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Dokumentenidentifikation DE69014541T2 22.06.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0421949
Titel Chemisch modifizierte Allergene und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Anmelder Laboratorio Farmaceutico Lofarma S.r.l., Mailand/Milano, IT
Erfinder Falagiani, Paolo, I-20131 Milano, IT;
Brenna, Oreste, I-20093 Cologno Monzese (MI), IT;
Mistrello, Giovanni, I-20135 Milano, IT
Vertreter Jung, H., Dipl.-Chem., Pat.-Anw., 61352 Bad Homburg
DE-Aktenzeichen 69014541
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, LI, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 19.09.1990
EP-Aktenzeichen 908304124
EP-Offenlegungsdatum 10.04.1991
EP date of grant 30.11.1994
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.06.1995
IPC-Hauptklasse A61K 39/35
IPC-Nebenklasse A61K 39/36   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung bezieht sich auf chemischmodifizierte Allergene und das Verfahren zu ihrer Herstellung. Im Detail bezieht sich die Erfindung auf einen neuen Typ von chemisch-modifizierten Allergenen, die eine günstige Wirkung bei der Behandlung von Allergiekrankheiten zeigen, sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung.

Es ist bekannt, daß eine Vielzahl von Menschen an Erkrankungen vom allergischen Typ leidet; die häufigsten Symptome dieser Kranheiten sind Asthma, Heuschnupfen und Bindehautentzündung sowie Urtikarie (Nesselsucht). Der Mechanismus, der solche Symptome hervorruft, verläuft typischerweise über einen allergischen Sensibilisierungszustand, in dem übermäßig viele Antikörper der Klasse IgE produziert werden, die sich gegen allgegenwärtige Allergene richten, wie Pollen, Hausstaubmilben, Pilzsporen und andere. Die IgE-Antikörper bieten nicht die für andere Antikörperklassen typische Schutzfunktion, sondern verursachen stattdessen eine komplexe zelluläre Reaktion, wenn sie mit den Allergenen reagieren, gegen die sie gerichtet sind, da sie die Fähigkeit besitzen, sich an die Membran der Mastzellen der Schleimhäute und an basophile Leukozyten zu binden. Die besagte Reaktion bewirkt die Freisetzung vasoaktiver Amine (zum Beispiel Histamin) und anderer Verbindungen, die die tatsächlichen Mediatoren der allergischen Reaktion und für diese verantwortlich sind.

Um diese allergischen Probleme zu verringern oder ganz zu beseitigen, wird seit vielen Jahrzehnten eine spezifische desensibilisierende Therapie praktiziert. Hierbei werden dem allergischen Patienten zunehmend größerer Dosen derjenigen Allergene, gegen die er allergisch ist, (üblicherweise durch eine subkutane Injektion) verabreicht, wobei diese Allergene zuvor durch diagnostische Untersuchungen identifiziert wurden. Traditionelle Allergenextrakte werden aus wässrigen Lösungen der Allergene mit einem nahezu neutralen pH-Wert (pH 7,0-7,4) und mit einer dem Serum ähnlichen osmotischen Stärke zubereitet.

Diese spezifische desensibilisierende Therapie führt über eine Vielzahl von Mechanismen zur Verminderung oder zum gänzlichen Verschwinden der allergischen Symptome: der bekannteste und sicherlich der wichtigste Mechanismus verläuft wie folgt: die wiederholte Injektion des Allergens induziert im Organismus die Produktion allergenspezifischer Antikörper vom IgG-Typ, sogenannte "Blockierende Antikörper" (blocking antibodies), die in der Lage sind, mit dem Allergen zu reagieren und dasselbe von der Reaktion mit den IgE-Antikörpern abzuhalten, aus der die oben beschriebene pathogene Reaktion ensteht.

Damit die besagte desensibilisierende Therapie erfolgreich sein kann, muß die injiziierte Gesamtdosis des Allergens groß sein.

Obwohl die allgemeine Akzeptanz der besagten spezifischen desensibilisierenden therapeutischen Behandlung aufgrund ihrer guten Wirksamkeit hoch ist, hat diese doch einige Nachteile, die durch unerwünschte Reaktionen entstehen, welche nach der Injektion des Allergens auftreten können. So können an der Injektionsstelle lokale Reaktionen (großflächige rote Flecken, Rötung, Juckreiz und andere) sowie systemische Reaktionen (Katarrh der Nasenschleimhäute oder Asthma sowie anaphylaktischer Schock) auftreten.

Um solche unerwünschten Reaktionen zu vermindern und damit die desensibilisierende Therapie sicherer zu gestalten, sind in den letzten Jahren allergene Extrakte vom Depot-Typ verwendet worden, d.h. Allergenextrakte mit langsamer Absorption, in denen die Allergenextrakte entweder präzipitiert oder an Aluminumhydroxid, Tyrosin oder Kalziumphosphat adsorbiert sind, um die Absorption im Organismus zu verlangsamen und somit die Reaktivität zu verringern. Mit Extrakten dieser Art vermögen Patienten die Inokulation des Extraktes besser zu tolerieren und es treten weniger unerwünschte Reaktionen auf.

Obwohl diese Allergenextrakte vom Depot-Typ eine Verbesserung darstellen, sind sie doch keineswegs die optimale und definitive Lösung des Problems, da ein gewisser Prozentsatz der Patienten auch auf sie mit unerwünschten Nebenwirkungen, sowohl lokal als auch systemisch, reagiert. In einem Versuch, diesen Nachteilen zu begegnen sind chemische Modifizierungen des Allergens erprobt worden, mit denen die allergene Reaktivität substantiell verringert werden sollte (d.h. die Fähigkeit, mit den an die Gewebsmastzellen gebundenen IgE-Antikörpern zu reagieren und daraufhin die pathogenen Reaktion zu bewirken), während die Stärke der immunogenen Wirkung unverändert bleibt (d.h. die Fähigkeit, die Bildung von blockierenden Antikörpern des IgG-Typs zu induzieren). Einige Autoren haben den Begriff "Allergoide" zur Bezeichnung der chemisch-modifizierten Allergene verwendet.

Eine der vorgeschlagenen Methoden zur Produktion solcher modifizierter Allergene, die zum Teil die erwünschten Eigenschaften aufweisen, ist die Denaturierungsmethode mit 8 M Harnstoff. Tatsächlich ist gezeigt worden, daß die Behandlung des Antigens E des Ambrosia elatior-Pollens (einer sehr wichtigen, in den USA wachsenden allergenen Pflanze) mit der dissoziierenden Wirkung einer 8 M Harnstofflösung dazu führte, daß das besagte Antigen einen großen Teil seiner Reaktionsfähigkeit mit den IgE-Antikörpern verlor, während es seine desensibilisierende Wirkung nach Injektion für therapeutische Anwendungen beibehielt. Andererseits ergaben Untersuchungen am Menschen, die auf die frühen vielversprechenden Experimente an Mäusen folgten, widersprüchliche Resultate. Des weiteren scheint die oben beschriebene Methode nur auf das Antigen E von Ambriosia elatior anzuwenden zu sein, welches aus zwei über nichtkovalente Bindungen zusammengehaltenen Polypeptiduntereinheiten besteht, die besonders anfällig gegen Denaturierungsagenzien (wie z.B. durch 8 M Harnstoff) sind.

Eine weitere bereits bekannte Methode zur Herstellung chemisch-modifizierter Allergene ist die Behandlung mit Aldehyden; am gebräuchlichsten sind Formaldehyd und Glutaraldehyd. Die Reaktionen zwischen der Aldehydfunktion und den Aminogruppen des Proteins sind zum Beispiel von R.E. Feeney, G. Blankenhorn und H.B.F. Dixon in Adv. Prot. Chem. 29, 135-203, 1975, beschrieben worden. Es darf dabei nicht außer Acht gelassen werden, daß nahezu alle Allergene chemisch gesehen aus Glykoproteinmolekülen bestehen, in denen die Proteinkomponente die immunologische Spezifität bestimmt.

