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Dokumentenidentifikation DE69019260T2 01.02.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0414035
Titel Gibbon Leukemia Virus-Rezeptor.
Anmelder American Cyanamid Co., Wayne, N.J., US
Erfinder O'Hara, Bryan Mark, Pearl River, New York 10965, US
Vertreter Wächtershäuser, G., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 80331 München
DE-Aktenzeichen 69019260
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 14.08.1990
EP-Aktenzeichen 901151365
EP-Offenlegungsdatum 27.02.1991
EP date of grant 10.05.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.02.1996
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse C07K 14/00   A61K 38/00   C12Q 1/68   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das Rezeptorprotein für das Gibbonaffen-Leukämievirus, ein Retrovirus, und tierische Gene und deren Proteine, die mit dem Gibbonaffen-Leukämievirus (GALV) wechselwirken. Diese GALV-Rezeptorproteine sind zum Eindringen des Virus in Zellen erforderlich und sind deshalb als Zellrezeptoren für GALV definiert.

Retroviren können in spezifizierte Gruppen eingeordnet werden, die von dem Weg abhängen, der von den Viren verwendet wird, um in die Zellen einzudringen. Man nimmt an, daß die Mitglieder einer gegebenen Gruppe zum Eindringen in Zellen spezifische Zellrezeptoren verwenden und daß es wenig, wenn überhaupt, Kreuzverwendung von Rezeptoren durch Mitglieder verschiedener Gruppen gibt. Im allgemeinen sind diese Rezeptoren praktisch unerforscht geblieben. Von den ungefähr acht menschlichen Rezeptoren, die spezifisch für die Retroviren sind, von denen bekannt ist, daß sie menschliche Zellen infizieren, ist nur einer kloniert worden (CD4 für HIV; Maddon et al., 1986; McDougal et al., 1986). Diese Erfindung betrifft daher einen der gegenwärtig bekannten Rezeptoren, die für eine Infektion tierischer, speziell menschlicher Zellen durch ein Retrovirus erforderlich sind. Obwohl man über das Vorhandensein eines spezifischen Rezeptorproteins für GALV (und für andere Retroviren, die andere Rezeptorwege verwenden) Vermutungen angestellt hat, ist bisher kein GALV- spezifischer Rezeptor kloniert oder charakterisiert worden.

Obwohl GALV angeführt worden ist,- versteht es sich, daß das mit Affensarkom assoziierte Virus und andere Viren, wie oben angegeben, denselben Rezeptor verwenden (Weiss et al., 1984).

Die neuen Gene und Proteine der vorliegenden Erfindung sind bei einer experimentellen Manipulation des GALV-Wirts, bei der Untersuchung von Virus/Rezeptor-Wechselwirkungen und bei der Aufklärung und Verwertung der üblichen Rolle des Rezeptors nützlich, die Wirkungsweisen bei einer Immunaktivität einschließt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

FIGUR 1. Southern-Analyse menschlicher (HU), transfizierter (GRT) und mit BamHI verdauter Maus(MO)-DNAs. Der linke Streifen zeigt einen Fleck, der mit dem ganzen (eine Sequenzwiederholung enthaltenden) 3,5 kb- EcoRI-Insert von pR7h hybridisiert ist. Die rechte Bahn ist mit dem 2,2 kb-EcoRI-HindIII-Subfragment hybridisiert.

FIGUR 2. Northern-Analyse menschlicher, transfizierter und Maus- RNAs. Die verwendeten Sonden sind das 2,2 kb-EcoRI-HindIII-Subfragment von pR7h (oberer Streifen) und eine Actin-Sonde (unterer Streifen; O'Hara et al., 1987). Bahnen 1-4, gesamte zelluläre Oligo(dT)-gereinigte RNA der menschlichen Zell-Linie TU.1.1.1 (O'Hara et al., 1987). Bahn 1, konfluente Zellen. 2, 109-Phase. 3, konfluent GALV-infiziert. Bahn 4, konfluent Mod- MuSV(GALV)-infiziert. Bahnen 5-8, gesamte zelluläre Oligo(dT)-gereinigte RNA der menschlichen Zell-Linie NT2.1.1 (O'Hara et al., 1987). Bahn 5, konfluent. 6, log-Phase. 7, konfluent GALV-infiziert. Bahn 8, konfluent Mo-MUSV(GALV)-infiziert. 9-11, cytoplasmatische Oligo(dT)-gereinigte RNAs von primären transfizierten GRT5-, sekundären transfizierten GRT9- bzw. NIH3T3-Zellen.

FIGUR 3. Southern- und Northern-Analysen unter Verwendung von cDNA- Sonden. (A) Southern-Analyse von mit HindIII verdauten menschlichen (H), transfizierten (GRT) und Maus-NIH3T3(M)-DNAs unter Verwendung des 5'- EcoRI-Insertfragments von Lamda HGR6 (subkloniert in pUC118) als Sonde. (B) Southern-Analyse von mit EcoRI verdauten DNAs unter Verwendung des mittleren EcoRI-Fragments von Lamda HGR6 (subkloniert in pUCIIB) als Sonde. (C) Northern-Analyse von Oligo(dT)-gereinigten RNAs. Bahn 1, NT2.1.1-RNA, die mit einer einzelsträngigen RNA-Sonde hybridisiert ist, die von dem 5'-EcoRI-Fragment von Lamda HGR6 abgeleitet ist und in der 3'- 5'-Richtung transcribiert ist, wie in Figur 6 gezeigt. Bahnen 2 und 3, GRT-5- und NT2.1.1-RNAs, die mit den drei EcoRI-Inserten von Lamda HGR6 (subkloniert in pUC118) als Sonde hybridisiert sind.

