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Dokumentenidentifikation DE68922540T2 05.10.1995
EP-Veröffentlichungsnummer 0354072
Titel Vorläufer des Hüllenglykoproteins des HIV-2 Retrovirus und verwandte Antigene.
Anmelder Institut Pasteur, Paris, FR
Erfinder Montagnier, Luc, F-92350 Le Plessis-Robinson, FR;
Hovanessian, Ara, F-93100 Montreuil, FR;
Laurent, Anne, F-75007 Paris, FR;
Krust, Bernard, F-75012 Paris, FR;
Rey, Marie-Anne, F-75004 Paris, FR
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 68922540
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument Fr
EP-Anmeldetag 09.06.1989
EP-Aktenzeichen 894016179
EP-Offenlegungsdatum 07.02.1990
EP date of grant 10.05.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.10.1995
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse A61K 39/395   C12P 21/00   C07K 14/155   C07K 1/00   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft antigene Vorläufer von Hüllglycoproteinen eines menschlichen HIV-2-Retrovirus und Antigene, die immunologisch mit spezifischen monoclonalen Antikörpern kreuzreagieren, die die vorstehenden Antigene erkennen, Vorläufer der Hüllglykoproteine des HIV-2-Retrovirus.

Die Erfindung betrifft genauer Antigene, die ausschließlich während bestimmter in vivo-Entwicklungsphasen einer Infektion als Folge eines menschlichen HIV-2-Retrovirus vorhanden sind. Diese Antigene sind für den Bildungs- und Reifungsprozeß des Hüllglykoproteins dieses Retrovirus charakteristisch und sind folglich an der Entwicklung und Proliferation des HIV-2-Retrovirus und demnach an der Ausbreitung der Infektion beteiligt.

Die Erfindung betrifft diese Antigene erkennende Antikörper, sowie diese Antikörper enthaltende immunogene Zusammensetzungen.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung der vorstehenden Antigene, sowie ihre Verwendung zur Diagnose einer Infektion durch ein inenschliches HIV-2-Retrovirus.

Ätiologische Mittel, die für die Entwicklung von Lymphadenopathiesyndromen (deren englische Abkürzung LAS lautet) verantwortlich sind oder mit der Entwicklung dieser Syndrome einhergehen oder für die Entwicklung von erworbenen Immunschwächesyndromen (AIDS) verantwortlich sind, wurden isoliert, identifiziert und charakterisiert.

Unter HIV (englische Abkürzung des menschlichen Immunschwächevirus) versteht man mehrere menschliche Retroviren, die unter bestimmten Bedingungen ein LAS gegebenenfalls in Verbindung mit AIDS beim Menschen hervorrufen können.

So wurde ein erstes Virus mit der Bezeichnung LAV-1 oder HIV-1 isoliert und in der Patentanmeldung GB 83/24 800, entsprechend der EP-Anmeldung 84 401 834 vom 14.09.84, veröffentlicht unter der Nr. 0 138 667, beschrieben. Dieses Virus wurde auch von F. Barre Sinoussi et al. in Science 220, Nr. 45-99, 20, Seiten 868-871 beschrieben.

Varianten dieses HIV-1-Virus mit den Bezeichnungen LAV ELI und LAV MAL wurden ebenfalls isoliert, charakterisiert und in der Patentanmeldung EP 84 401 834 beschrieben.

Die Isolierung und die Charakterisierung von Retroviren, die einer anderen Klasse angehören und nur eine verminderte immunologische Verwandtschaft mit den vorstehend genannten Viren besitzen, wurden in der europäischen Patentanmeldung Nr. 87 400 151.4, veröffentlicht unter der Nr. 239 425, beschrieben. Diese Retroviren, die unter der Bezeichnung HIV-2 neu gruppiert wurden, wurden bei mehreren erkrankten Afrikanern, die ein Lymphadenopathiesyndrom oder AIDS zeigten, isoliert.

Die Untersuchung dieser HIV-Retroviren, die Isolierung und Analyse ihrer Nucleotidsequenzen sowie die Charakterisierung ihrer antigenen Proteine erlaubten die Durchführung von Vergleichsstudien zwischen den erhaltenen verschiedenen Stämmen bezüglich ihrer Verwandtschaft oder, im Gegensatz dazu, ihrer Spezifität sowohl in struktureller als auch in funktioneller Hinsicht.

Diese HIV-1- und HIV-2-Retroviren wurden ebenfalls im Vergleich mit einem Retrovirus vom Affen (bezeichnet durch die Abkürzung SIV oder STLV-III) untersucht, und diese Untersuchung erlaubte den Nachweis einer gewissen Verwandtschaft zwischen den Proteinen und Glykoproteinen des HIV-2-Retrovirus und seiner Varianten und denen des SIV-Retrovirus.

Eine Verwandtschaft ist insbesondere auf der Ebene des Hüllproteins jedes dieser Viren zu beobachten. Man konnte diesbezüglich immunologische Kreuzreaktionen zwischen dem Hüllglykoprotein des SIV-Retrovirus und Antikörpern gegen das Hüllglykoprotein des HIV-2-Retrovirus nachweisen, während diese immunologische Kreuzreaktion nicht zwischen dem SIV-Retrovirus und dem HIV-1-Retrovirus und auch nicht zwischen den HIV-1- und HIV-2-Retroviren stattfindet.

Ergebnisse betreffend das Hüllglykoprotein des HIV-2-Retrovirus, das von dem env-Gen des Genoms dieses Retrovirus codiert wird, wurden in der vorstehend genannten europäischen Patentanmeldung Nr. 87 400 151.4, veröffentlicht unter der Nr. 0 239 425, angegeben. In dieser EP-Patentanmeldung wurde dieses Glykoprotein durch die Abkürzung gp140 bezüglich seines Molekulargewichts von etwa 140.000 D bezeichnet. Es wurde jedoch näher ausgeführt, daß die Berechnung des Molekulargewichts mit einer Abschätzung von ±10% vorgenommen wurde. In einer vorausgehenden französischen Patentanmeldung (Nr. 86/03881, veröffentlicht unter der Nr. 2 596 063) wurde ein als gp160 bezeichneter Vorläufer von gp140 (Molekulargewicht 160 kD ±10%) ebenfalls beschrieben.

Untersuchungen, die stärker auf das Hullglykoprotein des HIV-2-Retrovirus gerichtet waren, wurden durchgeführt und erlaubten den Erfindern, über die derzeit gegebenen Messungen hinausgehende Messungen des Molekulargewichts durchzuführen und folglich die Resultate auf der Basis der vorstehend beschriebenen Molekulargewichtsintervalle zu präzisieren. Das äußere Hüllglykoprotein besitzt in den viralen HIV-2-Teilchen - unter den erfindungsgemäßen Arbeitsbedingungen - ein Molekulargewicht von etwa 125.000 D (es wird als gp125 bezeichnet). Unter diesen gleichen Arbeitsbedingungen besitzt der bereits nachgewiesene und als gp160 in der Patentanmeldung FR 86/03881 bezeichnete Vorläufer gemäß den zuletzt erhaltenen Ergebnissen ein Molekulargewicht von ungefähr 140.000 D. Er wird demnach in der vorliegenden Patentanmeldung als "gp140" bezeichnet.

Im Rahmen der Erfindung wiesen die Erfinder die Existenz von mehreren Entwicklungsphasen nach, die zum Erhalt der Hüllglykoproteine in einer reifen Form führen, wobei diese reifen Hüllglykoproteine ein Glykoprotein gp125 und ein Glykoprotein gp36 umfassen. Die Erfinder haben nun verschiedene Stadien im Ablauf des viralen Replikationszyklus nachgewiesen, die auftreten, wenn pathogene Beschwerden sich als Folge einer Infektion durch ein menschliche HIV-2- Retrovirus entwickeln. Die Erfinder unterstrichen diesbezüglich die Bedeutung des Ablaufens mehrerer Stufen in den durch das HIV-2-Retrovirus infizierten Zellen, insbesondere in den menschlich T4-Lymphocyten.

Parallel dazu haben sie ähnliche Studien an den viralen Zyklen der HIV-1- und SIV-Retroviren durchgeführt. Diese zuletzt genannten Untersuchungen wiesen sehr spezifische Eigenschaften nach, die den Retroviren HIV-2 und SIV gemeinsam sind und im Gegensatz dazu offensichtlich während des viralen HIV-1-Replikationszyklus fehlen.

Die Erfindung stellt somit neue Mittel zum spezifischen Nachweis einer auf das menschliche HIV-2-Retrovirus zurückzuführenden Infektion bereit.

Im Hinblick auf die vorstehend genannten erhaltenen Ergebnisse erscheint der für die Retroviren HIV-2 und SIV typische virale Zyklus als ein komplexer Prozeß aus Kettenreaktionen, die nur in der Gesamtheit zur Bildung des äußeren Glykoproteins, das auf der Hülle des HIV-2- Retrovirus in seiner endgültigen Form vorhanden ist, führen können. Während dieses Prozesses konnten verschiedene antigene Vorläufer erkannt, isoliert und identifiziert werden. Alle besitzen insbesondere eine strukturelle Verwandtschaft, die sich auf das Peptidgrundgerüst des Hüllglykoproteins stützt, das durch das env-Gen des HIV-2- Retrovirus codiert wird, das in der vorstehend genannten EP-Patentanmeldung beschrieben ist.

Die Erfindung betrifft somit Proteine oder Glykoproteine, die als Folge einer Infektion durch ein menschliches HIV-2- Retrovirus während verschiedener Stufen des Bildungs- und Reifungszyklus des äußeren Hüllglykoproteins gp125 von HIV- 2 gebildet werden, denen das Peptidgrundgerüst des äußeren Hüllglykoproteins des menschlichen HIV-2-Retrovirus oder eines Glykoproteins gemeinsam ist, das eine immunologische Kreuzreaktion mit dem vorstehend genannten gp125 besitzt und sich bezüglich des Vorhandenseins und/oder der Zusammensetzung gegebenenfalls vorhandener Oligosaccharidketten unterscheidet.

Die spezifischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Proteine und Glykoproteine werden während jeder Stufe, die für die Bildung und Reifung des reifen äußeren Hüllglykoproteins des menschlichen HIV-2-Retrovirus unverzichtbar ist, erworben.

Dank der Untersuchung des viralen Zyklus schlugen die Erfinder die Möglichkeit vor, in spezielle Stufen der Bildung der reifen Hüllglykoproteine des menschlichen HIV-2-Retrovirus einzugreifen, wodurch Mittel bereitgestellt werden, um das normale Ablaufen des viralen Zyklus zu unterbrechen und die Vermehrung des für den Menschen infektiösen und unter bestimmten Bedingungen pathogenen Retrovirus zu stoppen.

Gemäß den vorstehenden Ausführungen betrifft die Erfindung ein retrovirales antigenes Glykoprotein, nämlich:

- ein Glykoprotein mit der Bezeichung gp300 mit einem Molekulargewicht (MG) von ungefähr 300 kD und bestehend aus der Kombination von zwei Einheiten eines Glykoprotein-gp140- Vorläufers des Hüllglykoproteins gp125, das durch das env- Gen des Genoms eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 codiert wird, das LAS oder AIDS verursachen kann, oder

- ein Dimeres des Vorläufers des Hüllglykoproteins eines Retrovirus, das mit Antikörpern, die gegen das Glykoprotein gp300 gerichtet sind, immunologisch kreuzreagiert.

Es wird darauf hingewiesen, daß der gp140-Vorläufer auch der Vorläufer von gp36 eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 ist. Die Erfinder haben festgestellt, daß die vorstehend genannte Kombination der zwei Einheiten von gp140 eine intrinsische Eigenschaft ihres Peptidgrundgerüsts ist.