Es ist gezeigt worden, daß die Behandlung von Ambrosia- und Lolium perenne-Allergenen mit Formaldehyd eine im Vergleich zum unbehandelten Allergen um Faktoren von 100-10.000 geringere allergene Reaktivität erhalten wurde. Die Bedingungen der chemischen Modifikation sind von Marsh in "The Antigens", Band III, Seite 317, Herausgeber Sela M., Academic Press, New York, beschrieben worden. Das so erhaltene Produkt weist bei Injektion für therapeutische Zwecke eine zufriedenstellende immunogene Kapazität auf, doch ist die Reaktivität von Patient zu Patient stark unterschiedlich. Als Folge können Dosisempfehlungen und Dosisabfolgen, die für den einen Patienten optimal sind, für andere Patienten ungeeignet sein.

Da Glutaraldehyd ein bi-funktioneller Aldehyd ist, bewirkt die Reaktion mit diesem Molekül die Bildung einer Mischung von Polymeren mit unterschiedlichen Molekulargewichten (vergleiche z.B. R. Patterson, J. Immunol. 110, 1413, 1973, Wo das Ambrosia-Antigen E der Polymerisation durch Glutaraldehyd ausgesetzt und dabei ein Produkt mit 10-100-fach geringerer allergener Aktivität erhalten wurde, oder auch D.M. Moran und A.W. Wheeler, Int. Archs. Allergy and Applied Immunology, 50, 693, 1976, wo eine ähnliche Vorgehensweise auf Phleum pratense-Allergene angewendet wurde). Allerdings zeigt die Polymerisationsmethode mit Glutaraldehyd zwei Nachteile:

1) Die Entfernung von Makromolekülen, wie sie die hier hergestellten Moleküle darstellen (zwischen 2x10&sup5; bis 2x10&sup7; Dalton), aus dem Organismus ist ein schwieriger Vorgang, so daß eine hohe Toxizität zu erwarten steht;

2) die Zugabe von Glyzin, Lysin oder anderen Aminosäuren oder Verbindungen mit mindestens einer Aminogruppe zum Abbruch der Reaktion resultiert in der Bildung von Reaktionsprodukten zwischen Glyzin und Glutaralehyd, die in keinerlei Beziehung zum nativen Allergen stehen und mit großer Wahrscheinlichkeit neue allergene Determinanten darstellen, die in Hinsicht auf die therapeutische Wirkung nutzlos sind.

Ein weiteres Verfahren zur Modifizierung von Allergenen ist im Britischen Patent Nr. 1282163 beschrieben, das die Reaktion von Allergenen aus Gramineae-Pollen und anorganischen Isozyanaten oder Polyaldehyden oder Carbodiimiden beschreibt. Das Ziel des Verfahrens ist die Herstellung modifizierten allergenen Materials, das relativ unlöslich oder nur teilweise wasserlöslich ist.

Das Alkalizyanatverfahren wird in saurem Medium durchgeführt, insbesondere bei pH 5. Die ablaufende Reaktion ist eine Kondensation der Aminogruppen des Allergens mit den Carboxylgruppen (aktiviert durch Zyansäure in Form von gemischten Anhydriden) des Allergens selbst (Methods in Enzymology, 25, 579, 1972). Durch die im Britischen Patent Nr. 1.282.163 beschriebene Verfahrensweise wird das Allergenmaterial polymerisiert, bis es unlöslich in Wasser oder wässrigen Lösungen wird.

Die oben beschriebenen Verfahrensweisen nach dem bisherigen Stand der Technik führen in allen Fällen zur Bildung polymerer Derivate des Allergens, so daß diese durch eine geringere Bindungsvalenz hinsichtlich der spezifischen Antikörper der IgE-Klasse charakterisiert sind.

Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung einen neuen Typ chemisch-modifizierter Allergene herzustellen, die die Fähigkeit haben, spezifische Antikörper der IgG- Klasse, die sich gegen das betreffende native Allergen richten, zu induzieren und gleichzeitig eine stark verringerte Reaktivität aufweisen, sowie keine der für die sogenannten "Allergoide" charakteristischen Nachteile zeigen.

Zu diesem Zweck hatten wir die Idee, einige der chemischen Gruppen des nativen Allergenmoleküls selektiv zu modifizieren, so daß die Affinität für die an zelluläre Rezeptoren gebundenen IgE-Moleküle verringert wird, ohne die Polymerisierung der Allergene zu verursachen. Dies wurde erreicht, indem die Allergene einer Carbamylierung (oder Thiocarbamylierung oder der Bildung von Gruppen des Guanidin-Typs) der primären Aminogruppen der Proteinkomponente des Allergens, insbesondere der terminalen Aminogruppe und der ε-Aminogruppen der Lysinreste, unterzogen wurden.

Die Carbamylierungsreaktion eines Proteinmoleküls, die den mit dem Stand der Technik Vertrauten bekannt ist, kann auch an anderen in der Proteinkette auftretenden chemischen Gruppen ablaufen, wie der Hydroxylgruppe des Tyrosin, der Sulfhydrylgruppe des Zystein, der Carboxylgruppe der Asparagin- und Glutaminsäure und der Imidazolgruppe des Histidin (Methods in Enzymology, 25, 579, 1982). Unter physiologischen pH-Bedingungen sind alle diese Derivate unstabil, während im Gegensatz dazu die Reaktionsprodukte der Carbamylierung der terminalen und der ε-Aminogruppen sehr stabil sind.

Es ist gezeigt worden, daß die nach der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen Carbamyl- und Thiocarbamylderivate und auch die Derivate vom Guanidin- Typ in der Lage sind, spezifische Antikörper der IgG- Klasse, die sich gegen die zugehörigen nativen Extrakte richten, zu induzieren. Es ist weiterhin gezeigt worden, daß diese Derivate in bemerkenswertem Umfang weniger reaktiv sind, als die zugehörigen nativen Extrakte, wie aus der folgenden Offenlegung hervorgehen wird.

Mit diesen Ausführungen im Einklang, sind chemischmodifizierte Allergene mit einer im Vergleich zum nativen Ausgangsmaterial verminderten allergenen Aktivität und der Fähigkeit spezifische Antikörper zu induzieren, die sich gegen das besagte native allergene Material richten, ein spezifisches Objekt der vorliegenden Erfindung, wobei vorgenannte chemisch-modifizierte Allergene dadurch charakterisiert sind, daß in ihnen ein Großteil der primären Aminogruppen des Proteinmoleküls des nativen Allergens chemisch-modifiziert ist und die folgende Struktur annimmt:

-NH-(C=X)-NH-R&sub1; (1)

Hierin repräsentiert X ein O, S oder NR&sub2;, R&sub2; repräsentiert ein H, eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe oder eine CN-Gruppe, und R&sub1; repräsentiert ein H, eine Alkylgruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe oder eine Arylalkylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylgruppe mit einem Heterozyklus. Die besagten Derivate sind zudem dadurch gekennzeichnet, daß sie nicht polymerisiert sind und daß sie in einem wässrigen Medium löslich und gegen tryptischen Angriff resistent sind.

Die durchschnittliche Prozentzahl der modifizierten primären Aminogruppen sollte zwischen 75% und 100% und bevorzugterweise bei ungefähr 90% liegen. Einerseits ist festgestellt worden, daß bei einem niedrigeren Substitutionsgrad als 75% die Reaktivität des chemischmodifizierten Allergenmaterials zu hoch ist. Andererseits kann die vollständige chemische Substitution nur unter sehr strengen Bedingungen erreicht werden.