FIGUR 4. Southern-Analyse von mit EcoRI verdauten menschlichen (H) DNAs, Vero-Zellen(V)-DNAs der afrikanischen grünen Meerkatze, Hund(D)-, Katzen(C)-, Frosch(F)- und Hefe(J)-DNAs unter Verwendung des 5'-EcoRI- Insertfragments von Lamda HGR6 (subkloniert in pUC118) als Sonde.

FIGUR 5. Menschliche DNAs, isoliert und mit sequenzierten Strängen. Die Markierungsstriche stellen EcoRI-Stellen dar. EcoRI-Linker sind an jedem Ende jedes Klons vorhanden, wo kein Markierungsstrich angezeigt ist. Das lange offene Leseraster ist für Lamda HGR6 durch den Pfeil (Translationsbeginn) und Stern (Endcodon) angezeigt.

FIGUR 6. DNA-Sequenz der menschlichen cDNA für den GALV-Rezeptor. Das lange offene Leseraster erstreckt sich von den Positionen 371 bis 2407 einschließlich.

FIGUR 7. Aminosäuresequenz des menschlichen GALV-Rezeptorproteins, wie aus dem langen offenen Leseraster in Figur 6 abgeleitet.

FIGUR 8. Struktur von pSV2GR6. Die dünne schwarze Linie stellt Sequenzen dar, die von pSV2gpt abstammen, der kleine Kasten stellt Sequenzen dar, die von der Vielfach-Klonierungsstelle von pUC118 abstammen, und der durch einen Pfeil angezeigte Kasten stellt Sequenzen dar, die von dem Insert von Lamda HGR-6 abstammen. Für dieses Konstrukt wird Lamda HGR6 teilweise mit EcoRI verdaut, und die drei zusammenhängenden EcoRI-Inserte werden als ein einziges Fragment isoliert. Dies wird dann an der EcoRI-Stelle in pUC118 kloniert (um pHGR6-1 zu ergeben), so daß das mutmaßliche 5'-Ende des Inserts proximal zur HindIII- Stelle in pU118 ist. Der Abschnitt dieses Plasmids zwischen den HindIII - und HpaI-Stellen wird zwischen den HindIII- und HapI-Stellen von pSV2gpt kloniert, um pSV2GR6 zu ergeben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft den GALV-Proteinrezeptor und seine Homologen, die in einer großen Vielfalt von tierischen Geweben exprimiert sind. Die primäre Aminosäuresequenz des Rezeptors ist in Figur 7 erläutert, in der der menschliche Rezeptor dargestellt wird. Jedoch existieren, wie man von dem großen Wirtsbereich von GALV (Weiss et al., 1984) und von einer Southern-Analyse anderer als menschlicher Arten (Figur 4) erwarten würde, bei Arten wie Hund, Katze, Maus und Affe und anderen engverwandte Homologe. Diese Beobachtungen unterstützen die allgemeine Existenz diskreter Gene, die wirklich homolog zum menschlichen GALV- Rezeptor sind. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung nicht nur das in Figur 7 identifizierte spezifische Protein, sondern auch Proteine mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und dem gleichen Vermögen, eine Virusinfektion zu gestatten, wie das in Figur 7 erläuterte Protein. Weiter betrifft die Erfindung die gereinigte DNA-Sequenz (Figur 6), die für den (menschlichen) GALV-Rezeptor codiert, und DNAs, die im wesentlichen die gleiche DNA-Sequenz mit im wesentlichen einer für die gleiche Aminosäuresequenz codierenden DNA wie in Figur 6 aufweisen. Es ist für normale Fachleute ersichtlich, daß andere derartige Proteine anderer Arten sowie andere Alternativen zu dem in Figur 7 erläuterten Protein durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert werden. Verschiedene Expressionssysteme können verwendet werden, um Varietäten zu diesen Proteinen zu erzeugen, aber solche Varietäten haben immer noch ein Protein mit ähnlichen biologischen Wirkungen wie denjenigen des vorliegenden Proteins zur Folge. Es wird von Fachleuten auch eingesehen, daß Modifikationen der in Figur 6 gezeigten DNA-Sequenz GALV- Rezeptorproteine zur Folge haben. Die resultierenden DNA-Sequenzen und die resultierenden Proteine, die im wesentlichen dieselbe Funktion beim Ermöglichen des Eindringens eines Virus aufweisen, sind im Bereich der Erfindung eingeschlossen. Die biologische Funktion des Rezeptors wird durch Infektionsuntersuchungen an Zellen gemessen, die normalerweise nicht infizierbar sind und mit Konstrukten transfiziert werden, die so entworfen sind, daß sie das Protein exprimieren (wie in Tabelle 1 veranschaulicht). Weiter charakterisieren und identifizieren Antikörperbindungs- Untersuchungen die Aminosäuresequenz und -struktur. Virusinfektions- Untersuchungen identifizieren die Rolle eines Proteins funktionell beim Ermöglichen des Eindringens eines Virus.

