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Dokumentenidentifikation DE69019291T2 21.09.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0424748
Titel Synthetische HTLV-I Hüll-Peptide.
Anmelder F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, CH
Erfinder Buonagurio, Deborah Anne, Mamronek, N.Y. 10543, US;
Longiaru, Mathew, West Orange, N.J. 07052, US
Vertreter Lederer, Keller & Riederer, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69019291
Vertragsstaaten BE, CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 12.10.1990
EP-Aktenzeichen 901195602
EP-Offenlegungsdatum 02.05.1991
EP date of grant 10.05.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.09.1995
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse A61K 39/21   C12P 21/02   G01N 33/569   C12N 15/62   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein synthetisches Gen, das für ein Epitop aus der immundominanten, konservierten Region des HTLV-I gp21 Hüllproteins kodiert, wie auch Hybridgene, die dieses synthetische Gen in Konjugation mit anderen Nukleotidsequenzen, die für ein oder mehrere Epitope aus den gp46 und gp21-Regionen des HTLV-I Hülproteins kodieren. Ebenfalls eingeschlossen sind die entsprechenden Polypeptide, rekombinante Vektoren enthaltend diese Gene, einzellige Wirtsorganismen enthaltend solche Vektoren, Methoden zur Herstellung der Polypeptide und Methoden zum Detektieren von Antikörpern gegen HTLV-I unter Verwendung der erfindungsgemässen Polypeptide.

Der humane T-Zell-Keukämie Virus Typ I (HTLV-I) ist ein Typ C Retrovirus, welcher in einigen Gebieten von Japan, der Karibik, Afrika, den südöstlichen Vereinigten Staaten und Südamerika endemisch ist. Man vermutet, dass in Japan mehr als 1% der 9 Millionen Blutspender vor dem Blutscreening mit dem Virus infiziert sind und dass 35% der Bevölkerung von Okinawa infiziert sein könnte (Swinbanks, Natur 323, 384 [1986]. HTLV-I ist das ätiologische Agens für T-Zell-Keukämie von Erwachsenen (ATL), einer aggressiven Leukämie, die vorwiegend die T4 Helferzellen attackiert. ATL-Patienten produzieren Antikörper gegen die Hauptproteine des Virus und die provirale DNA kann integriert in die DNA der Leukämiezellen gefunden werden. Eine Anzahl von proviralen HTLV-I Genomen wurden molekular kloniert und die gesamte Nukleotidsequenz von einem der proviralen DNAs wurde bestimmt (Seiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3618-3622 [1983]). HTLV-I ist verknüpft mit einer Anzahl von neurologischen Störungen, einschliesslich tropischer spastischer Paraparese, HTLV-I assoziierter Myelopathie und Multipler Sklerose. HTLV-I könnte ebenfalls eine indirekte Rolle in der Entstehung chronischer lymphozytischer Leukämie von B-Zellen spielen.

Die Arten der Uebertragung von HTLV-I ähneln denen des humanen Immunschwäche-Virus (HIV-1), dem ursächlichen Agens von AIDS. Uebertragung von HTLV-I kann durch Sexualkontakt, Transfusion von Antikörper-positivem Blut und Blutkomponenten und durch gemeinsames Benutzen von kontaminierten Nadeln unter Drogenabhängigen erfolgen. Das Virus kann von der Mutter durch die Plazenta auf das Kind oder durch Weitergabe von infizierten Zellen mit der Brustmilch übertragen werden. Die offensichtlichen Aehnlichkeiten zwischen den Uebertragungsarten von HIV-1 und HTLV-I zeigen, dass Populationen mit einem Risiko für HIV-1 Infektionen ebenfalls ein Risiko für HTLV-I Infektionen haben. Es gibt viele Berichte über AIDS-Patienten, die Antikörper gegen HTLV-I haben. Obwohl das Vorkommen von HTLV-I Infektionen in der Bevölkerung noch sehr niedrig ist (weniger als 1%), ist das Virus unter intravenösen Drogenkonsumenten verbreitet. Weiterhin ist über eine Ausbreitung der Seropositivität für das humane T-Zell Leukämie-Virus Typ II (HTLV-II) in dieser Bevölkerungsgruppe berichtet worden.

HTLV-II ist nahe verwandt mit HTLV-I (kreuzreaktive Antigene) und wurde ursprünglich aus einem Patienten mit Haarzell-Leukuamie isoliert. Eine Studie durch Williams und Mitarbeiter (1988) über die Serumprävalenz von HTLV-I Infektionen in US-Blutspendern zeigte, dass 0.025% von zufällig ausgewählten Blutspendern in acht geografisch getrennten Gebieten der Vereinigten Staaten serologische Anzeichen von HTLV-I Infektionen aufwiesen. Basierend auf diese Prävalenz von HTLV-I Infektionen prophezeihen die Untersucher die Infizierung von ungefähr 2800 Blutempfängern jährlich.

Das Amerikansiche Rote Kreuz begann die Testung von Spenderblut auf HTLV-I im Dezember 1988, um die nationalen Blutlieferungen zu schützen und die Ausbreitung von HTLV-I Infektionen aufzuhalten. Die Antikörper-Screeningtests beinhalten halbgereinigtes, aufgetrenntes Virus aus kultivierten humanen T-Zell-Linien. Es gibt inherente Probleme mit viralen Lysatassays, die durch HIV-1 Screeningtests bestätigt werden, eines davon ist eine hohe Anzahl von Falsch-Positiven.

WO-A-90/15 075 (publiziert 13. Dezember 1990) offenbart die Nukelotidsequenz, die für einen grossen Teil des HTLV-I Hüllproteins kodiert. Sie offenbart ebenfalls einen rekombinanten Vektor, enthaltend die Sequenzen kodierend für diesen Teil des HTLV-I env-Proteins, die Expression des HTLV-I env-Proteins und die Detektion von Antikörpern unter Verwendung dieses env-Proteins. EP-181 107 offenbart zwei Polypeptide aus gp46 und gp21 des HTLV-I env-Proteins, ihre Expression und immunologische Antivität. Sisk et al. (Gene 48 [1986] 183-193) offenbart die Expression einer Subsequenz des HTLV-I env-Proteins (Aminosäuren 210-400) als Fusion mit lacZ. Keine dieser Referenzen beschreibt ein Polypeptid entsprechend den Aminosäuren 342-434 des gp21 Hüllproteins oder Fusionsproteine, die teilweise aus diesem Polypeptid bestehen.

Die Erwünschtheit rekombinanter DNA-Technologie zur Herstellung von HTLV-I Antigenen zum Einsatz in einem HTLV-I Antikörper Screeningassay unter Verwendung von rekombinanten Proteinen als Testantigenen, sollte zu einer Entwicklung von Immunoassays mit höherer Sensitivität und Spezifität als in derzeit erhältlichen viralen Lysattests führen.

Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung:

- eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Epitop aus der immundominanten, konservierten Region der gp21 Region des HTLV-I Hüllproteins (HTLV-I env) enthält,

- ein Hybridgen, enthaltend eine erste Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Epitop aus der immundominanten, konservierten Region der gp21 Region von HTLV-I env enthält, welches am Carboxyende an eine zweite Nukleotidsequenz fusioniert ist, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Epitop aus der gp46, gp 21 oder der gp46 und gp21 Region von HTLV-I env enthält,

- die den Nukeotidsequenzen der vorliegenden Erfindung entsprechenden Polypeptide, insbesondere ein Polypeptid enthaltend HTLV-I abgeleitete Aminosäuren mit einem Epitop aus der immundominanten, konservierten Region der gp21 env Region von HTLV-I, worin die HTLV-I abgeleiteten Aminosäuren mit einem Epitop in dem Polypeptid aus Aminosäuren 342-434 der gp21 Region von HTLV-I env bestehen, welche wahlweise Aminosäure-Substitutionen enthalten, die die biologische Aktivität nicht wesentlich verändern. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Hybridpolypeptid, umfassend eine erste Aminosäuresequenz, enthaltend ein Epitop aus der immundominanten, konservierten Region von HTLV-I env gp21, fusioniert am Carboxyterminus an eine zweite Aminosäuresequenz, enthaltend ein Epitop aus HTLV-I env gp46, env gp21 oder gp46 und gp21,

- rekombinante Vektoren enthaltend die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung,

- einzellige Wirtsorganismen enthaltend rekombinante Vektoren, die die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten,

- ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des den rekombinanten Vektor enthaltenden einzelligen Wirts, wobei unter geeigneten Bedingungen die entsprechenden Hybridproteine hergestellt werden,

- ein Verfahren zum Detektieren von Antikörpern für HTLV-I Hüllproteine, das die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden ERfindung als Antigene beinhaltet.