Da die der chemischen Modifikation unterworfenen Allergenextrakte eine heterogene Proteinmischung enthalten, ist hier zu beachten, daß der Modifikationsgrad nur einen Durchschnittswert darstellt. Demnach kann ein niedrigerer Modifikationsgrad als 75% bedeuten, daß ein Teil der allergenen Proteine nur geringfügig modifiziert wurde und ein hoher Grad an allergener Aktivität erhalten blieb.

Die Allergenmodifizierung nach der vorliegenden Erfindung mit X=O oder S kann durch Behandlung mit einem Alkalimetallzyanat (KCNO oder NaCNO) oder durch Behandlung mit organischen Isozyanaten (R&sub1;-NCO) oder mit organischen Isothiozyanaten (R&sub1;-NCS) in alkalischem Milieu erfolgen. Für den Fall der Behandlung mit Zyanaten werden Aminogruppen erhalten, die mit einer unsubstituierten Carbamylgruppe modifiziert sind, wohingegen bei Anwendung einer der beiden anderen Reaktandentypen substituierte Carbamyl- oder Thiocarbamylderivate erhalten werden. Die Produkte der Erfindung mit X=NR&sub2; (substituierte Guanidinderivate) können durch Behandlung mit Verbindungen einer geeigneten Strukturformel, die Derivate bilden können, erhalten werden.

Die Reaktion läuft bei pH-Werten im Bereich 7 bis 11 ab, bevorzugt bei pH 9-9,6, während die Temperatur im Fall der Behandlung mit Alkalimetallzyanaten zwischen Raumtemperatur und 50 ºC, bevorzugt zwischen 35 und 40 ºC, liegen kann und die Gesamtreaktionszeit zwischen 12 und 36 Stunden beträgt, bevorzugt zwischen 16 und 24 Stunden.

Für den Fall der chemischen Modifikation mit organischen Isozyanaten oder Isothiozyanaten, die beide vergleichsweise reaktiver sind, ist es geeignet, die Reaktion bei Raumtemperatur oder bei einer niedrigeren Temperatur, bevorzugt zwischen 0 ºC und 5 ºC, ablaufen zu lassen, während die Gesamtreaktionszeit zwischen 30 Minuten und 8 Stunden, bevorzugt zwischen 2 und 4 Stunden, betragen kann.

Für den Fall der Modifikation mit Reaktanden, die geeignet sind, eine substituierte Guanidinstruktur zu ergeben, können die Reaktionszeiten, Temperatur und die mögliche Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels in der passendsten Weise von mit der Technik vertrauten Personen gewählt werden.

Das dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung zu unterwerfende Allergenmaterial kann aus einer Substanz bezogen werden, die dieses Allergen enthält, wie Pollen, Milben, Kopfschuppen, Pilze, Insektengifte u.a., und zwar durch Extraktion dieser Substanz nach wohlbekannten Vorschriften mit einem geeigneten Lösungsmittel, welches im Normalfall wässriger Natur ist. Der erhaltene Allergenextrakt enthält hauptsächlich Proteine und Glykoproteine, die üblicherweise mit Verunreinigungen, wie freien Kohlenhydraten und Pigmenten, vermischt sind, von denen der Extrakt z.B. durch Dialyse, Präzipitation oder Gel-Filtration getrennt und aufgereinigt wird.

Es kann auch eine andere Extraktionsmethode verwendet werden, in der das Allergenmaterial oder ein wässriger Extrakt des Allergenmaterials mit einer Phenollösung behandelt wird, wobei das Allergen aus der Phenolphase gewonnen wird. Eine umfangreiche Beschreibung von Methoden, mit denen der besagte Zweck erreicht werden kann, ist dem Artikel von J.N. Newell (J. Allergy 13, 117, 1942) zu entnehmen.

Das Allergenmaterial, das aus der Aufreinigung mittels jedweder geeignet erscheinender Methode erhalten wird, kann mit der Verfahrensweise behandelt werden, die das Objekt der vorliegenden Erfindung darstellt. Die chemische Modifikation, die das Objekt der vorliegenden Erfindung (Anm. d. Übersetzers: Das Original verwendet hier "Finding/Befund", wo "Erfindung" gemeint ist) darstellt, kann gleichermaßen an Gesamtextrakten, an teilweise aufgereinigten oder an reinen Allergenen, in Mischungen oder einzeln behandelt, durchgeführt werden.

Das auf diese Weise erzeugte Material für die chemische Modifikation besteht auf jeden Fall aus unpolymerisiertem Material.

Für den Fall der Behandlung mit Zyanat ist es möglich, zum Beispiel festes KCNO (frisch umkristallisiert) zu dem Allergenextrakt zuzusetzen, sodaß die Konzentration letztendlich zwischen 0,1 M und 1,5 M, bevorzugt zwischen 0,4 M und 0,8 M, beträgt. Der pH-Wert der Lösung wird bei dem gewünschten Wert gehalten, indem Natrium Tetraborat als festes Salz zu einer Konzentration von 0,1 M zugegeben und, wenn nötig, der pH-Wert mit 1 M NaOH eingestellt wird.

Für den Fall der Modifikation mit organischen Isozyanaten oder Isothiozyanaten kann ein verträgliches organisches Lösungsmittel verwendet werden, da diese Substanzen in manchen Fällen nicht sonderlich wasserlöslich sind.

Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, wird der chemisch-modifizierte Allergenextrakt einem Gelchromatographischen Schritt unterzogen, um das im Überschuß vorliegende chemische Reaktanz und mögliche Abbauprodukte abzutrennen. Dabei kann der Extrakt mit einer geeigneten Salzlösung ins Gleichgewicht gesetzt werden.

Der Substitutionsgrad kann durch Titration mit Trinitrobenzolsulfonsäure (wie von Habbe in Anal. Biochem. 14, 328, 1966, beschrieben) der vorhandenen Aminogruppen pro mg des Allergenproteins vor und nach der Modifikationsreaktion oder, mit größerer Genauigkeit (für den Fall der Modifikation mittels eines Alkalizyanates), durch Analyse der Verringerung der Anzahl der Lysingruppen in einem Protein-Hydrolysat des modifizierten Allergens und dem Erscheinen von Homozitrullin (G.R. Stark und D.G. Smith, J. Biol. Chem. 238, 214, 1963) bestimmt werden.

Eine elektrophoretische Analyse im Natrium dodecylsulfate-enthaltenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) eines allergenen Proteins, wie Ovalbumin, das einer der Beschreibung der vorliegenden Erfindung entsprechenden chemischen Modifikation unterzogen wurde, hat lediglich eine einzige Proteinbande mit einem Molekulargewicht, welches dem des nativen Proteins entspricht (45.000 Daltons) ergeben, woraus folgt, daß die Polymerisierung des Allergens vollständig vermieden wird.

Der nach dem oben offengelegten Verfahren chemischmodifizierte Allergenextrakt kann in einer wässrigen Form hergestellt und verabreicht werden über die parenterale, sublinguale, nasale oder orale Route oder über die bronchiale Route mit Hilfe eines geeigneten Inhalierungsgerätes oder als lyophilisierte Verbindung für die Rekonstitution und anschliessende angemessene Verabreichung als die wässrige Form oder als in Liposomen oder einem anderen "Drug Delivery-System" eingeschlossene lyophilisierte Verbindung für die Verabreichung über die orale, parenterale oder die Inhalierungsroute oder als ein von einem Inertträger (z.B. Laktose) umschlossenes Pulver für die Verabreichung über die nasale oder die bronchiale Route durch ein geeignetes Inhalierungsgerät oder als ein von einem Inertträger (z.B. Laktose) umschlossenes Pulver, in Tablettenform, die möglicherweise zusätzlich durch ein geeignetes Verfahren gegenüber den Darmsekreten resistent gemacht werden kann, für die Verabreichung über die orale Route.