Das antigene Protein gp300 ist noch durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:

- es liegt in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten vor, der mit einem menschlichen Retrovirus der Familie HIV-2 infiziert ist, insbesondere in den menschlichen T4-Lymphocyten oder in den permanenten Linien, die von diesen T4-Lymphocyten stammen,

- sein isoelektrischer Punkt (pI) liegt in einem pH-Bereich von 6,8 bis 7,8

- es ist mit Oligosaccharidketten glycosyliert, die über den Stickstoff gebunden sind,

- es ist in ionischen Detergentien stabil, insbesondere in 1% SDS, in nichtionischen Detergentien, insbesondere 2% Triton X-100, in 4M Harnstoff, in starken Salzen und in Reduktionsmitteln,

- es dissoziiert in vitro spontan in zwei Glykoproteine mit Molekulargewichten von etwa 140 kD in einem pH-Bereich zwischen 4 und 5,

- nach Isolierung und Reinigung durch Gelelektrophorese dissoziiert es in einem Acetatpuffer in vitro in zwei Glykoproteine mit Molekulargewichten von etwa 140 kD bei pH-Werten, die 6 entsprechen oder darunter liegen,

- es zeigt nach der Reinigung an einer Immunaffinitätssäule vom Typ HIV-2 Serum-Sepharose mit spezifischen Antikörpern, die aus Serum eines Patienten erhalten wurden, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-SDS-Gel in Gegenwart von 6M Harnstoff eine Bande, die einem Molekulargewicht von 300 kD entspricht.

Die Erfinder haben festgestellt, daß die Bildung des Dimeren, das aus dem gp300 besteht, eine vorübergehende Stufe des viralen Zyklus ist und wahrscheinlich für die Reifung der Hüllglykoproteine des menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 notwendig ist. In der Tat ist das vorstehend genannte antigene Protein gp300 dadurch gekennzeichnet, daß es nicht nachgewiesen wird durch die elektrophoretische Analyse eines biologischen Mediums, das aus viralen Partikeln besteht, die in dem spezifischen Kulturmedium von mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infizierten Zellen nach Markierung mit ³&sup5;S-Methionin (200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) während 18 Stunden und Reinigung der erhaltenen Extrakte vorhanden sind, die die infizierten Zellen und ihr entsprechendes Kulturmedium enthalten, während es unter den gleichen Bedingungen in den vorstehend genannten infizierten Zellen nachgewiesen wird.

Dies führte zu der Annahme, daß gp300 ein vorübergehender spezifischer Vorläufer der endgültigen Hüllglykoproteine ist. Diese Eigenschaft des viralen Zyklus eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2, die zum Erhalt eines gp300-Proteins führt, ist einzigartig und ungewöhnlich im Hinblick auf die bekannten allgemeinen Mechanismen der Bildung von Glykoproteinen, bei denen Oligosaccharidglykosylierungsketten über Stickstoff gebunden sind.

Außerdem haben die Erfinder interessanterweise festgestellt, daß bei der Bildung und der Reifung der Hüllglykoproteine des Retrovirus SIVmac ebenfalls eine Dimerisierungsstufe vorkommt, die zum Erhalt eines Glykoproteins des Typs von gp300 führt, das für ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 genau charakterisiert wurde. Im Gegensatz dazu erlaubte die Parallelbeobachtung des viralen Zyklus des menschlichen HIV-1-Retrovirus die Feststellung, daß keine Dimerisierungsstufe zur Bildung eines mit gp300 verwandten Glykoproteins führt.

Diese Ergebnisse zeigen völlig überraschend, daß die Bildung eines Dubletts (oder Dimeren) aus dem Vorläufer gp140 des Hüllglykoproteins eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 eine spezifische Eigenschaft für die Expression des env-Gens des menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 und SIV ist.

Diese Feststellung kann bei der Suche und der Entwicklung von Mitteln zur selektiven Diagnose einer Infektion ausgenützt werden, die auf ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 mit der Fähigkeit, ein LAS oder AIDS unter bestimmten Bedingungen hervorzurufen, zurückzuführen ist. Nachstehend wird auf diese geeigneten diagnostischen Mittel eingegangen werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Protein, das Eigenschaften zeigt, die denjenigen des gp300 bezüglich des Peptidgrundgerüsts identisch sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es keine Glykosylierungsgruppen besitzt, und daß sein Molekulargewicht etwa 200 kD beträgt.

Dieses Protein p200, auf das im Verlauf der nachstehenden Beispiele eingegangen werden wird, wurde während eines Spaltungversuches mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase H (nachstehend als "Endo-H" bezeichnet) nachgewiesen. Dieses Protein, das die nichtglykosylierte Form von gp300 darstellt, könnte von speziellem Interesse sein hinsichtlich des eventuellen Vorhandenseins eines dem gp300 und dem p200 gemeinsamen Epitops, das sich im gp300 aufgrund des Vorhandenseins von Oligosaccharidketten, die für die Endkonformation von gp300 wichtig sind, jedoch die Zugänglichkeit zu einem bedeutenden Epitop stören, als weniger antigen erweisen würde

Während der Untersuchung des viralen Zyklus wurde ein anderes Glykoprotein nachgewiesen: Es handelt sich um ein gereinigtes Glykoprotein gp150, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in vitro (nur in den Zellen eines Patienten, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist) nachgewiesen wird nach Markierung dieser Zellen mit einem radioaktiven Tracer, der während einer kurzen Zeitspanne zugesetzt wird, in Gegenwart eines Inhibitors für die Glukosidaseenzyme, insbesondere Castanospermin, anschließende Eliminierung dieses radioaktiven Tracers durch Waschen und Ersatz durch nichtradioaktive Moleküle vor einer Stufe zur Bestimmung der Radioaktivität von während verschiedener Zeitintervalle entnommenen Proben, wobei diese Stufe den Nachweis des Tracers in den Proteinen und Glykoproteinen, die nach der Markierung gebildet wurden, erlaubt. Die Beobachtung von gp150 wird nach einer Zeit durchgeführt, die gleich oder nahe derjenigen ist, die zuin Nachweis von gp300 benötigt wird. Das Protein gp150 ist nun gekennzeichnet durch:

- ein Molekulargewicht von etwa 150 kD,

- das Peptidgrundgerüst des Vorläufers des Hüllglykoproteins gp125, das von dem env-Gen des Genoms eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 codiert wird, oder von einem Retrovirus, dessen äußeres Hüllglykoprotein von Antikörpern aus dem Serum eines Patienten erkannt wird, der mit dem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, insbesondere Antikörper, die gegen gp125 gerichtet sind,

- terminale Glucosereste auf einer Oligosaccharidkette.

Die vorstehend beschriebenen Proteine und Glykoproteine und bevorzugt gp 300 erwiesen sich als vorteilhaft für die Verwendung in antigenen Zusammensetzungen zur Diagnose des Vorhandenseins von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, wobei diese Zusammensetzungen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein vorstehend definiertes Protein oder ein antigenes Glykoprotein umfassen.

Diese Zusammensetzungen sind insofern besonders interessant, als sie die Bildung von Immunkomplexen vom Typ Antigen-Antikörper mit Antikörpern des Serums eines mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infizierten Patienten erlauben. Folglich werden diese Zusammensetzungen und/oder die Antigene, die sie enthalten, vorteilhafterweise zur Durchführung einer spezifischen Diagnose einer Infektion als Folge eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 eingesetzt.

Außerdem betrifft die Erfindung monoclonale Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie das auf den vorstehenden Seiten definierte gp300 erkennen, und daß sie nicht das reife Hüllglykoprotein gp125 und das reife gp36 erkennen.

Andere monoclonale Antikörper sind dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Epitop erkennen, das auf dem vorstehend genannten Glykoprotein gp300 exponiert und für Antikörper zugänglich ist, wobei das Epitop jedoch in den reifen Proteinen gp125 und gp36 in ihrer natürlichen Konformation entweder nicht exponiert oder maskiert ist.

Derartige monoclonale Antikörper können auch neutralisierend sein, insbesondere indem sie die Bindung eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 an seinen Rezeptor hemmen, insbesondere an den T4-Rezeptor menschlicher Lymphocyten, die ihn tragen.

Andere erfindungsgemäße interessante monoclonale Antikörper erkennen das vorstehend definierte p200 und erkennen die reifen Hüllglykoproteine gp125 und gp36 nicht.

Andere monoclonale Antikörper sind dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Epitop auf p200 erkennen, wobei dieses Epitop auf den Proteinen gp125 und gp36 und/oder auf dem Protein gp300 in ihren natürlichen Konformationen jedoch entweder nicht exponiert oder maskiert vorliegt.

Die vorstehend genannten monoclonalen Antikörper können immunogene und neutralisierende Eigenschaften besitzen und die Proliferation eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 unterbrechen.

Mehrere Methoden für die Produktion der vorstehend genannten Antikörper können zur Durchführung der Erfindung beitragen. Beispielsweise kann man Asciteskulturen bei Tieren, insbesondere bei Nagetieren wie Mäusen verwenden. Man kann auch Antikörper aus Zellkulturen, entweder immobilisiert oder verkapselt oder auch in Suspension, erzeugen. Es wird insbesondere die Technik der Hybridome, erhalten durch die Fusion von Lymphocyten eines Tieres, das zuvor mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 inokuliert wurde, verwendet. Lymphocyten des infizierten Tiers werden dann entnommen und mit ausgewählten Myelomazellen fusioniert, um Hybride zu bilden, die anschließend entsprechend ihrer Fähigkeit, spezifische Antikörper gegen die vorstehend beschriebenen Proteine und antigenen Glykoproteine zu produzieren, ausgewählt werden.

Diese produzierten monoclonalen Antikörper werden beispielsweise zur Inaktivierung von Proteinen und/oder Glykoproteinen verwendet, mit denen sie einen Immunkomplex bilden, oder werden wegen ihrer Fähigkeit, das normale Ablaufen der Bildung der endgültigen Hüllglykoproteine eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 zu verhindern, ausgewählt. Außerdem könnten sich bei der gegebenen Verwandtschaft des Peptidgrundgerüsts der erfindungsgemäßen Proteine und Glykoproteine monoclonale Antikörper gegen diese Glykoproteine, insbesondere gegen gp300, p200 als wirksam gegen gp125 erweisen.

Eine andere mögliche Anwendung dieser Antikörper besteht beispielsweise im Nachweis von viralen Antigenen in biologischen Präparaten oder auch in der Reinigung von Proteinen und/oder Glykoproteinen, beispielsweise auf einer Affinitätssäule.

Im allgemeinen ist die Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen Glykoproteine und Proteine beschränkt, sofern sie aus einem einzigen menschlichen Retrovirus vom Typ HIV- 2 erhalten wurden. Sie umfaßt im Gegensatz dazu Proteine und Glykoproteine, die antigene, immunologische, sogar immunogene Eigenschaften gemeinsam mit den vorstehend beschriebenen Proteinen und Glykoproteinen besitzen, wobei diese Proteine und Glykoproteine auch beispielsweise durch ihre Fähigkeit definiert sein können, von spezifisch gegen die entsprechenden für ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 charakteristischen Proteine gerichteten Antikörpern erkannt zu werden.

Dieser Hinweis gilt beispielsweise für die Glykoproteine gp300 und andere Vorläufer des äußeren Hüllglykoproteins eines SIVmac-Virus, dessen viraler Zyklus von den Erfindern studiert wurde, und dessen gemeinsame Eigenschaften mit den vorstehend genannten Proteinen und Glykoproteinen eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 aufgezeigt wurden.

Die Erfindung betrifft auch eine immunogene Zusammensetzung, die ein wie vorstehend definiertes Glykoprotein gp300 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen geeigneten Vehikel für die Herstellung von Impfstoffen enthält.