Beschreibung der Zeichnungen Figur 1:

Veranschaulicht die Nukleotidsequenz des synthetischen ENV93 Gens. Der obere Strang repräsentiert die kodierende Sequenz. Die Aminosäuresequenz entspricht Aminosäuren 343-434 des HTLV-I Hüllpolyproteins innerhalb der gp21 Transmembranregion. Die authentische provirale DNA- Sequenz wurde in Codons umgewandelt, die bevorzugterweise in E.coli Genen verwendet werden, die auf hohem Niveau exprimiert werden. Ueberlappende BamHI Enden wurden in die 5' Enden des Konstrukts inkorporiert, um die Insertion in die einzige BamHI Schnittstelle des pDS56/RBSII Expressionsvektors zu erleichtern. Die Pfeilspitzen bezeichnen die Oligonukleotide 1-14, die verknüpft und in vier Blöcken ligiert wurden, um zum Endprodukt zu gelangen.

Figur 2:

Illustriert den Zusamenbau des synthetischen ENV93 Gens, das durch schrittweise Ligation von 14 überlappenden Oligonukeotidfragmenten hergestellt wurde. Das Gen wurde in vier Blöcke getrennt: Block 1: Oligos 1, 2, 8, 9; Block 2: Oligos 3, 4, 10, 11; Block 3: 5, 6, 12, 13; Block 4: 7, 14. Alle oligonukleotide, mit Ausnahme er 5' terminalen Fragmente 1 und 14, wurden an ihren 5' Enden phosphoryliert. Zuerst wurden die Oligonukleotide jeden Blocks zusammengebracht und ligiert. Die Blöcke wurden dann miteinander verschmolzen und zur Herstellung des ENV93 Produktes ligiert. Pfeilspitzen markieren die Grenzen der 14 Oligonukleotidebausteine. Der 5' Terminus der Duplex (Oligos 1 und 14) wurden phosphoryliert, um die Insertion in den gewünschten Klonierungsvektor zu erleichtern.

Figur 3:

Illustriert die Insertion des ENV93 Konstrukts in die BamHI Schnittstelle von pDS56/RBSII. Vektor pDS56/RBSII (Stueber et al., EMBO J. 3, 3143-3148 [1984]) wurde für die Expression von Fremdgenen in E.coli entwickelt. Die Klonierungsregion mit dem Polylinker ist durch das regulierbare Promoter/Operator Element P/02 (Fusion zwischen dem Coliphagen T5 Promoter und dem E.coli lac Operator) und den Lambda t&sub0; Terminator flankiert. Zwei E.coli Indikatorgene sind anwesend: bla (β - Lactamase) mit eigenem Promotor und ribosomaler Bindungsstelle, die Resistenz für Ampicillin verleiht, und CAT (Chloramphenicol-Acetyl- Transferase) mit ihrer eigenen ribosomalen Bindungsstelle. Dem CAT-Gen folgt abwärts der t&sub1; Terminator des rrnB Operons, der das Durchlesen der Transkription von CAT in den aus pBR322 abgeleiteten Replikationsursprung verhindert. Unmittelbar oberhalb der Polylinkerstelle ist das ATG Startcodon zusammen mit der synthetischen ribosomalen Bindungsstelle RBSII. Das pDS56/RBSII Expressionssystem umfasst drei Vektoren, die in ihrer dem ATG Codon benachbarten Basenanzahl differieren und daher alle drei Leserahmen der zu exprimierenden Fremd-DNA ermöglichen. Diese Vektoren können nur in E.coli Zellen stabil gehalten werden, die das kompatible Plasmid pDMI-1 enthalten. Der lac Repressor wird von pDMI-1 überproduziert und verleiht damit Resistenz gegen Kanamycin durch Expression des Neomycin-Phosphortransferase-Gens.

Figur 4:

Illustriert die Nukleotid und abgeleitete Aminosäuresequenz des mittels des pDS56/RBSII Vektors exprimierten rekombinanten ENV93 Proteins. Das translatierte Protein ist 106 Aminosäuren lang. Die unterstrichenen Aminosäuren an Amino- und Carboxyterminus sind aus Vektorsequenzen abgeleitet. Der Rest des Proteins sind die 93 Aminosäuren, die den Aminosäuren 342-434 des gp21 Transmembran-Hüllproteins des HTLV-I Virus entsprechen.

Figur 5:

Illustriert die Expression des HTLV-I ENV93 Proteins in E.coli Zellen W3110, HE5505 und JE5506. Ganze Zellysate, erhalten aus bakteriellen Kulturen nach 0, 2 und 4 Stunden Induktion sowie nach 4 Stunden ohne Induktion, wurden elektrophoretisch in einem mit Coomassie Blau R250 gefärbten 12% Polyacrylamid/SDS Gel aufgetrennt. Die Pfeilspitze weist auf die Position des ENV93 Proteins bei ungefähr 12 Kd, das nur in den IPTG- induzierten proben vorhanden ist.

Figur 6:

Illustriert schematisch die Struktur des proviralen HTLV-I Genoms. Die komplette Nukleotidsequenz des Genoms wurde durch Seiki et al., supra, bestimmt. Die das Hüllprotein kodierende Region ist vergrössert, um die Nukeotid- und Aminosäurepositionen der Restriktionsschnittstellen innerhalb der gp46 und gp21 Domänen zu zeigen. Die Kartenposition des synthetischen ENV93 Genkonstruktes ist angegeben. Die gezeigten Restriktionsschnittstellen wurden zur Generierung der Hüllfragmente III, IIIA, IIIB', II, I und II+I verwendet, die fast die ganze kodierende Region umfassen. Die Zahl der in jedem Fragment vorhandenen Aminosäuren ist direkt über dem Fragment angegeben. Diese DNA Stücke wurden hinter ENV93 in den pDS56/RBSII Vektor kloniert, um eine Expression der kodierten Epitope als ENV93 Fusionsproteine auf hohem Niveau zu erreichen.

Figur 7:

Illustriert exprimierte HTLV-I Hüllproteine. Verschiedene Regionen der die Hülle kodierenden Sequenz wurden hinter das synthetische ENV93 Gen in den pDS56/RBSII Vektor ligiert. Rekombinante Fusionsproteine wurden in E.coli exprimiert und die Proteine, die die grösste Reaktivität im EIA aufwiesen, sind dargestellt.

Figur 8:

Illustriert die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des exprimierten rekombinanten ENV93/HTLV-I-IIIB' Proteins. Das Protein ist 158 Aminosäuren lang. Die unterstrichenen Reste sind entweder das Ergebnis von Vektorsequenzen oder Linkersequenzen, die zur Herstellung des Konstruktes verwendet wurden.

Figur 9:

Illustriert die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des ENV93/HTLV-I-I Fusionsproteins. Das Polypeptid hat 245 Aminosäuren. Die unterstrichenen Aminosäurereste sind nicht in der HTLV-I Hüllsequenz vorhanden. Diese irrelevanten Sequenzen sind entweder Vektorspezifisch oder durch die zur Generierung des DNA Konstrukts verwendeten synthetischen Linker kodiert.