Als alternative Verabreichungsmethode können die entsprechend der vorliegenden Erfindung modifizierten Allergenextrakte über die parenterale Route zugeführt werden, nachdem sie mit einer Substanz wie L-Tyrosin, Aluminiumhydroxid oder Kalziumphosphat adsorbiert oder kopräzipitiert sind oder durch eine andere Trägersubstanz, die eine verzögerte Freisetzung des aktiven Wirkstoffes von der Injektionsstelle (Delayed Release) bewirkt.

Die Präparationen des besagten chemisch-modifizierten Allergenextraktes können auch als ölförmige Suspension, als Syrup oder in Form eines Elixiers mit der Zugabe von Inertträgerstoffen oder von Verbindungen, welche die Geschmacksqualitäten für die orale Verabreichung verbessern, hergestellt werden.

Die charakteristische Monomernatur der entsprechend der vorliegenden Erfindung modifizierten Allergenextrakte macht diese besonders anwendbar, nicht nur bei parenteraler Verabreichung, sondern auch bei der Verabreichung über die nasale, die orale und die sublinguale Route oder in allen Fällen von Verabreichungswegen, die eine geeignete Absorption des aktiven Wirkstoffes durch die Mukosa als Mittel ihrer Wirksamkeit bieten. Es ist wohlbekannt, daß Moleküle mit hohem Molekulargewicht (wie zum Beispiel die mit Formaldehyd, Glutaraldehyd, Polyethylenglykol und anderen Stoffen polymerisierten Allergenextrakte) die erwähnten strukturellen anatomischen Barrieren oft nur unter bemerkenswerten Schwierigkeiten oder gar nicht überqueren können.

Die therapeutische Behandlung mittels oraler Verabreichung des entsprechend der Vorschrift der vorliegenden Erfindung modifizierten Allergenextraktes kann besonders wirksam sein. So ist es wohlbekannt, daß die allergenen Proteine, aus denen der Allergenextrakt besteht, in bemerkenswertem Ausmaß durch die in den Pankreassekreten vorkommenden proteolytischen Enzyme abgebaut und inaktiviert sind; dagegen sind die entsprechend der Vorschrift der vorliegenden Erfindung modifizierten Allergenextrakte gegen tryptischen Abbau sehr widerstandsfähig, wie in in vitro-Experimenten gezeigt worden ist. Folglich können sie den optimalen Bedingungen für einen geeigneten immunogenen Stimulus vom Schutztyp ausgesetzt werden, d.h. wahrscheinlich durch die Peyer'schen Plaques, die ein wichtiges peripheres Lymphorgan darstellen.

Bei jeder der oben erwähnten Verabreichungsmethoden kann eine spezifische desensibilisierende Behandlung in einer vorhersagbaren Weise auf der Basis sowohl des aufgereinigten Allergens als auch einer Mischung von Allergenen, modifiziert entsprechend der Vorschrift, die das Objekt der vorliegenden Erfindung ist, sowohl einzeln als auch in Mischung, erfolgen.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Präparationsbeispielen zum Zweck der Veranschaulichung, jedoch nicht zum Zweck der Einschränkung, offengelegt. Die Beispiele werden zusammen mit den experimentellen Test vorgelegt.

BEISPIEL 1

Ein wässriger Extrakt (5% G/V) einer Pollenmischung aus Poa pratensis, Phleum pratense und Hoicus lanatus wurde aus dem Lyophilisat mit destilliertem Wasser hergestellt (Konzentration ungefähr 10 mg Protein/mL, mit der Lowry-Methode bestimmt). Die Lösung wurde über eine Sephadex_ G-25-Säule (Pharmacia) gelfiltriert, um die niedermolekularen Bestandteile zu entfernen und gleichzeitig die Probe mit einem geeigneten Puffer, wie zum Beispiel 20 mM Natrium Phosphat-Puffer pH 6,86 ins Gleichgewicht zu setzen. Zu der so erhaltenen Lösung wurden Natrium Tetraborat-decahydrat (3,85 g/100 mL) und Kaliumzyanat (4,15 g/100 mL) zugegeben. Diese Salze wurden unter Rühren aufgelöst und der pH-Wert durch Zugabe von 0,1 M NaOH auf einen Wert von 9,3 eingestellt. Danach wurde die Lösung weitere 20 Stunden lang in einer geschlossenen Flasche in einem 40 ºC warmen thermostatischen Bad langsam gerührt. Während der ersten Stunden der Reaktion wurde der pH durch Zugabe von 1 M Phosphorsäure konstant gehalten. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionsmischung erneut über eine Sephadex_ G-25-Säule gelfiltriert, um den Überschuß an Zyanat zu entfernen, und gleichzeitig wurde die Probe mit einem geeigneten Puffer, wie zum Beispiel phosphatgepufferter Salinelösung (PBS) pH 7,2 ins Gleichgewicht gesetzt. Die Präparation wurde dann über eine Membran mit einer Porengröße von 0,22 um (Millipore) steril filtriert und in sterilen Probenbehältern bei 4 ºC aufbewahrt. Der prozentuale Substitutionsgrad der Aminogruppen wurde mit der Trinitrobenzolsulfonsäure- Methode (TNBS) bestimmt und betrug 87%.

In vivo-Test der allergenen Aktivität

15 Balb/c-Mäuse (5 Tiere pro Gruppe) mit einem Körpergewicht von 18-20 g wurden durch intraperitoneale Verabreichung (0,25 mL) von 10 ug (Anm. d. Ü.: das Original verwendet hier fälschlicherweise 10 g) eines Extraktes aus Pollen einer Gramineae-Mischung, entweder in Form des nativen oder des zyanatmodifizierten Extraktes, unter Zugabe von 1 mg Al(OH)3 immunisiert. Die dritte Versuchstiergruppe erhielt lediglich 0,25 mL PBS + 1 mg Al(OH)3 nach dem selben Protokoll wie die anderen Versuchstiere. Nach 28 Tagen erhielten alle Versuchstiere eine Zusatzdosis (Booster) desselben Materials wie bei der ersten Immunisierung. Eine Woche später wurden die Tiere getötet, das Blut der Versuchstiere jeder Gruppe wurde gepoolt und dann mit dem Test nach Ovary (Mouse-Rat Passive Cutaneous Anaphylaxis Test, Int. Archs. Allergy Appl. Immunol., 3, 293, 1952) auf das Vorhandensein spezifischer IgE-Antikörper untersucht.

Die in der Tabelle 1 im folgenden gezeigten Ergebnisse verdeutlichen, daß der chemisch-modifizierte Extrakt der Gramineae-Mischung eine signifikant geringere Fähigkeit zur Induktion spezifischer IgE-Antikörper aufweist, als derselbe unmodifizierte Extrakt (p < 0,01).

TABELLE 1 Maus-Ratte Passiver Hautanaphylaxie-Test (PCA-Test)
Serumverdünnungen Mäuse immunisiert durch Physiolog. Lösung Nativer Extrakt Gramineae Pollen Modifiziert. Extrakt Gramineae Pollen

Bemerkungen: 100 uL der Lösungen einer Verdünnungsreihe in physiologischer Lösung des Serums der mit physiologischer Lösung + 1 mg Al(OH)3 oder mit 10 ug des nativen Extraktes aus Pollen einer Mischung von Grainineae + 1 mg Al(OH)3 oder mit 10 ug eines modifizierten Extraktes aus Pollen einer Mischung von Gramineae + 1 mg Al(OH)3 behandelten Mäuse wurden Sprague- Dawley-Ratten intradermal injiziiert. Nach 48 Stunden wurde diesen Tieren 1 mL einer physiologischen Lösung intravenös injiziiert, die 1 mg des nativen Extraktes aus einer Mischung von Gramineae und 5 mg Evans-Blau enthielt. Nach einer halben Stunde wurden die Tiere getötet und das Vorhandensein charakteristischer Flecken auf der umgestülpten Rückenhaut der Tiere wurde geschätzt. Die Verdünnung mit der geringsten Konzentration, die noch einen "Fleck" mit einem Durchmesser von 7 mm erzeugt, wurde als der PCA-Titer bezeichnet.