Eine so gebildete immunogene Zusammensetzung wird bezüglich der Proteine und/oder antigenen Glykoproteine so zusammengesetzt, daß sie die Verabreichung einer Dosis von 10 bis 100 ug pro Kilogramm erlaubt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des antigenen Glykoproteins gp300, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

- Lyse der Zellen, die mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert sind und Abtrennung des Überstands und des Zellextrakts,

- Inkubation des Zellextrakts und/oder des Überstands auf ein Immunaffinitätssäule mit einem Immunabsorbens, das gereinigte Antikörper umfaßt, die vom Serum eines Patienten erhalten wurden, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, wobei diese Antikörper an einen passenden Träger gebunden sind, in Gegenwart eines Puffers und für einen Zeitraum, der lang genug ist, um die Bildung eines immunologischen Antigen-Antikörper-Komplexes zu erlauben,

- Waschen der Säule mit einem Puffer zur Entfernung der Moleküle, die nicht an den Träger gebunden werden,

- Auftrennung der eluierten Proteine, beispielsweise durch Elektrophorese und durch Elektroelution

- Gewinnung der gesuchten antigenen Proteine.

Die infizierten Zellen können auch einem durch ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 infizierten Patienten entnommen werden. Sie können ebenso auch in vitro aus einer Zellkultur, die durch HIV-2 infiziert ist, erhalten werden. Derartige Zellkulturen können auf der Basis von CEM-Linien hergestellt werden.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung dieses Glykoproteins wird analog erhalten, wobei der vorstehende Schritt der Elektroelution jedoch durch die nachstehenden Schritte ersetzt wird:

- Elution der an die vorstehend genannte Immunaffinitätssäule gebundenen Proteine,

- Reinigung der so eluierten Produkte auf einer Chromatographiesäule, die, gebunden an das Trennmaterial, monoclonale Antikörper enthält, die gp300 erkennen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Lyse der infizierten Zellen in einer Detergenslösung durchgeführt, die in dem Immunadsorbens enthaltenen Antikörper werde auf Agarosekügelchen fixiert und es wird in Gegenwart eines Bindungspuffers gearbeitet.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die in vitro- Diagnose der Gegenwart von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, um eine eventuelle Infektion mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 festzustellen, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

- Inkontaktbringen dieser biologischen Probe mit einem vorstehend beschriebenen Antigen oder einer erfindungsgemäßen antigenen Zusammensetzung unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Antigen- Antikörper-Komplexes erlauben,

- Nachweise des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.

Die biologische Probe, an der die Diagnose durchgeführt wird, kann eine biologische Flüssigkeit sein, insbesondere ein Serum, ein biologischer Gewebsextrakt, sofern vermutet wird, daß sie durch ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 infizierte Zellen enthält.

Ein derartiges Verfahren kann besonders interessant in dem Ausmaß durchgeführt werden, in dem es den vorzeitigen Nachweis einer Infektion mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 oder einem verwandten Retrovirus erlaubt, von dem die Erfinder das Erscheinen von gp300 in einem vorzeitigen Stadium des viralen Replikationszyklus des für die Infektion verantwortlichen Retrovirus nachgewiesen haben.

Zur Durchführung des vorstehend genannten diagnostischen Verfahrens haben die Erfinder eine Reagenszusammenstellung oder ein Kit zum Nachweis von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, der vermutlich durch ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, entwickelt, welches durch die folgenden Bestandteile gekennzeichnet ist:

- mindestens ein antigenes Protein und/oder Glykoprotein, wie vorstehend beschrieben, oder

- eine aus diesen Bestandteilen zusammengestellte Zusammensetzung oder auch ein Gemisch dieser verschiedenen Bestandteile, und

- Mittel, um die Reaktion zur Bildung des Immunkomplexes zwischen den vorstehenden Antigenen und den gegebenenfalls in der zu untersuchenden biologischen Probe vorhandenen Antikörpern zu ermöglichen, insbesondere, falls notwendig, mit einem oder mehreren Inkubationspuffern,

- eine Negativkontrollprobe,

- Mittel zum Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes.

Nachdem nun die verschiedenen Stufen der Bildung des infektiösen HIV-2-Retrovirus sowie die Bedeutung bestimmter unter ihnen bei der Entwicklung der Infektion beschrieben wurden, haben die Erfinder die Ausarbeitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorgeschlagen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens einen Inhibitor der Glukosidasen I und/oder II, insbesondere das Castanospermin oder das Desoxyjirimycin oder ein Gemisch dieser Inhibitoren in einer ausreichenden Dosis enthält, um die Abspaltung der terminalen Glucosereste der Oligosaccharidketten vom dem Glykoprotein gp150 während des viralen Zyklus zu blokkieren, zusammen mit einem physiologisch verträglichen Excipiens.

Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die Lektüre der nachstehenden Beispiele sowie in den Figuren, deren Legende nachstehend angegeben ist, offensichtlich.

Die Figur 1 umfaßt die Figuren 1A und 1B, welche die Hüllglykoproteine von HIV-2 darstellen.

- Figur 1A: Vergleich der Proteine mit hohem Molekulargewicht von HIV-1 und HIV-2

Mit HIV-1 oder HIV-2 infizierte CEM-Zellen wurden mit ³&sup5;S- Methionin (200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) 18 Stunden lang markiert. Extrakte aus den infizierten Zellen (CELL) und ihr entsprechendes Kulturmedium (SN) wurden auf spezifischen Immunaff initätssäulen gereinigt: HIV-1-Serum- Sepharose-Säule, spezifisch für die HIV-1-Proteine (Krust et al., 1988) und HIV-2-Serum-Sepharose-Säule, spezifisch für die HIV-2-Proteine (siehe "Experimentelles Vorgehen"). Die gereinigten Proteine wurden durch Elektrophorese auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-SDS-Gel, das 6M Harnstoff enthielt, analysiert. Eine Fluorographie des Gels ist in Figur 1A angegeben. Die Größen der HIV-1- und HIV-2- Proteine sind auf der linken Seite und auf der rechten Seite der Bahnen angegeben. p68 und p55 sind die reverse Transkriptase bzw. der Vorläufer von gag. gp160 und gp120 sind der Glykoproteinvorläufer der Hülle von HIV-1 bzw. sein Spaltprodukt. gp300, gp140 und gp125 sind Vorläufer des Glykoproteins und das Spaltprodukt des Hüllproteins von HIV-2.

- Figur 1B: Identifizierung der Glykoproteine von HIV-2

Mit HIV-2 infizierte CEM-Zellen und T-Lymphocyten wurden mit ³H-Glucosamin (200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) 18 Stunden lang markiert. Extrakte der infizierten Zellen (Bahn C) und das Kulturmedium, das das Virus enthielt (Bahn V) wurden auf einer HIV-2-Serum-Sepharose-Säule gereinigt, und die markierten Proteine wurden durch Elektrophorese der in den CEM-Zellen synthetisierten HIV-2-Glykoproteine auf einem 7,5%igen Gel analysiert. In der ganz linken Bahn zeigt die Elektrophorese auf einem 12,5%igen Acrylamidgel das Vorhandensein von gp36. Dieser Teil der Figur mußte überexponiert werden, um gp36 nachzuweisen, weshalb gp140/125 in Form einer dicken Bande aufgelöst ist.

- Figur 2: Analyse der HIV-2-Glykoproteine in einer zweidimensionalen Gelelektrophorese

Die aus mit HIV-2 infizierten CEM-Zellen gereinigten Glykoproteine gp300, gp140 und gp125 (CELL) wurden mit ³&sup5;S-Methionin markiert. Die Glykoproteine sowie das das Virus enthaltende Kulturmedium wurden analysiert (SN bezeichnet das mit dem Kulturmedium erhaltene Ergebnis; die Herstellungsbedingungen für die zweidimensionale Gelelektrophorese sind denjenigen der Figur 1A vergleichbar) (siehe "Experimentelles Vorgehen"). Der pH-Gradient der isoelektrischen Focussierung (erste Dimension) entspricht dem angegebenen. In der zweiten Dimension wurden die Proteine auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-SDS-Gel, das 6M Harnstoff enthielt, aufgetrennt. Die Fluorographien der Gele sind in Figur 2 gezeigt.

- Figur 3: Dissoziierung des nativen (a) und denaturierten (b und c) Proteins gp300

a/ - Aus mit HIV-2 infizierten CEM-Zellen gewonnene und mit ³&sup5;S-Methionin markierte Extrakte wurden auf einer HIV- 2-Serum-Sepharose-Säule gereinigt. Diese Probe wurde anschließend in zwei gleiche Aliquote geteilt: einer wurde in einem Bindungspuffer (Bahn 1) inkubiert, während der andere in einem Puffer, der 30 mM Natriumacetat pH 4,0, 0,2 mm PMSF, 100 Einheiten/ml Aprotinin und 5 mM β- Mercaptoethanol enthielt, inkubiert wurde (Bahn 2). Nach 1 Stunde bei 37ºC wurde das saure Medium neutralisiert, und die zwei Proben wurden elektrophoretisch analysiert.

b/ - Das mit ³&sup5;S-Methionin markierte gereinigte und lyophilisierte gp300 wurde in einem Natriumacetatpuffer (100 ul) bei pH 4, wie vorstehend angegeben, suspendiert (Bahn 2). Es wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, bevor zweimal Elektrophoresepuffer, der 2M Harnstoff enthielt, zugegeben wurde. Die Ergebnisse der Bahn 1 entsprechen dem lyophilisierten direkt in dem Elektrophoresepuffer suspendierten gp300.

c/ - Mit ³&sup5;S-Methionin markiertes, gereinigtes und lyophilisiertes gp390 wurde in einer Lösung, die 30 mM Tris-HCl, 0,2 mM PMSF und 100 Einheiten/ml Aprotinin enthielt, suspendiert, und mit HCl auf pH 7,5, 7,0, 6,5 und 6,0 (wie in der Figur angegeben) gepuffert. Nach 60 Minuten bei 37ºC wurden in zwei Zugaben Elektrophoresepuffer zugesetzt, und die Proben wurden elektrophoretisch analysiert.

Fluorographien dieser Gele sind in a, b und c gezeigt. In Abschnitt c ist die charakteristische Bande von gp300 in gp140 dissoziiert, wobei diese Dissoziation mittels eines densitometrischen Scanners dieser Fluorographie quantifiziert werden kann.

- Figur 4: Spaltung der HIV-2-Glykoproteine mit Endo-H

Die Glykoproteine gp300, gp140/gp125 und gp125, die gereinigt und lyophilisiert wurden (vergleiche "Experimentelles Vorgehen") wurden in einem Puffer, der 150 mM Natriumcitrat bei pH 5,5, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 0,5 mM PMSF enthielt, suspendiert und dann 2 Minuten auf 90ºC erhitzt. Aliquote Teile dieser Proben wurden ohne Endo-H (Bahn 1) oder mit 0,4 (Bahn 2), 2 (Bahn 3) und 10 (Bahn 4) mU Endo-H inkubiert (2 Stunden, 30ºC).

Alle diese Reaktionen wurden durch Zugabe von Elektrophoresepuffer in zwei Anteilen gestoppt. Die Elektrophorese wurde wie für Figur 1 beschrieben durchgeführt. Die Fluorographien der verschiedenen Gele sind angegeben. Die Pfeile p90 und p80 auf der rechten Seite zeigen die Position des Spaltungsprodukts an. Die Bedingungen für die Endo-H-Spaltung wurden von Tarentino et al. 1974 beschrieben.

- Figur 5: Isotop-Markierung der HIV-2-Glykoproteine mit ¹&sup4;C-Mannose oder ³H-Fucose

Mit HIV-2 infizierte Zellen wurden 18 Stunden lang mit ¹&sup4;C- Mannose (25 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) oder ³H-Fucose (200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) markiert. Extrakte der infizierten Zellen (Bahn C) und des das Virus enthaltenden Kulturmediums (Bahn V) wurden auf einer HIV-2-Serum-Sepharose- Säule gereinigt. Die markierten Glykoproteine wurden anschließend durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel analysiert. Die Fluorographie ist in Figur 5 angegeben.