Die GALV-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung werden durch Expressionsvektoren erzeugt, die eine DNA-Sequenz umfassen, die für ein menschliches GALV-Rezeptorprotein (oder DNA-Sequenzen der Homologen anderer Arten) oder Mutanten (mit oder ohne die Fähigkeit, eine Anfälligkeit für eine Infektion auf normalerweise nicht infizierbare Zellen zu übertragen) codieren, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in der oder aus der Aminosäuresequenz des menschlichen GALV- Rezeptorproteins oder seines Homologen aus anderen Arten insertiert, deletiert oder ersetzt worden sind.

Zusätzlich umschließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von GALV-Rezeptorhomologen aller tierischer Arten, bei denen eine DNA-Sonde verwendet wird, die aus der DNA in Figur 6 ausgewählt ist oder im wesentlichen die gleiche DNA-Sequenz, wie in Figur 6 identifiziert, aufweist, um die geeignete DNA aus den anderen Arten zu isolieren.

Weiter läßt, wie durch Fachleute ermittelt werden kann, die Manipulation des GALV-Rezeptors eine Steuerung des Eindringens eines Virus in Zellen zu. Dies ermöglicht die Verhütung von bestimmten Virusinfektionen und die Fähigkeit, diesen Mechanismus für Retroviren zu steuern, welche das GALV-Rezeptorprotein für ein zelluläres Eindringen verwenden. Eine Menge eines das GALV-Rezeptorprotein infizierenden Mittels, die das GALV-Rezeptorprotein reguliert, wird verwendet, um die zelluläre Infizierbarkeit für Retroviren zu beeinflussen.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die Plasmide, DNA- Sequenzen und Mikroorganismen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung hinterlegt sind, in der Kultursammlung der American Cyanamid Company hinterlegt, die in Princeton, New Jersey, unterhalten wird, und sie sind bei der American Type Culture Collectign in Rockford, Maryland 20952 USA hinterlegt, außer wenn das Gegenteil angegeben ist.

Obwohl sich die Verwendung von gentechnologischen Verfahren für effektive Verfahren eignet, um die GALV-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, muß ebenso bemerkt werden, daß die vorliegenden Proteine andere Verfahren zur Herstellung umfassen, wie z.B. eine chemische Synthese oder eine Reinigung aus tierischen Geweben.

Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, das neue Rezeptorprotein des GALV-Rezeptors bereitzustellen. Auch wird das GALV- Rezeptorprotein anderer tierischer Arten außer dem menschlichen GALV- Rezeptorprotein durch die vorliegende Erfindung umfaßt. Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, eine isolierte DNA-Sequenz zu liefern, die für den GALV-Rezeptor codiert. Diese und andere Ziele der Erfindung werden durch die ausführlichere Beschreibung der Erfindung ersichtlich, die im folgenden bereitgestellt wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das GALV-Rezeptorprotein. Die am ausführlichsten untersuchte Art ist die menschliche, obwohl es anerkannt ist, daß ähnliche Proteine in anderen Tierarten existieren. Deshalb schließt die Erfindung jene homologen Proteine anderer Arten ein. Die vorliegende Erfindung offenbart die Struktur der cDNA für den GALV- Rezeptor aus menschlichen HL60-Zellen. Weiter wird die Funktion der isolierten cDNA beim Ermöglichen des Eindringens eines Virus in den folgenden Beispielen bereitgestellt, aber beschränkt dieselbe nicht.

BEISPIEL 1 Isolierung des GALV-Rezeptors

Teile des menschlichen Rezeptorgens für den Gibbonaffen-Leukämievirus (GALV) werden auf die folgende Weise isoliert. Zuerst wird DNA aus menschlichen Zellen (die leicht mit GALV infiziert werden und deshalb diesen Virus-Rezeptor exprimieren) auf einem einer Vielfalt von Wegen in Maus-N1H3T3-Zellen eingeführt (die nicht mit dem Virus infiziert werden können), wobei das Verfahren der CAPO&sub4;-Fällung unten beschrieben wird. Menschliche DNA mit großem Molekulargewicht wird mit pSV2gpt in einer wäßrigen Lösung, die CaCl&sub2; enthält, gemischt, und die Mischung wird zu einer zweiten Lösung gegeben, die Phosphat und HEPES-Puffer bei pH 7,1 enthält. Die DNAs fallen zusammen in Aggregaten mit CaPO&sub4; aus, und dieses Aggregat wird auf Zellen in einer Kultur aufgebracht (Maus-N1H3T3-Zellen). Ein Teil der Zellen nimmt Aggregate der DNA-Mischung auf und baut die transfizierte DNA ein und exprimiert sie.