Figur 10:

Illustriert die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des rekombinanten ENV93/HTLV-I-II+I Hüllproteins. Das Polypeptid ist 344 Aminosäuren lang. Die unterstrichenen nicht-spezifischen Reste sind von Vektorsequenzen kodiert.

Figur 11:

Illustriert die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des rekombinanten ENV93/HTLV-I-II Proteins. Das Protein ist 217 Aminosäuren lang. Die unterstrichenen Reste sind entweder durch Vektorsequenzen oder durch den für die Herstellung des Konstruktes verwendeten synthetischen Linker kodiert.

Figur 12:

Illustriert die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des ENV93/HTLV-I-III Fusionsproteins. Das Polypeptid ist 315 Aminosäuren lang. Die unterstrichenen nicht-spezifischen Reste sind entweder durch Vektor- oder synthetische Linkersequenzen kodiert.

Figur 13:

Illustriert die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des rekombinanten ENV93/HTLV-I-IIIA Hüllproteins. Das Protein ist 249 Aminosäuren lang. Die unterstrichenen Reste werden durch Vektor- oder synthetische Linkersequenzen beigesteuert.

Figur 14:

Illustriert die Immunreaktivität von verschiedenen rekombinanten HTLV-I Proteinen. OD&sub4;&sub9;&sub2; Werte sind angegeben für ENV93/HTLV-I-I, ENV93/HTLV-I-II und ENV93/HTLV-I-II+I. Die HTLV-I positiven Proben wurden von Boston Biomedical, Inc. (BBI) erhalten und die negativen Proben wurden von der Western States Plasma Company, Inc. (WSP) gekauft. Proben Nrn. 6595 und 9100 repräsentieren hochreaktive positive Kontrollen.

Die Methoden dieser Erfindung umfassen eine Vielzahl von Schritten, die in logischer Abfolge enthalten: (1) Herstellen der Gene, die das Gen- Konstrukte der Erfindung kodieren, (2) Insertion dieser Gene in ein geeignetes Klonierungsvehikel zur Herstellung eines rekombinanten Vektors enthaltend die Genkonstrukte, 93) Transfer des rekombinanten Klonierungsvehikels in einen kompatiblen Wirtsorganismus, (4) Selektion und Wachstum eines solchen modifizierten Wirts, der die inserierten Gensequenzen exprimiert, (5) Identifizierung und Reinigung des Genprodukts, und (6) Verwendung des Genprodukts zum Detektieren von Antikörpern gegen HTLV-I.

1. Herstellung der Gene

Das erste Genkonstrukt der Erfindung besteht aus einer Nukleotidsequenz, kodierend für ein Polypeptid, enthaltend ein Epitop aus der immundominanten, konservierten Region der gp21 Region von HTLV-I env. Die ganze Nukleotidsequenz des HTLV-I Genoms ist bestimmt worden (siehe Seiki et al., supra). Jeder Teil dieser Sequenz, die für ein Epitop aus der immundominanten, konservierten Region kodiert, ist für das Genkonstrukt der Erfindung geeignet. Die Nukleotidsequenz, die zum Herstellen der als ENV93 bezeichneten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet wird, entspricht vorzugsweise den Aminosäuren 342- 434 der HTLV-I Hülle (numeriert gemäss Seiki). Die Nukleotidsequenz kann mittels bekannter Methoden, wie etwa chemischer Synthese unter Verwendung eines DNA Synthesizers, hergestellt werden (Certa et al., EMBO J. 5, 3051-3056 [1986]). Die entsprechenden Nukleotidsequenzen können ebenfalls aus humanen T-Zell-Linien erhalten werden, die durch HTLV-I Virions viral transformiert worden sind, wie dies in Yoshida et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 79, 2031-2035 [1982] und Poiesz et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 77, 7415-7419 [1980], ausgeführt wird. Die DNA Fragmente können dann nach bekannten Methoden isoliert, eine cDNA Bibliothek hergestellt und die gewünschten Hüllgenfragmente durch Absuchen der cDNA Bibliothek erhalten werden. Gemäss der Beschreibung in Manzari et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 1574-1578 [1983], und der Europäischen Patentanmeldung mit der Publikationsnummer 181107, können HTLV-I Hüllfragmente auch aus Plasmiden, wie etwa dem als dCRXl bezeichneten Plasmid, das Env, pX und LTR von HTLV-I enthält, erhalten werden.

In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde eine Nukleotidsequenz entsprechend den Aminosäuren 342-434 der HTLV-I Hülle durch chemische Synthesemethoden hergestellt. Zur Erleichterung der Synthese wurde die Gensequenz in Oligonukleotidfragmente aufgetrennt und mit einem DNA-Synthesizer hergestellt. Die einzelsträngigen DNA Fragmente wurden nach Polyacrylamid-Gelelektrophorese aus dem Gel isoliert. Die Nukleotidsequenzen wurden dann in einer schrittweisen Ligation vereinigt und ergaben das als ENV(93) bezeichnete Genkonstrukt:

Die Nützlichkeit des ENV(93) Genkonstruktes besteht darin, dass es alleine oder als ein geeigneter Träger für die hohe Expression von anderen Epitopen von HTLV-I env als Fusionsproteine verwendet werden kann. Wenn ENV(93) als Träger benutzt wird, ist es Teil eines Hybridgens, welches ENV(93) enthält, das an eine Nukleotidsequenz fusioniert ist, die für eine oder mehrere Epitope aus den gp46 und gp21 Regionen des HTLV-I Hüllproteins kodiert. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ENV(93) beispielsweise an verschiedene Subsequenzen, die, wie in den Figuren 6 und 7 beschrieben, innerhalb der gp46 und gp21 Regionen liegen, fusioniert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls solche Hybridgene, die aus ENV(93) bestehen, das an die folgenden Teile von HTLV-I env fusioniert ist:

Nukleotide 6101-6499 (I)

Nukleotide 5780-6103 (II)

Nukleotide 5180-5779 (III)

Nukleotide 5255-5677 (IIIA)

Nukleotide 5780-6499 (II + I)

Nukleotide 5672-5827 (IIIB')

Die resultierenden Hybridgene (mit den nachfolgend beschriebenen abgeleiteten Aminosäuresequenzen) sind wie folgt:

ENV(93)/HTLV-I-I

wie in Figur 9 beschrieben

ENV(93)/HTLV-I-II

wie in Figur 11 beschrieben

ENV(93)/HTLV-I-II+I

wie in Figur 10 beschrieben

ENV(93)/HTLV-I-III

wie in Figur 12 beschrieben

ENV(93)/HTLV-I-IIIA

wie in Figur 9 beschrieben

ENV(93)/HTLV-I-IIIB'

wie in Figur 8 beschrieben

2. Herstellung der Polypeptide

Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Polypeptide, die den vorstehend erwähnten Genkonstrukten entsprechen. Die Polypeptide können mittels dem Fachmann bekannter synthetischer Methoden hergestellt werden, wie etwa der Festphasen- oder Flüssigphasen-Synthese, bzw. durch rekombinante Herstellung. Mit rekombinanten Methoden wird das Genkonstrukt in einen geeigneten Vektor plasmidischen oder phagischen Ursprungs inseriert. Geeignete Expressionsvektoren aus Plasmiden oder Phagen sind z.B. im Laborhandbuch "Molecular Cloning" von Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, erwähnt.

In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entspricht das Peptid einem Epitop aus der immundominanten, konservierten Region der gp21 Region von HTLV-I env, vorzugsweise Aminosäuren 342-434 aus der gp21 Region von HTLV-I env, mit einer Aminosäuresequenz wie in Figur 4 (Env93) beschrieben.

