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Dokumentenidentifikation DE68921229T2 22.06.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0336324
Titel Prozess zur Behandlung von unlöslichem heterogenem Fusionsprotein.
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder Yoshikawa, Kazuhide, Yokohama-shi Kanagawa-ken, JP
Vertreter Grünecker und Kollegen, 80538 München
DE-Aktenzeichen 68921229
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 31.03.1989
EP-Aktenzeichen 891057358
EP-Offenlegungsdatum 11.10.1989
EP date of grant 22.02.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.06.1995
IPC-Hauptklasse C07K 1/113
IPC-Nebenklasse C07K 1/14   C12P 21/02   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Erfindungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Solubilisieren, Reinigen und Falten (refolding) eines Fusionsproteins, das aus menschlichem Nervenwachstumsfaktor und einem Teil menschlichen Wachstumshormons besteht.

Beschreibung des Standes der Technik

Durch die Methode der Genmanipulation ist es möglich, für Wirtszellen heterogenes Protein herzustellen, indem in die Wirtszellen Gene eingebracht werden, die für das Protein kodieren. Die so hergestellten heterogenen Proteine nehmen oftmals eine Struktur höherer Ordnung an, welche die Expression ihrer eigenen physiologischen Aktivität inhibiert, und sie verbleiben in Form von unlöslichen Agglomeraten in den Wirtszellen. Diese unlöslichen heterogenen Proteine erfordern für ihre wirksame Verwendung unausweichlich eine Reihe von Behandlungen, zu denen die Solubilisierung, Reinigung und Faltung gehören.

Die Reihe von Behandlungen zum Solubilisieren und Falten von in den Wirtszellen hergestelltem unlöslichen heterogenen Protein kann auf bekannte Weise durchgeführt werden, wobei z.B. das unlösliche heterogene Protein zur Solubilisierung in einer Lösung eines starken Proteindenaturierungsmittels, wie einer 4-9 M Guanidinhydrochloridlösung, behandelt und dann durch Verringern der Konzentration des Proteindenaturierungsmittels gefaltet wird. Bei diesem Verfahren liegt jedoch das Problem in der Handhabung einer großen Menge von Materialien, da die Dialyse oder Verdünnung der Lösung erforderlich ist, um die Konzentration des Proteindenaturierungsmittels zu verringern. Wenn eine Verbindung wie Guanidinhydrochlorid verwendet wird, tritt ein zusätzliches Problem bei der Behandlung der erzeugten Abfallflüssigkeit auf. Guanidinhydrochlorid kann nicht durch ein gewöhnliches Verfahren zur Abfallflüssigkeitsentsorgung, wie etwa das Belebtschlammverfahren, beseitigt werden.

In "Protein Purification: Micro to Macro", Seite 279-305 (1987), ist offenbart, daß die Wirkungen von denaturierenden Mitteln oftmals additiv oder synergistisch sind. Ein Beispiel dafür ist die Beobachtung, daß der pH, bei dem ein Protein denaturiert, bei Zugabe von chaotropen Mitteln herabgesetzt wird.

Ein weiteres Verfahren zur Faltung ist bekannt, worin unlösliches heterogenes Protein zur Solubilisierung in einer Alkalilösung behandelt und durch anschließendes Herabsetzen des pH-Werts der Lösung gefaltet wird. In diesem Verfahren wird im Vergleich zu dem vorhergehenden Verfahren eine einfachere und leichtere Methode zum Handhaben einer großen Menge von Materialien bereitgestellt, da die Herabsetzung des pH-Werts durch Zugabe einer sauren Substanz erreicht werden kann.

Das Problem bei diesem Verfahren ist jedoch, daß die Solubilisierungsrate von unlöslichem heterogenen Protein zu niedrigen Werten tendiert, da die Alkali lösung schwerlich mit dem Inneren der Agglomerate des unlöslichen heterogenen Proteins in Berührung gebracht wird. Eine niedrige Solubilisierungsrate ist nicht bevorzugt, da sie zu einer niedrigeren Ausbeute führt.

Gemäß "Protein Purification: Micro to Macro", Seiten 429-442 (1987), ist die Konzentration des Proteins von besonderer Bedeutung, da die optimale Konzentration niedrig liegen kann (1 mg/ml oder weniger), wobei höhere Konzentrationen die Aggregation oder Ausfällung begünstigen.