Um nur jene Zellen zu untersuchen, die transfiziert worden sind, wird eine Selektion auf die Anwesenheit von pSV2gpt vorgenommen. Um dies zu bewerkstelligen, werden die Zellen in einem Medium kultiviert, das Mycophenolsäure und Xanthin enthält. Die Mycophenolsäure legt den Zellen eine Stoffwechselblockade auf, die durch die Expression von Guaninphosphoribosyl-Transferase (codiert durch pSV2gpt) durch deren Verwendung von Xanthin überwunden werden kann (Mulligan und Berg, 1981). Nach ungefähr zwei Wochen in diesem Medium bleiben nur transfizierte Zellen übrig. Eine gegebene Zelle in dieser Kultur exprimiert nun ungefähr 0,1% der menschlichen Donor-DNA. Es wird erwartet, daß ein Teil davon (annähernd 1/1000) den menschlichen Rezeptor für GALV exprimiert. Solche Zellen werden durch Infektion mit einem Antibiotikum-resistenten Virus isoliert, das die Wechselwirkung mit dem GALV-Rezeptor erfordert, um in Zellen einzudringen. Dieses Virus wird hergestellt, indem man unter Verwendung von GALV pGV16, ein G418-resistentes, replikationsdefektes Virus (Noda et al., 1986), aus Zellen birgt, so daß das pGV16-Virus durch GALV pseudotypisiert wird. Der Überstand aus diesen infizierten Zellen enthält nun GALV und durch GALV pseudotypisiertes pGV16 (d.h., das pGV16- RNA-Genom ist in einem GALV-Teilchen enthalten). Die Mischung [bezeichnet als pGV16(GALV)] kann nun lediglich unter Verwendung des Weges Zellen infizieren, der normalerweise von GALV verwendet wird. Diese Mischung wird auf die transfizierten Mauszellen aufgetragen, und diese werden zwei Tage später mit dem Antibiotikum G418 behandelt. Nur mit pGV16 infizierte Zellen überleben. Diese werden als primäre Transfektanten bezeichnet und sollten ungefähr 0,1% des menschlichen Genoms in jedem unabhängigen Isolat enthalten.

BEISPIEL 2 Transfektion

Das transfizierte Material, das in den primären Transfektanten gefunden wird, enthält eine große Menge menschlicher repetitiver Sequenzen und sollte auch das menschliche GALV-Rezeptorgen einschließen. Weil jedoch der Druck für die Beibehaltung des Gens nach einer Infektion mit dem Virus und der Selektion auf pGV16 verloren gegangen ist, kann man erwarten, daß viele Transfektanten das Gen segregiert haben, wie es für jedes derartige Experiment normal ist. Aus diesem Grund wird ein primärer Transfektant gesucht, der mit pGV16 infiziert worden ist, aber nicht mit dem zur Replikation fähigen GALV. Die andauernde Anwesenheit des Rezeptors und deshalb des Rezeptorgens kann in einer solchen Zelle gezeigt werden, weil sie gegen eine Superinfektion nicht iimnun ist, wie es Zellen sind, die mit GALV infiziert worden sind. Diese bilden die Mehrzahl der Isolate, weil GALV im Überschuß zu pGV16 in den pGV16(GALV)-Vorratsstämmen vorhanden ist. Es wird ein Transfektant, der nur mit pGV16 infiziert ist, ausgewählt, in diesem Fall die Zelle, die als GRT5 bezeichnet wird, eine DNA wird aus ihr präpariert, und die DNA wird in einer zweiten Transfektionsrunde verwendet, um sekundäre Transfektanten zu erhalten. Das Verfahren, um diese zu erhalten, ist dem ähnlich, das verwendet wird, um primäre Transfektanten abzuleiten. D.h., DNA aus GRT5 wird mit pSV2gpt gemischt, mit CaPO&sub4; gefällt und in NIH3T3-Zellen transfiziert. Diese werden dann in einem Medium kultiviert, das Mycophenolsäure und Xanthin enthält, und die überlebenden Zellen werden mit pGV16(GALV) infiziert. G418 wird dann aufgebracht, und die überlebenden Zellen werden hochgezüchtet und untersucht, um mutmaßliche sekundäre Transfektanten für das Rezeptorgen nachzuweisen. Da provirales pGV16 in der primären Donor- DNA anwesend ist, sind einige der sekundären Transfektanten aus der Transfektion der proviralen DNA G418-resistent geworden. Die echten Rezeptortransfektanten können jedoch von diesen unterschieden werden, weil die Mehrzahl der sekundären Transfektanten GALV-Erzeuger sein sollten. Die sekundären Transfektanten werden deshalb auf eine GALV-Erzeugung durchmustert, und DNA wird aus jeglichen gefundenen präpariert. Diese DNA wird in einer Southern-Analyse untersucht, um festzustellen, ob irgendeiner der Erzeuger menschliche repetitive Sequenzen enthält. Weil die Verfahren der primären und sekundären Transfektion allmählich die Menge an menschlicher repetitiver DNA, die in einem Transfektanten gefunden wird, verringern, wird erwartet, daß irgendeine in einem sekundären Transfektanten gefundene repetitive menschliche DNA spezifisch mit dem Rezeptorgen assoziiert ist.