Das ENV93 Polypeptid kann alleine oder als Teil eines Hybridpolypeptids oder Fusionsproteins verwendet werden. Wenn es als Teil eines Hybridpolypeptids verwendet wird, entspricht die erste Sequenz einem Epitop aus der immundominanten, konservierten Region von HTLV-I env, fusioniert an deren Carboxyterminus eine zweite Aminosäuresequenz fusioniert ist, die für eine oder mehrere Epitope aus der gp46, gp21 oder der gp46 und gp21 Region von HTLV-I env kodieren. In der bevorzugten Ausführungsform ist ENV93 mit verschiedenen Subsequenzen fusioniert, die innerhalb der gp46 und gp21 Region liegen, wie sie untenstehend aufgeführt sind:

a) Aminosäuren 308-440 von gp46 und gp21 (I)

b) Aminosäuren 201-308 von gp46 (II)

c) Aminosäuren 201-440 von gp46 und gp21 (II + I)

d) Aminosäuren 1-200 von gp46 (III)

e) Aminosäuren 26-166 von gp46 (IIIA)

f) Aminosäuren 165-216 von gp46 (IIIB')

Die Sequenzen sind in Figuren 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13 beschrieben.

Aminosäure-Substitutionen, die nicht wesentlich die biologischen Aktivitäten des Proteins beeinflussen, sind bekannt und beispielsweise durch H. Neurath und R.L. Hill in "The Proteins", Academic Press, New York [1979], beschrieben. Die am häufigsten beobachteten Aminosäure- Substitutionen sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, und umgekehrt. Jegliche Polypeptide, die solche Substitutionen enthalten, werden als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung angesehen.

3. Herstellung des rekombinanten Vektors enthaltend das ENV(93) Konstrukt

In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das ENV(93) Genkonstrukt in einen Vektor inseriert, der für die Expression von Fremdgenen in E.coli, nämlich Vektor pDS56/RBSII (Stueber et al., supra), entwickelt wurde. Figur 3 und dessen Legende illustrieren diesen Prozess im Detail. Allerdings sind auch andere Vektoren, wie etwa das Plasmid pDS8/RBSII oder das Plasmid pA-env-20, geeignet. Diese Plasmide enthaltenden E.coli Stämme sind von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) unter der Zugangsnummer DSM 3519 bzw. DSM 3516 frei erhältlich. Eine Vielzahl von anderen rekombinanten Vektoren und einzelligen Wirten sind geeignet, solange sie die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung ermöglichen.

4. Verfahren zur Herstellung der Peptide der vorliegenden Erfindung

Das Verfahren zur Herstellung der eerfindungsgemässen Peptide ist im Detail in den Figuren und Beispielen erklärt und besteht im wesentlichen aus der unter geeigneten Bedingungen erfolgenden Kultivierung des den rekombinanten Vektor enthaltenden einzelligen Wirts, der das entsprechende Hybridprotein herstellt.

5. Verfahren zum Detektieren von Antikörpern für HTLV-I Hüllproteine

Die Entwicklung eines auf rekombinanten viralen Proteinen basierenden Antikörper-Screeningtests für HTLV-I verlangt 1) die Selektion eines Epitopes, das immundominant und unter Virusisolaten konserviert ist; 2) eine Expression des Epitops in einem geeigneten Vektor/Wirts-System auf hohem Niveau; und 3) Reinigung des rekombinanten proteins zur Homogenität und in grosser Ausbeute aus dem Wirt, in dem es produziert wurde. Um dieses Ziel zu erreichen, wird das ENV(93), das die Aminosäuren 343- 434 des HTLV-I Hüllproteins innerhalb der gp21 Region kodiert, durch chemische und enzymatische Methoden hergestellt. Diese Region der Hülle wurde ausgewählt, weil die korrespondierende Region (gp41) der HIV-1 Hülle eine Anzahl von konservierten und immunreaktiven Epitopen enthält (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 6159-6163 [1986]; Gnann et al., J. Virol., 61, 2639-2641 [1987] und J. Infect. Dis. 156, 261-267 [1987]). Zusätzlich zeigen die Hydrophobizitätsprofile von sowohl HTLV-I wie auch von HIV-1 Hüllpolypeptiden aus der Transmembran-Region ähnliche Muster, die darauf hinweisen, dass diese Region der HTLV-I Hülle wichtig in der Immunantwort sein könnte. Die authentische Nukleotidsequenz, die für Aminosäuren 342-434 des Hüllproteins kodiert, wurde so abgewandelt, dass nicht oft verwendete Codons in der Translation von E.coli-Proteinen durch solche ersetzt wurden, die bevorzugt von der E.coli Translationsmaschinerie verwendet werden (Ikemura, J. Mol. Biol., 146, 1-21 [1981]; Grosjean und Fiers, Gene 18, 199-209 [1982]). Diese Strategie wurde in der Hoffnung auf maximale Expression des ENV93 Epitops in dem bakteriellen Wirt angewandt. Ein ähnlicher Ansatz wurde in der Konstruktion eines synthetischen HIV-1 Genes gewählt, der zu einer Expression des kodierten Epitops in E.coli auf hohem Niveau führte (Certa et al., supra).

Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Methoden als diagnostische Reagenzien für die Detektion von Antikörpern gegen HTLV-I verwendet werden.

Die Western-Blotting Analyse ist zum Beispiel dazu geeignet (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 [1979]). Gemäss dieser Technik wird das Polypeptid der vorliegenden Erfindung aus dem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch auf Nitrocellulose-Papier transferiert. Dieses Nitrocellulose-Papier wird dann mit dem zu testenden Serum behandelt. Nach dem Waschen wird das Nitrocellulose-Papier mit Peroxidase markiertem anti-human IgG behandelt. Danach wird die Proxidase durch ein geeignetes Substrat, wie z.B. O-Phenylendiamin, bestimmt. Natürlich können auch andere Markierungen, wie etwa radioaktive oder Fluoreszenz- Markierungen, verwendet werden.

Eine geeignetere Technik für die Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-I, unter Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung, ist die enzymverbundene Immunoabsorptionsbestimmung (ELISA). Diese Bestimmung umfasst:

(a) Immobilisierung eines erfindungsgemässen Polypeptids auf einen festen Träger;

(b) In Kontakt bringen einer menschlichen Serumprobe, die verdächtigt wird, Antikörper gegen HTLV-I zu enthalten, mit dem immobilisierten Polypeptid aus Schritt (a) und Erlauben, dass sich der immobilisierte Polypeptid-Antikörper-Komplex bilden kann;

(c) Wegwaschen von ungebundenem Material von den Komplexen aus Schritt (b); und

(d) Detektieren dieser Komplexe durch die Zugabe von einem markierten Reagenz, das zur selektiven Detektion von humanen Antikörpern fähig ist, wie etwa markiertes Staphylococcus Aureus Protein A oder antihuman IgG, wodurch die Gegenwart von Antikörpern gegen HTLV-I Viren im Serum angezeigt wird.

Geeignete feste Träger sind die inneren Wände von Testgefässen (Teströhrchen, Titerplatten, Küvetten oder Glas oder künstliches Material) wie auch die Oberfläche von festen Körpern (Stäbe aus Glas oder künstlichem Material, Stäbe mit endständigen Verdickungen, Stäbe mit terminalen Lappen oder Lamellen). Kügelchen aus Glas oder künstlichem Material sind besonders geeignete Festphasenträger.

Geeignete Markierungen sind alle detektierbaren Funktionalitäten, die nicht in die Bindung des Reagenzes an dessen Bindungspartner eingreifen. Zahlreiche Markierungen sind zur Verwendung in ELISA-Assays oder anderen Immunoassays bekannt, z.B. Meerrettich Peroxidase, Radioisotope wie ¹&sup4;C und ¹³¹J, Fluorophore, wie Seltenerdchelate oder Fluorescein, Spinmarkierungen und dergleichen.

In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein ELISA (EIA) Assay unter Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung durchgeführt, die, wie in Beispiel 9 beschrieben, an Kugeln immobilisiert sind.

