ultrabeschallung wird dreimal wiederholt.

Der Zelldebris wird durch Zentrifugation bei 47 000 x g für 20 Minuten bei 4ºC entfernt. Der Überstand wird dann durch Glaswolle filtriert, wobei das Filtrat das rohe Enzym ist.

Das Enzym katalysiert die Umwandlung von Isopenicillin N zu Penicillin N und umgekehrt, unter Bildung eines Gleichgewichtszustands zwischen den beiden Molekülen. Daher wird die Aktivität auf zwei Wegen gemessen, einmal mittels Isopenicillin N als Ausgangssubstrat und einmal mittels Penicillin N als Ausgangsmaterial. Das Gesamtprotein wird durch das Verfahren von Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265 (1951) gemessen. Der Zellextrakt wird in einem Endvolumen von 0,5 ml gemischt mit 1,4 mM Isopenicillin N oder Penicillin N, 0,2 mM Dithiotreit, 0,1 mM Pyridoxal-5'-phosphat (gemessen durch das Hydrazinverfahren (H. Wada und E. Snell, J. Biol. Chem. 236, 2089 (1961)) und 50 mM Pyrophosphat-HCl, pH = 8,3. Das Reaktionsgemisch wird dann bei 37ºC für 20 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch zehnminütiges Kochen gestoppt. Sie wird dann durch einen 0,45 um Filter filtriert.

Penicillin N und Isopenicillin N sind schwierig durch HPLC zu trennen. Die Verbindungen müssen mit o-Phthaldialdehyd gemäß dem Verfahren von D.W. Aswad, Anal. Biochem. 137, 405 (1984) und J. Usher, M. Lewis und D.W. Hughes, Anal. Biochem. 149, 105 (1985) derivatisiert werden. Zwanzig ul des Filtrats werden mit 5 ul der Derivatisierungslösung gemischt (4 mg o-Phthaldialdehyd (Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) gelöst in 300 ul Methanol, 250 ,41 0,4 M Natriumborat pH = 9,4, 390 ul H&sub2;O und 60 ul 1M N-Acetyl-L-cystein, auf pH 5-6 mit NaOH eingestellt). Die Reaktion läßt man 2 Minuten bei Raumtemperatur laufen, bevor man sie mit 200 ul 50 mM Natriumacetat, pH = 5,0 beendet. Fünfzig ul Teile werden mittels HPLC unter Verwendung einer Flußrate von 1 ml/min und einer Fluoreszenzmessung bei 360 nm analysiert. Wenn Isopenicillin N in die Gemische eingearbeitet wird, wandeln die Zellextrakte, die die Racemaseaktivität exprimieren, einen Teil des Isopenicillin N in Penicillin N um. Genauso wird Penicillin N in Gegenwart der Zellextrakte in Isopenicillin N umgewandelt. Man beobachtet keine Umwandlung, wenn kein Zellextrakt zum Gemisch gegeben wird. Zusätzlich reagiert ein Antikörper gegen das gereinigte Racemaseenzym mit einer 50 000 Dalton Bande auf einem Western Blot. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß das klonierte Gen zu einem Protein führt, das Racemaseaktivität und dieselbe Größe aufweist, wie das gereinigte Racemaseenzym.

Beispiel 4 Konstruktion von Plasmid pPSJ78

Dieses Beispiel beschreibt ein Konstruktionsprotokoll für Plasmid pPSJ78, einem erfindungsgemäßen Racemaseexpressionsvektor, der den Promotor des IPNS Gens von Penicillium zur Expressionssteuerung der erfindungsgemäßen für Racemase kodierenden Sequenz positioniert enthält. Der Promotor des IPNS Gens von Penicillium kann aus dein Plasmid pLC2 isoliert werden, das von der American Type Culture collection (Rockville, MD 20852) unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53334 erhältlich ist (Hinterlegungsdatum: 20. November 1985). Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLC2 ist in Figur 6 der zeichnungen dargestellt.

