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Dokumentenidentifikation DE68924478T2 07.03.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0377842
Titel Prototypische FeLV-Isolate für die Verwendung als Krankheitsmuster oder Impfstoffe.
Anmelder Harvard University, Cambridge, Mass., US;
Colorado State University Research Foundation, Fort Collins, Col., US
Erfinder Hoover, Edward A., Ft. Collins Colorado 80525, US;
Mullins, James I., Brookline, Mass.02146, US
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte BOEHMERT & BOEHMERT, NORDEMANN UND PARTNER, 28209 Bremen
DE-Aktenzeichen 68924478
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 12.12.1989
EP-Aktenzeichen 891229643
EP-Offenlegungsdatum 18.07.1990
EP date of grant 04.10.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.03.1996
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse A61K 39/21   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Herleitung molekularer Klone von FeLV und ihre Verwendung als Impfstoffe und in Krankheitsmodellen.

Hintergrund der Erfindung

Retroviren bilden eine große Klasse umhüllter RNA-Viren, die eine große Anzahl spezifischer Säugerwirte befallen. Sie werden durch eine Anzahl von Mechanismen infektiös übertragen&sub1; sind häufig mit schweren Krankheiten verbunden und teilen gemeinsame Elemente in ihren Strukturen. Die Retroviren, die aus einem (+)-Strang-RNA-Dimer(ssRNA) bestehen, bilden lange terminale Wiederholungen ("LTR") in ihren proviralen DNA-Intermediaten und ein Genom, das für Capsidproteine (das "gag"-Gen), reverse Transkriptase- und Integrase-Funktionen (das "pol"-Gen) und das Membranhüllgen ("env") codiert. Bei speziellen Viren ist gezeigt worden, daß zusätzlich zu den Funktionen der allgemeinen Gene andere offene Leserahmen vorhanden sind, die für Proteine codieren, die spezifische Funktionen aufweisen.

Katzenleukämieviren (FeLV) sind Retroviren vom exogenen Typ C, die verantwortlich sind für Induktion einer mannigfaltigen Reihe von lymphoretikulären Erkrankungen von Katzen, die nicht aus Inzuchten stammen, einschließlich Lymphosarkom, Leukämie, aplastischer Anämie, Myelodysplasie und erworbenem Immundefekt-Syndrom von Katzen (Hardy et al., Cancer Res. 36:582, 1976; Hardy, Feline Leukemia Virus, Hardy, Essex, McCelland, eds. (Elsevier/North Holland, 1980), pp. 3-31; Hoover, Rojko, Olsen, Feline Leukemia, Olsen, ed. (CRC Press, Boca Raton, Fla., 1980), pp. 32-51; Hardy und Essex, Prog. Allergy 37:353, 1986). Das Genom von FeLV ist ein Dimer von 60-705 von einzelsträngiger RNA, die ein gag-Gen, das die Capsidproteine codiert, ein pol-Gen, das die Protease, reverse Transkriptase und Integrase codiert und ein env-Gen, das die viralen Hüllproteine gp70 und p15E codiert, umfaßt. Wenn eine empfängliche Zelle mit FeLV infiziert ist (in vivo oder in vitro), wird das Genom, wie bei anderen Retroviren, in eine doppelsträngige DNA-Kopie transkribiert, die dann als ein Provirus in die zelluläre DNA getragen wird, das in 5'-LTR (lange terminale Wiederholung)-gag-pol-env-LTR-3'-Regionen organisiert ist. Das integrierte Provirus dient dann als Matrize für die Herstellung von FeLV-RNAs und schließlich von infektiösen reifen Viruspartikeln.