BEISPIEL 3 Isolierung von cDNA und cDNA-Sonden

Eine Genom-Bibliothek wird aus jeglichen derartigen sekundären Transfektanten konstruiert, die in Beispiel 2 gefunden wurden (in diesem Fall GRT9, dem sekundären Transfektanten und Lamda gt10 und EcoRI als Vektor- bzw. Klonierungsenzym), und unter Verwendung einer menschlichen DNA als Sonde, die in einer Nick-Translation radioaktiv gemacht wurde, auf die Anwesenheit von Klonen durchmustert, die eine menschliche repetitive DNA enthalten. Man findet, daß einer aus 500000 Klonen mit der Sonde hybridisiert. Dieser Klon (Lamda R7h) wird bis zur Homogenität Plaquegereinigt, und sein EcoRI-Insert mit 3,5 kb wird in pGEM2 und pUC118 kloniert. Man findet, daß dieses EcoRI-Fragment mit 3,5 kb aus EcoRI- HindIII-Fragmenten mit 2,2 und 1,3 kb besteht. Eine Verwendung des gesamten Fragments mit 3,5 kb als Sonde in der Southern-Analyse zeigt, daß die klonierte DNA wie erwartet menschliche repetitive Sequenzen enthält und daß sie in den meisten der Transfektanten mit einem EcoRI-Fragment mit 6,6 kb hybridisiert, aber nicht nennenswert mit Maus-DNA (Figur 1, längere Aussetzungszeiten offenbaren die Anwesenheit einer hybridisierenden Bande in Maus-DNA, die wie erwartet die Maus-Homologie darstellt). Die Anwesenheit dieser letztgenannten transfizierten Sequenz in unabhängigen Transfektanten zeigt, daß die Sequenzen in Lamda R7h Teil des Rezeptorgehs sind oder sich in unmittelbarer Nähe zum Rezeptorgen befinden. Eine Verwendung des Fragments mit 2,2 kb als Sonde ergibt das gleiche Ergebnis, außer daß in menschlicher DNA nur ein einziges Fragment mit 6,6 kb nachgewiesen wird (Figur 1). Dies zeigt an, daß nur Einzelkopie-Sequenzen in diesem Fragment enthalten sind.

Wenn dieses Fragment in einer Northern-Analyse als Sonde verwendet wird, wird in menschlichen Zellen und in GRT5, dem Transfektanten mit der größten Kopienzahl für die transfizierte DNA, eine einzige mRNA mit ungefähr 4 kb nachgewiesen; in Mauszellen wird keine stark hybridisierende RNA gefunden (Figur 2). Dies zeigt an, daß die klonierten Sequenzen in RNA exprimiert sind und deshalb für ein Durchmustern von cDNA-Banken geeignet sind. Demgemäß wird eine cDNA-Bank aus menschlichen HL60-Zellen (erhalten von Clontech, #HL1020b) mit dem Fragment durchmustert, und es wird gefunden, daß 1/10000 der Plaques hybridisieren. Drei von diesen (die Lamda-Isolate HGR6, HGR7 und HGR16, Figur 5) werden gereinigt, und die enthaltenen EcoRI-Fragmente werden unter Verwendung des Didesoxyterminations-Verfahrens in puC118 subkloniert und sequenziert.

Die Analyse der Sequenzen offenbart mehrere Merkmale.

1) Die Sequenzen der Klone sind praktisch identisch.

2) Lamda HGR6 und Lamda HGR16 enthalten ein einziges großes offenes Leseraster mit jeweils 679 Aminosäuren, deren mutmaßliche Aminosäuresequenzen identisch sind.

3) Lamda HGR7 scheint eine abgeschnittene cDNA zu sein, insofern als es ein großes offenes Leseraster mit einer identischen mutmaßlichen Aminosäuresequenz für das 3'-Zweidrittel des mutmaßlichen Proteins enthält, für das durch die obigen Isolate codiert wird, beginnend bei Aminosäure 180 in Figur 7.

4) Das mutmaßliche Protein, für das durch diese Isolate codiert wird (Figur 7), weist die Kennzeichen eines integralen Membranproteins auf. D.h., eine Analyse durch das Programm von Kyte und Doolittle (1982) weist mehrere Regionen als mögliche membranüberspannende Bereiche nach (diese sind ungefähr die Reste 15-39, 159-182, 228-251 und 651-674). Andere Regionen sind auch hydrophob, obwohl in geringerem Ausmaß, und können ebenfalls membranüberspannende Bereiche darstellen (beispielsweise die Regionen 56-79, 118-141 und 555-578). Die Ähnlichkeit des angenommenen Proteins mit integralen Membranproteinen ist in Übereinstimmung mit seiner erwarteten Funktion als Retrovirus-Rezeptor.

Um die Isolate weiter zu charakterisieren, werden EcoRI-Fragmente, die aus Lamda HGR6 subkloniert wurden, in einer Southern-Analyse menschlicher, transfizierter und Maus-DNAs verwendet. Es wird gefunden, daß alle in menschlicher DNA nachgewiesenen Fragmente auch in transfizierten DNAs gefunden werden, aber nicht in Maus-DNA (Figur 3A, B). Dies bestätigt weiter, daß die Isolate von dem Rezeptorgen abstammen, weil eine derartig große Länge einer Sequenz nicht in unabhängigen Transfektanten gefunden würde, außer daß auf ihre Anwesenheit hin selektioniert worden wäre. Die Figur 3C zeigt, daß die erwartete RNA unter Verwendung von cDNA-Sonden nachgewiesen wird.