In vitro-Test der allergenen Aktivität (RAST-Inhibierung)

Polystyrolkügelchen wurden aktiviert und der native Extrakt der Pollen einer Mischung von Gramineae wurde nach einer geeigneten Vorschrift an die Kügelchen fixiert (Deutsches Patent DE 3338759C1).

20 uL des Serums eines gegen Gramineae allergischen Patienten wurden in einem Reagenzglas mit 30 uL der Lösungen einer Verdünnungsreihe des nativen Extraktes einer Mischung von Gramineae oder desselben Extraktes, nach Modifikation mit Zyanat, 3 Stunden lang bei 20 ºC inkubiert.

Danach wurde zu jedem Reagenzglas ein Kügelchen zugegeben, das zuvor mit dem Extrakt einer Mischung von Gramineae sensibilisiert worden war, und die Reagenzgläser wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach geeignetem Waschen wurden 50 uL einer ¹²&sup5;I-anti-IgE-Lösung (Sferikit_, Lofarma Allergeni, Mailand, Italien) zugegeben und die Proben weitere 16 Stunden inkubiert. Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung angefertigt.

Nach dem Ende der Inkubationszeit wurde die Restradioaktivität der Kügelchen mit einem Gammastrahlenzähler bei mindestens ein-minütiger Zähldauer gemessen. Die relative Allergenizität wird als diejenige Menge des Allergenextraktes ausgedrückt, die die RAST- Antwort eines Pools positiver Seren um 50% zu inhibieren vermag.

Die Inhibitionsrate, von 0 bis 100 %, wurde nach der Gleichung von L. Yman (Develop. Biol. Standard, 29, 151, 1975) berechnet:

((cpm positive Kontrolle)-(cpm Probe)) x 100 /(cpm positive Kontrolle)-(cpm negative Kontrolle)

wobei die "negative" Kontrolle die nicht-spezifische Radioaktivität ist (d.h. der cpm-Wert, der erhalten wird bei Zugabe von Phosphatpuffer anstelle des Patientenserums bei der Prä-Inkubation vor der Zugabe der mit dem entsprechenden Extrakt sensibilisierten Kügelchen), während die "positive" Kontrolle die maximale Radioaktivität darstellt (d.h. der Wert, der erhalten wird bei Zugabe von Phosphatpuffer anstelle der Extraktverdünnungen bei dem Inhibitionstest).

Der mit Zyanat in alkalischem Medium modifizierte Allergenextrakt der Gramineae-Mischung erwies sich in diesem Test als signifikant weniger wirksam als derselbe unmodifizierte Extrakt (p< 0,01).

Test der imunogenen Aktivität

Kaninchen (Neuseeland Black Rabbits, Charles River, Calco, Como) wurden mit einer Emulsion immunisiert, die 3 mg des nativen oder modifizierten Extraktes einer Mischung von Gramineae in Freund'schem Adjuvanzmedium enthielt.

Es wurden sechs Immunisierungen im Abstand von jeweils 21 Tagen vorgenommen. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurde eine Blutprobe entnommen und die Seren der Kaninchen, die mit dem nativen Extrakt einer Mischung von Cramineae oder dem modifizierten Extrakt einer Mischung von Gramineae behandelt worden waren, wurden separat mit dem Ouchterlony-Immunodiffusionstest (Progress in Allergy, Band V, S. 1-78, Hrsg. Kallas, P., Karger, New York, 1958) gegen geeignete Verdünnungen des nativen Extraktes einer Mischung von Gramineae getestet.

Unter Einbeziehung derjenigen Verdünnung des Serums als Referenzparameter, die die Bildung einer Präzipitationsbande im Agarosegel bewirkt, zeigen die untersuchten Proben keinen Unterschied, wodurch die Tatsache bestätigt wird, daß die immunogenen Eigenschaften (d.h. die Fähigkeit, IgG-Antikörper zu induzieren, die mit den im Extrakt vorhandenen Antigenen kreuzreagieren) des mit Zyanat in alkalischem Medium modifizierten Extraktes aus einer Mischung von Gramineae praktisch unverändert sind.

Toxikologische Analuse - Subchronische Toxizität

20 Sprague-Dawley-Ratten (10 weibliche und 10 männliche) wurden über die subkutane Route 12 Wochen lang mit einer Dosis des zyanatmodifizierten Extraktes einer Mischung von Gramineae behandelt, die 100 mal größer war als die klinisch ordnungsgemäße Dosis, um mögliche toxikologische Wirkungen zu untersuchen.

Es wurden keine pathologisch relevanten Hinweise erhalten, selbst auf der histologischen Ebene der untersuchten Organe (Ovarien, Milz, Leber, Lunge, Niere, Nebennierendrüsen, Herz, Thymus, Gehirn und Lymphknoten), wodurch bestätigt wird, daß die chemische Modifikation im derivatisierten Produkt keine Veränderungen hervorruft, die toxikologische Eigenschaften betreffen.

Hauttest am Menschen

Lösungen des nativen Extraktes einer Mischung aus Gramineae oder des mit Zyanat in alkalischem Medium modifizierten Extraktes wurden auf angemessene Weise verdünnt und danach solchen Patienten intradermal in die volare Seite des Unterarmes verabreicht, die gegen die Pollen von Gramineae allergisch sind.

Die Ergebnisse dieses Experimentes können aus Tabelle 2 abgelesen werden. Diese beziehen sich auf die Messung von Erythemendurchmessern 15 Minuten nach der Inokulation. Die Verdünnungslösung diente als negative Kontrolle (Coca + 0,03% Humanalbumin).

TABELLE 2 Hauttest an freiwilligen Patienten
Konz. nativer Extrakt Konz. modifiz. Extrakt Verdünnung Patient-Nr. *Durchmesser der Erytheme (mm)

Wie hier zu sehen ist, ist die Reaktivität des modifizierten Extraktes einer Mischung von Gramineae signifikant geringer, als die des zugehörigen unmodifizierten Extraktes (p< 0,01 bei allen untersuchten Konzentrationen).

BEISPIEL 2

Ein wässriger Extrakt (5% G/V) aus Parietaria judaica-Pollen, zuvor mit Hilfe von Ethylether delipidiert, wurde aus dem Lyophilisat mit destilliertem Wasser re-hydriert (Konzentration ungefähr 10 mg, mit der Mikro-Kjeldhal-Methode bestimmt). Die Lösung wurde über eine Sephadex_ G-25-Säule (Pharmacia) gelfiltriert und mit 20 mM Phosphat-Puffer pH 6,86 ins Gleichgewicht gesetzt. Die so erhaltene Lösung wurde mit Natrium Tetraboratdecahydrat (3,85 g/100 mL) und Kaliumzyanat (4,15 g/100 mL) chemisch-modifiziert. Nach einer möglichen wie in Beispiel 1 beschriebenen pH-Einstellung wurde die Lösung 20 Stunden lang in einer geschlossenen Flasche in einem 40 ºC warmen thermostatischen Bad langsam gerührt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionsmischung erneut über eine Sephadex_ G-25-Säule gelfiltriert, um den Überschuß an Modifikationsreagenz aus dem allergenen Extrakt zu entfernen. Die gewählten Chromatographiebedingungen (Gelvolumen/Probenvolumen größer als 5) entsprechen dem vorgenannten Zweck: der Zyanatüberschuß wird weit von der Proteinfraktion entfernt eluiert, wie leicht mit einem einfachen CaCl&sub2;-Test (Anm. d. U.: sollte es CoCl&sub2; heißen ?) oder anderen, zum Beispiel den von W.R. Fearson in Biochem. J., 17, 84, 1923, beschriebenen Tests nachgewiesen werden kann.