FeLV sind in Untergruppen A, B und C auf der Basis von Virusinterferenz und Neutralisationstests klassifiziert worden und die Verteilung der Untergruppen innerhalb von Katzenpopulationen unterscheidet sich merklich. Viren der Untergruppe A sind in allen untersuchten natürlicherweise vorkommenden Infektionen gefunden worden, entweder alleine oder in Kombination mit B und C. Untergruppe B, die in etwa 40% aller Infektionen gefunden wird, und Untergruppe C, die in vielleicht 1% der Infektionen gefunden wird, treten als Mischinfektionen der Untergruppen A und B, A und C, oder A, B und C auf. Untergruppenidentität korreliert auch mit dem Wirtsbereich der Infektion in vitro und Pathogenität bei Katzen: FeLV-A-Isolate sind manchmal beschränkt auf Wachstum in Katzenzellen und sind minimal pathogen; FeLV-B-Isolate wachsen in heterologen Zellen, wie z.B. fibroblastoiden Zellen von Mensch und Hund, und werden mit größerer Häufigkeit bei Katzen mit proliferativer Krankheit gefunden; und die seltenen FeLV-C-Isolate weisen einen erweiterten Wirtsbereich auf, einschließlich Zellen von Mensch, Hund und Meerschweinchen, und sind in der Lage, aplastische Anämie zu induzieren.

Pedersen et al., Vetinary Immunology and Immunopathology, 11, 123-148, 1986, offenbart einen Impfstoff gegen FeLV-induzierte Krankheit bei Katzen, welcher ganze, abgetötete FeLV-Viren vom Subtyp B umfaßt.

Mit Blick auf die verheerende Wirkung von FeLV-induzierter Krankheit bei Hauskatzen hat die Verhinderung von FeLV-Inf ektion durch Impfung anfälliger Tiere eine hohe Priorität für Forscher auf dem Gebiet der Tiermedizin. Zahlreiche Versuche, solch einen Impfstoff herzustellen, sind im wesentlichen erfolglos gewesen und Tatsache ist, daß der einzige kornmerziell erhältliche Impfstoff (Leukocell , Norden Laboratories, Lincoln, Nebraska) wegen seiner fraglichen Wirksamkeit heftig kritisiert wgrden ist (Pedersen et al., Feline Practice 15: 7-20, 1985). Die vorliegende Erfindung stillt den Bedarf auf dem Gebiet nach einem geeigneten FeLV-Impfstoff, und liefert weiterhin andere damit verbundene Vorteile, einschließlich der Definition eines Prototyps eines hoch infektiösen FeLV-A-Immunitätstestvirus, eines Prototyps eines molekular geklonten Immundefekt-induzierenden FeLV, und eines Krankheitsmodells, das für das Studium von retroviral induziertem Immundefekt-Syndrom und Leukämie bei Katzen und Menschen hilfreich ist.

Offenbarung der Erfindung

Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung molekulare Klone von Katzenleukämievirusisolaten, die (a) einen Prototyp eines hoch infektiösen, minimal pathogenen Virus, (b) ein abweichendes Genom, das replikationsdefekt ist und mit einem tödlichen Immundefekt bei Katzen, vergleichbar mit Aids, verbunden ist (Hoover, Blood 70:1880-1892, 1987; Overbaugh et al., Science 239:906-910, 1988) und (c) ein chimäres Genom codieren, das replikationskompetent ist und das oben beschriebene Immundefekt-Syndrom induziert. Genauer gesagt werden diese molekularen Klone verwendet, um Zellinien zu erzeugen, die infektiöses Virus produzieren, das bei der Herstellung von Impfstoffen oder der Erzeugung von Virämie oder von Immunitätstestsystemen für die Krankheit hilfreich ist.

Eine isolierte DNA-Sequenz, die das provirale Genom eines FeLV-A-Subtyps oder eines biologischen Derivats davon codiert, ist offenbart. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung schließt FeLV-A-Subtyp oder "biologisches Derivate davon" Mutanten eines FeLV-A-Subtyps ein, die mindestens 92% zu einem FeLV-A- Subtyp homolog sind. Die offenbarte DNA-Sequenz kann vom proviralen molekularen Klon 61C, der replikationsdefekt und nicht geeignet ist, Virämie bei Katzenarten (Felis domestica) zu induzieren oder von den Klonen 61E oder EECC abgeleitet werden, die geeignet sind, persistente Virämie bei Katzenarten zu induzieren.