A. Konstruktion des als Zwischenstufe benötigten Plasmids pPSJ77

Das Plasmid pOW392 (konstruiert wie in Beispiel 2) wird im wesentlichen gemäß Beispiel 1 isoliert, außer daß das Anzuchtmedium 15 ug/ml Tetracyclin statt 100 ug/ml Ampicillin enthält. Etwa 25 ug der Plasmid pOW392 DNA in 25 ul 0,1 fachem TE Puffer werden zu 10 ul 10fach ReactR 3 Puffer (BRL), 60 ul H&sub2;O und 5 ,41 ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym EcoRI gegeben und gemischt. Die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert. Etwa 10 ul ( 100 Einheiten) Restriktionsenzym NcoI werden dann zum Gemisch gegeben und die Reaktion wird bei 37ºC für 3 Minuten weiter inkubiert. Die Reaktion wird dann einmal mit Phenol, einmal mit Phenol-Chloroform (1:1 Phenol:Chloroform, Chloroform ist in Wirklichkeit 23:1 Chloroform : Isoamylalkohol) und einmal mit Chloroform extrahiert. Das EcoRI-verdaute partiell NcoI-verdaute Plasmid pOW392 wird mit 1/10 Volumen 2,5 M NaOAc (pH = 5,2) und 2 Volumina Ethanol gefällt. Das Gemisch wird für 20 Minuten auf -20ºC abgekühlt und dann in einer Eppendorfzentrifuge für 10 Minuten pelletiert. Die DNA wird in 18 ul H&sub2;O resuspendiert. Etwa 2 ul Auftragspuf fer (25 % V/V Glycerin, 0,05 % G/V Bromphenolblau und 0,05 % Xylencyanol) werden zur DNA Lösung gegeben, die dann auf einem 1 %igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen wird, bis das 7,9 kb EcoRI-Ncol Restriktionsfragment deutlich von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist.

Die 7,9 kb Bande wird im wesentlichen gemäß Beispiel 2B sichtbargemacht und isoliert.

Das Plasmid pLC2, erhältlich von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 53334 (Hinterlegungsdatum: 20. November 1985) wird im wesentlichen gemäß Beispiel I isoliert. Das Plasmid wird ebenfalls mit EcoRI und NcoI verdaut. Ein 925 bp EcoRI-NcoI Restriktionsfragment wird aus den entstehenden Produkten des Verdaus isoliert. Das 925 bp EcoRI-Ncol Fragment enthält den IPNS Promotor von Penicillium. Wenn dieses Fragment mit dem 7,9 kb EcoRI-NcoI Fragment von Plasmid pOW392 im wesentlichen gemäß Beispiel 2C ligiert wird, enthält das entstehende Plasmid pPSJ77 den Penicillium IPNS Promotor zur Expressionssteuerung des Racemasegens positioniert.

B. Konstruktion des als zwischenstufe benötigten Plasmids pPS5I

Etwa 15 ug von Plasmid pMLC12 DNA (NRRL B-18097 (Hinterlegungsdatum: 8. August 1986) und Figur 9) werden in 5 ul 10fach EcoRI Puffer und 40 ul Wasser gelöst. Das Plasmid kann gemäß Beispiel 1 isoliert werden, außer daß das Anzuchtmedium 25 ug/ml Chloamphenicol anstatt 100 ug/ml Ampicillin enthält. Etwa 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym EcoRI werden zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 3 Minuten zur Herstellung eines Partialverdaus inkubiert. Die Reaktion wird durch Extraktion mit gepuffertem Phenol beendet, wonach eine Extraktion mit Chloroform folgt. Das Plasmid pMLC12 enthält zwei EcoRI Restriktionsstellen, im E. coli lacZα Fragment und im Chloramphenicolresistenzgen (CAT). Der gewünschte Partialverdau der EcoRI Stelle soll im lacZα Fragment auftreten und nicht im CAT Gen. Dieser EcoRI Verdau bildet ein Gemisch von Plasmid pMLC12 DNA Molekülen: ungeschnitten, an der unerwünschten Stelle geschnitten, an der gewünschten Stelle geschnitten und an beiden Stellen geschnitten, was Fragmente bildet, die kleiner als die 2,7 kb Moleküle mit voller Länge sind. Die EcoRI-verdaute Plasmid pMLC12 DNA wird gefällt, durch Zentrifugation gewonnen, in 50 ul TE Puffer gelöst und auf ein 0,8 %iges präparatives Agarosegel aufgetragen. Die linearen Moleküle mit voller Länge (das heißt 2,7 kb) werden isoliert.