- Figur 6: Hemmung der Glykosylierung an Stickstoff durch Tunicamycin

Mit HIV-2 infizierte Zellen wurden in Abwesenheit von Tunicamycin (Bahn C) oder in Anwesenheit von Tunicamycin (Bahn TM) (2 ug/ml) mit ³&sup5;S-Methionin (Ausschnitt mit der Bezeichnung ³&sup5;S-met; 200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) oder mit ³H-Glucosamin (Ausschnitt mit der Bezeichnung ³H- GLcNAc; 200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) 16 Stunden lang markiert. Die mit Tunicamycin behandelten Zellen wurden zuerst mit dem Antibiotikum (2 ug/ml) 2 Stunden lang inkubiert (37ºC), bevor sie mit ³&sup5;S-Methionin oder ³H- Glucosamin markiert wurden. Extrakte der infizierten Zellen (CELL) und des Kulturmediums, das das Virus enthielt (SN), wurden auf einer HIV-2-Serum-Sepharose-Säule gereinigt und durch Elektrophorese auf einem 7,5%igen Polyacrylamidgel analysiert. Fluorographien dieser Gele sind angegeben. Die Positionen des nichtglykosylierten Hüllvorläufers (p90/80) und des nichtglykosylierten Dimeren (200 kD) sind durch kleine Pfeile auf der rechten Seite angegeben. Die Proteine 90/80 kD und 200 kD bauen kein ³H-Glucosamin (Ausschnitt ³H-GlcNAc, CELL Bahn TM) ein.

- Figur 7: Wirkung der Inhibitoren der Oligosaccharidspaltungen auf den Prozeß der Bildung des Hüllglykoproteins von HIV-2

Mit HIV-2 infizierte CEM-Zellen wurden mit ³&sup5;S-Methionin (200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) in Abwesenheit eines Spaltungsinhibitors (Bahnen T) oder in Anwesenheit eines Spaltungsinhibitors der Oligosaccharide markiert (16 Stunden, 37ºC): 1 mM Bromconduritol (Bahnen Bro); 1 mM Castanospermin (Bahnen Cast.); 10 ug/ml Swainsonin (Bahnen Sw); 3 mM Desoxynojirimycin (Bahnen dNM) und 1 mM Desoxymannojirimycin (Bahnen dMM). Extrakte der infizierten Zellen (Ausschnitt mit der Bezeichnung CELL) und des die viralen Partikel enthaltenden Kulturmediums (Ausschnitt SN) wurden auf einer HIV-2-Serum-Sepharose-Säule gereinigt, um die viralen Glykoproteine gp125, gp140, gp300 in den infizierten Zellen und gp125 in dem Kulturmedium nachzuweisen. Alle Proben wurden durch Elektrophorese auf einem 7,5%igen Polyacrylamidgel analysiert. Um zu zeigen, daß die Hemmung der Bildung von gp125 durch die mit verschiedenen Inhibitoren behandelten Zellen für das virale Glykoprotein spezifisch ist, wurde das Kulturmedium getestet, was zum Nachweis des Vorhandenseins des Kernproteins p26 durch einen Immunpräzipitationstest führte, bei dem ein für HIV-2 seropositives Serum eingesetzt wurde (Clavel et al., 1986a, 1987). p26 wurde durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel (12,5%) analysiert. Die Figuren stellen die Fluorographie dar, die nur einen einzigen Teil jedes Gels zeigt.

- Figur 8: Wirkung von Castanospermin und Monensin auf den Prozeß der Bildung der HIV-2-Glykoproteine

a/ - Markierungsversuche mit einem radioaktiven Tracer während einer kurzen Zeit, gefolgt von einer Eliminierung dieses Tracers und seinem Ersatz durch nichtradioaktive Moleküle ("Pulse-Chase"-Versuch) wurden ausgehend von durch HIV-2 infizierte CEM-Zellen in Abwesenheit von Castanospermin (Kontrolle) oder in Anwesenheit von 1 mM Castanospermin (Cast.) durchgeführt.

Kontrolle: Die infizierten Zellen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC in einem Medium ohne Methionin inkubiert, bevor eine Markierung über eine kurze Zeitspanne von 15 Minuten mit ³&sup5;S-Methionin (200 uCi/ml; 4 x 10&sup5; Zellen/ml, Bahn 1) durchgeführt wurde. Der radioaktive Tracer wurde eliminiert und durch das Kulturmedium, das 5 mM kaltes Methionin enthielt, für 0,5, 1,5 und 3 Stunden ersetzt (Ergebnis, dargestellt in den Bahnen 2, 3 bzw. 4) Cast.: Die durch HIV-2 infizierten CEM-Zellen wurden in einem Medium ohne Methionin, das Castanospermin enthielt, inkubiert (1 Stunde bei 37ºC) und dann rasch während 30 Minuten mit ³&sup5;S- Methionin markiert. Die Zellen wurden anschließend nach der Elimination des radioaktiven Tracers und des Ersatzes durch nichtradioaktive Moleküle wie vorstehend beschrieben, aber in Gegenwart von Castanospermin 0,5, 1,5 und 3 Stunden lang "gechased" (Bahnen 2, 3 bzw. 4).

b/ - "Pulse-chase"-Experimente mit einem radioaktiven Tracer unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen mit HIV-2 infizierten Zellen wurden in Abwesenheit von Monensin (Kontrolle) oder in Anwesenheit von 1 um Monensin durchgeführt. Die infizierten Zellen mit oder ohne Monensin wurden in einem Medium ohne Methionin 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert und dann während einer kurzen Zeitspanne (30 Minuten) mit ³&sup5;S-Methionin markiert (Bahn 1). Die markierten Zellen wurden anschließend in dem Kulturmedium, das 5 mM kaltes Methionin enthielt, 0,5, 1,5 und 3 Stunden lang "gechased" (Bahnen 2, 3 bzw. 4).

Die Extrakte wurden auf einer HIV-2-Serum-Sepharose-Säule gereinigt, und die markierten Proteine wurden durch Elektrophorese auf einem 7,5%igen Polyacrylamidgel analysiert. Die Ergebnisse sind in den Fluorographien dargestellt. p55 ist der Vorläufer von gag in Abschnitt A, Bahn 1.

- Figur 9: Vorläufer der SIV-Glykoproteine

Mit SIV infizierte HUT-78-Zellen wurden 16 Stunden lang bei 37ºC mit ³&sup5;S-Methionin (200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml), ³H- Fucose (200 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) und ¹&sup4;C-Mannose (25 uCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) markiert. Extrakte der infizierten Zellen (Bahnen C) und des SIV-enthaltenden Kulturmediums (Bahnen V) wurden auf einer HIV-2-Serum-Sepharose-Säule gereinigt. Ein für HIV-2 positives Serum wurde verwendet, um die Immunpräzipitationsreaktion der SIV-Proteine durchzuführen, da die HIV-2- und SIV-Proteine immunologische Kreuzreaktionen zeigen. Alle Proben wurden elektrophoretisch auf einem 7,5%igen Polyacrylamidgel analysiert (vergleiche "Experimentelles Vorgehen"). Eine Fluorographie der verschiedenen Gele ist gezeigt. Die elektrophoretische Mobilität von gp300SIV und von gp140SIV entspricht derjenigen der Glykoproteine gp300 und gp140 von HIV-2. gp130SIV besitzt eine Mobilität, die geringfügig höher als die von gp125 von HIV-2 ist. Das mit ³&sup5;S-Methionin markierte p55 ist wahrscheinlich der Vorläufer von gag von SIV.

- Figur 10: Schematische Darstellung der Bildungsstufen des Hüllglykoproteins von HIV-2

Das synthetisierte und glykosylierte 80 kD Polypeptid führt zur Bildung eines "unreifen Vorläufers der Glykoproteine" gp150, der rasch durch die Glukosidasen des granulären endoplasmatischen Retikulums (RER) deglykosyliert wird. Eine Veränderung der Umgebung (insbesondere des pH-Werts) führt nun zur Dimerisierung, die zur Bildung von gp300, dem "Zwischenvorläufer in dimerer Form" führt. gp300 wird durch die Mannosidasen des RER gespalten, bevor es in den Golgi- Apparat transportiert wird. Andere Spaltungen von gp300 werden durch die Mannosidasen des Golgi-Apparates durchgeführt, vor dem Transfer von Fucose und Sialinsäureresten in dem Golgi-Internum-Bereich und in dem Trans-Golgi-Bereich. Schließlich wird das Dimere in einen "reifen Vorläufer" gp135 als Folge des sauren pH-Werts, der in dem Kompartiment des Trans-Golgi-Netzes (TGN) vorliegt, dissoziiert. gp135 wird in die Plasmamembran transportiert und durch die zelluläre Protease gespalten, was zu reifen Hüllglykoproteinen von HIV-2, gp125 und gp36 führt. Tunicamycin (TM) hemmt den Zusammenbau der Dolichol-P-P- glycanreste; das Castanospermin (Cast.) und das Desoxynojirimycin (dNM) hemmen die Glucosidasen des RER; Desoxymannojirimycin (dMM) hemmt die spaltenden Mannosidasen im RER und im cis-Golgi- und Golgi-Internum- Bereich; Monensin hemmt den Transport der Membranglykoproteine und der Sekretionsproteine aus dem Golgi- Apparat.

BEISPIELE EXPERMINTELLES VORGEHEN I - MATERIALIEN

L-(³&sup5;S)-Methionin (spezifische Aktivität: 1000 Ci/mmol), L- (6-³H)-Fucose (spezifische Aktivität: 45-70 Ci/mmol), D-(6- ³H)-Glucosamin (spezifische Aktivität: 20-40 Ci/mmol) und D-(U-¹&sup4;C)-Mannose (spezifische Aktivität: 200-300 mCi/mmol), bezogen von Amersham (Amersham, UK).

Bromconduritol, Castanospermin, 1-Desoxymannojirimycin (dMM), 1-Desoxynojirimycin (dNM), Swainsonin und Tunicamycin wurden von Boehringer-Mannheim (Mannheim, BRD) bezogen.

Die Endo-β-N-acetylglucosaminidase-H wurde von Calbiochem (San Diego, USA) bezogen.

Die Ampholine stammten von Pharmacia (Uppsala, Schweden).

II - VIREN UND ZELLEN

Ein HIV-1BRU-Isolat des menschlichen Immunschwächevirus vom Typ 1 (beschrieben von Montagnier et al., 1984), ein HIV- 2ROD-Isolat des menschlichen Immunschwächevirus vom Typ 2 (beschrieben von Clavel et al. 1986a) und ein Affenimmunschwächevirus SIVmac142 (beschrieben von Daniel et al. 1985) wurden bei dieser Untersuchung verwendet.

Die verschiedenen Zellinien und die menschlichen Lymphocyten wurden in einem RPMI-1640-Suspensionsmedium (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise France), enthaltend 10% (Vol./Vol.) fötales Kälberserum, gezüchtet; 2 ug/ml Polybrene (SIGMA) wurden den durch HIV infizierten Zellkulturen zugesetzt. Die Zellen des Clons CEM13 stammen von der Linie CEM von menschlichen lymphoiden Zellen (hinterlegt bei der ATCC unter der Nr. CCL119) ab und exprimieren das T4-Antigen in großer Menge. 5 Tage nach der Infektion mit dem HIV-1BRU- Isolat oder mit dem HIV-2ROD-Isolat produzieren etwa 80 bis 90% der Zellen virale Partikel und können aufgrund cytopathogener Wirkungen ausgelöst durch die Vakuolisierung der Zellen und das Auftreten von Synzytien kleiner Größe identifiziert werden.

Die HUT-78-Zellinie ist eine andere Zellinie von positiven menschlichen T4-Lymphocyten (Gadzdar et al. 1980), die in hohem Maße für die Replikation von SIVmac142 permissiv ist (Daniel et al. 1985). Periphere Lymphocyten aus dem Blut von Spendern mit gesundem Blut wurden 3 Tage lang mit 0,02% (Gew./Vol.) der P-Fraktion von Phytohämagglutinin (DIFCO, Detroit, USA) in einem RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum komplettiert war, stimuliert. Die Zellen wurden anschließend in einem RPMI-1640-Medium, das 10% (Vol./Vol.) T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF, Biotest) enthielt, gezüchtet. Nach der Infektion mit HIV-2 wurden die Lymphocyten in Gegenwart von 10% (Vol./Vol.) TCGF und 2 g/ml Polybrene gezüchtet.