Rekombinante Plasmide, die geeignet sind, die Expression des proviralen Genoms eines FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivates davon zu leiten, und Säugerzellen, die mit solch einem rekombinanten Plasmid transfiziert sind, sind ebenfalls offenbart. Geeignete Säugerzellen schließen Katzenzellen, wie z.B. AH927, CRFK, FCWF, Fc9, Katzenembryofibroblasten oder primäre Katzenzellkulturen und Lungenzellen vom Nerz ein.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivats davon offenbart. Das Verfahren umfaßt allgemein: (a) Transfektion einer Säugerwirtszelle mit einem rekombinanten Plasmid, das geeignet ist, die Expression des proviralen Genoms eines FeLV- A-Subtyps oder biologischen Derivats davon zu leiten, wobei das Plasmid eine DNA-Sequenz umfaßt, die das provirale Genom eines FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivats davon umfaßt;

(b) Kultivieren der Wirtszelle in einem geeigneten Medium; und

(c) Trennen des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivats davon von den Wirtszellen. Geeignete DNA-Sequenzen umfassen jene, die von den Klonen 61E und EECC abgeleitet sind. In einer alternativen Ausführungsform wird die Säugerwirtszelle cotransfiziert mit einem wie oben kurz beschriebenen Plasmid, wobei das Plasmid eine DNA-Sequenz, die von dem Klon 61C abgeleitet ist, und eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein replikationskompetentes provirales Genom codiert, wie z.B. eine DNA- Sequenz, die vom Klon 61e abgeleitet ist. Die Verfahren können, nach dem Trennschritt, auch Reinigen des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivats davon durch Methoden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, umfassen.

In einem damit verbundenen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines FeLV-Impfstoffes offenbart. Das Verfahren umfaßt allgemein: (a) Transfizieren einer Säugerwirtszelle mit einem rekombinanten Plasmid, das geeignet ist, die Expression des proviralen Genoms eines FeLV- A-Subtyps oder biologischen Derivates dayon zu leiten; (b) Kultivieren der Wirtszelle in einem geeigneten Medium; (c) Ernten der Immunogenen des FeLV-A-Subtyps oder des biologischen Derivates; und (d) Inaktivieren des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivats davon. In einer alternativen Ausführungsform wird die Säugerwirtszelle wie oben beschrieben cotransfiziert. Der FeLV-A-Subtyp oder das biologische Derivat davon kann auf mehreren Wegen inaktiviert werden, einschließlich Behandlung mit Formalin, beta-Propiolacton oder binärem Ethylenimin (BEI), unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend sind, um Inaktivierung zu bewirken. Das Verfahren kann auch, nach dem Inaktivierungsschritt, Konzentrieren des FeLV-A-Subtyps umfassen, um eine antigene Masse zu erhalten, die zur klinischen Verabreichung geeignet ist, um Schutz bei den Katzenarten vorzusehen.

Es werden auch Verfahren zum Schutz eines Katzenwirtes vor FeLV-Infektion offenbart. In einem solchen Verfahren wird eine immunologisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, die einen inaktivierten FeLV-A-Subtyp oder biologisches Derivat davon in Kombination mit einem physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt, dem Katzenwirt verabreicht. Geeignete Träger oder Verdünnungsmittel umfassen steriles Wasser und Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung kann auch ein geeignetes Adjuvans umfassen, wie z.B. vollständiges oder unvollständiges Freundsches Adjuvans, RIBI, Öladjuvanzien, partikuläre Adjuvanzien, wie z.B. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, oder allgemein immunstimmulierende Adjuvanzien, wie z.B. Avridine und ama3l-91. In einem Aspekt umfaßt der physiologisch akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel zellfreien Kulturüberstand, der von FeLV-A- Subtyp-produzierenden Zellen gewonnen wird. In dieser Hinsicht kann der physiologisch akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel weiter Ganzzellysate von FeLV-A-Subtyp-produzierenden Zellen umfassen. In einem verwandten Verfahren wird eine immunologisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, die das env-Genprodukt eines FeLV-A-Subtyps umfaßt, in Kombination mit einem physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht.