Es ist bekannt, daß Protein eine Primär-, Sekundär-, Tertiär- und manchmal Quartärstruktur annimmt. Die Primärstrukturen sind aus etwa 20 Arten von Aminosäuren zusammengesetzt und bisher sind mehr als 200 verschiedene Primärstrukturen festgestellt worden. Die Sekundär- und Tertiärstrukturen, sogenannte Strukturen höherer Ordnung, werden durch die intramolekulare Verknüpfung zwischen Aminosäuren in der Primärstruktur von Proteinen hervorgerufen. Es sind gegenwärtig mehr als 100 Arten von Tertiärstrukturen bekannt, die mit Hilfe der Röntgenbeugung zur Kristallstrukturanalyse festgestellt wurden. Außerdem lehrt die neuere Methode der Genmanipulation, daß selbst diejenigen heterogenen Proteine, welche in Wirtszellen schwierig herzustellen sind, in fusionierter Form mit einem weiteren Protein, welches leicht herzustellen geht, hergestellt werden können. Bei dieser Methode werden zwei oder mehrere Arten von Protein in fusionierter Form über eine Aminosäuresequenz, wie Thrombin, Faktor Xa und Trypsin, kombiniert hergestellt, welche durch ein willkürlich gewähltes Enzym spezifisch abgebaut wird, und das Produkt wird später mit diesem Enzym behandelt, um ein angestrebtes Protein herzustellen.

Für die so durch die Methode der Genmanipulation hergestellten Proteine oder fusionierten Proteine mit vielen verschiedenen Strukturen gibt es vermutlich ein Optimum der Bedingungen für die Behandlungsschritte, wie die Solubilisierung, Reinigung und Faltung usw. Zum Beispiel kann ein unlösliches fusioniertes heterogenes Protein, das aus menschlichem Nervenwachstumsfaktor (im folgenden als NGF bezeichnet) und einem Teil menschlichen Wachstumshormons (im folgenden als hGH bezeichnet), welche beide von Escherichia coli hergestellt werden, besteht, durch Behandeln mit einer Alkalilösung solubilisiert werden, aber es ergibt einen Niederschlag, wenn der pH für die Faltungsbehandlung herabgesetzt wird, was zu einer merklichen Verringerung der Ausbeute führt.

Es ist den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelungen, die Probleme des Standes der Technik durch ausführliche und fortgesetzte Untersuchungen des Verfahrens der Behandlungsschritte, wie der Solubilisierung, Reinigung und Faltung von unlöslichem fusionierten heterogenen Protein, welches bisher unbekannt war, zu lösen und so haben sie schließlich diese Erfindung zustandegebracht.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren zum Solubilisieren, Reinigen und Falten eines Fusionsproteins bereitstellen, das aus menschlichem Nervenwachstumsfaktor und einem Teil menschlichen Wachstumshormons besteht, umfassend die folgenden Schritte:

a) das Inkontaktbringen des Fusionsproteins mit einer wäßrigen Säurelösung umfassend 7 M Harnstoff,

b) das Einstellen des pH-Werts auf 10 bis 13 durch Zufügen einer alkalischen Substanz und Erniedrigen der Harnstoffkonzentration auf ungefähr 3,5 M und

c) das Erniedrigen des pH-Werts.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlicher beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt drei Schritte, entsprechend der Solubilisierung, Reinigung und Faltung des Proteins.

(1) Die Solubilisierungsbehandlung des unlöslichen fusionierten heterogenen Proteins

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei dem Bruchstücke von Bakterien, die unlösliches fusioniertes heterogenes Protein enthalten, welche durch Aufbrechen von Wirtszellen, z.B. durch Homogenisieren oder Ultraschall, hergestellt wurden, oder Konzentrate der Bakterienbruchstücke, die aus den obigen Bakterienbruchstücken durch Zentrifugation, Ultrafiltration oder Gelfiltration hergestellt wurden, mit einer wäßrigen Säure lösung in Gegenwart eines schwachen Denaturierungsmittels für Protein in Kontakt gebracht werden, um das gewünschte Fusionsprotein zu solubilisieren.