Die partiell EcoRI-verdaute Plasmid pMLC12 DNA wird in 5 ul 10fach SalI Puffer und 40 ul Wasser gelöst. Etwa 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym SalI werden zur EcoRI-linearisierten Plasmid pMLC12 DNA gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. Die SalI Einzelschnittstelle in Plasmid pMLC12 liegt 24 Basenpaare von der MRI Stelle im lacZα Fragment von Plasmid pMLC12 entfernt. Daher bildet der vollständige SalI Verdau der partiell EcoRI-verdauten Plasmid pMLC12 DNA vier DNA Fragmente: eines mit 2,7 kb, das gewünschte Molekül, eines mit einer Länge von 24 bp, eines mit 0,6 kb und eines mit 1,9 kb. Die DNA Moleküle werden nach der Größe auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt. Die linearen 2,7 kb Moleküle mit nahezu voller Länge werden isoliert.

Das Acetamidasegen von Aspergillus nidulans kann auf einem 5,0 kb EcoRI-Sall Restriktionsfragment von Plasmid p3SR2 isoliert werden (Figur 10 und NRRL B-18182, Hinterlegungsdatum: 26. Februar 1987). Etwa 10 ug von Plasmid p3SR2 werden in 5 ul 10fach EcoRI Puffer und 40 ul Wasser gelöst. Etwa 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym EcoRI werden zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch eine Extraktion mit gepuffertem Phenol beendet, der eine Extraktion mit Chloroform folgt. Die EcoRI-verdaute p3SR2 Plasmid DNA wird gefällt, durch Zentrifugation gewonnen und in 5 41 10fach SalI Puffer und 40 ul Wasser resuspendiert. Etwa 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym SalI werden zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. Die zwei bei diesen Verdaus erzeugten DNA Fragmente werden auf einem 0,8 %igen präparativen Agarosegel der Größe nach aufgetrennt. Ein 4,3 kb Fragment enthält pBR322 DNA und das andere 5,0 kb Fragment enthält das Acetamidasegen (amdS) von Aspergillus nidulans. Das amdS Gen funktioniert als Selektionsmarker in Penicillium und anderen Stämmen. Das Gen ermöglicht ein Wachstum auf Acetamid-enthaltenden Medien. Das 5,0 kb EcoRI-SalI Fragment wird isoliert. Etwa 3 4g des 5,0 kb EcoRI-SalI Fragments werden gewonnen und in 5 ul Wasser resuspendiert.

Ein ul der EcoRI-SalI verdauten Plasmid pMLC12 DNA wird zu etwa 4 ,41 des 5-0 kb EcoRI-SalI Restriktionsfragments von Plasmid p3SR2 zusammen mit 2 ul 10fach Ligasepuffer, 2 ul T4 DNA Ligase und 11 ul Wasser gegeben. Die entstehende Ligationsreaktion wird über Nacht bei 15ºC inkubiert. Die ligierte DNA enthält das Plasmid pPS51 und andere ähnliche Ligationsprodukte.

Dieses Ligationsgemisch wird zur Transformation von E. coli K12 C600 (ATCC 33524) verwendet. Teile des transformierten Zellgemisches werden auf L-Agarplatten ausplattiert, die 25 ug/ml Chloramphenicol enthalten. Die Platten werden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Kolonien, die ein Plasmid ohne Insertion enthalten, wie E. coli K12 C600/pMLC12, unterscheidet man von Kolonien, die ein Plasmid mit Insertion enthalten, wie E. coli K12 C600/pPS51 durch Restriktionsnanalyse. Es wird eine Kolonie identifiziert, die ein Plasmid mit Insertion enthält. Die Plasmid DNA von dieser Kolonie wird auf das Vorkommen des 5,0 EcoRI-SalI Restriktionsfragments gescreent, das das Aspergillus nidulans amdS Gen enthält, und es hat die korrekte Struktur für das gewünschte Plasmid pPS51. Es wird im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Beispiel 1 eine Plasmidpräparation von Plasmid pPS51 im großen Maßstab durchgeführt. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pPS51 ist in Figur 8 der Zeichnungen dargestellt.