Die Präparation wurde dann über eine Membran mit einer Porengröße von 0,22 um (Millipore) steril filtriert und in sterilisierten Probenbehältern bei 4 ºC aufbewahrt. Der prozentuale Substitutionsgrad wurde auf der Basis der Homozitrullinkonzentration bestimmt, da die im Pollenextrakt von Parietaria judaica anwesenden Pigmente den TNBS-Test stark beeinflussen, und betrug 85%.

In vivo-Test der allergenen Aktivität

15 Balb/c-Mäuse (5 Tiere pro Gruppe) mit einem Körpergewicht von 18-20 g wurden durch intraperitoneale Verabreichung (0,25 mL) von 10 ug eines nativen Extraktes aus Parietaria judaica-Pollen oder des betreffenden Zyanat-modifizierten Extraktes unter Zugabe von 1 mg Al(OH)3 immunisiert. Die dritte Versuchstiergruppe erhielt lediglich 0,25 mL PBS + 1 mg Al(OH)3 nach dem selben Protokoll wie die anderen Versuchstiere.

Nach 28 Tagen erhielten alle Versuchstiere eine Zusatzdosis (Booster) desselben Materials wie bei der ersten Immunisierung.

Eine Woche später wurden die Tiere getötet, das Blut der Versuchstiere jeder Gruppe wurde gepoolt und dann mit dem Maus-Ratte Passiven Hautanaphylaxie-Test auf das Vorhandensein spezifischer IgE-Antikörper untersucht.

Die in der Tabelle 3 im folgenden gezeigten Ergebnisse verdeutlichen, daß der chemisch-modifizierte Extrakt aus Parietaria eine signifikant geringere Fähigkeit zur Induktion spezifischer IgE-Antikörper aufweist, als der entsprechende unmodifizierte Extrakt (p < 0,01).

TABELLE 3 Maus-Ratte Passiver Hautanaphylaxie-Test (PCA-Test)
Serumverdünnungen Mäuse immunisiert durch Verdünnungslösung Nativer Extrakt aus Parietaria Pollen Modifiziert. Extrakt aus Parietaria Pollen Titer*

Bemerkungen: 100 uL der Lösungen einer Verdünnungsreihe in physiologischer Lösung der Seren der mit physiologischer Lösung + 1 mg Al(OH)3 oder mit 10 ug des nativen Extraktes aus Parietaria-Pollen oder mit 10 ug des modifizierten Extraktes aus Parietaria-Pollen behandelten Mäuse wurden Sprague-Dawley-Ratten intradermal injiziiert. Nach 48 Stunden wurde diesen Tieren 1 mL einer physiologischen Lösung intravenös injiziiert, die 1 mg des nativen Extraktes aus Parietaria-Pollen und 5 mg Evans- Blau enthielt. Nach einer halben Stunde wurden die Tiere getötet und das Vorhandensein charakteristischer Flecken auf der umgestülpten Rückenhaut der Tiere wurde geschätzt. Die Verdünnung mit der geringsten Konzentration, die noch einen "Fleck" mit einem Durchmesser von 7 mm erzeugt, wurde als der PCA-Titer bezeichnet.

In vitro-Test der allergenen Aktivität

Polystyrolkügelchen wurden mit Glutaraldehyd aktiviert und der native Extrakt aus Parietaria judaica- Pollen wurde nach einer geeigneten Vorschrift an die Kügelchen fixiert (Deutsches Patent DE 3338759C1). 20 uL des Serums eines gegen Parietaria judaica-Pollen allergischen Patienten wurden in einem Reagenzglas mit 30 L der Lösungen einer Verdünnungsreihe des nativen Parietaria-Extraktes oder desselben Extraktes, nach Modifikation mit Zyanat in alkalischem Medium, 3 Stunden lang bei 20 ºC inkubiert. Danach wurde zu jedem Reagenzglas ein Kügelchen zugegeben, das zuvor wie in Beispiel 1 beschrieben sensibilisiert worden war, und die Reagenzgläser wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach geeignetem Waschen wurden 50 uL einer ¹²&sup5;I- anti-IgE-Lösung zugegeben und die Proben weitere 16 Stunden inkubiert.

Die Restradioaktivität der Kügelchen in den Proben wurde mit einem Gammastrahlenzähler bei mindestens einminütiger Zähldauer gemessen.

Die relative Allergenizität wird als diejenige Menge des Allergenextraktes ausgedrückt, die die RAST-Antwort eines Pools positiver Seren um 50% zu inhibieren vermag.

Die Inhibitionsrate, von 0 bis 100 %, wurde nach der Gleichung von L. Yman (Develop. Biol. Standard, 29, 151, 1975) berechnet:

((cpm positive Kontrolle)-(cpm Probe)) x 100 /(cpm positive Kontrolle)-(cpm negative Kontrolle)

wobei die "negative" Kontrolle die nicht-spezifische Radioaktivität ist (d.h. der cpm-Wert, der erhalten wird bei Zugabe von Phosphatpuffer anstelle des Patientenserums bei der Prä-Inkubation vor der Zugabe der mit dem entsprechenden Extrakt sensibilisierten Kügelchen), während die "positive" Kontrolle die maximale Radioaktivität darstellt (d.h. der Wert, der erhalten wird bei Zugabe von RAST-Puffer anstelle der Extraktverdünnungen bei dem Inhibitionstest).

Der modifizierte Allergenextrakt der Parietaria-Pollen erwies sich in diesem Test als signifikant weniger wirksam als derselbe Extrakt in seiner native Form (p< 0,01).

Test der imunogenen Aktivität

Kaninchen (Neuseeland Black Rabbits, Charles River, Calco, como) wurden mit einer Emulsion immunisiert, die 3 mg des nativen oder Zyanat-modifizierten Extraktes aus Parietaria-Pollen in Freund'schem Adjuvanzmedium enthielt.

Es wurden sechs Immunisierungen im Abstand von jeweils 21 Tagen vorgenommen. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurde eine Blutprobe entnommen und die Seren der Kaninchen, die mit dem nativen Extrakt aus Parietaria- Pollen oder dem mit Zyanat modifizierten Extrakt aus Parietaria-Pollen behandelt worden waren, wurden separat mit dem Ouchterlony-Immunodiffusionstest gegen geeignete Verdünnungen des nativen Extraktes aus Parietaria-Pollen getestet.

Unter Einbeziehung derjenigen Verdünnung des Serums als Referenzparameter, die die Bildung einer Präzipitationsbande im Agarosegel bewirkt, zeigen die untersuchten Proben keinen Unterschied, wodurch die Tatsache bestätigt wird, daß die immunogenen Eigenschaften (d.h. die Fähigkeit, IgG-Antikörper zu induzieren, die mit den im Extrakt vorhandenen Antigenen kreuzreagieren) des mit Zyanat entsprechend der Vorschrift, die das Objekt der vorliegenden Erfindung ist, modifizierten Extraktes aus Parietaria-Pollen praktisch unverändert sind.

Toxikologische Analyse: Subchronische Toxizität

20 Sprague-Dawley-Ratten (10 weibliche und 10 männliche) wurden über die subkutane Route 12 Wochen lang mit einer 250 ug-Dosis des zyanatmodifizierten Extraktes aus Parietaria-Pollen behandelt (dies entspricht einer Dosis 100 mal größer als die klinisch ordnungsgemäße Dosis).