III - METABOLISCHE MARKIERUNG DER ZELLEN

Um die Proteine metabolisch zu markieren wurden die infizierten Zellen 16 Stunden lang bei 37ºC in einem MEM-Kulturmedium (englische Abkürzung von Minimum Essential Medium) ohne L-Methionin und Serum, aber durch 200 uCi/ml L- (³&sup5;S)-Methionin komplettiert, inkubiert. Für die metabolische Markierung der Glykoproteine wurden die infizierten Zellen 16 Stunden lang bei 37ºC in einem MEM-Kulturmedium ohne Serum und Glucose, aber komplettiert mit 200 uCi/ml ³H-Fucose und 200 uCi/ml D-[6-H]-Glucosamin oder 25 uCi/ml ¹&sup4;C-Mannose inkubiert.

IV - ZELLEN UND VIRALE EXTRAKTE

Die zellulären 10&sup7;-Zellen entsprechenden Bodensätze wurden in 100 ul des folgenden Puffers resuspendiert: 10 mM Tris- HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 100 Einheiten pro ml Aprotinin (Iniprol CHOAY) vor der Zugabe von 100 ul des gleichen Puffers, enthaltend 2% (Vol./Vol.) Triton X-100. Die zellulären Extrakte wurden bei 12.000 g 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand wurde bei -80ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Für die Präparationen des viralen Extrakts wurden 100 ul 10 x Lysepuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,6, 1,5 M NaCl, 10 mM EDTA, 10% (Vol./Vol.) Triton X-100, 100 Einheiten/ml Aprotinin) pro ml geklärtem Überstand der infizierten CEM-Zellen zugesetzt. Diese Präparate wurden wie folgt verwendet.

V - HERSTELLUNG EINES IMMUNABSORBENS MIT IM SERUM EINES FÜR DAS HIV-2-VIRUS SEROPOSITIVEN PATIENTEN VORHANDENEN ANTI- KÖRPERN

Immunglobuline eines Serums für HIV-2 seropositiven Patienten wurden mit 50% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; ausgefällt, in 20 mM Natriumphosphat (pH 8,0) aufgelöst, anschließend über eine DEAE- Cellulosesäule(DE 52, Whatman) durch Elution mit 20 mM Natriumphosphat (pH 8,0) gereinigt. Diese so gereinigten Immunglobuline wurden als zu 90% rein beurteilt. Die Antikörper wurden anschließend an CNBr-aktivierte CL 4B-Sepharose gemäß der von Berg (1977) beschriebenen Technik gekoppelt. 2 mg IgG wurden pro ml Sepharose -CL-4B gekoppelt. Dieses Immunabsorbens wird als "HIV-2-Serum- Sepharose" bezeichnet.

VI - BINDUNGEN DER HIV-2-PROTEINE AN EINE IMMUNAFFINITÄTSSÄULE

Zelluläre Extrakte von CEM-Zellen, die HIV produzieren, wurden zuerst in 2 Volumina Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (Vol./Vol.) Triton X-100 , 20% (Vol./Vol.) Glycerin, 7 mM Mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF, 100 Einheiten/ml Aprotinin) vor der Inkubation mit einem Volumen "HIV-2-Serum-Sepharose" verdünnt. Die Überstände der das HIV-2-Virus produzierenden Zellen wurden auf gleiche Weise wie die zellulären Extrakte behandelt, außer daß ein 1/10 des 10fach konzentrierten Bindungspuffers pro Volumen Überstand zugesetzt wurde. Die Stufe der Bindung wurde 1 Nacht lang durchgeführt, dann wurde die Säule ausreichend mit dem Bindungspuffer gewaschen. Die an die Säule gebundenen Proteine wurden eluiert, indem man sie in einem Elektrophoresepuffer (125 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% (Gew./Vol.) SDS, 2 M Harnstoff, 20% Glycerin, 1% β-Mercaptoethanol) erhitzte. Die eluierten Proteine wurden auf Elektrophoresegelen von 7,5%igem SDS- Polyacrylamid, enthaltend 6 M Harnstoff, und 0,1% Bisacrylamid anstelle von 0,2% (Gew./Vol.) analysiert.

VII - PRÄPARATIVE ELEKTROPHORESE

Die von der Affinitätssäule eluierten HIV-2-Glykoproteine wurden durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel wie vorstehend beschrieben analysiert, und die Regionen des Gels, die die viralen Glykoproteine enthielten, wurden bezüglich der Position der Proteinmarker mit zuvor ermitteltem Molekulargewicht (BRL) geschnitten.

Die Glykoproteine wurden durch 16stündige Inkubation bei 4ºC in einem Elutionspuffer (0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5 mM EDTA, 0,05% (Gew./Vol.) SDS, 0,2 mM PMSF) eluiert. Die so erhaltenen Glykoproteinfraktionen wurden lyophilisiert und im Kühlschrank bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt.

VIII - ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE

Eine zweidimensionale Gelelektrophorese wurde wie von O'Farrel (1975) beschrieben, mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: die mit L-(³&sup5;S)-Methionin markierten, an eine HIV-2-Serum-Sepharosesäule gebundenen Proteine wurden eluiert, indem man sie in einem Elektrophoresepuffer wie vorstehend beschrieben erhitzte und anschließend in einem Volumen eines Puffers, der 9,5 M Harnstoff, 8% (Vol./Vol.) Mercaptoethanol, 1,6% (Gew./Vol.) Ampholine bei einem pH- Wert, der im Intervall von 6,5 bis 9 gelegen ist, 0,4% (Gew./Vol.) Ampholin bei einem pH-Wert, der in einem Intervall von 3 bis 10 gelegen ist und 100 Einheiten/ml Aprotinin enthielt, verdünnte.

BEISPIEL 1 - CHARAKTERISIERUNG DER GLYKOPROTEINE gp300 UND gp140

Das von der Analyse mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese erhaltene Auflösungsschema der mit ³&sup5;S-Methionin markierten Glykoproteine gp300, gp140 und gp125, zeigt, daß gp300 und gp140 vorhanden sind. Diese zwei Proteine stellen deutlich getrennte Banden auf dem Gel dar, aber sie besitzen einen isoelektrischen Punkt (pI), der einem pH- Wert, der von 6,8 bis 7,8 variiert, entspricht. Diese Ergebnisse sind in der Figur 2 gezeigt. Diese Ähnlichkeit zwischen den Proteinen gp140 und gp300 legt nahe, daß gp300 eine dimere Form von gp140 ist.

gp125 zeigt zugleich weniger Heterogenität in den infizierten Zellen und in den viralen Partikeln und wandert an einen isoelektrischen Punkt bei pH-Werten im Bereich zwischen 6,2 und 6,5.

In den infizierten Zellen wurde das Vorhandensein von kleineren Subeinheiten des Proteins gp125 mit einem isoelektrischen Punkt für pH-Werte im Bereich von 7,2 und 7,3 beobachtet. Diese zuletzt genannte Proteinkategorie ist in dem HIV-2-Virion nicht vorhanden, weshalb es wahrscheinlich ein nicht abschließend gebildetes Glykoprotein darstellt.

Die saure Natur des reifen gp125 kann eine Folge der Sialinsäure an bestimmten Kohlenhydratketten sein, die während der Reifung des Hüllglykoproteins hinzugefügt werden.

Das Hüllglykoprotein gp300 ist sehr stabil, da es gegenüber ionischen (1% SDS) und nichtionischen (2% Triton x-100 ), Detergentien, Harnstoff (2-6 M), starken Salzen (1 M NaCl) und Reduktionsmitteln (1% β-Mercaptoethanol) resistent ist. Jedoch konnte festgestellt werden, daß gp300 in einem Medium mit saurem pH-Wert unter Bildung von zwei Glykoproteinen gp140 dissoziiert werden kann. In diesen Versuchen wurden an eine Immunaffinitätssäule gebundene Proteine in einein Acetatpuffer mit pH-Werten im Bereich zwischen 4 und 7 inkubiert. Diese Proben wurden anschließend elektrophoretisch auf einem Polyacrylamidgel analysiert. Die Figur 3A, auf der die Ergebnisse dargestellt sind, zeigt, daß eine Bande von gp300 in eine der Position von gp140 entsprechende Bande umgewandelt wird, wenn die Probe bei pH 4 inkubiert wird. Andere Versuche wurden durchgeführt, wobei gereinigte gp300- Präparate, erhalten aus den präparativen Elektrophoresegelen, wie vorstehend beschrieben, verwendet wurden. Derartige denatuierte Proben von gp300 wurden vollständig in einem Acetatpuffer mit pH 6,0 dissoziiert. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Figur 3B dargestellt. Die Effizienz der Dissoziation des gereinigten Glykoproteins gp300 ist wahrscheinlich eine Folge der Absenkung des pH-Werts und des Vorhandenseins von SDS-Resten in der lyophilisierten Probe, da das an die Säule gebundene native Glykoprotein gp300 im gleichen Puffer bei höheren pH-Werten als pH 5 nicht dissoziierbar war.

In einem Tris-HCl-Puffer ist die Dissoziation weniger wirkungsvoll. Bei pH 7,5 beobachtet man nur eine schwache Dissoziation von gp300 in Form von gp140, die jedenfalls mit Absenkung der pH-Werte zunimmt. In einem Tris-Puffer mit pH-Wert 6,0 betrug die Dissoziation ungefähr 80%, wie Figur 3C zeigt. Bei der Dissoziation des reinen gp300 in einem anderen Acetat- oder Tris-HCl-Puffer konnte kein anderes Protein als gp140 nachgewiesen werden (die Versuche wurden auf einem 15%igen Polyacrylamidgel durchgeführt). Diese Ergebnisse zeigen an, daß gp300 eine dimere Form von gp140 ist, die ihrerseits ein Vorläufer des Hüllglykoproteins von HIV-2 ist. Folglich erscheint wahrscheinlich, daß während der Bildung des Hüllglykoproteins zwei gp140-Moleküle an einem pH-abhängigen Fusionsmechanismus teilnehmen.

BEISPIEL 2 - CHARAKTERISIERUNG DER OLIGOSACCHARIDSEITENKETTEN DER HIV-2-GLYKOPROTEINE

Eine Spaltung mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase-H (Endo-H) erlaubte für die Glykoproteine von HIV-2 den Nachweis des Vorhandenseins von am Stickstoff gebundenen Oligosacchariden (Tarentino et al. 1974). gp300, das Gemisch aus (gp140, gp125) und gp125 allein wurden affinitätschromatographisch und mittels präparativer Elektrophorese (vergleiche Experimentelles Vorgehen) gereinigt. Die lyophilisierten Proben wurden in einem Endo-H-Spaltungspuffer, der nicht die Dissoziation von gp300 in gp140 begünstigt, suspendiert.

Nach der Spaltung mit Endo-H entspricht die elektrophoretische Mobilität von gp300 der schwächeren eines Proteins mit 200 bis 250 kD. Eine kleine Fraktion von in gp140 dissoziiertem gp300 wurde gespalten und führte zu einem 80 kD Protein. Die Ergebnisse sind in Figur 4, Abschnitt gp300 dargestellt. Die das Gemisch aus gp140, gp125 enthaltende Probe wurde durch Endo-H gespalten und ergab Proteine mit 90 und 80 kD, während gp125 allein in ein 90 kD-Protein während dieser Spaltung umgewandelt wurde, wie die Abschnitte gp140/125 und gp125 der Figur 4 zeigten. Eine Spaltung mit Endo-H von gp140 und von gp125 führt zu Produkten mit Molekulargewichten von 80 bzw. 90 kD.