C. Abschließende Konstruktion von Plasmid pPSJ78

Das amdS Gen wird dann auf einem 5,65 kb EcoRI Fragment von pPS51 isoliert und in pPSJ77 (von Beispiel 4) zur Bereitstellung eines Selektionsmarkers inseriert, der in Penicillium und anderen Organismen verwendet werden kann. Ein Transformand, der das Plasmid pPS51 enthält, wird im wesentlichen gemäß Beispiel 1 isoliert, außer daß statt 100 ug/ml Ampicillin 25 ug/ml Chloramphenicol im Anzuchtmedium enthalten sind. Etwa 25 4g von Plasmid pPS51 werden mit 50 Einheiten Restriktionsenzym EcoRI verdaut und das entstehende 5,65 kb EcoRI Fragment wird im wesentlichen gemäß Beispiel 2B isoliert.

Ein einzelner Transformand, der das Plasmid pPSJ77 (wie in Beispiel 4A konstruiert) enthält, wird angezogen und das Plasmid wird im wesentlichen gemäß Beispiel 1 isoliert, außer daß statt 100 ug/ml Ampicillin 15 ug/ml Tetracyclin im Anzuchtmedium enthalten sind. Etwa 25 4g Plasmid pPSJ77 ( 25 ul) werden mit 10 ul 10fach ReactR 3 Puffer (BRL), 60 ,41 H&sub2;O und 5 ul Restriktionsenyzm EcoRI ( 50 Einheiten) gemischt. Die Reaktion wird dann bei 37ºC für 90 Minuten inkubiert, dann nacheinander mit Phenol, Phenol : Chloroform und Chloroform extrahiert.

Das 5,65 kb MRI Fragment von Plasmid pPS51, das das Aspergillus nidulans amdS Gen enthält, wird mit dem EcoRI verdauten pPSJ77 gemischt, ligiert und in JM109 im wesentlichen gemäß Beispiel 4A transformiert. Die Transformanden werden auf Platten selektioniert, die 15 ug/ml Tetracyclin enthalten. Das entstehende Plasmid wird pPSJ78 genannt. Eine Restriktions- und Funktionskarte von pPSJ78 ist in Figur 5 der Zeichnungen dargestellt. Die entgegengesetzte Orientierung des 5,65 kb EcoRI Fragments, das das amdS Gen enthält, würde ebenso funktionieren und liegt innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Die Orientierung des Fragments kann durch Restriktionsanalyse mit SalI (siehe Figur 5) bestimmt werden. Das Plasmid, das das amdS Gen-enthaltende Fragment in der entgegengesetzten Orientierung enthält, wird als pPSJ78A bezeichnet. Ein Protokoll zur Transformation von Penicillium mit den erfindungsgemäßen Vektoren ist in Beispiel 5 beschrieben.

Beispiel 5 Genetische Transformation von Penicillium A. Penicillium chrysogenum Stämme

Ein Penicillium Stamm zur Transformation wird von der American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 9480 erhalten. Andere Penicillium chrysogenum Stämme oder andere kornrnerzielle durch Mutation, Selektion oder genetische Züchtung zum Zweck der verbesserten Bildung von Penicillin G oder Penicilin V von ATCC 9480 abstammende Stämme sind ebenfalls zur Verwendung bei der Herstellung von Transformanden mit den erfindungsgemäßen Vektoren und Plasmiden geeignet.

B. Herstellung eines einheitlichen Impfguts für die Zellkultur

Um Penicillium chrysogenum Zellen effizient zu transformieren, ist es notwendig, die Zellwände unter Bildung von stabilen Protoplasten zu entfernen. Bei der Herstellung solcher Protoplasten ist es vorteilhaft, mit einem einheitlichen Impfgut zu beginnen. Andererseits ist die Herstellung von Zellen in Kultur nicht reproduzierbar und man verliert bei Versuchen Zeit P chrysogenum Protoplasten aus ungeeigneten oder unpassenden Zellmengen zu präparieren.