BEISPIEL 4 Expression

Der endgültige Beweis, daß Lamda HGR6 für den GALV-Rezeptor codiert, wird dadurch abgeleitet, daß sein Potential, eine Anfälligkeit für eine GALV- Infektion auf Mauszellen zu übertragen, gezeigt wird. pHGR6-1, das die drei EcoRI-Insertfragmente von Lamda HGR6 in der richtigen Orientierung enthält, wird mit HindIII, das in die Vielfach-Klonierungsstelle des pUC118-Vektors am 5'-Ende des Inserts einschneidet, und mit HpaI verdaut, das in die untranslatierte 3'-Region des Inserts einschneidet. Dieses Fragment wird verwendet, um die Region von pSV2gpt zwischen den HindIII - und HpaI-Stellen zu ersetzen. Das resultierende Plasmid pSV2GR6 (Figur 8) enthält das gesamte offene Leseraster, das für den Rezeptor mit dem SV40 frühen Promotor stromaufwärts und einem SV40 Polyadenylierungs-Signal stromabwärts codiert. Mit diesem Plasmid transfizierte Mauszellen werden für eine GALV-Infektion empfänglich gemacht, was eine endgültige Bestätigung liefert, daß der Klon in der Tat für den GALV-Rezeptor codiert. Unter Verwendung des infektiösen Zentrumsassays wird gefunden, daß bis zu 1% der Zellen, die mit pSVgpt und pSV2GR6 transfiziert und auf die Anwesenheit von pSV2gpt hin selektioniert sind, infizierbar sind.

Das Plasmid pSV2GR6 ist in der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 68070 (2. August 1989) hinterlegt.

TABELLE 1 Expression von pSV2GR6 macht Maus-NIH3T3-Zellen für eine Infektion durch GALV empfänglich
Transfizierte DNA G418R-Kolonienb Kein Virus a Anzahl von Zellen, die den Virus erzeugen/untersuchte Anzahl. NIH3T3- Zellen (transfiziert und dann in einem Mycophenolsäure enthaltenden Medium kultiviert) wurden pGV16(GALV) ausgesetzt und mit PG4-Zellen in einem infektiösen Zentrumsassay plattiert. b In einem G418-enthaltenden Medium gebildete Kolonien/getestete Anzahl. NIH3T3-Zellen (transfiziert und dann in einem Mycophenolsäure enthaltenden Medium kultiviert) wurden, nachdem sie, wo angezeigt, pGV16(GALV) ausgesetzt worden waren, in der Gegenwart von G418 plattiert. ND = nicht durchgeführt.

BIBLIOGRAPHIE

Kyte J und Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. Journal of Molecular Biology, 157:105-132 (1982).

Maddon PJ, Dalgleish AG, McDougal JS, Clapham PR, Weiss RA und Axel R. The T4 gene encodes the AIDS virus rezeptor and is expressed in the immune system and the brain. Cell, 47:333-348 (1986).

Mcdougal JS, Kennedy MS, Sligh JM, Cort SP, Mawle A und Nicholson JKA. Binding of HTLV-III/LAV to T4+ cells by a complex of the 110K viral protein and the T4 molecule. Science, 231:382-385 (1986).

Mulligan RC und Berg P. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78:2072-2076 (1981).

Noda TM, Satake M, Robins T und Ito Y. Isolation and characterization of NIH3T3 cells expressing polyoma small T antigen. Journal of Virology, 60:105-113 (1986).

O'Hara B, Klinger HP, Curran T, Zhang Y und Blair DG. Molecular and Cellular Biology, 7:2941-2946 (1987).

Southern PJ und Berg P. Journal of Molecular and Applied Genetics, 1:327- 341 (1982).

Weiss RN, Teich N, Varmus H und Coffin J. RNA Tumor Viruses: Molecular Biology of Tumor Viruses, Second Edition, Volume 1. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor 1984.