In der Tat wurde durch metabolische Markierung der Zellen mit ¹&sup4;C-Mannose und ³H-Fucose der Einbau von Mannose in gp300, gp140 und gp125 gezeigt, während nur gp300 und gp125 Fucose einbauen konnten (Figur 5). Die Fucosereste werden normalerweise auf Oligosaccharidketten in einem fortgeschrittenen Stadium des Glykosylierungszyklus nach Wirkung von am endoplasmatischen Retikulum und am Golgi- Apparat haftenden Enzymen übertragen (Kornfeld und Kornfeld, 1985; Fuhrmann et al., 1985).

Aus diesen Gründen kann man annehmen, daß aller Wahrscheinlichkeit nach die schwache Resistenz von gp125 gegenüber Spaltung mit Endo-H, verglichen mit gp140, eine Folge der Konversion bestimmter Oligosaccharid-Seitenketten vom Typ Mannose in komplexe Oligosaccharide während der Transformation des Hüllglykoproteins ist (Kornfeld und Kornfeld, 1985). Die Tatsache, daß gp140 keinen Fucoserest enthält, entspricht der Tatsache, daß es einen Vorläufer von gp300 und gp125 darstellt.

BEISPIEL 3 - WIRKUNG VON TUNICAMYCIN EINEM INHIBITOR DER GLYKOSYLIERUNG AUF DIE BILDUNG VON HIV-2-GLYKOPROTEINEN

Alle Glykoproteine, die Oligosaccharide in Bindung an Stickstoff tragen, erhalten ihre Oligosaccharidkette Glc&sub3;Man&sub9;-GlcNAc&sub2;-pp-Dolichol dank einer Reaktion, die durch die Protein-Oligosaccharidyltransferase durchgeführt wird, die den blockweisen Transfer von Oligosaccharidketten auf die Asparaginreste katalysiert (vergleiche die Literaturstellen Kornfeld und Kornfeld, 1985). Das Tunicamycin blockiert eine derartige Glykosylierung am Stickstoff, indem es die Bildung von N-Acetylglucosaminpyrophosphoryldolichol, der ersten Stufe im Zusammenbau von Oligosacchariden, die an Lipide gebunden sind, hemmt (Li et al., 1978; Heifetz et al., 1979). In Gegenwart von 2 ug/ml Tunicamycin wird die gesamte Glykosylierung am Stickstoff der Hüllglykoproteine von HIV-2 in den infizierten Zellen blockiert. Dieses Ergebnis wird durch das Fehlen eines ³H- Glucosamineinbaus in die viralen Glykoproteine gp300, gp140, gp125 gezeigt (Figur 6). Unter diesen Versuchsbedingungen wurde jedoch nicht die Proteinsynthese in den infizierten Zellen, die mit Tunicamycin behandelt worden waren, beeinträchtigt. Derartige mit ³&sup5;S- Methioninisotopen markierte Kulturen zeigten zwei Hauptproteine mit offensichtlichen Molekulargewichten von 200 und 80 bis 90 kD, die in großen Banden wandern (Figur 6). Das Molekulargewicht dieser Proteine fällt mit den Spaltproduken durch Endo-H von gp300, gp140 und gp125 zusammen (Figur 4), was nahelegt, daß die Proteine mit den Molekulargewichten von 200 kD, 80 bis 90 kD nichtglykosylierten Formen der Hüllglykoproteine von HIV-2 entsprechen.

Das Molekulargewicht des 80 bis 90 kD-Proteins entspricht dem Molekulargewicht, das von dem nichtglykosylierten Vorläufer der HIV-2-Hülle erwartet wird, abgeschätzt auf der Grundlage dessen Nukleinsäuresequenz (Guyader et al., 1987). Das 200 kD-Glykoprotein ist wahrscheinlich die dimere Form des nichtglykosylierten Hüllvorläufers. Diese Resultate bestätigen, daß die Hüllproteine von HIV-2 am Stickstoff gebundene Polysaccharidketten enthalten. Außer der Hemmung der Glykosylierung hemmt eine Behandlung mit Tunicamycin die Bildung und den Export des Hüllglykoproteins, da das 80 bis 90 kD-Protein in dem extrazellulären Medium nicht nachgewiesen wurde, wie Figur 6, Bahn SN, zeigt.

Die Ergebnisse dieser Versuche erlauben die Vermutung, daß die Glykosaccharidketten der Hüllproteine von HIV-2 wahrscheinlich am zellulären Transport durch den Golgi-Apparat beteiligt sind. Das Fehlen von nichtglykosylierten Formen des Hüllproteins in dem extrazellulären Medium der mit Tunicamycin behandelten Zellen könnte gegebenenfalls auf seinen raschen Abbau zurückzuführen sein. Zahlreiche Berichte haben allgemein vorgeschlagen, daß die nichtglykosylierte Form eines Proteins gegenüber der Wirkung von Proteasen empfindlicher ist als seine glykosylierte Form (Olden et al., 1978; Schwartz et al., 1976). Im Einklang mit diesen Ergebnissen stellen Proteine mit kleinem Molekulargewicht, die in den mit ³&sup5;S-Methionin markierten, in Tunicamycin gezüchteten Zellen vorhanden sind, wahrscheinlich Teilabbauprodukte des nichtglykosylierten Hüllproteins dar (Figur 6).

BEISPIEL 4 - WIRKUNG VON INHIBITOREN DER ANHEFTUNG VON OLIGOSACCHARIDEN AUF DIE SYNTHESE UND DIE TRANSFORMATION DER HIV-2-GLYKOPROTEINE

An Asparagin gebundene Oligosaccharide (Glc&sub3;Man&sub9;-GlcNAC&sub2;) der Glykoproteine unterliegen umfangreichen Modifikationen oder einer Transformation nach ihrer Bindung an Proteine (vergleiche Kornfeld und Kornfeld, 1985). Die Reaktionen zur Abspaltung der Glucose- und Mannoseenden durch Enzyme finden im Lumen des granulären endoplasmatischen Retikulums (RER) und im Golgi-Apparat durch Wirkung von spezifischen Mannosidasen und Glucosidasen statt.

Man kann in die Transformation von Oligosaccharidketten von Glykoproteinen eingreifen, indem man spezifische Glucosidase- und Mannosidaseinhibitoren verwendet (berichtet von Schwartz und Datema, 1984; Fuhrmann et al., 1985). In diesen Versuchen wurden verschiedene Bindungsinhibitoren verwendet, um die Lokalisierung der Vorläufer der HIV-2- Glykoproteine zu untersuchen und auch um die Rolle der Glykosylierung im Verlauf der Transformation des Vorläufers der Hülle zu untersuchen. Die verwendeten Inhibitoren sind die folgenden: Castanospermin, ein Pflanzen-Alkaloid, das die Glucosidase I hemmt (Saul et al., 1983); Desoxynojirimycin (dNM), ein Glucoseanalogon, das die Glucosidasen I und II hemmt, die die Abspaltung der endständigen Glucose gewährleisten (Lemansky et al., 1984); Desoxymannojirimycin (dMM), ein Analogon der Mannose, das die durch die Mannosidase katalysierten Reaktionen hemmt (Fuhrmann et al., 1984); Bromconduritol (6-Brom-3,4,5- trihydroxycyclohex-1-en), das die Glucosidase II (Datema et al., 1982) hemmt; Swainsonin, ein Indolizidinalkaloid, das die Mannosidase II des Golgi-Apparats hemmt (Tulsiani et al., 1982).

Die durch HIV-2 infizierten und durch ³&sup5;S-Methioninisotope in Abwesenheit oder in Anwesenheit verschiedener Bindungsinhibitoren und intrazellulärer und extrazellulärer Proteine markierten Zellen wurden affinitätschromatographisch gereinigt (Figur 7). Es wurde bestätigt, daß die infizierten Zellen gp300, gp140 und gp125 enthalten, während nur gp125 in dem extrazellulären Milieu beobachtet wurde (die Ergebnisse sind in der Figur 7, Abschnitte "CELL" und SN, Bande T dargestellt). In den mit Castanospermin oder dNM behandelten Zellen wurde ein normaler gp300-Gehalt, das Fehlen von gp125 und eine kleine Menge eines 150 kD-Proteins beobachtet, das wahrscheinlich der glykosylierten Form von gp140 entspricht. Folglich wurde in derartigen Zellen die Transformation des Hüllglykoproteins blockiert, da kein gp125 in dem extrazellulären Milieu nachgewiesen wurde, trotz der Produktion von p26, des Kernproteins von HIV-2 (Figur 7, Bahnen Cast. und dNM).

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Entfernung der endständigen Glucosereste von den Oligosaccharidketten des Vorläufers des Hüllglykoproteins für seine Transformation und die Spaltung durch die zelluläre Protease notwendig ist. Das Bromconduritol, das auf die Glucosidase II einwirkt, hemmte auch zu 70 bis 90% die normale Produktion von gp125, aber die Gehalte an gp140 und gp300 blieben normal (Figur 7, Bahnen Bro.). Im Gegensatz zu Castanospermin und dNM (die die Entfernung des endständigen Glucoserests hemmen) blockiert die Behandlung mit Bromconduritol (das die Entfernung der zwei internen Glucosereste hemmt) nicht vollständig die Transformation des Hüllglykoproteins von HIV-2. In der Tat kann ein geringer Gehalt an gp125 in den intra- und extrazellulären Medien nachgewiesen werden. Dieses zuletzt genannte Ergebnis legt nahe, daß ein geringer Grad an Mannoseabspaltung ohne Entfernung der zwei internen Glucosereste stattgefunden haben kann.

Die Mannosidaseinhibitoren, Swainsonin und dMM erzeugten keine offensichtlichen Modifikationen im intrazellulären Gehalt an gp300, gp140 oder gp125, aber der extrazelluläre Spiegel von gp125 lag um 50% unter der entsprechenden Form in den Kontrollzellen (Figur 7, Bahnen Sw und dMM). Obwohl die Oligosaccharidkette nur eine Deglykosylierung erlitten hatte, wird der Vorläufer des Glykoproteins dank proteolytischer Enzyme gespalten, wodurch ein gp125-ähnliches Protein entsteht, das jedoch mehr Mannose enthält, was wahrscheinlich den zellulären Transport von gp125 beeinflußt. Das Molekulargewicht des extrazellulären Glykoproteins, das in Gegenwart von dMM produziert wird, ist geringfügig höher als das des in Abwesenheit des Inhibitors produzierten Proteins. Das ist wahrscheinlich eine Folge der höheren Konzentration von Mannoseresten des von den mit dMM behandelten Zellen synthetisierten extrazellulären Proteins (Figur 7, Bahn SN).

Man kann daraus ableiten, daß die Wirkungen der Inhibitoren der Spaltungsenzyme auf die Transformation des Hüllglykoproteins von HIV-2 spezifisch sind, da die Synthese und Produktion von p26 von HIV-2 überhaupt nicht beeinflußt werden (Figur 7, Bahn SN).