Das fusionierte Protein ist das Zielprotein, welches am stromaufwärts gelegenen Ende des N-Terminus mit dem ganzen oder einem Teil eines allogenen oder heterogenen Proteins kombiniert ist, welches von den verwendeten Wirtszellen leicht hergestellt werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das fusionierte Protein aus NGF und hGH zusammengesetzt.

Zu Proteindenaturierungsmitteln gehören im allgemeinen bekannte Denaturierungsmittel, wie z.B. Guanidinhydrochlorid, Harnstoff, oberflächenaktive Mittel und Thiocyansäuresalze. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist Harnstoff am meisten bevorzugt, da er den geringsten Einfluß auf den lebenden Organismus hat und leicht beseitigt werden kann. Die Konzentration des Proteindenaturierungsmittels kann diejenige sein, bei der ein unlösliches fusioniertes heterogenes Protein leicht in der Lösung dispergiert wird. Die Konzentration, welche für die Dispergierung erforderlich ist, kann in geeigneter Weise bestimmt werden, wobei hauptsächlich die Natur des Denaturierungsmittels in Betracht zu ziehen ist. Wenn Harnstoff als Denaturierungsmittel verwendet wird, muß berücksichtigt werden, daß Protein im allgemeinen durch Harnstoff bei einer Konzentration von mehr als 2 M denaturiert wird und daß Agglomerate von unlöslichem fusionierten heterogenen Protein bei einer Harnstoffkonzentration dispergiert werden können, die niedriger ist als die, bei der das Protein denaturiert wird.

Proteindenaturierungsmittel können entweder in Form einer Lösung in einer wäßrigen Säure lösung oder zusammen mit dem fusionierten Protein vorliegen, bevor eine wäßrige Säurelösung in Kontakt mit den Agglomeraten des unlöslichen fusionierten Proteins gebracht wird. Letzteres erscheint besser, da eine geringere Menge des Proteindenaturierungsmittels ausreichend sein kann. In dieser Erfindung erleichtert es das Dispergieren eines unlöslichen fusionierten heterogenen Proteins mit einem Proteindenaturierungsmittel einer wäßrigen Säurelösung, in die Tiefe der Agglomerate des fusionierten Proteins einzudringen, um die Solubilisierungsrate zu verbessern. Während der Dispergier- und Solubilisierungsschritte kann das gesamte Gemisch zusätzlich in Bewegung gehalten werden.

Die wäßrigen Säurelösungen können wäßrige Lösungen von geläufigen sauren Substanzen sein, zu denen z.B. anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Thiocyansäure, Iodwasserstoffsäure und Bromwasserstoffsäure, und organische Säuren, wie Essigsäure, gehören. Unter diesen sind jedoch wäßrige Lösungen von organischen Säuren wie Essigsäure bevorzugt, da organische Säuren fusioniertes heterogenes Protein wirksamer denaturieren. Die Konzentration der sauren Substanzen kann diejenige sein, bei deren PH der wäßrigen Lösung das angestrebte fusionierte heterogene Protein reversibel durch Säure denaturiert wird. Zum Beispiel sollte für das fusionierte Protein, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist, ein pH von 2-5, vorzugsweise 3-4, mittels einer sauren Substanz herbeigeführt werden.

(2) Die Reinigungsbehandlung des unlöslichen fusionierten heterogenen Proteins

Der Schritt der Reinigung von unlöslichem fusionierten heterogenen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Erhöhen des pH-Werts der Säurelösung, welche das solubilisierte fusionierte heterogene Protein enthält, durch Zugabe einer Alkalisubstanz.

Zu den eingesetzten Alkalisubstanzen können z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Ammoniak, Alkylamine und dergleichen ohne jede Einschränkung gehören

Der pH sollte auf einen Wert, bei dem das fusionierte heterogene Protein reversibel durch Alkali denaturiert wird, und deshalb vorzugsweise auf einen möglichst hohen pH-Wert angehoben werden. Bei einem hohen pH-Wert können mehr Verunreinigungen, die nicht das fusionierte heterogene Protein sind, ausfallen, was zu einer verbesserten Reinigung führt und gleichzeitig kann die Rate des in einer wäßrigen Alkalilösung solubilisierten Proteins verbessert werden. Im Falle eines fusionierten Proteins, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist, sollte der pH z.B. auf 10-13 angehoben werden.