Eine andere geeignete Methode zur Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-I mit Polypeptiden der vorliegenden Erfindung ist ein Enzymimmunologischer Test gemäss der sogenannten "Doppel-Antigen-Sandwich-Methode". Diese Methode basiert auf der Arbeit von Maiolini, Immunological Methods 20, 25-34 [1978]. Gemäss dieser Methode wird das zu testende Serum mit dem oben definierten festen Träger, auf dem die Polypeptide der vorliegenden Erfindung aufgebracht sind, und mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das mit Peroxidase markiert ist, in Kontakt gebracht. Die immunologische Reaktion kann in einem oder in zwei Schritten durchgeführt werden. Wenn die immunologische Reaktion in zwei Schritten durchgeführt wird, erfolgt ein Waschschritt zwischen den zwei Inkubationen. Nach der oder den immunologischen Reaktion/Reaktionen wird ein Waschschritt durchgeführt. Danach wird die Peroxidase mit einem Substrat, wie etwa O-Phenylendiamin, bestimmt. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die nur zum Zweck der Illustration dienen, weiter beschrieben.

Die oben beschriebenen Methoden für die Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-I können in geeigneten Testkits durchgeführt werden, die in einem Behälter ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthalten.

Beispiel 1 SYNTHESE VON ENV93 OLIGONUKLEOTIDEN

Das synthetische Gen wurde so in 14 Oligonukleotidfragmente (Figuren 1 und 2) aufgeteilt, dass eine Einzelstrang-Sequenz mit 12-14 Nukleotiden überlappt. Die resultierenden Fragmente waren 30-46 basen lang. Die einzelnen Oligonukleotide wurden an einem MilliGen 7500 und Applied Biosystems 380 DNA Synthesizer, unter Verwendung von derivatisiertem, porenkontrolliertem Glas als festem Träger, hergestellt. Die einzelsträngigen DNA-Fragmente wurden aus einem 7M Harnstoff enthaltenden 12% Polyacrylamidgel isoliert und über einer Sep-Pak C18 Kartusche (Waters Associates/Millipore) entsalzt. Die DNA-Konzentration wurde durch messen der UV-Absorption bei 260nm in einem Spectrophotometer bestimmt.

Beispiel 2 ZUSAMMENBAU DES ENV93 GENS

Zwei Microgramm (150 pmol) der Oligonukleotide 2-13 wurden in getrennten 50ul Reaktionen, bestehend aus 50mM Tris-HCl, pH 7.5, enthaltend 10mM MgCl&sub2;, 5mM DTT, 0.1mM Spermidin, 0.1mM EDTA, 0.1mM ATP, 0.21 pmol-³²P-ATP (3.000 Ci/mmol), und 5 Einheiten von T4 Polynukleotid-Kinase (New England Biolabs) konasiert. Die Reaktionen wurden 40 Minuten bei 37ºC inkubiert, gefolgt von 10 Minuten bei 70ºC, um die Kinase zu inaktivieren. Die in jeder Reaktion nicht-inkorporierte Radioaktivität wurde durch G-50 Sephadex Säulenchromatographie entfernt. Die 5' terminalen Fragmente, Oligonukleotide 1 und 14, wurden nicht phosphoryliert, um die Bildung von Polymeren während der nachfolgenden Anelierungs- und Ligationsreaktionen zu verhindern. Phosphorylierte Oligonukleotide 2-13 wurden unter Vakuum getrocknet und in 20ul Ligationspuffer ohne DDT und ATP (50mM Tris-HCl, pH 7.5, enthaltend 10mM MgCL&sub2;) resuspendiert. 10ul (1ug) wurden für die tatsächliche Genherstellung genommen. 1ug der End-Fragmente 1 und 14 wurden lyophilisiert und in 10ul des gleichen Ligationspuffers resuspendiert.

Das synthetische ENV93 Gen wurde in einer schrittweisen Ligation zusammengesetzt. Die Oligonukleotide wurden zwei minuten gekocht, in einer Eppendorf Mikrozentrifuge herunterzentrifugiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt. Die 10ul Proben wurden dann, wie in Figur 2 dargestellt, zur Bildung der Blöcke 1-4 vereinigt. Die Blöcke wurden für zwei Minuten gekocht, in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und bei Raumtemperatur 5 Minuten abgekühlt. Die Blöcke wurden bei 37ºC fünf Minuten inkubiert und bei Raumtemperatur 10 Minuten gekühlt. Ein gleiches Volumen von 2x Ligationspuffer (50mM Tris-HCl, pH 7.5, enthaltend 10mM MgCl&sub2;, 20mM DDT und 2mM ATP) wurde jedem der die anelierten Oligonukleotide enthaltenden Blöcke zugefügt. 400-800 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) wurden jeder Blockligation zugegeben und die Reaktionen (Ligationsreaktion Nr. 1) wurden bei 14ºC für 16 Stunden inkubiert. Die Ligase wurde durch die Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 10mM inaktiviert.

Ein Zehntel von jeder Ligationsreaktion wurde für die Analyse auf einem 10% Polyacrylamidgel, enthaltend 7M Harnstoff, entfernt. Die Ligationsreaktionen wurden so angepasst, dass sie 0.3M NaOAc, pH 5.2 enthielten und mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert. Nach einer Aetherextraktion wurde MgCl&sub2; bis 10mM zugegeben und die Ligationsprodukte wurden mit zwei Volumina 100% Ethanol präzipitiert.

Die Ethanol-Pellets wurden durch Zentrifugation wiedergewonnen, mit 70% Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 10ul von 50mM Tris-HCl, pH 7.5, enthaltend 10mM MgCl&sub2;, resuspendiert. Der nächste Schritt war das Anelieren der vier Blöcke mittels ihrer 12-14 Basenpaarüberlappungen (Figur 2). Die Blöcke wurden bei 37ºC 10 Minuten inkubiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur gekühlt. Die Blöcke wurden in einem Röhrchen vereinigt und bei 37ºC 10 Minuten inkubiert. Die Röhrchen wurden innerhalb 30 Minuten langsam auf 14ºC gekühlt. Ein gleiches Volumen von 2x Ligationsgemisch und 800 Einheiten von T4 DNA Ligase (New England Biolabs) wurde zugegeben und die Reaktion wurde 16 Stunden bei 14ºC durchgeführt (Ligationsreaktion Nr. 2). EDTA wurde bis 10mM zugegeben, um die Ligase zu inaktivieren. Das 283 bp BamHI Fragment wurde durch Elektrophorese in 4% Nusieve GTG Agarose/TAE Minigel, enthaltend 0.5ug/ml Ethidiumbromid, gereinigt. Die oberste Bande wurde ausgeschnitten und das Fragment Phenol- und Aether-extrahiert, nachdem die Agarose bei 65ºC geschmolzen war. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert, das erhaltene Pellet mit 70% Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 3 KLONIERUNG VON ENV93 IN pUC18

Um die Sequenz des ENV93 Konstrukts zu verifizieren, wurde zuerst das Fragment in die einzige BamHI Schnittstelle des pUC18 Sequenzierungsvektors kloniert (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119 [1985]).

Das ENV93 DNA Pellet (250ng) wurde in destilliertem H&sub2;O resuspendiert und in einer 20ul Reaktion kinasiert, die 50mM Tris-HCl, pH 7.5; 10mM MgCl&sub2;, 5mM DTT, 0.1mM Spermidin, 20uM ATP und 9U T4 Polynukleotid-Kinase enthielt. Die Kinasereaktion wurde bie 37ºC 40 Minuten inkubiert. Das Konaseenzym wurde 15 Minuten bei 70ºC hitze-inaktiviert. Die ENV93 DNA enthaltende Reaktion wurde mit destilliertem Wasser 1:5 verdünnt. Fünf ng der ENV93 DNA wurden mit 50ng dephosphoryliertem Vektor (1:1 Molverhältnis) 16 Stunden bei 14ºC ligiert. Die Reaktion wurde auf 10mM EDTA eingestellt und 15 Minuten bei 70ºC erhitzt. Kompetente E.coli RR1 Zellen (ATCC Nr. 31343) wurden mit der Mischung transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien erhalten. Die Transformanten, welche aufgrund von BamHI-Verdau das ENV93-Konstrukt zu enthalten schienen, wurden der Dideoxy-Sequenzierung unterworfen. M13 Universal-Sequenzierungsprimer, welche gerade ausserhalb der Polylinker Klonierungsstelle an gegenüberliegende Stränge des Vektors hybridisieren, wurden in Verbindung mit dem Promega Dideoxy-Sequenzierungssystem verwendet, um eine Sequenzinformation für beide Stränge des Inserts zu generieren. 17-mer Primer spezifisch für ENV93 waren zusätzlich nötig, um die Sequenz der beiden Stränge der ENV93 Duplex zu vervollständigen. Das Insert eines klons mit der korrekten ENV93 Konstruktion wurde zur Vorbereitung der Ligation in einen Expressionsvektor mittels eines Gels gereinigt.