Eine entweder lyophilisierte oder aus Flüssigstickstofflagerung entnommene und bei Raumtemperatur aufgetaute Ampulle vegetativer Zellen ( 10&sup9; koloniebildende Einheiten in 1,0 ml Schutzflüssigkeit: 5 % Lactose, 10 % Glycerin und 0,1 % Tween 80) wird in 1 ml steriler Kochsalzlösung verdünnt. Etwa 0,1 ml dieser Suspension wird zum Beimpfen jedes der ungefähr 20 Schrägagarröhrchen mit Sporulationsmedium verwendet: Lactose 15,0 g/l, Maisquellwasser 2,5 g/l, Pepton 5,0 g/l, Nacl 4,0 g/l, MgSO&sub4; 7 H&sub2;O 0,5 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,6 g/l, FeCl&sub3; 6 H&sub2;O 0,005 g/l, CuSO&sub4; 5 H&sub2;O 0,002 g/l, Einstellen auf pH = 7,0, Agar 30,0 g/l und Autoklavieren für 20 Minuten bei 120 psi.

Jedes Schrägagarröhrchen [15 cm x 2,5 cm] enthält 25 ml verfestigtes Medium. Das gleichmäßig über die Schrägagaroberfläche verteilte Impfgut läßt man bei 25ºC wachsen, bis ein bedeckender Myzelrasen entsteht und sporuliert (1 Woche für die meisten Stämme) Der Bewuchs aus einem Schrägagarröhrchen wird in 10 ml sterilem flüssigem Kulturmedium suspendiert und die Supension wird in 106 ml flüssiges Kulturinedium überführt. Der die suspendierten Zellen enthaltende Kolben wird auf einem Rundschüttler gestellt und bei 25ºC für 18 Stunden bei 285 U/min mit einem Ausschlag von 1 Inch inkubiert.

Das wäßrige Kulturmedium wird folgendermaßen hergestellt: 100 ml Lösung A (36 g/l Saccharose, 7,5 g/l L-Asparagin, 15 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 21 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,75 g/l Na&sub2;SO&sub4;, 0,18 g/l MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,06 g/l CaCl&sub2;, 1 ml/l Salzelösung, neutraler pH) werden in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben. Der Kolben wird mit einem handelsüblichen Verschluß verschlossen und bei 121ºC für 20 Minuten autoklaviert. Zwei ml Lösung B (Glucose, 108 g/l) und 4 ml Lösung C (25 g/l Saccharose, 12,5 ml Maisquellwasser (4 % G/V Stickstoff), 5,5 g/l Ammoniumacetat, 5 g/l CaCO&sub3;, pH auf 6,5 mit KOH eingestellt und bei 121ºC für 20 Minuten autoklaviert) werden dann zur Lösung A gegeben, um das flüssige Kulturmedium herzustellen.