Am Ende der Behandlung wurden die Versuchstiere getötet und ihre Organe auf Anzeichen toxikologischer Schädigungen hin untersucht.

Es wurden keine pathologisch relevanten makroskopischen und/oder histologischen Hinweise in den untersuchten Organen erhalten (Leber, Lunge, Milz, Herz, Niere, Nebennierendrüsen, Gehirn , Thymus, Ovarien und Lymphknoten), wodurch bestätigt wird, daß die chemische Modifikation des Extraktes aus Parietaria-Pollen im derivatisierten Produkt keine Veränderungen hervorruft, die toxiische Eigenschaften hervorrufen.

Hauttest am Menschen

Lösungen des nativen Extraktes aus Parietaria-Pollen oder des mit Zyanat entsprechend Beispiel 2 modifizierten Extraktes wurden auf angemessene Weise verdünnt und danach solchen Patienten intradermal in die volare Seite des Unterarmes verabreicht, die gegen Parietaria-Pollen allergisch sind.

Die Ergebnisse dieses Experimentes können aus Tabelle 4 abgelesen werden. Diese beziehen sich auf die Messung von Erythemendurchmessern 15 Minuten nach der Inokulation. Die Verdünnungslösung diente als negative Kontrolle (Coca + 0,03% Humanalbumin).

TABELLE 4 Hauttest
Konz. nativer Extrakt Konz. modifiz. Extrakt Verdünnung Patient-Nr. *Durchmesser der Erytheme (mm)

Wie aus den Werten der Tabelle 4 abgelesen werden kann, ist die Reaktivität des in alkalischem Medium mit Zyanat modifizierten Extraktes aus Parietaria-Pollen signifikant geringer, als die des zugehörigen unmodifizierten Extraktes (p< 0,01 bei allen untersuchten Konzentrationen).

BEISPIEL 3

Ein wässriger Extrakt (5% G/V) aus Dermatophagoides pteronyssinus (DP) wurde durch Lyophilisieren konzentriert, im kleinstmöglichen Volumen 20 mM Natrium Phosphat-Puffer pH 6,86 aufgenommen und über eine Sephadex_ G-25-Säule gelfiltriert, wobei die Säule mit dem selben Puffer eluiert und der Ausschlußpeak gesammelt wurde. Zu 50 mL der so erhaltenen Lösung wurden Natrium Tetraborat-decahydrat (1,92 g) und Kaliumzyanat (2,05 g), beide frisch aus 50%-Ethanol bei einer Temperatur nicht über 50 ºC umkristallisiert, zugegeben. Nach Auflösung dieser Salze und Einstellung des pH-Wertes auf 9,3 durch Zugabe von 1 M NaOH wurde der gelfiltrierte Extrakt weitere 22 Stunden lang in einem 40 ºC warmen thermostatischen Bad aufbewahrt. Während der ersten Stunden der Reaktion wurde der pH durch Zugabe von 1 M Phosphorsäure konstant gehalten. Die so erhaltene Präparation wurde erneut über eine Sephadex_ G-25-Säule gelfiltriert, um den Überschuß an Reagenz zu entfernen, dann über eine Membran mit einer Porengröße von 0,22 um (Millipore) steril filtriert und in sterilisierten Probenbehältern bei 4 ºC aufbewahrt. Der prozentuale Substitutionsgrad der Aminogruppen wurde mit dem TNBS-Test bestimmt und betrug 84%.

In vivo-Test der allergenen Aktivität

15 Balb/c-Mäuse (5 Tiere pro Gruppe) mit einem Körpergewicht von 18-20 g wurden durch intraperitoneale Verabreichung (0,25 mL) von 10 ug eines nativen DP- Extraktes oder des entsprechenden mit Zyanat in Gegenwart von 1 mg Al(OH)3 als Adjuvanz modifizierten Extraktes immunisiert. Die dritte Versuchstiergruppe erhielt lediglich 0,25 mL PBS + 1 mg Al(OH)3 nach dem bereits oben offengelegten Protokoll.

Nach 28 Tagen erhielten alle Versuchstiere eine Zusatzdosis (Booster) desselben Materials wie bei der ersten Immunisierung.

Eine Woche später wurden die Tiere getötet, das Blut der Versuchstiere jeder Gruppe wurde gepoolt und dann mit dem Maus-Ratte Passiven Hautanaphylaxie-Test auf das Vorhandensein spezifischer IgE-Antikörper untersucht.

Die in der Tabelle 5 im folgenden gezeigten Ergebnisse verdeutlichen, daß der chemisch mit Zyanat in alkalischem Medium modifizierte DP-Extrakt eine signifikant geringere Fähigkeit zur Induktion spezifischer IgE-Antikörper aufweist, als der unmodifizierte DP-Extrakt (p < 0,01).

TABELLE 5 Maus-Ratte Passiver Hautanaphylaxie-Test (PCA-Test)
Serumverdünnungen Gruppen Verdünnungslösung Nativer DP-Extrakt Modifiziert. DP-Extrakt Titer

Bemerkungen: 100 uL der Lösungen einer Verdünnungsreihe in physiologischer Lösung des Serums der mit physiologischer Lösung + 1 mg Al(OH)3 oder mit 10 ug des nativen DP-Extraktes + 1 mg Al(OH)3 oder mit modifiziertem DP-Extrakt + 1 mg Al(OH)3 behandelten Mäuse wurden Sprague-Dawley-Ratten intradermal injiziiert. Nach 48 Stunden wurde diesen Tieren 1 mL einer physiologischen Lösung intravenös injiziiert, die 1 mg des nativen DP- Extraktes und 5 mg Evans-Blau enthielt. Nach einer halben Stunde wurden die Tiere getötet und das Vorhandensein charakteristischer Flecken auf der umgestülpten Rückenhaut der Tiere wurde geschätzt. Die Verdünnung mit der geringsten Konzentration, die noch einen "Fleck" mit einem Durchmesser von 7 mm erzeugt, wurde als der PCA-Titer bezeichnet.

In vitro-Test der allergenen Aktivität

Polystyrolkügelchen wurden aktiviert und der native DP-Extrakt wurde nach einer geeigneten Vorschrift an die Kügelchen fixiert (Deutsches Patent DE 3338759C1).

20 uL des Serums eines gegen den DP-Extrakt allergischen Patienten wurden in einem Reagenzglas mit 30 uL der Lösungen einer Verdünnungsreihe des nativen DP- Extraktes oder desselben Extraktes, nach Modifikation mit Zyanat in alkalischem Medium, 3 Stunden lang bei 20 ºC inkubiert.

Danach wurde zu jedem Reagenzglas ein Kügelchen zugegeben, das zuvor mit dem DP-Extrakt sensibilisiert worden war, und die Reagenzgläser wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach geeignetem Waschen wurden 50 uL einer Human-¹²&sup5;I-anti-IgE-Lösung zugegeben und die Proben weitere 16 Stunden inkubiert.

Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung angefertigt. Nach dem Ende der Inkubationszeit wurde die Restradioaktivität der Kügelchen mit einem Gammastrahlenzähler bei (Anm. d. U.: sollte es hier "mindestens" heißen ?) ein-minütiger Zähldauer gemessen. Die relative biologische Potenz wird als diejenige Menge des Allergenextraktes ausgedrückt, die die Antwort der positiven Kontrollprobe nach der folgenden Gleichung von L. Yman um 50% zu inhibieren vermag:

((cpm positive Kontrolle)-(cpm Probe)) x 100 /(cpm positive Kontrolle)-(cpm negative Kontrolle)

wobei die "negative" Kontrolle die nicht-spezifische Radioaktivität ist (d.h. der cpm-Wert, der erhalten wird bei Zugabe von Phosphatpuffer anstelle des Patientenserums bei der Prä-Inkubation vor der Zugabe der mit dem entsprechenden Extrakt sensibilisierten Kügelchen), während die "positive" Kontrolle die maximale Radioaktivität darstellt (d.h. der Wert, der erhalten wird bei Zugabe von Phosphatpuffer anstelle der Extraktverdünnungen bei dem Inhibitionstest).