Wie oben festgehalten, offenbart die vorliegende Erfindung Impfstoffe gegen FeLV-induzierte Krankheit. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt der Impfstoff einen inaktivierten FeLV-A-Subtyp, als den einzigen FeLV-Subtyp, oder biologisches Derivat davon, das durch ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar ist, in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans. In bevorzugten Ausführungsformen ist der FeLV-A-Subtyp oder das biologische Derivat davon durch eine DNA-Sequenz codiert, die von Klon EECC oder Klon 61E abgeleitet ist.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt der Impfstoff einen inaktivierten FeLV-A-Subtyp, der durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die von einem FeLV-Klon abgeleitet ist, der replikationskompetent ist, wie z.B. Klon 61E, in Verbindung mit einem inaktivierten biologischen Derivat eines FeLV-A-Subtyps, der durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die von Klon 61C, als dem einzigen FeLV-Subtyp, abgeleitet ist, mit einem physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.

Katzenwirte, die durch Impfung mit einem FeLV-A-Subtyp oder biologischen Derivat davon tödliche Immundefekt-Krankheit zeigen, werden offenbart. Diese Katzenwirte sind hilfreich als Krankheitsmodelle sowohl für Katzen als auch für andere Säugetiere, einschließlich Menschen.

Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch Hinweis auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Darstellung der vollständigen Nukleotidsequenz von Klon 61e. Die Sequenz beginnt am 5'-LTR und erstreckt sich zum 3'-LTR, entsprechend der 8440-Nukleotidregion, die schematisch in Fig. 2 gezeigt ist. Abgeleitete Aminosäuresequenzen der zwei hauptsächlichen offenen Leserahmen (ORFs) sind durch einen Einbuchstabencode unterhalb der DNA-Sequenz bezeichnet. Restriktionsstellen, die auch in Fig. 2 vermerkt sind, werden oberhalb der DNA-Sequenz gezeigt.

Fig. 2A ist eine Restriktionsstellenkarte von Klon 61E mit der Lage von offenen Leserahmen (ORFs). Von oben nach unten sind Rahmen 1 bis 3 dargestellt. Vertikale Striche ( ) markieren Positionen von Terminationscodons. Kästchen ( ) stellen die ORFs dar, von denen bekannt ist, daß sie virale Proteine codieren und die Positionen der wahrscheinlich beginnenden Methionine für die gag(gag-pol)- und env-Translationsprodukte dar. Angezeigte Restriktionsstellen entsprechen BamHI(B), BglII (B2), EcoRI(RI), HindIII(H3), KpnI(K), PstI(P), SmaI(S), SstII(S2) und XhoI(X). Eine Restriktionsenzymkarte von Klon 61C ist in Fig. 2B gezeigt. In der Karte des unterschiedlichen Klons sind nur abweichende Stellen angezeigt.

Fig. 3 ist eine Darstellung der Nukleotidsequenz der env-3'- LTR von 61C und ein Vergleich mit der entsprechenden Region des molekularen Klons 61E. Teile der Nukleotidsequenz von 61E sind zusammen mit der Einbuchstabenübersetzung des env-Proteins gezeigt. Die entsprechende Sequenz von Klon 61C wurde bestimmt und nur die abweichenden Nukleotide und Aminosäuren, sind hier gezeigt. Die Bereiche vollständiger Nukleotididentität sind nicht gezeigt und sind durch ../... angezeigt. Wo solche Unterschiede zu einer Änderung in der abgeleiteten Aminosäuresequenz führen, ist der Dreibuchstabenaminosäurecode gezeigt. Bindestriche zeigen Lücken an.

Fig. 4a ist eine Darstellung von Plasmid pUC18-61E.

Fig. 4b ist eine Darstellung von Plasmid pUC18-61C.