C. Herstellung von Penicillium Protoplasten

Zellen einer 24 Stunden Kultur werden durch Unterdruckfiltration geerntet (Whatman Papier Nr. 1 in einem Büchner Trichter) und in Puffer suspendiert (0,01 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, 0,01 M MgSO&sub4;, 0,01 M Dithiotreit, 1,00 M KCl und pH = 7,0 mit HCl). Um eine Endkonzentration an Zellen von 1 g Zellmasse pro 50 ml Puffer zu erhalten, wird ausreichend Puffer zugegeben. Die Zellsuspension wird in einem 250 ml Schüttelkolben in ein Rundschüttlerwasserbad gestellt und bei 29- 30ºC für 10 Minuten bei 140 Upm mit einem Ausschlag von 1 Inch inkubiert. Die Dithiotreit-behandelten Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 ml Enzymlösung (10 mg/ml Novozym, Novo Industri A/B Bagsvaerd, Denmark, 0,01 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, 0,01 M MgSO&sub4;, 0,01 M Dithiotreit, 1,00 M KCl und pH = 5,8 mit HCl) in einem 250 Schüttelkolben resuspendiert. Diese Zellsuspension wird dann in ein Rundschüttlerwasserbad bei 29-30ºC für 15 Minuten bei 140 Upm mit einem Ausschlag von 1 Inch gestellt. Die Enzym-behandelten Zellen werden dann bei 1240 x g für 6 Minuten zentrifugiert und das entstehende Pellet wird in Puffer (0,01 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, 0,01 M MgSO&sub4;, 1,00 M KCl und pH = 7,0 mit HCl) resuspendiert. Die Suspension wird zuerst bei 950 x g für 6 Minuten zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird im gleichen Puffer resuspendiert und die Suspension wird bei 700 x g für 6 Minuten zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird in 5 ml des gelichen Puffers resuspendiert. Diese Suspension enthält primär große Protoplasten und osmotisch empfindliche Zellen, die noch etwas Zellwandstruktur aufweisen. Verglichen mit den kleinen Protoplasten, die durch das obige Verfahren entfernt werden, ist der Prozentsatz an Protoplasten, die zur Regenerierung von Zellwänden fähig sind, und der Prozentsatz an lebensfähigen osmotisch stabilen Zellen für die großen Protoplasten und osmotisch empfindlichen Zellen in der schließlichen Lösung höher. Die Zellsuspension wird mit Puffer auf eine Konzentration von 2 x 10&sup8; Zellen/ml verdünnt.

D. Transformationsverfahren

Für jedes transformierende Plasmid werden 0,1 ml der Suspension an osmotisch empfindlichen Penicillium chrvsogenum Zellen (etwa 2 x 10&sup7; Zellen) versetzt mit 10 ul 50 mM CaCl&sub2;, 25 ug Plasmid DNA in 5-15 ul TE Puffer und 0,9 ml einer Lösung aus frisch gelöstem Polyethylenglycol 4 000 (Baker, 40 % Gewicht/Volumen in osmotisch stabilisiertem Puffer). Das Gemisch wird gevortext, 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, bei 700 x g für 2 Minuten zentrifugiert und erneut gevortext. Zwei Teile zu je 0,5 ml werden dann auf die Oberfläche von osmotisch stabilisiertem Acetamidmedium ausgebracht (1,7 g/l Hefestickstoffgrundlage ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 125 g/l Saccharose, 0,738 g/l Acetamid, 1,27 g/l CaCl&sub2; und 22 g/l Noble-Agar). Um die Gesamtzahl an lebensfähigen Zellen zu messen, die in den Transformationsgemischen enthalten sind, werden Teile aus dem Transformationsgemisch auf Medien plattiert, in denen das Acetamid durch eine äquimolare Menge Ammoniumsulfat ersetzt ist. Sieben bis zehn Tage nach der Transformation sind auf dem Acetamidmedium Transformandenkolonien mit einer ausreichenden Größe zur Subkultivierung vorhanden. Verkümmerte Transformanden werden leicht von stabilen Transformanden unterschieden, da verkümmerte Transformanden nicht nach einer Subkultivierung auf frischem Acetamidmedium wachsen können. Zellen, die mit einem Plasmid transformiert sind, das das Acetamidasegen enthält, bilden in vier bis fünf Tagen nach der Transformation sichtbare Kolonien.

E. Analyse der Penicillium Transformanden

Penicillium Transformanden, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformiert sind, die das amdS Gen enthalten, exprimieren eine Acetamidaseaktivität (das amdS Genprodukt), die in Extrakten von untransformierten P. chrysogenum Empfängerstämmen (beispielsweise ATCC 9480) nicht detektiert wird. Diese Aktivität führt zu einer Fähigkeit der transformierten Stämme, mittels des Ammoniak zu wachsen, der durch die Acetamidhydrolyse freigesetzt wird, wenn keine anderen Stickstoffquellen verfügbar sind. Die erfindungsgemäßen Penicillium Transformanden exprimieren auch die Racemaseaktivität.

Stabile Transformanden tragen die transformierende DNA in ihrer hochmolekularen DNA. Sonden, beispielsweise die für Racemase kodierende Sequenz oder Fragmente der Aspergillus DNA, die das Acetamidasegen enthalten, hybridisieren mit der hochmolekularen DNA dieser Transformanden sogar nach häufigem überimpfen auf nicht selektives Medium (Ammonium als Stickstoffquelle). Der transformierende Phänotyp (Bildung von Racemase und, falls ein amdS Vektor verwendet wurde, die Fähigkeit zum Wachstum auf Acetamid als alleinige Stickstoffquelle) wird von den Transformanden auch nach einem Überimpfen auf nicht selektives Medium beibehalten.