BEISPIEL 5 - WIRKUNG VON CASTANOSPERMIN UND MONENSIN AUF DIE TRANSFORMATION DER HIV-2-GLYKOPROTEINE

Um die intrazelluläre Transformation der HIV-2- Glykoproteine zu untersuchen, wurden Versuche unter Einsatz von Tracern (pulse-chase) durchgeführt. Die HIV-2- infizierten Zellen wurden rasch mit radioaktivem ³&sup5;S- Methionin 15 Minuten lang markiert und dann wurde der Einbau des Tracers (chase) 0,5, 1,5 und 3 Stunden lang verfolgt (Figur 8, Kontrolle). gp140 ist das erste Protein, das 15 Minuten nach der Markierung nachgewiesen wird. Während der Verfolgung des Einbaus des radioaktiven Tracers kann gp300 nach einer halben Stunde nachgewiesen werden, während gp125 erst nach 1,5 bis 3 Stunden nachgewiesen wird. Die Tatsache, daß gp300 nach der Synthese von gp140 beobachtet wird, und daß gp125 erst nach der Bildung von gp300 beobachtet wird (Figur 8A, Bahnen 1 bis 4), legt nahe, daß die Dimerisierung ein für die Transformation des Oligosaccharids in ein durch Reifung entstandenes Glykoprotein, das gp125, notwendiges Zwischenstadium ist. Diese Theorie wird durch die Verwendung von Castanospermin bestätigt, das das Entfernen des externen Glucoserests und der Polysaccharidketten hemmt. Nach 30minütiger Markierung (pulse) in Gegenwart von Castanospermin wird ein Protein mit 150 kD mit gp300 (Figur 8, Cas., Bahn 1) nachgewiesen. Das 150 kD-Protein könnte gp140 entsprechen. Die schwache Molekulargewichtszunahme des ersten Vorläufers wird auf das Vorhandensein von Glucoseresten in den Oligosaccharidketten zurückgeführt. Daher stellt das in den HIV-2-infizierten Zellen synthetisierte gp140 den Vorläufer des Glykoproteins ohne Glucosereste dar. Gemäß diesem Ergebnis stellt das 150 kD-Protein (gp150) das erste Hüllglykoprotein von HIV-2, das noch keine Reifung durchlaufen hat, dar. Die Entfernung der Glucosereste in den Kontrollzellen entspricht einer raschen Transformation, die während oder unmittelbar nach der cotranslationellen Translokation der Glykoproteinvorläufer in das endoplasmatische Retikulum stattfindet (Lemansky et al., 1984). Nach 30minütiger Markierung (pulse) und 3stündiger Beobachtung des Einbaus des Tracers (chase) in Gegenwart von Castanospermin wird der gp150- Spiegel stufenweise verringert, während die Menge an gp300 zunimmt (Figur 8, Cast., Bahnen 1 bis 4). Unter diesen Versuchsbedingungen wurde der Vorläufer nicht unter Erhalt von gp125 gespalten.

Eine andere Charakterisierung des Hüllglykoproteins von HIV-2 wurde während der Einbauversuche eines radioaktiven Tracers (pulse-chase) durchgeführt, wobei Monensin, ein kationischer Ionophor, verwendet wurde, das den Transport von Proteinen aus dem Golgi-Apparat über die Plasmamembran oder in bestimmten Fällen den Transport der Proteine auf der Ebene der Zisternen des Internums des Golgi-Apparats hemmt (Tartakoff und Vassali, 1977; Johnson und Schlesinger, 1980; Strous und Lodish, 1980; Griffiths et al., 1983). HIV-2-infizierte Zellen einerseits in Abwesenheit, andererseits in Anwesenheit von Monensin wurden mit einem radioaktiven Tracer (pulse) 30 Minuten lang markiert, dann wurde der Einbau des Tracers (chase) 0,5, 1,5 und 3 Stunden lang verfolgt (Figur 8B). In Gegenwart von Monensin synthetisierten die HIV-2-infizierten Zellen gp140 in normalem Gehalt ebenso wie die dimere Form. Umgekehrt konnte keine Spur von gp125 in den mit Monensin behandelten Zellen nachgewiesen werden. Nach 1,5- bis 3stündigem Verfolgen des Einbaus des Tracers (chase) haben die mit Monensin behandelten Zellen ein 135 kD-Protein (gp135) angereichert, das wahrscheinlich das Dissoziationsprodukt des Vorläufers des Dimeren ist. Das geringfügig niedrigere Molekulargewicht von gp135 verglichen mit gp140 ist eine Folge der Entfernung bestimmter Mannosereste durch die Mannosidasen des RER und des Golgi-Apparats. Dieses gp135 kann anschließend in die Plasmamembran transportiert und durch die zelluläre Protease gespalten werden. Die Hemmung des Transports der Proteine durch Monensin blockiert das Glykoprotein gp135 in dem "trans"-Teil des Golgi-Apparats (trans-Golgi). Kein gereiftes Hüllglykoprotein wird in den mit Monensin behandelten Zellen nachgewiesen, unabhängig davon, ob es intra- oder extrazellulär ist, während das Kernprotein (core) p26 synthetisiert und ausgeschieden wird.

BEISPIEL 6 - DIMERISIERUNG DES VORLAUFERS DER GLYKOPROTEINE IN DEN DURCH SIVmac INFIZIERTEN ZELLEN

Die Nucleotidsequenz des HIV-2-Hüllglykoproteins zeigt eine beträchtliche Homologie (75% identische Aminosäuren) mit derjenigen von SIV (Guyader et al., 1987; Chakrabarti et al., 1987; Franchini et al., 1987). Aus diesen Gründen wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Dimerisierung der Hüllglykoproteine auch in durch SIV infizierten Zellen nachwiesen werden kann. SIV-Proteine wurden auf einer Immunaffinitätssäule gereinigt, die spezifische Antikörper gegen die HIV-Proteine in dem Ausmaß enthielt, in dem die Proteine gag, pol und env von HIV-2 und SIV antigene Kreuzreaktionen zeigen. Die Figur 9 zeigt, daß die mit SIV infizierten Zellen 3 Proteine mit hohem Molekulargewicht synthetisieren, die analog denen sind, die in den durch HIV-2 infizierten Zellen synthetisiert werden: gp300, gp140 und gp130. Der Beweis, daß die in den durch SIV infizierten Zellen vorhandenen Glykoproteine Glykoproteine sind, wurde durch isotypische Markierung mit ¹&sup4;C-Mannose und ³H-Fucose erbracht. Diese 3 Proteine haben Mannose eingebaut, aber nur gp300/SIV und gp130/SIV haben Fucose eingebaut. gp300/SIV und gp140/SIV sind intrazelluläre Proteine, während gp130/SIV ein extrazelluläres Glykoprotein ist. Die Tatsache, daß gp300/SIV und gp130/SIV die Fucose einbauen können, zeigt, daß diese Proteine Transformationsprodukte von gp140/SIV sind.

Diese Ergebnisse zeigen an, daß eine Dublettbildung (Dimeres) des Vorläufers des Hüllglykoproteins eine spezifische Eigenschaft der Expression des Hüllgens von HIV-2 und SIV ist. Man kann umgekehrt feststellen, daß das Hüllglykoprotein von HIV-1 keine Dimerisierung während seiner Transformation erleidet. Die durch HIV-1 in Gegenwart von Castanospermin oder dNM infizierten Zellen reichern das Hülldimere nicht an, wie es für HIV-2 oder SIV der Fall ist.

DISKUSSION:

Wie die Beispiele zeigen, gelang es den Erfindern, den Prozeß der Bildung des Hüllglykoproteins von HIV-2 zu bestimmen, und sie haben einen grundlegenden Mechanismus bei der Synthese der Glykoproteine, umfassend an Stickstoff gebundene Oligosaccharidketten, nachgewiesen. Die Hüllglykoproteine von HIV-2, d.h. das extrazelluläre Glykoprotein gp125 und das Transmembran-Glykoprotein gp36 stammen von einem gemeinsamem Vorläuferglykoprotein ab (Guyader et al., 1987). Ein unerwartetes Element, das erfindungsgemäß beschrieben wird, ist die Tatsache, daß zum Transport und zur Transformation im Golgi-Apparat der Vorläufer des Glykoproteins eine homologe Dimerenbildung benötigt. Der Dimerisierungsmechanismus des Hüllglykoproteins ist nicht vollständig geklärt. Die Tatsache, daß das im Rahmen der Erfindung gereinigte Dimere bei einem sauren pH-Wert (pH 6,0) dissoziiert werden kann, legt nahe, daß die Dimerisierung pH-abhängig sein könnte.

Die Erfinder haben die Tatsache nachgewiesen, daß im natürlichen Vorläufer des Glykoproteins vorhandene Oligosaccharidketten für die Dimerenbildung nicht wesentlich sind. Dies wurde durch zwei Versuche gezeigt: (1) die Spaltung mit Endo-H führt zu einer Modifikation der elektrophoretischen Mobilität des Dimeren ohne dessen Dissoziation; (2) in Gegenwart von Tunicamycin synthetisieren durch HIV-2 infizierte Zellen einen nichtglykosylierten Hüllvorläufer (80 bis 90 kD), der ein Dimeres (200 kD) bilden kann. Diese Ergebnisse bestätigen die Tatsache, daß die Dimerenbildung eine intrinsische Eigenschaften des Peptidgrundgerüsts des Vorläufers der Hülle ist.

Markierungsversuche über eine kurze Zeitspanne (englisch "pulse") mit einem radioaktiven Tracer, einer anschließenden Eliminierungsstufe durch Auswaschen dieses Tracers und dessen Ersatz durch nichtradioaktive Moleküle und die Verfolgung der Lokalisation der Radioaktivität (englisch "chase"), ausgehend von zu verschiedenen Zeitintervallen entnommenen Proben mit oder ohne castanospermin (Figur 8) zeigen, daß die Dimerisierung des Vorläufers des Glykoproteins normalerweise unmittelbar nach der Entfernung der Glucosereste eintritt. Da die Glucosidasen an die Membranen des endoplasmatischen Retikulums assoziiert sind, kann man vermuten, daß die Dimerisierung im RER eintritt. In Gegenwart von Castanospermin wird das Dimere im RER angereichert und nicht transformiert. Indes verhindert, wenn die Glucosereste entfernt werden, die Hemmung der Mannosidasen des RER nicht die Transformation der dimerisierten Glykoproteine während der Passage durch den Golgi-Apparat (Figur 7). Dies erlaubt die Aufstellung der Hypothese, daß die Glucosereste der Oligosaccharidketten des dimerisierten Vorläufers seinen Austritt aus dem RER verhindern. Entsprechend damit kann die Hypothese aufgestellt werden, daß die Abspaltung der Glucosereste für einen effektiven Transport vom RER in den Golgi-Apparat notwendig ist, was gegebenenfalls auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß die deglucosylierten Oligosaccharide einen Teil der Erkennungsstelle für einen Transportrezeptor bilden (Lodish et Kong, 1984, Lemansky et al., 1984). Es ist ebenso möglich, daß die Suppression der Glucose dafür wichtig ist, daß der dimerisierte Vorläufer eine funktionelle korrekte Konfiguration einnimmt (Schlesinger et al., 1984). Diese funktionelle Konfiguration würde die Wirkung der spaltenden Mannosidasen begünstigen.

Im Hinblick auf diese Ergebnisse haben die Erfinder eine schematische Darstellung der Transformation der Hüllglykoproteine von HIV-2 vorgeschlagen (Figur 10). Die vermutliche Größe des Peptidgrundgerüsts des Vorläufers des Hüllglykoproteins beträgt etwa 80 kD (Figuren 4 und 6). Die Oligosaccharidkette wird von Dolichol-P-P auf einen Vorläufer der Hülle (80 kD), wahrscheinlich auf Aminosäurereste vom Typ Asparagin, die als Akzeptoren fungieren, übertragen (Kornfeld und Kornfeld, 1985). Das Tunicamycin hemmt den Zusammenbau von Dolichol-P-P und Glycan, und aus diesem Grund wird das 80 kD-Protein nicht glykosyliert. Die Hinzufügung von Oligosaccharidketten an das 80 kD-Protein führt zum Erhalt des ersten Vorläufers des Hüllglykoproteins, gp150. Dieser Vorläufer könnte als solcher vorliegen oder im Gegensatz dazu in den infizierten Zellen nicht vorliegen, weil das Anfügen von Polysaccharidketten und die Abspaltung der Glucosereste wahrscheinlich während der Transduktion des Vorläufers stattfindet. Unabhängig davon wird gp150 rasch deglucosyliert, was zum gp140 führt. In diesem Stadium würde eine Veränderung der Umgebung, vielleicht bezüglich des pH-Werts, zur Dimerenbildung durch Fusion von zwei gp140-Molekülen führen. Das so erhaltene gp300 kann dann durch eine Mannosidase des RER gespalten werden und in Richtung Golgi-Apparat transportiert werden. In Gegenwart von Castanospermin oder dNM wird gp150 dimerisiert und im RER angereichert. Dieses Dimere wird nicht transformiert, weil es glucosyliert ist. Jedoch kann das Dimere, solange es in einer deglucosylierten Form vorhanden ist, in den Golgi-Apparat transportiert werden. Die Hemmung der Mannosidase des RER durch dNM blockiert nicht den Erhalt des dimerisierten Vorläufers.