Fig. 4c ist eine Darstellung von Plasmid pUC18-61EECC.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wie oben festgehalten, betrifft der Gegenstand der Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zum Schutz von Katzenwirten vor FeLV-Infektion, besonders indem infektiöse provirale molekulare Klone vorgesehen sind, die ein FeLV des Subtyps A oder ein biologisches Derivat davon codieren. Wenn bestimmte Klone, wie z.B. Klon 61E, verwendet werden, um Katzenzellen in vitro zu transfizieren, produzieren solche transfizierten Zellen ein infektiöses Virus, das nicht zytopatisch für T-Lymphozyten von Katzen oder fibroblastoide Zellen von Katzen ist. Das Wachstum dieses Virus ist auf Katzenzellen beschränkt (und ist deshalb ökotrop). Es wird hierin gezeigt, daß das Virus, das von diesen Zellen abgeleitet ist, Katzen, die frei von spezifischen Pathogenen sind, vom Entwöhnungsalter bis zum Erwachsenenalter infiziert. Keine dieser Katzen hat Krankheit mehr als 1 Jahr nach der Impfung entwickelt, obwohl sie persistente Virusinfektion entwickelt haben. Somit codiert das provirale Genom von FeLV-A ein prototypisches, ökotropes, horizontal übertragbares und minimal pathogenes Katzenleukämievirus. Es kann von anderen Katzenleukämieviren teilweise durch seine Fähigkeit unterschieden werden, Virämie bei Katzen im Nichtneugeborenenalter in konsistenter Weise zu induzieren und dadurch FeLV, das in der Natur gefunden wird, in geeigneterer Weise als irgend ein anderer Stamm, der bisher offenbart wurde, nachzuahmen. Die Nukleotidsequenz seines Hüllgens ist sehr hoch konservativ zu anderen Stämmen von FeLV, die auch leicht übertragen werden und bei allen in der Natur FeLV-infizierten Katzen vorkommen. Deshalb wird erwartet, daß eine Immunantwort, die auf die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung auf der Basis von FeLV-A hin erzeugt wird, gegen wirklich jedes beliebige andere horizontal übertragbare Katzenleukämievirus in der Natur schützt. Weiterhin wird ein wirksames Immunitätstessystem vorgesehen, das Schutz gegen einen homologen viralen Immunitätstestsystem zeigt, aufgrund der einzigartigen Fähigkeit des Virus, das durch DNA-Sequenzen codiert ist, die von den Klonen 61E oder EECC abgeleitet sind, ein hohes Vorkommen von Virämie bei Katzen zu induzieren, die mit 61E oder EECC geimpft sind.

Der Gegenstand der Erfindung betrifft auch Verfahren und Zusammensetzungen, um ein relevantes Krankheitsmodell bei Katzenarten vorzusehen, das verwendet werden kann, um weiterhin einen wirksamen FeLV-Impfstoff zu liefern (d.h. Schutz gegen Krankheit) oder das verwendet werden kann, um Möglichkeiten der Prophylaxe und Therapie verwandter Immundefekte bei anderen Arten (z.B. menschliche Immundefekt-Virusinfektionen beim Menschen) zu studieren. Der provirale molekulare Klon 61C von FeLV ist nicht infektiös, kann aber durch nachfolgende Transfektion mit molekularem Klon 61e oder Infektion mit Virus 61E gerettet werden, wenn er in Katzenzellen transfiziert ist. Werden 8 Wochen alte anfällige Katzen geimpft, induziert die sich ergebende Mischung von Virus 61E und 61C eine tödliche Immundefekt-Krankheit innerhalb von 4 Monaten, die typisch für diejenige ist, die bei Katzen beobachtet wird, die mit dem ursprünglichen Isolat von FeLV-FAIDS geimpft wurden (Hoover, Blood 70:188-1892, 1987; Overbaugh, Science 239:906-910, 1988). Zusätzlich kann ein chimärer FeLV-proviraler molekularer Klon (EECC) konstruiert werden durch Austausch von Teilen des Genoms von 61E und 61C. Wenn solch ein Kontrukt in empfängliche Katzenzellen transfiziert wird, ist das sich ergebende Virus (FeLV-EECC) replikationskompetent und induziert Immundefekt -Krankheit.

In bevorzugten Ausführungsformen werden für die Herstellung replikationskompetenter Viren die Proviren FeLV-61e-A und FeLV-EECC in einen geeigneten zellulären Wirt in Kultur, z.B. die Zellinien CRFK [ATCC# CCL94] oder AH927, bequemerweise als provirales Plasmid mit oder ohne einen selektierbaren Marker transfiziert. Transfektionsverfahren können DEAE-Dextranpräzipitation, Calciumphosphatpräzipitation oder Elektroporation umfassen. Das provirale Genom wird als ein Ergebnis der Einführung der proviralen DNA in das zelluläre Genom integriert werden. Die transfizierten Zellen werden selektiert, vermehrt und auf reverse Transkriptase, Virusproduktion, den Umfang von freigesetzten viralen Proteinantigenen und irgendwelche anderen Charakteristika, die mit der Verwendung des Virus als Impfstoff verbunden sind, gescreent.