Anspruch[de]

1. Konstruierte DNA Verbindung, die ein Protein kodiert, das die Isopenicillin-N-Epimerase (Racemase) Aktivität von Streptomyces clavuligerus und folgende Aminosäuresequenz aufweist:

worin Ala für einen Alaninrest steht, Arg für einen Argininrest steht, Asn für einen Asparaginrest steht, Asp für einen Asparaginsäurerest steht, Cys für einen Cysteinrest steht, Gln für einen Glutaminrest steht, Glu für einen Glutaminsäurerest steht, Gly für einen Glycinrest steht, His für einen Histidinrest steht, Ile für einen Isoleucinrest steht, Leu für einen Leucinrest steht, Lys für einen Lysinrest steht, Met für einen Methioninrest steht, Phe für einen Phenylalaninrest steht, Pro für einen Prolinrest steht, Ser für einen Serinrest steht, Thr für einen Threaninrest steht, Trp für einen Tryptophanrest steht, Tyr für einen Tyrosinrest steht und Val für einen Valinrest steht.

2. Konstruierte DNA Verbindung nach Anspruch 1, die folgende DNA Sequenz enthält

worin A für Desoxyadenyl steht, G für Desoxyguanyl steht, C für Desoxycytidyl steht und T für Thymidyl steht.

3. 2,0 kb ClaI-StyI Restriktionsfragment von Plasmid pOW390 (NRRL B-18431).

4. Rekombinanter DNA Vektor, der die DNA Sequenz nach Anspruch l oder 2 enthält.

5. Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 4, der eines der folgenden Plasmide ist:

pOW3921 konstruiert durch Ligation des 0,9 kb Styi-BamHI Fragments von pOW390 (NRRL B-18431) mit der BamHI-HincII- verdauten M13mp18 RF Vektor-DNA unter Bildung von Plasmid mOW390, ortspezifische Mutagenese der einzelsträngigen mOW390 DNA unter Bildung von Plasmid mOW391, Ligation des 0,9 kb BamHI-NcoI Fragments von mOW391, des 5,75 kb XbaI- BamHI Fragments von pCZR111 (NRRL B-18249) und eines doppelsträngigen Phosphotriester-synthetisierten Xbai-NcoI- Fragments unter Bildung eines als Zwischenstufe benötigten Plasmids, das mit BamHI verdaut und mit dem 2 kb BamHI Fragment von pOW390 ligiert wird,

pPSJ77, konstruiert durch Ligation des 7,9 kb EcoRI-NcoI Restriktionsfragments von pOW392 mit dem 925 bp EcoRI-NcoI Fragment von pLC2 (ATCC 53334),

pPSJ78, konstruiert durch Ligation der EcoRI-SalI-verdauten pMLC 12 DNA (NRRL B-18097) mit dem 5,0 kb EcoRI-SalI Fragment von p3SR2 (NRRL B-18182) unter Bildung von pPS51 und Insertion des 5,65 kb EcoRI Fragments von pPS51 in das EcoRI-verdaute pPSJ77,

pPSJ78A, konstruiert wie pPSJ78, wobei das 5,65 kb EcoRI Fragment in der entgegengesetzten Richtung liegt,

pOW390 (NRRL B-18431)

mOW390, konstruiert durch Ligation des 0,9 kb StyI-BamHI Fragment s von pOW390 mit dem HincII-BamHI-verdauten Vektor Ml3mp18, oder

mOW391, hergestellt durch ortsspezifische Mutagenese von mOW390.

6. Rekombinante Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist.

7. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 6, die E. coli K12, Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus oder Streptomyces ist.

8. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 7, die E. coli K12 RR1ΔM15/pOW390 oder E. coli K12 JM109/pOW392 ist.

9. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 7, die Penicillium chrysogenum/pPSJ78 ist.







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