ID-Nr. der Sequenz: 1

Sequenztyp: Nucleotid-Sequenz

Sequenzlänge: 3211 Basenpaare

Art des Stranges: Einzelstrang

Topologie: Linear

Organismus der ursprünglichen Quelle: Mensch

Merkmale: Von 371 bis 2407 Bp Offenes Leseraster

Eigenschaften: Menschliches Rezeptorgen des Gibbonaffen- Leukämievirus

GAGCTGTCCC CGGTGCCGCC GACCCGGGCC GTGCCGTGTG CCCGTGGCTC 50

CAGCCGCTGC CGCCTCGATC TCCTCGTCT CCCGCTCCGCC CTCCCTTTTC 100

CCTGGATGAA CTTGCGTCCT TTCTCTTCTC CGCCATGGAA TTCTGCTCCG 150

TGCTTTTAGC CCTCCTGAGC CAAAGAAACC CCAGACAACA GATGCCCATA 200

CGCAGCGTAT AGCAGTAACT CCCCAGCTCG GTTTCTGTGC CGTAGTTTAC 250

AGTATTTAAT TTTATATAAT ATATATTATT TATTATAGCA TTTTTGATAC 300

CTCATATTCT GTTTACACAT CTTGAAAGGC GCTCAGTAGT TCTCTTACTA 350

AACAACCACT ACTCCAGAGA 370

ATG GCA ACG CTG ATT ACC AGT ACT ACA GCT GCT ACC GCC 409

GCT TCT GGT CCT TTG GTG GAC TAC CTA TGG ATG CTC ATC 448

CTG GGC TTC ATT ATT GCA TTT GTC TTG GCA TTC TCC GTG 487

GGA GCC AAT GAT GTA GCA AAT TCT TTT GGT ACA GCT GTG 526

GGC TCA GGT GTA GTG ACC CTG AAG CAA GCC TGC ATC CTA 565

GCT AGC ATC TTT GAA ACA GTG GGC TCT GTC TTA CTG GGG 604

GCC AAA GTG AGC GAA ACC ATC CGG AAG GGC TTG ATT GAC 643

GTG GAG ATG TAC AAC TCG ACT CAA GGG CTA CTG ATG GCC 682

GGC TCA GTC AGT GCT ATG TTT GGT TCT GCT GTG TGG CAA 721

CTC GTG GCT TCG TTT TTG AAG CTC CCT ATT TCT GGA ACC 760

CAT TGT ATT GTT GGT GCA ACT ATT GGT TTC TCC CTC GTG 799

GCA AAG GGG CAG GAG GGT GTC AAG TGG TCT GAA CTG ATA 838

AAA ATT GTG ATG TCT TGG TTC GTG TCC CCA CTG CTT TCT 877

GGA ATT ATG TCT GGA ATT TTA TTC TTC CTG GTT CGT GCA 916

TTC ATC CTC CAT AAG GCA GAT CCA GTT CCT AAT GGT TTG 955

CGA GCT TTG CCA GTT TTC TAT GCC TGC ACA GTT GGA ATA 994

AAC CTC TTT TCC ATC ATG TAT ACT GGA GCA CCG TTG CTG 1033

GGC TTT GAC AAA CTT CCT CTG TGG GGT ACC ATC CTC ATC 1072

TCG GTG GGA TGT GCA GTT TTC TGT GCC CTT ATC GTC TGG 1111

TTC TTT GTA TGT CCC AGG ATG AAG AGA AAA ATT GAA CGA 1150

GAA ATA AAG TGT AGT CCT TCT GAA AGC CCC TTA ATG GAA 1189

AAA AAG AAT AGC TTG AAA GAA GAC CAT GAA GAA ACA AAG 1228

TTG TCT GTT GGT GAT ATT GAA AAC AAC CAT CCT GTT TCT 1267

GAG GTA GGG CCT GCC ACT GTG CCC CTC CAG GCT GTG GTG 1306

GAG GAG AGA ACA GTC TCA TTC AAA CTT GGA GAT TTG GAG 1345

GAA GCT CCA GAG AGA GAG AGG CTT CCC AGC GTG GAC TTG 1384

AAA GAG GAA ACC AGC ATA GAT AGC ACC GTG AAT GGT GCA 1423

GTG CAG TTG CCT AAT GGG AAC CTT GTC CAG TTC ACT CAA 1462

GCC GTC AGC AAC CAA ATA AAC TCC AGT GGC CAC TCC CAG 1501

TAT CAC ACC GTG CAT AAG GAT TCC GGC CTG TAC AAA GAG 1540

CTA CTC CAT AAA TTA CAT CTT GCC AAG GTG GGA GAT TGC 1579

ATG GGA GAC TCC GGT GAC AAA CCC TTA AGG CGC AAT AAT 1618

AGC TAT ACT TCC TAT ACC ATG GCA ATA TGT GGC ATG CCT 1657

CTG GAT TCA TTC CGT GCC AAA GAA GGT GAA CAG AAG GGC 1696

GAA GAA ATG GAG AAG CTG ACA TGG CCT AAT GCA GAC TCC 1735

AAG AAG CGA ATT CGA ATG GAC AGT TAC ACC AGT TAC TGC 1774

AAT GCT GTG TCT GAC CTT CAC TCA GCA TCT GAG ATA GAC 1813

ATG AGT GTC AAG GCA GCG ATG GGT CTA GGT GAC AGA AAA 1852

GGA AGT AAT GGC TCT CTA GAA GAA TGG TAT GAC CAG GAT 1891

AAG CCT GAA GTC TCT CTC CTC TTC CAG TTC CTG CAG ATC 1930

CTT ACA GCC TGC TTT GGG TCA TTC GCC CAT GGT GGC AAT 1969

GAC GTA AGC AAT GCC ATT GGG CCT CTG GTT GCT TTA TAT 2008

TTG GTT TAT GAC ACA GGA GAT GTT TCT TCA AAA GTG GCA 2047

ACA CCA ATA TGG CTT CTA CTC TAT GGT GGT GTT GGT ATC 2086

TGT GTT GGT CTG TGG GTT TGG GGA AGA AGA GTT ATC CAG 2125