Verunreinigungen, die bei hohem pH ausfallen, können in jeder gebräuchlichen Weise entfernt werden, wie etwa durch Zentrifugation, Ultrafiltration, Gelfiltration und dergleichen.

(3) Die Faltungsbehandlung des unlöslichen fusionierten heterogenen Proteins

Die Faltungsbehandlung von unlöslichem fusionierten heterogenen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, den pH einer wäßrigen Alkalilösung, welche darin gelöstes fusioniertes heterogenes Protein enthält, zu erniedrigen, um das Protein wieder in eine Form zu falten, welche physiologische Aktivität aufweisen kann.

Wenn eine hohe Konzentration eines Proteindenaturierungsmittels bei der Solubilisierungsbehandlung verwendet wird, ist jedoch eine zusätzliche Behandlung zur Erniedrigung der Konzentration des Denaturierungsmittels eventuell auch für den enzymatischen Abbau des fusionierten Proteins erforderlich. Deshalb ist es bei der Solubilisierungsbehandlung zur Faltung bevorzugt, zum Dispergieren von Agglomeraten von unlöslichem fusionierten heterogenen Protein entweder ein Proteindenaturierungsmittel in einer Konzentration zu verwenden, bei der das Protein nicht denaturiert wird, oder alternativ dazu ein Denaturierungsmittel in einer hohen Konzentration zu verwenden, von der erwartet wird, daß sie auf einen Wert erniedrigt wird, der nicht ausreichend ist, um das Protein zu denaturieren, wenn die Lösung mit einer wäßrigen Säurelösung vermischt wird. Wenn eine hohe Konzentration eines Proteindenaturierungsmittels verwendet wird und die daraus hervorgehende Lösung nach der Faltungsbehandlung das Denaturierungsmittel in einer Konzentration enthält, die hoch genug ist, um das fusionierte Protein zu denaturieren, kann die Konzentration, falls dies erforderlich ist, durch Dialyse oder Verdünnung erniedrigt werden. So ist die Verwendung eines Proteindenaturierungsmittels bei der Solubilisierungsbehandlung vorteilhaft, um eine höhere Solubilisierungsrate von unlöslichem fusionierten heterogenen Protein zu erhalten und folglich die endgültige Ausbeute an Protein zu verbessern.

Wie oben erwähnt worden ist, wird ein fusioniertes heterogenes Protein zuerst in einer wäßrigen Säurelösung solubilisiert und anschließend wird der pH der Lösung erhöht, wie es in der Behandlung (2) oben erläutert ist.

Als Alkali können allgemein bekannte Alkalisubstanzen, wie sie oben bei der Reinigungsbehandlung beschrieben wurden, eingesetzt werden. Aber organische Basen wie Ammoniak oder Triethylamin sind bevorzugt, da sie eine höhere Rate der Faltung versprechen, als dies bei anderen Alkalisubstanzen der Fall ist. Zusätzlich kann eine höhere Rate der Faltung erwartet werden, wenn eine wäßrige Lösung von mindestens einer organischen Base eingesetzt wird, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Monoethanolamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin. Der Grund, weshalb eine wäßrige Lösung einer organischen Phase eine hohe Rate der Faltung von fusioniertem heterogenen Protein bewirkt, ist nicht klar. Ferner führen von den organischen Basen Monoethanolamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin zu einer Faltung mit einer höheren Rate. Der Grund dafür ist ebenfalls nicht klar, aber vermutlich trägt die geradkettige Struktur dieser Verbindungen dazu bei.

Wie für Behandlung (2) erläutert worden ist, sollte der pH in einen Bereich angehoben werden, in dem das fusionierte Protein reversibel durch Alkali denaturiert wird. Für ein fusioniertes Protein, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist, ist ein pH von weniger als 10 nicht ausreichend zur Denaturierung in einer alkalischen Lösung und ein pH größer als 13 kann zu einer irreversiblen Denaturierung führen. Deshalb ist ein pH im Bereich 10-13 vorzuziehen. Ein pH im Bereich 11-12 ist mehr bevorzugt, um eine höhere Rate der Faltung zu erhalten. Vermutlich liegt dies daran, daß der pH die Faltung sowie die Solubilisierung in einem alkalischen Medium sehr fein beeinflußt.