Beispiel 4 KLONIERUNG VON ENV93 IN pDS56/RBS II

Das synthetische ENV93 Gen wurde, wie in Figur 3 beschrieben, direkt in die BamHI Schnittstelle des passenden Leserahmen des Expressionsvektors pDS56/RBSII ligiert (Stueber et al., supra). Der Vektor wurde mit BamHI linearisiert, dephosphoryliert und von dem pDMI-1 kompatiblen Plasmid durch Elektrophorese in einem 0.7% Agarose/TAE Minigel abgetrennt. Die DNA wurde von der Agarose gereinigt. 5ng des Inserts wurden mit 60ng des Vektors (1:1 Molverhältnis) in einer 20ul Reaktion bei 14ºC 16 Stunden ligiert. Die Hälfte der Ligationsmischung wurde für die Transformation kompetenter E.coli W3110 Zellen (ATC Nr. 27325) verwendet. Die DNAs von Ampicillin/Kanamycin-resistenten Klonen wurden mittels Restriktionsenzymverdauung auf die Anwesenheit von ENV93-Inserts abgesucht, die in den Expressionsvektor in der richtigen Orientierung für die Proteinexpression inseriert sind. Eine Anzahl von positiven Klonen wurde identifiziert und die DNA aus einem von diesen wurde zur Transformierung der E.coli-Stämme JE5505 und JE5506 verwendet (Hirota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1417-1420 [1977]).

Die Insertion des ENV93 Epitops in den pDS56/RBSII Vektor führt nach Translation zu einem rekombinanten Protein mit 106 Aminosäuren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz und die kodierenden Nukleotide des tatsächlich exprimierten Proteins des ENV93 Konstruktes sind in Figur 4 gezeigt. Die Vektorsequenzen tragen drei Aminosäuren am N-Terminus und 10 Aminosäuren am C-Terminus zum Protein bei, die nicht durch das HTLV-I Genom spezifiziert sind.

Beispiel 5 EXPRESSION DES ENV93 EPITOPS IN E. COLI

Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte durch Isopropyl-β- D-Thiogalactosid (IPTG) Induktion einer aktiv wachsenden Bakterienkultur mit Modifikationen der Beschreibung von Certa et al., supra. E.coli Kulturen wuchsen bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0.6-0.7 bei 37ºC (Zeit 0). Zu diesem Zeitpunkt wurde 1ml Anteil entfernt. Die Kultur wurde in zwei Glaskolben aufgeteilt und einem Glaskolben wurden 0.5mM IPTG zugegeben. Die Kulturen wurden bei 37ºC inkubiert in 1ml Anteile wurden zwei und vier Stunden nach Induktion entnommen. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in Lysepuffer resuspendiert (125mM Tris- HCl, pH 6.8 enthaltend 10% Glycerol, 2% SDS, 0.1% BPB, 1.25% 2-Mercaptoethanol). Gleiche Mengen von Lysaten ganzer Zellen wurden in einem 12% Polyacrylamid/SDS-Gel unter Verwendung des von Laemmli, Nature 277, 680-685 [1970], beschriebenen diskontinuierlichen Puffersystems elektrophoretisch aufgetrennt. Proben wurden durch Kochen vor dem Auftragen auf das Gel denaturiert. Proteine wurden durch Färben mit Coomassie Brilliant Blau R250 visualisiert.

Figur 5 zeigt die Expression des rekombinanten ENV93 Proteins in drei E.coli Wirtsstämmen, die das Plasmid pDS56/RBSII ENV93 beherbergen. Das 12Kd ENV93 Polypeptid wurd in unterschiedlichen Mengen in den getesteten E.coli-Stämmen exprimiert. Der JE5506 Wirt produziert die grössten Mengen ENV93, im W3110 Wirt ist ENV93 durch Coomassie Färbung gerade noch nachzuweisen.

Beispiel 6 REINIGUNG DES REKOMBINANTEM ENV93 PROTEINs

Das rekombinante Protein wurde mit Modifikationen gemäss Manne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 376-380 [1985] gereinigt. Ein Zellpellet aus einer induzierten 500ml Bakterienkultur wurde in 25ml Puffer 1 resuspendiert (10mM Tris-HCl, pH 8, enthaltend 2mM EDTA, 1mM DTT). Die lösung wurde mit 12.000 x g für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10ml Puffer 1 resuspendiert. Lysozym wurde bis zu 0.75mg/ml zugegeben und die Suspension wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. MgCl&sub2; bis 23mM und 4.5mg DNase I wurden zugegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 37ºC gehalten. Fünfundzwanzig ml Puffer 2 (10mM Tris-HCl, pH 8 enthaltend 1mM DTT) wurden zugegeben und das Lysat wurde mit 12.000 x g 10 minuten bei 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 25ml Puffer 2 gewaschen und 10 Minuten bei 4ºC mit 12.000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 25ml Puffer 3 (10mM Tris-HCl, pH 8 enthaltend 1mM DTT, 0.15m NaCl, 0.5% Triton X-100) resuspendiert. Die Lösung wurde 15 Minuten bei 0ºC, 30 Minuten bei 37ºC und 15 Minuten bei 0ºC gehalten. Die Probe wurde bei 4ºC 10 Minuten mit 12.000 xg zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 25ml Puffer 2 gewaschen und mittels Zentrifugation gesammelt. Das Pellet wurde in 0.2ml Puffer 2 resuspendiert und durch Zugabe von 3.8ml Puffer 4 (10mM Tris-HCl, pH 8 enthaltend 7M GuHCl, 5mM DTT) aufgelöst. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Der Ueberstand wurde 1:15 mit Puffer 6 (10mM Tris-HCl, pH 8 enthaltend 5mM DTT) verdünnt und 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Ausfällung der Proteine inkubiert. Das Protein wurde durch Zentrifugation mit 12.000 x g bei 4ºC für 10 Minuten gesammelt. Das Pellet wurde mit 20ml Puffer 6 gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt. Das resultierende Pellet wurde langsam in 3ml Puffer 5 aufgelöst (125mM Tris-HCl, pH 6.8 enthaltend 4% (w/v) SDS, 5mM DTT, 0.02% NaN&sub3;). Weitere Reinigung wurde durch Chromatographie an einer Sephacryl S200 (Pharmacia) 1.6 x 95cm Säule, äquilibriert mit 25mM Tris-HCl, pH 8 enthaltend 5mM DTT, 0.1% SDS, 1mM EDTA, 0.1M NaCl und 0.02% NaN&sub3; erreicht. Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, die das interessierende Protein enthielten, wurden vereinigt und die Proteinkonzentration durch UV-Absorption bei 280nm bestimmt. Das gesammelte Material wurde zum Beschichten von Polystyrolkugeln im Enzym-Immunoassay verwendet.

Beispiel 7 EXPRESSION VON HUELL-EPITOPEN ALS ENV93 FUSIONS-PROTEINE

Das ENV93 Konstrukt wird als geeigneter Träger für die effiziente Expression von anderen Regionen des HTLV-I Genoms benutzt. Dieses System sollte genügende Mengen von rekombinanten HTLV-I Proteinen hervorbringen, die für die Evaluation von Test-Antigenen in einem Antikörper-Screeningassay nötig sind.