In dem Golgi-Apparat durchquert gp300 die verschiedenen Kompartimente wahrscheinlich durch vesikulären Transport (Griffiths und Simons, 1986). Während dieses Transports wird die Oligosaccharidkette durch die Mannosidasen des Golgi vor dem Anfügen anderer Zucker, wie Fucose und Sialinsäure, gespalten. Der Nachweise des Einbaus von Fucose wurde durch isotypische Markierung von gp300 mit ³H- Fucose erhalten. Der Nachweis des Einbaus der Sialinsäure wurde indirekt durch Spaltung von gp300 mit Neuraminidase erhalten, einem Enzym, das die in den verschiedenen Glykoproteinen endständigen N-Acetylneuraminsäuren hydrolysieren kann (Peyrieras et al., 1983). gp300 von HIV-2 kann mit Neuraminidase gespalten werden, wie die signifikante Verringerung der elektrophoretischen Mobilität des Dimeren zeigt. Die Ergebnisse entsprechen der Beobachtung, daß der Vorläufer seine dimerisierte Form während seines Transports und seiner Transformation in Golgi-cis, Golgi-Internum- und trans-cisternären Bereich vor dem Transport in das trans- Golgi-Netz beibehält (TGN; Griffiths und Simons, 1986), wo er durch eine Absenkung des pH-Werts des Kompartiments dissoziiert wird. Das dissoziierte Dimere führt zu Glykoproteinen (gp135) mit einem Molekulargewicht, das leicht unter dem des Vorläufers des zuerst nachgewiesenen Glykoproteins (gp150-140) liegt. gp135 könnte durch die Plasmamembran transportiert werden und so durch die zelluläre Protease gespalten werden, bevor reife Hüllglykoproteine von HIV-2, gp125 und gp36 erhalten werden. Monensin hemmt wahrscheinlich den Transport vom Golgi-Apparat in Richtung Plasmamembran. Aus diesem Grund reichert sich gp135 im Golgi-Apparat an.

Es ist bekannt, daß der Golgi-Apparat am Verteilungsmechanismus von Sekretionsproteinen und Proteinen der Plasmamembran beteiligt ist. Dieser Mechanismus scheint im terminalen Kompartiment des Golgi-Apparats mit der Bezeichnung TGN (Griffiths und Simons, 1986) stattzufinden. Dieses Kompartiment entspricht der "trans"-Seite der Golgi- Stapel, die manchmal als Lysosomen des endoplasmatischen Retikulums des Golgi-Apparats (GERL) bezeichnet werden und jüngst als Postvakuolen des Golgi-Apparats oder weiter intern gelegene Zisternen des Golgi-Komplexes bezeichnet wurden (Novikoff, 1976; Saraste und Kuismanen, 1984; Orci et al., 1987). Auf völlig interessante Weise wurde der pH- Wert des TGN untersucht, und es wurde festgestellt, daß er mittelmäßig sauer ist, d.h. etwa 6 (Anderson und Pathak, 1985; Griffiths und Simons, 1986). Der saure pH-Wert in dem TGN könnte an der Dissoziation des gebildeten Dimeren beteiligt sein.

Die vorstehend diskutierten Ergebnisse zeigen die Tatsache, daß die Bildung und die Transformation der Hüllglykoproteine von HIV-2 in einen Prozeß münden, der mehrere Stufen umfaßt und insbesondere die Synthese eines unreifen Vorläufers gp150-140, die Synthese eines intermediären dimerisierten Vorläufers oder gp300 und schließlich eines reifen Vorläufers, gp135, umfaßt. Trotz ihrer Verwandtschaft besitzen die HIV-1- und HIV-2- Retroviren verschiedene Mechanismen zur Bildung ihrer Hüllglykoproteine, was eine charakteristische Eigenschaft sein kann, die besonders vorteilhaft ist, um zwischen einer Infektion infolge HIV-1 und einer Infektion infolge HIV-2 zu unterscheiden.


Anspruch[de]

1. Retrovirales antigenes Glykoprotein, nämlich

- ein Glykoprotein mit der Bezeichnung gp300, mit einem Molekulargewicht (MG) von ungefähr 300 kD und bestehend aus der Kombination von zwei Einheiten eines Glykoprotein gp140-Vorläufers des Hüllglykoproteins gp125, das durch das env-Gen des Genoms eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 codiert wird, das LAS oder AIDS verursachen kann, oder

- ein Dimer des Vorläufers des Hüllglykoproteins eines Retrovirus, das mit Antikörpern, die gegen das Glykoprotein gp300 gerichtet sind, immunologisch kreuzreagiert.

2. Antigenes Glykoprotein gp300 nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

- es liegt in den Zellen einer biologischen Probe eines patienten vor, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, insbesondere in den menschlichen T4-Lymphocyten oder in den permanenten Linien, die von diesen T4-Lymphocyten stammen,

- sein isoelektrischer Punkt (pI) liegt in einem pH-Bereich von 6,8 - 7,8,

- es ist mit Oligosaccharidketten glykosyliert, die über den Stickstoff gebunden sind,

es ist in ionischen Detergentien stabil, insbesondere in 1 % SDS, in nicht-ionischen Detergentien, insbesondere 2 % Triton X-1OO, in 4 M Harnstoff, in Salzen und in Reduktionsmitteln,

- es dissoziiert in vitro spontan in zwei Glykoproteine mit Molekulargewichten von etwa 140 kD, in einem pH- Bereich zwischen 4 und 5,

- nach Isolierung und Reinigung durch Gelelektrophorese dissoziiert es in einem Acetatpuffer in vitro in zwei Glykoproteine mit Molekulargewichten von etwa 140 kD bei pH-Werten, die 6 entsprechen oder darunter liegen,

- es zeigt nach der Reinigung an einer Immunaffinitätssäule vom Typ HIV-2 Serum-Sepharose mit spezifischen Antikörpern, die aus Serum eines Patienten erhalten wurden, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist- auf einem 7,5%igen Polyacrylamid- SDS-Gel in Gegenwart von 6 M Harnstoff eine Bande, die einem Molekulargewicht von 300 kD entspricht.

3. Antigenes Glykoprotein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer elektrophoretischen Analyse eines biologischen Mediums nicht gefunden wird, das aus viralen Partikeln besteht, die in dem spezifischen Kulturmedium von Zellen vorliegen, die durch ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert sind, nach Markierung mit ³&sup5;S-Methionin (200 uCi/ml, 4 x 10&sup6; Zellen/ml) während 18 Stunden und Reinigung der erhaltenen Extrakte, die infizierte Zellen und deren entsprechendes Kulturmedium enthalten, während es unter den gleichen Bedingungen in den infizierten Zellen selbst gefunden wird.

4. Protein p200, das von dem Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 stammt, gekennzeichnet durch ein nicht-glykosyliertes Grundgerüst, das mit dem des Glykoproteins identisch ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 200 kD, und das sich von dem Glykoprotein durch die Abwesenheit von Glykosylierungsresten unterscheidet.

5. Gereinigtes Glykoprotein gp150, das in vitro in den Zellen eines Patienten nachgewiesen werden kann, der mit einem menschlichen Retrovirus des Typs HIV-2 infiziert ist, gekennzeichnet durch:

- Molekulargewicht von etwa 150 kD,

- das Peptidgerüst des Vorläufers des Hüllglykoproteins gp125, das von dem env-Gen des Genoms eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 codiert wird oder von einem Retrovirus, dessen Glykoprotein der äußeren Hülle von Antikörpern aus dem Serum eines Patienten erkannt wird, der mit dem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, insbesondere Antikörper, die gegen gp125 gerichtet sind,

- terminale Glucosereste auf einer Oligosaccharidkette.

6. Antigene Zusammensetzung für die Diagnose der Gegenwart von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Protein oder ein antigenes Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt.

7. Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er das Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erkennt, daß er aber die reifen Hüllglykoproteine gp125 und gp36 nicht erkennt.

8. Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop erkennt, das auf dem Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 exponiert und für den Antikörper zugänglich ist, wobei das Epitop jedoch in den reifen Proteinen gp125 und gp36 in ihrer natürlichen Konformation entweder nicht exponiert oder maskiert ist.

9. Antikörper nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem neutralisierend wirkt, insbesondere indem er die Bindung eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 an seinen Rezeptor hemmt, insbesondere an den T4-Rezeptor menschlicher Lymphocyten, die ihn tragen.

10. Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er das Protein p200 nach Anspruch 4 erkennt und daß er die reifen Glykoproteine gp125 und gp36 nicht erkennt.

11. Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop des Proteins p200 nach Anspruch 4 erkennt, wobei das Epitop jedoch entweder nicht exponiert oder maskiert auf den Proteinen gp125 und gp36 und/oder auf dem Protein gp300 in ihrer natürlichen Konformation vorliegt.

12. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er neutralisierend wirkt, insbesondere, daß er die Bindung eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 an seinen Rezeptor hemmt, insbesondere an den T4-Rezeptor menschlicher Lymphocyten.

13. Immunogene Zusammensetzung, enthaltend ein Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder das Protein p200 nach Anspruch 4, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel geeignet für die Herstellung von Impfstoffen.

14. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Protein und einem antigenen Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammengesetzt ist, so daß die Verabreichung einer Dosis von 10 bis 100 ug pro kg möglich ist.

15. Verfahren zur Herstellung des antigenen Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Lyse der Zellen, die mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert sind, und Abtrennung des Überstandes und des Zellextrakts,

- Inkubation des Zellextrakts und/oder des Überstandes auf einer Immunaffinitätssäule mit einem Immunabsorbens, das gereinigte Antikörper umfaßt, die vom Serum eines Patienten erhalten wurden, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, wobei diese Antikörper vorteilhafterweise an einen passenden Träger gebunden sind, in Gegenwart eines Puffers und für einen Zeitraum, der lang genug ist zur Bildung eines immunologischen Antigen-Antikörper- Komplexes,

- Waschen der Säule mit einem Puffer zur Entfernung der Moleküle, die nicht an den Träger gebunden werden,

- Auftrennung der eluierten Glykoproteine,

- Gewinnung der gesuchten antigenen Proteine.

16. Verfahren nach Anspruch 15 für die Herstellung des Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrennung der Glykoproteine durch Elektrophorese und durch Elektroelution der Proteine erfolgt, die auf der Säule zurückgehalten werden.

17. Verfahren nach Anspruch 15 für die Herstellung des Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrennung der Glykoproteine folgendermaßen durchgeführt wird:

- Elution der an die vorstehend erwähnte Immunaffinitätssäule gebundenen Proteine,

- Reinigung der so eluierten Produkte auf einer Chromatographiesäule, die, gebunden an das Trenngel, monoclonale Antikörper enthält, die gp300 erkennen.

18. Verfahren für die in vitro-Diagnose der Gegenwart von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, um eine eventuelle Infektion mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 festzustellen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einer antigenen Zusammensetzung nach Anspruch 6 unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Antigen- Antikörper-Komplexes erlauben,

- Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.

19. Kit zum Nachweis von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert sein kann, gekennzeichnet durch folgende Bestandteile:

- mindestens ein Protein und/oder ein antigenes Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

- oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 6,

- oder auch ein Gemisch dieser verschiedenen Bestandteile und

- Mittel, um die Reaktion zur Bildung des immunologischen Komplexes zwischen den vorstehenden Antigenen und den gegebenenfalls in der zu untersuchenden biologischen Probe vorhandenen Antikörpern zu ermöglichen, insbesondere, falls notwendig, mit einem oder mehreren Inkubationspuffern,

- eine Negativ-Kontrollprobe,

- Mittel zum Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes.







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