Durch die oben beschriebenen Arbeitsschritte kann eine alkalische Lösung erhalten werden, welche das fusionierte heterogene Protein stabil darin gelöst enthält. Das fusionierte heterogene Protein, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist, kann, wenn es nur mit einer wäßrigen alkalische Lösung solubilisiert ist, ausgefällt werden, wenn der pH der Lösung zur Faltung erniedrigt wird, aber durch die oben beschriebenen Arbeitsschritte bleibt es in der Lösung, ohne ausgefällt zu werden, und außerdem können Verunreinigungen entfernt werden. Die Entfernung von Verunreinigungen kann auf der Stufe durchgeführt werden, bei der der pH erhöht ist, wie in (2) erläutert ist.

Die Erniedrigung des pH-Werts kann durch Dialyse und dergleichen ausgeführt werden, aber unter dem Gesichtspunkt der Leichtigkeit der Durchführung ist es mehr bevorzugt, entweder eine anorganische Säure, wie Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure, oder eine organische Säure, wie Essigsäure und Glycin, zuzugeben. Wie oben festgestellt wurde, ist jedoch die Dialyse der Lösung insbesondere dann brauchbar, wenn die Lösung nach der Faltung immer noch ein Denaturierungsmittel in einer Konzentration enthält, die hoch genug ist, um ein fusioniertes heterogenes Protein zu denaturieren, und deshalb die Erniedrigung der Konzentration erforderlich ist. Die Dialyse erreicht gleichzeitig die Verringerung sowohl des pH-Werts als auch der Konzentration des Denaturierungsmittels. Der pH sollte auf einen niedrigeren Wert im Vergleich zu dem einer alkalischen Lösung eingestellt werden. Der bevorzugte Bereich ist 7-9, aber mehr bevorzugt 7-8, im Bereich von neutral bis schwach alkalisch. In diesem Bereich von neutral bis schwach alkalisch können die fusionierten heterogenen Proteine existieren und stabil bleiben.

Vor der Erniedrigung des pH-Werts der alkalischen Lösung wird die Zugabe einer Sulfhydrylverbindung wie Glutathion in der reduzierten Form, Cystein, 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Schwefelwasserstoff und dergleichen empfohlen, um zu verhindern, daß in dem fusionierten heterogenen Protein Disulfidbindungen ausgebildet werden, und folglich die Rate der Faltung zu verbessern.

Der Schritt der Solubilisierungsbehandlung dieser Erfindung erlaubt es, unlösliches fusioniertes heterogenes Protein in einfachen und leichten Arbeitsgängen zu solubilisieren. Auch der Schritt der Reinigungsbehandlung dieser Erfindung macht es durch einen einfachen und leichten Arbeitsgang der Zugabe einer Alkalisubstanz möglich, Verunreinigungen zu entfernen, welche in der Säurelösung enthalten sind, die das fusionierte heterogene Protein enthält, welche durch die Solubilisierungsbehandlung dieser Erfindung erhalten worden ist. Ferner wird bei der Faltungsbehandlung dieser Erfindung der pH der alkalischen Lösung, die das fusionierte heterogene Protein enthält, welche durch die Solubilisierungs- und Reinigungsbehandlungen erhalten worden ist, erniedrigt, um das angestrebte heterogene Protein in der Form zu erhalten, in welcher die Aktivität vorhanden ist. Der Behandlungsschritt gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich dazu, rasch und bequem auch eine solche große Menge von fusioniertem heterogenen Protein zu behandeln, wie sie durch die früheren Verfahren nicht behandelt werden konnte. Insbesondere wenn Harnstoff als Proteindenaturierungsmittel verwendet wird, können Abfallflüssigkeiten in einem einfachen Arbeitsgang entsorgt werden.

Ausführliche Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen besser verständlich.

Im folgenden ist ein Beispiel angegeben, welches sich auf ein fusioniertes heterogenes Protein bezieht, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist, welches von Escherichia coli hergestellt wird, um die vorliegende Erfindung ausführlicher zu erläutern, aber der Umfang dieser Erfindung ist nicht auf das Beispiel beschränkt.