ACC ATG GGG AAG GAT CTG ACA CCG ATC ACA CCC TCT AGT 2164

GGC TTC AGT ATT GAA CTG GCA TCT GCC CTC ACT GTG GTG 2203

ATT GCA TCA AAT ATT GGC CTT CCC ATC AGT ACA ACA CAT 2242

TGT AAA GTG GGC TCT GTT GTG TCT GTT GGC TGG CTC CGG 2281

TCC AAG AAG GCT GTT GAC TGG CGT CTC TTT CGT AAC ATT 2320

TTT ATG GCC TGG TTT GTC ACA GTC CCC ATT TCT GGA GTT 2359

ATC AGT GCT GCC ATC ATG GCA ATC TTC AGA TAT GTC ATC 2398

CTC AGA ATG 2407

TGAAGCTGTT TGAGATTAAA ATTTGTGTCA ATGTTTGGGA CCATCTTAGG 2457

TATTCCTGCT CCCCTGAAGA ATGATTACAG TGTTAACAGA AGACTGACAA 2507

GAGTCTTTTT ATTTGGGAGC AGAGGAGGGA AGTGTTACTT GTGCTATAAC 2557

TGCTTTTGTG CTAAATATGA ATTGTCTCAA AATTAGCTGT GTAAAATAGC 2607

CCGGGTTCCA CTGGCTCCTG CTGAGGTCCC CTTTCCTTCT GGGCTGTGAA 2657

TTCCTGTACA TATTTCTCTA CTTTTTGTAT CAGGCTTCAA TTCCATTATG 2707

TTTTAATGTT GTCTCTGAAG ATGACTTGTG ATTTTTTTTT CTTTTTTTTA 2757

AACCATGAAG AGCCGTTTGA CAGAGCATGC TCTGCGTTGT TGGTTTCACC 2807

AGCTTCTGCC CTCACATGCA CAGGGATTTA ACAACAAAAA TATAACTACA 2857

ACTTCCCTTG TAGTCTCTTA TATAAGTAGA GTCCTTGGTA CTCTGCCCTC 2907

CTGTCAGTAG TGGCAGGATC TATTGGCATA TTCGGGAGCT TCTTAGAGGG 2957

ATGAGGTTCT TTGAACACAG TGAAAATTTA AATTAGTAAC TTTTTTGCAA 3007

GCAGTTTATT GACTGTTATT GCTAAGAAGA AGTAAGAAAG AAAAAGCCTG 3057

TTGGCAATCT TGGTTATTTC TTTAAGATTT CTGGCAGTGT GGGATGGATG 3107

AATGAAGTGG AATGTGAACT TTGGGCAAGT TAAATGGGAC AGCCTTCCAT 3157

GTTCATTTGT CTACCTCTTA ACTGAATAAA AAAGCCTACA GTTTTTAGAA 3207

AAAA 3211

ID-Nr. der Sequenz: 2

Sequenztyp: Aminosäure-Sequenz

Sequenzlänge: 680 Aminosäuren

Molekül-Typ: Protein

Organismus der ursprünglichen Quelle: Mensch

Eigenschaften: Menschliches Rezeptorprotein des Gibbonaffen- Leukämievirus


Anspruch[de]

1. Gibbonaffen-Leukämievirus(GALV)-Rezeptorprotein mit der in Figur 7 definierten Aminosäuresequenz; oder mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und mit der gleichen Fähigkeit, eine Virusinfektion zu erlauben, wie das Protein in Figur 7.

2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein menschliches Protein ist.

3. Protein nach Anspruch 1, bei dem das Protein von einer anderen als der menschlichen Art abgeleitet ist.

4. GALV-Rezeptorprotein nach Anspruch 1 oder 2 mit der in Figur 7 definierten Aminosäuresequenz.

5. Gereinigte isolierte DNA-Sequenz, die für ein Gibbonaffen- Leukämievirus-Rezeptorprotein kodiert, definiert in Figur 6; oder mit im wesentlichen der gleichen DNA-Sequenz und im wesentlichen der gleichen Aminosäure-Kodierungssequenz wie die DNA in Figur 6, entsprechend einem Protein, das die gleiche Fähigkeit aufweist, eine Virusinfektion zu erlauben, wie das Protein in Figur 7.

6. Gereinigte isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 5, bei der das Rezeptorprotein vom Menschen abgeleitet ist.

7. Gereinigte isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 5, bei der das Protein von einer anderen als der menschlichen Art abgeleitet ist.

8. Verfahren zum Identifizieren von Gibbonaffen- Leukämievirus-Rezeptorprotein, wobei das Verfahren umfaßt: Auswählen einer DNA-Sonde wie in Figur 6 identifiziert oder einer DNA-Sonde mit im wesentlichen der gleichen DNA-Sequenz wie derjenigen, die in Figur 6 definiert ist; Isolieren einer resultierenden DNA, die für Rezeptorprotein kodiert, das die gleiche Fähigkeit besitzt, eine Virusinfektion zu erlauben, wie das Protein in Figur 7.







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