Der mit Zyanat in alkalischem Medium modifizierte Allergenextrakt aus DP erwies sich in diesem Test als signifikant weniger wirksam als derselbe unmodifizierte Extrakt und bestätigt so die verminderte allergene Reaktivität des modifizierten Extraktes (p< 0,01).

BEISPIEL 4

0,05 mL Methylisozyanat wurden zu 5 mL einer Lösung (10 mg/mL) von Ovalbumin in 0,1 M Natrium Tetraborat- Puffer, 0,2 M Imidazol enthaltend, mit einem pH-Wert von 9,3 zugegeben und die Lösung wurde im Eisbad auf 0-4 ºC gekühlt. Zugaben wurden unter Rühren zu den Zeitpunkten 0,5', 10' und 15' vorgenommen. Nach 60 Minuten wurde die Proteinlösung über eine mit 20 mM Phosphatpuffer pH 6,86 equilibrierte Sephadex G-25-Säule gelfiltriert, um den Überschuß an Methylisozyanat und dessen Abbauprodukte zu entfernen.

Der mit dem TNBS-Test bestimmte Substitutionsgrad betrug 89%. Im RAST-Inhibitionstest war das auf die beschriebene Weise modifizierte Ovalbumin signifikant weniger reaktiv als das unmodifizierte Ovalbumin.

BEISPIEL 5

0,05 mL einer 12%-igen Lösung (G/V) Methylisozyanat in Acetonitril wurde unter Rühren bei den Zeitpunkten 0', 20', 40' und 80' zu einer Ovalbuminlösung (10 mg/mL) in 0,1 Natrium Tetraborat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,3, 0,2 M Imidazol enthaltend, und im Eisbad auf 0-4 ºC gekühlt, zugegeben. Nach 3 Stunden wurde die Proteinlösung wie im vorstehenden Beispiel gelfiltriert.

Der mit dem TNBS-Test bestimmte Substitutionsgrad betrug 81%.

Im RAST-Inhibitionstest war das auf die beschriebene Weise modifizierte Ovalbumin signifikant weniger reaktiv als das unmodifiziierte Ovalbumin.

Diese Erfindung wurde offengelegt mit spezifischem Bezug auf einige besondere Ausführungsarten derselben, allerdings mit dem Verständnis, daß Modifikationen und/oder Veränderungen von den mit der Technik vertrauten ohne Abweichung von Geist und Rahmen der Erfindung eingeführt werden können.


Anspruch[de]

1. Chemisch-modifizierte Allergene, deren allergene Aktivität im Vergleich zu dem entsprechenden nativen Allergenstoff vermindert ist und die in der Lage sind, spezifische, gegen den vorgenannten nativen Allergenstoff gerichtete Antikörper zu induzieren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Großteil der primären Aminogruppen des Proteinmoleküls chemisch so modifiziert ist, daß diese die folgende Struktur annehmen:

-NH-(C=X)-NH-R&sub1; (1)

worin X ein O, S oder NR&sub2; darstellt, R&sub2; ein H, eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe oder eine CN-Gruppe repräsentiert, und R&sub1; ein H, eine Alkylgruppe mit 1-8 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe oder eine Arylalkylgruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylgruppe mit einem Heterozyklus repräsentiert und die vorgenannten Derivate weiterhin dadurch gekennzeichnet sind, daß sie nicht polymerisiert sind und daß sie in einem wässrigen Medium löslich und gegen tryptischen Angriff resistent sind.

2. Allergene nach Anspruch 1, worin der durchschnittliche Prozentsatz der modifizierten primären Aminogruppen im Bereich von 75 bis 100% liegt.

3. Allergene nach dem Anspruch 2, bei denen der besagte Prozentsatz bei ungefähr 90% liegt.

4. Chemisch-modifizierte Allergene, deren allergene Reaktivität im Vergleich zu der des betreffenden nativen Allergenmaterials vermindert ist, und die in der Lage sind, spezifische gegen das betreffende native Allergenmaterial gerichtete Antikörper zu induzieren, worin vorgenannte chemisch-modifizierte Allergene dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus den betreffenden nativen Allergenen durch Behandlung mit einem Alkalimetallzyanat, einem organischen Isozyanat oder einem organischen Isothiozyanat in alkalischem Medium erhalten werden können.

5. Allergene nach Anspruch 4, worin die vorgenannte Behandlung mit einem Alkalimetallzyanat bei einem pH-Wert zwischen 7 und 11, bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 50 ºC und innerhalb einer Gesamtzeit zwischen 12 und 36 Stunden durchgeführt wird.

6. Allergene nach Anspruch 5, worin der pH-Wert während der vorgenannten Behandlung zwischen 9 und 9,6 liegt.

7. Allergene nach Anspruch 5, worin die Temperatur während der vorgenannten Behandlung zwischen 35 ºC und 40 ºC beträgt.

8. Allergene nach Anspruch 5, worin die Gesamtzeit der vorgenannten Behandlung zwischen 16 und 24 Stunden beträgt.

9. Allergene nach Anspruch 4, worin die vorgenannte Behandlung mit einem organischen Isozyanat oder mit einem organischen Isothiozyanat bei einem pH-Wert zwischen 7 und 11, bei einer der Raumtemperatur gleichen oder niedrigeren Temperatur und während einer Gesamtzeit zwischen 30 Minuten und 8 Stunden durchgeführt wird.

10. Allergene nach Anspruch 9, worin der pH-Wert während der vorgenannten Behandlung zwischen 9 und 9,6 liegt.

11. Allergene nach Anspruch 9, worin die Temperatur während der vorgenannten Behandlung zwischen 0 ºC und 5 ºC beträgt.

12. Allergene nach Anspruch 9, worin die Gesamtzeit der vorgenannten Behandlung zwischen 2 und 4 Stunden beträgt.

13. Ein Verfahren zur Herstellung der chemischmodifizierten Allergene im Einklang mit den vorangegangenen Ansprüchen, worin das Verfahren aus der Behandlung des zugehörigen nativen Allergenmaterials mit einem Alkalimetallzyanat oder mit einem organischen Isozyanat oder mit einem organischen Isothiozyanat in alkalischem Medium besteht.

14. Ein Verfahren nach Anspruch 13, worin die vorgenannte Behandlung bei einem pH-Wert zwischen 9 und 9,6 durchgeführt wird.

15. Ein Verfahren nach den Ansprüchen 13 oder 14, worin vorgenannte Behandlung mit einem Alkalimetallzyanat bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 50 ºC und während einer Gesamtzeit zwischen 12 und 36 Stunden durchgeführt wird.

16. Ein Verfahren nach dem Anspruch 15, worin die vorgenannte Temperatur zwischen 35 ºC und 40 ºC beträgt.

17. Ein Verfahren nach den Ansprüchen 13 oder 14, worin vorgenannte Behandlung mit einem organischen Isozyanat oder einem organischen Isothiozyanat bei Raumtemperatur oder einer niedrigeren Temperatur und während einer Gesamtzeit zwischen 30 Minuten und 8 Stunden durchgeführt wird.

18. Ein Verfahren nach dem Anspruch 17, worin die vorgenannte Temperatur zwischen 0 ºC und 5 ºC beträgt.

19. Pharmazeutische Präparationen, die die nach den vorstehenden Ansprüchen 1-12 chemisch-modifizierten Allergene zusammen mit einem physiologisch verträglichen Trägerstoff oder Arzneimittelträger enthalten.







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