Das fusionierte heterogene Protein, das aus NGF und hGH zusammengesetzt ist ( im folgenden als NGF-hGH bezeichnet), welches in den folgenden Beispielen vorkommt, hat ein Molekulargewicht von etwa 30.000 Dalton. Die stromaufwärts gelegene Region (N-terminale Seite) ist ein Teil von hGH, zusammengesetzt aus 140 Aminosäuren, und in der stromabwärts gelegenen Region liegt NGF, welcher aus 118 Aminosäuren zusammengesetzt ist. Da diese beiden Teile nach der Faltung getrennt werden, sind sie über eine spezifische Erkennungssequenz von Aminosäuren (Ile-Glu-Gly-Arg) verknüpft. Dieses NGF-hGH wurde von Escherichia coli als Wirtszellen gemäß dem Verfahren, wie es in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Sho 61-205485 offenbart ist, hergestellt.

BEISPIEL 1

Nach der Kultur von Wirtszellen wurden 10 g Bakterienmasse in 100 ml einer 20 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH = 8), welche 5% Glycerin und 2 mM EDTA enthielt, suspendiert. Die Bakterienmasse wurde in einem Ultraschallzellmischer aufgebrochen und zentrifugiert. Das NGF-hGH wurde in Form eines Niederschlags von 8 g zusammen mit unlöslichen Fragmenten der Bakterienmasse erhalten. Dieser Niederschlag wurde in 200 ml einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung (pH = 4), welche 7 M Harnstoff enthielt, suspendiert. Anschließend wurde eine Solubilisierungsbehandlung durchgeführt und ein Teil des Niederschlags mit Ausnahme der Fragmente der Bakterienmasse und dergleichen wurde solubilisiert.

BEISPIEL 2

Zu der wäßrigen Essigsäurelösung, welche das NGF-hGH enthielt, das in Beispiel 1 solubilisiert wurde, wurden 200 ml 10 Vol.-%iges Monoethanolamin zugegeben und der pH wurde auf 12 eingestellt. In der so hergestellten alkalischen Lösung wurde Protein ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation zusammen mit den Verunreinigungen, die nicht in Beispiel 1 solubilisiert wurden, entfernt.

BEISPIEL 3

400 ml einer Alkalilösung, die NGF-hGH enthielt, welches in Beispiel 2 enthalten wurde, wurden gegen 10 1 einer 0,15 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH = 8,5) dialysiert, um gleichzeitig die Konzentration von Harnstoff und den pH auf 8,5 zu erniedrigen. Es wurde keine Ausfällung von Protein auf dieser Stufe der Dialyse beobachtet. Nach der Dialyse wurde eine Lösung von rohem Protein, welche 500 mg NGF-hGH enthielt, erhalten. Zu einer Lösung, die 1 mg Rohextrakt des erhaltenen NGF-hGH enthielt, wurden 10 ug Faktor Xa (hergestellt von Sigma Co.) zugegeben und das Gemisch wurde bei 37ºC eine Stunde lang behandelt.

Die Lösung wurde nach der Behandlung einer Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid unterzogen, um die Proteinzusammensetzung zu analysieren. Es wurde bestätigt, daß hGH mit einem Molekulargewicht von etwa 15000 Dalton und NGF mit einem Molekulargewicht von etwa 14000 Dalton vorhanden waren. Aber die Anwesenheit von nichtabgebautem NGF-hGH wurde nicht bestätigt, was auf eine ungenügende Faltung oder eine hohe Konzentration eines Proteindenaturierungsmittels, welches in der Lösung zurückblieb, zurückzuführen sein kann.

Die Lösung von rohem NGF, enthaltend NGF, welche wie oben erwähnt erhalten wurde, wurde zu einer Kulturlösung von Ratten-Pheochromocytoma PC12-Zellen zugegeben und es wurde die Aktivität des NGF untersucht. Das Ergebnis war, daß die Aktivität, die beobachtet wurde, wenn die NGF-Lösung zu dem Kulturmedium zugegeben wurde, so daß eine Proteinkonzentration von 1 ug/ml erhalten wurde, in der gleichen Größenordnung lag, wie die, die beobachtet werden konnte, wenn ein Kontroll-Maus-NGF (hergestellt von Sigma Co., 2,5 NGF) zugegeben wurde, so daß sich 100 ng/ml ergaben. Diese Tatsache bestätigte, daß der NGF in der resultierenden Lösung bis zu dem Zustand gefaltet war, in dem der NGF die physiologische Aktivität aufweisen konnte.

Mittlerweile wurde die Menge an Protein in Lösung durch die Extinktion bei 280 nm in diesem und auch den nachfolgenden Beispielen bestimmt.