Die Quelle für HTLV-I Hüll DNA ist das Plasmid pH2Ex. Dieses Plasmid wurde ursprünglich aus dem Phagen λCRl subkloniert, der env, pX und das 3' LTR von HTLV-I enthält (Manzari et al., supra; Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 181.107). Eine Karte der die Hülle kodierenden Region ist in Figur 6 gezeigt. Die angezeigten Restriktionsstellen wurden benutzt, um die folgenden DNA Fragmente zu erzeugen: III, IIIA, IIIB', II, I und II+I. Diese DNA repräsentiert fast die gesamte kodierende Sequenz der Hülle. Jedes Fragment wurde abwärts von ENV93 in das Plasmid pDS56/RBSII inseriert und, wie in Figur 7 gezeigt, rekombinante Fusionsproteine in E.coli exprimiert und, wie vorstehend beschrieben, gereinigt.

Beispiel 8 KONSTRUKTION VON ENV937HTLV-I-IIIB'

Ein 154 bp SalI/HpaI Fragment (Nts 5673-5827) wurde aus pH2Ex (Figur 6) isoliert. Diese IIIB' DNA kodiert 52 Aminosäuren, die Aminosäuren 165- 216 aus der gp46 Hülldomäne entsprechen. Synthetische SalI 8-mer Linker wurden dem Fragment beigegeben und das IIIB' wurde in die SalI Schnittstelle des Plasmids pDS56/RBSII ENV93 ligiert. Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des aus diesem Konstrukt exprimierten Fusionsproteins sind in Figur 8 dargestellt. Das 17.8 Kd Protein mit 158 Aminosäuren zeigt die höchste Expression in JE5506 Zellen.

KONSTRUKTION VON ENV937HTLV-I-I

Das 718 bp XhoI Fragment (Nts 5778-6496, Figur 6) wurde in die SalI Schnittstelle von pDS56/RBSII subkloniert, um das pBSEVN Konstrukt zu erzeugen. Diese DNA wurde mit BamHI/HindIII verdaut, um das 413 bp I Fragment freizusetzen. Das I Fragment kodiert 133 Aminosäuren entsprechend den Aminosäuren 308-440 des Hüllpolypeptids. Der C-Terminus von gp46 ist zusammen mit dem grössten Teil der gp21 Domäne in Fragment I enthalten. Die Zugabe des 10-mer HindIII Linkers war nötig, um das I Fragment in die HindIII Schnittstelle des Plasmids pDS56/RBSII ENV93 zu inserieren. Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des exprimierten Fusionsproteins ist in Figur 9 gezeigt. Das Polypeptid mit 245 Aminosäuren hat ein Molekulargewicht von 27Kd. Das ENV93/HTLV-I-I Konstrukt bewirkt die Expression einer doppelten Menge des ENV93 Epitops. Die gesamte ENV93 Sequenz ist in dem I Fragment enthalten.

KONSTRUKTION VON ENV93/HTLV-I-II+I

Das 718 bp XhoI Fragment (Nts 5778-6496) wurde aus pH2Ex isoliert und direkt in die passende SalI Schnittstelle des Plasmids pDS56/RBSII ENV93 ligiert. Das II-I Fragment kodiert für 240 Aminosäuren, entsprechend den Resten 201-440 des HTLV-I Hüllpolypeptids. Aus gp46 und gp21 abgeleitete Epitope sind in dem II-I Fragment vorhanden. Das aus diesem Konstrukt exprimierte rekombinante Fusionsprotein ist 344 Aminosäuren lang und entspricht einem Molekulargewicht von 37.9Kd. Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des ENV93/HTLV-I-II+I Proteins ist in Figur 10 gezeigt.

KONSTRUKTION VON ENV93/HTLV-I-II

Die pbsENV DNA wurde mit BamHI verdaut, um das 328 Bp II Fragment freizugeben. Das II Fragment kodiert Aminosäuren 201-308 des C-Terminus des gp46 Hüllproteins (Fig. 6). Die klebrigen 5'BamHI Enden wurden mit Klenow Enzym aufgefüllt und 10-mer HindIII Linker wurde der DNA anligiert, um die Insertion in die HindIII Schnittstelle des Plasmids pDS56/RBSII ENV93 zu erleichtern. Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des exprimierten Fusionsproteins ist in Figur 11 gezeigt. Das ENV92/HTLV-I-II Protein mit 217 Aminosäuren hat ein Molekulargewicht von 24Kd.

KONSTRUKTION VON ENV937HTLV-I-III

Das III Fragment repräsentiert den N-Terminus von gp46 mit Aminosäuren 1-200. Das III Fragment wurde aus pH2Ex durch NcoI/XhoI Verdau isoliert (Figur 6) und die 599 Bp DNA wurde in die HindIII Schnittstelle von pENV59 über die Ligation mit synthetischen HindIII Linkern subkloniert. Das III Fragment wurde aus dem pENV59/HTV-I-III DNA Konstrukt als 613 Bp HindIII Fragment gereinigt. Die klebrigen 5' HindIII Enden wurden mit Klenow Enzym aufgefüllt und 10-mer HindIII Linker wurden an die stumpfen Enden der DNA ligiert. Das Insert wurde in die HindIII Schnittstelle des Plasmids pDS56/RBSII ENV93 ligiert. Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des exprimierten rekombinanten Proteins sind in Figur 12 dargestellt. Das ENV93/HTLV-I-III Polypeptid hat ein Molekulargewicht von 35Kd und besteht aus 315 Aminosäuren.

KONSTRUTION VON ENV93/HTLV-I-IIIA

Das IIIA Fragment wurde aus dem Plasmid ENV59/HTLV-I-IIIA durch PvuII/AslI Verdau erhalten (Figur 6). Das IIIA Fragment kodiert Aminosäuren 26-166 des gp46 Proteins. Das 5'SalI Ende des 419 Bp Fragments wurde mit Klenow Enzym aufgefüllt und 10-mer SalI Linker wurden zur Insertion in die einzige SalI Schnittstelle des Plasmids pDS56/RBSII ENV93 anligiert. Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäurensequenz des exprimierten ENV93/HTLV-I-IIIA Fusionsproteins ist in Figur 13 gezeigt. Das 28Kd Polypeptid ist 249 Aminosäuren lang.

Beispiel 9 ENZYMIMMUNOASSAY (EIA)

Gereinigte, rekombinante HTLV-I Proteine wurden auf Polystyrol- Kugeln (1/4 inch Durchmesser) in einer Endkonzentration von 10ug/ml in 0.05M Carbonat-Bicarbonat Puffer, pH 9.5 aufgetragen. Die Auftragung erfolgte bei 37ºC für 18 Stunden. Ungebundene Proteine wurden durch Waschen mit deionisiertem Wasser entfernt und die Kugeln wurden bei 37ºC getrocknet und bei 4ºC trocken gelagert. HTLV-I positive und negative Seren wurden in Reaktionsröhrchen durch Verteilen von 10ul Serum in 400ul Probenverdünnung (20% Serum von neugeborenen Kälbern, 0.5% Tween 20, 0.01% Ziegen IgG, 0.01% Thimerosal, 5mM EDTA in 0.02M Phosphat gepufferter Salzlösung, pH 7.0) vorverdünnt. Eine beschichtete Kugel wurde in das Röhrchen gegeben und in einem Schüttler/Inkubator bei 37ºC 30 Minuten inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch Waschen mit deionisiertem Wasser in einem automatischen Kugelwascher entfernt. 250ul Ziegen anti-human IgG, markiert mit Meerrettich-Peroxidase (Boehringer Mannheim), wurden 1:9000 mit Konjugatverdünner (0.1M Tris-Azetat, pH 7.3 enthaltend 20% fötales Kälberserum, 0.04% 4-Aminoantipyrin, 1% Tween 20, 0.1% (v/v) Kathon) verdünnt und in das Reaktionsgefäss gegeben. Inkubation erfolgte in einem Schüttler/Inkubator bei 37ºC für 15 Minuten. Freie Konjugate wurden durch Waschen mit deionisiertem Wasser entfernt. 250ul Substratlösung (2mg/ml o-Phenylendiamin in 0.1M Kaliumcitrat, pH 5.25 enthaltend 0.02% Wasserstoff-Peroxyd, 0.01% Kathon) wurde in jedes Reaktionsgefäss gegeben und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1ml 1N Schwefelsäure beendet. Die optische Dichte bei 492nm wurde in einem COBAS RESA Spektrophotometer gemessen. EIA Resultate für die rekombinanten HTLV-I Fusionsproteine sind in Figur 14 dargestellt. Das ENV93/HTLV-I-II+I Protein zeigt die grösste Reaktivität mit den getesteten positiven Serumproben.