BEISPIEL 4

Unter Befolgung der gleichen Arbeitsvorschrift wie in Beispiel 1 wurden 10 g eines Niederschlags, der NGF-hGH aus Wirtszellen enthielt, erhalten. Dieser Niederschlag wurde in 200 ml einer 0,1 M wäßrigen Essigsäurelösung (pH = 4), welche 3,5 M Harnstoff enthielt, suspendiert und eine Solubilisierungsbehandlung wurde durchgeführt. Dann wurden 200 ml von 10 Vol.-%igem Monoethanolamin zugegeben und, nachdem der pH auf 12 eingestellt worden war, wurde das gesamte Gemisch zentrifugiert, um den abgeschiedenen Niederschlag zu entfernen. Glutathion in der reduzierten Form wurde bis zu einer Konzentration von 1 mM zugegeben, die Lösung wurde 90 Minuten lang in Bewegung gehalten und der pH der Lösung wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf 8,5 eingestellt. So wurde eine Lösung erhalten, in welcher der NGF bis zu dem Zustand gefaltet war, in dem die physiologische Aktivität vorhanden war. Diese Lösung enthielt 450 mg Protein. Die Aktivität von NGF wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 bestätigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

8 g des Niederschlags, der aus Wirtszellen in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden solubilisiert, wobei 200 ml einer Essigsäurelösung (pH = 4), welche 3,5 M Harnstoff enthielt, verwendet wurden, und gegen 10 1 einer 0,15 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH = 8,5) ohne Zugabe einer Alkalisubstanz dialysiert. Der größte Teil des in der Lösung gelösten Proteins fiel als Niederschlag aus. 50 mg des Niederschlags wurden durch Zentrifugation abgetrennt und in der Dialyselösung suspendiert. Es wurde versucht, NGF und hGH abzubauen, wobei der Faktor Xa verwendet wurde, was sich aber als vergeblich erwies. Die Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid zeigte, daß der größte Teil des NGF-hGH unverdaut blieb. Die Untersuchung dieser Proteinlösung auf eine Aktivität von NGF ergab ein negatives Ergebnis. Somit wurde keine Aktivität des NGF bestätigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

8 g eines Niederschlags, der aus Wirtszellen in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden mit 200 ml einer 10 Vol.-%igen Lösung von Monoethanolamin (pH = 12), die 3,5 M Harnstoff enthielt, solubilisiert. Diese Lösung wurde gegen 10 1 einer 0,15 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Lösung (pH = 8,5) dialysiert. Dann wurde der größte Teil des in der Lösung gelösten Proteins als Niederschlag ausgefällt. Der Niederschlag wurde in ähnlicher Weise wie in Vergleichsbeispiel 1 behandelt, aber ergab nur NGF ohne Aktivität.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Solubilisieren, Reinigen und Falten eines Fusionsproteines, das aus menschlichem Nervenwachstumsfaktor und einem Teil menschlichen Wachstumshormons besteht, umfassend die folgenden Schritte:

(a) das Inkontaktbringen des Fusionsproteines mit einer wäßrigen Säurelösung von pH 2 bis 5, umfassend eine denaturierende Konzentration an Harnstoff,

(b) das Einstellen des pH's auf 10 bis 13 durch Zufügen einer alkalischen Substanz und Erniedrigen der Harnstoffkonzentration auf ungefähr 50 % ihres Anfangswertes, wodurch Unreinheiten ausgefällt werden, die entfernt werden, während das Fusionsprotein, das aus menschlichem Nervenwachstumsfaktor und einem Teil menschlichen Wachstumshormons besteht, in Lösung bleibt,

(c) Erniedrigen des pH's der Überstandes auf pH 7 bis 9, und

(d) Reduzieren der Harnstoffkonzentration, falls notwendig.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens eine organische Base ausgewählt aus der Gruppe, die aus Monoethanolamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin besteht, als alkalische Substanz verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Erniedrigen des pH's gemäß Schritt (c) in Gegenwart einer Sulfhydrylverbindung durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wäßrige Säurelösung gemäß Schritt (a) 7 M Harnstoff umfasst, und wobei die Harnstoffkonzentration in Schritt (b) auf ungefähr 3,5 M Harnstoff erniedrigt wird.







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