Anspruch[de]

1. Polypeptid enthaltend aus HTLV-I abgeleitete Aminosäuren mit einem Epitop aus der immundominanten, konservierten Region der gp21 env Region von HTLV-I, worin die HTLV-I abgeleiteten Aminosäuren mit einem Epitop in dem Polypeptid aus den Aminosäuren 342-434 der gp21 Region von HTLV-I env bestehen und das wahlweise Aminosäuresubstitutionen enthalten kann, die nicht wesentlich die biologische Aktivität beeinflussen, mit der Ausnahme des natürlich vorkommenden HTLV-I env Proteins.

2. Das Polypeptid gemäss Anspruch 1 mit der Aminosäuresequenz

3. Nukleotidsequenz kodierend für ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 oder 2.

4. Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 3, worin die Nukleotidsequenz ein synthetisches Gen ist.

5. Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 4, worin das synthetische Gen aus Kodons besteht, die bevorzugt von E. coli benutzt werden.

6. Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 4 oder 5, worin die Nukleotidsequenz die Sequenz

hat.

7. Hybridpolypeptid umfassend eine erste Aminosäuresequenz enthaltend ein Epitop aus der immundominanten, konservierten Region von HTLV-I env gp21 verknüpft am Carboxy-Ende mit einer zweiten Aminosäuresequenz enthaltend ein Epitop aus HTLV-I env gp46, env gp21 oder gp46 und gp21.

8. Hybridpolypeptid gemäss Anspruch 7, worin das Epitop in der ersten Aminosäuresequenz aus Aminosäuren 342-434 der gp21 Region besteht und das wahlweise Aminosäuresubstitutionen enthält, die die biologische Aktivität nicht wesentlich verändern.

9. Hybridpolypeptid gemäss Anspruch 7 oder 8, worin die zweite Aminosäuresequenz Aminosäuren Ausgewählt aus der folgenden Gruppe entspricht:

Aminosäuren 308-440 aus gp46 und gp21 (I),

Aminosäuren 201-308 aus gp46 (II),

Aminosäuren 201-440 aus gp46 und gp21 (II + I),

Aminosäuren 1-200 aus gp46 (III),

Aminosäuren 26-166 aus gp46 (IIIA) oder

Aminosäuren 165-216 aus gp46 (IIIB').

10. Hybridpolypeptid gemäss einem der Ansprüche 7-9, worin die zweite Aminosäuresequenz den Aminosäuren 308-440 aus gp46 und gp21 entspricht und das Hybridpolypeptid die Formel (I) hat:

11. Hybridpolypeptid gemäss einem der Ansprüche 7-9, worin die zweite Aminosäuresequenz den Aminosäuren 201-308 aus gp46 entspricht und das Hybridpolypeptid die Formel (II) hat:

12. Hybridpolypeptid gemäss einem der Ansprüche 7-9, worin die zweite Aminosäuresequenz den Aminosäuren 201-440 aus gp46 und gp21 entspricht und das Hybridpolypeptid die Formel (II+I) hat:

13. Hybridpolypeptid gemäss einem der Ansprüche 7-9, worin die zweite Aminosäuresequenz den Aminosäuren 1-200 aus gp46 entspricht und das Hybridpolypeptid die Formel (III) hat:

14. Hybridpolypeptid gemäss einem der Ansprüche 7-9, worin die zweite Aminosäuresequenz den Aminosäuren 26-166 aus gp46 entspricht und das Hybridpolypeptid die Formel (IIIA) hat:

15. Hybridpolypeptid gemäss einem der Ansprüche 7-9, worin die zweite Aminosäuresequenz den Aminosäuren 165-216 aus gp46 entspricht und das Hybridpolypeptid die Formel (IIIB') hat:

16. Hybridgen kodierend für ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 7-15.

17. Hybridgen gemäss Anspruch 16, worin die erste Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Epitop aus der immunodominanten, konservierten Region von HTLV-I env gp21 enthält, eine Nukleotidsequenz gemäss einem der Ansprüche 3-6 ist.

18. Hybridgen gemäss Anspruch 16 oder 17, worin die zweite Nukleotidsequenz, kodierend für eine Polypeptidsubsequenz von HTLV-I env gp46, gp21 oder gp46 und gp21, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

Aminosäuren 308-440 aus gp46 und gp21 (I),

Aminosäuren 201-308 aus gp46 (II),

Aminosäuren 201-440 aus gp46 und gp21 (II + I),

Aminosäuren 1-200 aus gp46 (III),

Aminosäuren 26-166 aus gp46 (IIIA) oder

Aminosäuren 165-216 aus gp46 (IIIB').

19. Hybridgen gemäss Anspruch 18, worin die zweite Nukleotidsequenz des HTLV-I env ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

Nukleotide 6101-6499 aus gp46 und gp21 (I),

Nukleotide 5780-6103 aus gp46 (II),

Nukleotide 5780-6499 aus gp46 und gp21 (II + I),

Nukleotide 5180-5779 aus gp46 (III),

Nukleotide 5255-5677 aus gp46 (IIIA) oder

Nukleotide 5672-5827 aus gp46 (IIIB').

20. Rekombinanter Vektor bestehend aus einem Vektor und einem Gen mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Nukleotidsequenz gemäss einem der Ansprüche 3-6, oder

b) einem Hybridgen gemäss einem der Ansprüche 16-19.

21. Vektor gemäss Anspruch 20, der zur Replikation in einem einzelligen Wirt fähig ist.

22. Rekombinanter Vektor gemäss Anspruch 20 oder 21, der zur Replikation in einem E. coli Stamm fähig ist.

23. Einzelliger Wirt enthaltend einen rekombinanten Vektor gemäss einem der Ansprüche 20-22.

24. Wirt gemäss Anspruch 23, der ein E. coli Bakterium ist.

25. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 7-15 umfassend Kultivieren eines einzelligen Wirts, enthaltend den rekombinanten Vektor, der die Nukleotidsequenz kodierend für das Polypeptid enthält, unter den geeigneten Wachstumsbedingungen, so dass das Polypeptid exprimiert wird, und isolieren des besagten Polypeptids.

26. Verfahren zum Detektieren von Antikörpern für HTLV-I in menschlichen Körperflüssigkeiten, umfassend in Kontakt bringen einer Testprobe mit einem Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 7-15, ermöglichen der Bildung von Protein/Antikörperkomplexen und Detektieren der Komplexe.

27. Verfahren gemäss Anspruch 26, das ein Immunoassay ist.

28. Verfahren gemäss Anspruch 27, das ein Enzym-Immunoassay ist.

29. Verfahren gemäss Anspruch 27 oder 28, das ein Enzymgekoppelter-Immunoabsorbens-Assay oder ein Doppel-Antigen-Sandwich- Verfahren ist.

30. Verwendung eines Polypeptides gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 7-15 zur Detektion von Antikörpern für HTLV-I in Körperflüssigkeiten von Säugern.

31. Test Kit zum Detektieren von Antikörpern für HTLV-I in Körperflüssigkeiten von Säugern, umfassend in einem Behälter ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 7-15.







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