Für die Herstellung replikationsdefekter Viren, wie z.B. FeLV- 61C, wird das provirale Genom in einen geeigneten zellulären Wirt in Kultur transfiziert und die resultierende transformierte Linie wird co-transfiziert oder co-infiziert mit einem replikationskompetenten proviralen Genom oder Virus, wie z.B. FeLV-61E.

Stabil transfizierte Zellinien, die FeLV-Protein und Viren konstitutiv exprimieren, werden bis zu 100% Konfluenz in 150 cm²-Rollerflaschen kultiviert, indem z.B. mit einem Minimum von 5 - 6 X 10&sup7; Zellen/Rollerflasche, die 250 ml Zellkulturmedium enthält, eingesät wird. Nachdem die Zellen nach 3 bis 7 Tagen Konfluenz erreicht haben, wird das Zellkulturmedium verworfen und die Zellen werden z.B. mit 250 ml Viruswachstumsmedium ergänzt. Die Zellen werden weiter inkubiert, normalerweise bei 37ºC, für einen bis mehrere Tage und das FeLV-enthaltende Medium wird geerntet. Mehrfaches Ernten, vorzugsweise ein Minimum von fünfmal, ist möglich, bis sich der Zellmonolayer von den Flaschen zu lösen beginnt. Die Erntematerialien von FeLV können bis zu 100-fach konzentriert werden in Abhängigkeit von Virustiter und/oder Antigengehalt, wie für Virusflüssigkeiten beschrieben. Inaktivierung, Konzentrierung und Versetzen der Zellinienflüssigkeiten mit Adjuvans erfolgt wie für Virusflüssigkeiten und ist hierin beschrieben.

Nachdem einmal ein geeigneter FeLV-A-Subtyp oder biologisches Derivat davon hergestellt worden ist, kann der Katzenwirt durch irgendein geeignetes Mittel mit einer ausreichenden Menge des inaktivierten Virus, das von klonierter proviraler DNA hergestellt wird, oder mit dem Virus und Zellsubstratmischungen geimpft werden, um eine angemessene Immunantwort zu liefern. Die Menge an verwendetem Virus wird allgemein von etwa 10&sup4; bis etwa 5 x 10&sup6;, gewöhnlicherweise etwa 1 - 5 x 10&sup5; Herdbildende Einheiten pro kg Wirt (FFU/Kg), reichen. Das Virus kann in einem beliebigen physiologisch akzeptablen Medium, z.B. sterilem Wasser, Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, Wachstumsmedium oder derartigem, sein. Im allgemeinen wird das Dosierungsvolumen 0,5 bis 2,0 ml betragen und subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös oder auf dergleichem Wege durch Injektion verabreicht werden. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können kürzlich geimpften Wirten verabreicht werden. Eine oder mehrere Auffrischungsinjektionen können in wöchentlichen bis sechswöchentlichen, gewöhnlicherweise zwei- bis vierwöchentlichen Intervallen vorgenommen werden.

Um die Beispiele zusammenzufassen, die folgen, wurde der das F6A-Virus codierende provirale Klon 61E direkt aus DNA von Darmgewebe einer Katze gewonnen, die frei von bestimmten Pathogenen war, nach Impfung mit zellfreiem Überstand von Lymphosarkom von einer Hauskatze aus Fort Collins, Colorado, die ein natürlicherweise vorkommendes Katzenlymphosarkom aufwies. Um Klone mit intakten Proviren zu erhalten, wurde DNA von Katze 1161 zuerst mit EcoRI gespalten (das nicht innerhalb des FeLV-Genoms spaltet) und auf einem Saccharosegradienten fraktioniert. Fraktionen, die DNA von hinreichender Länge, um potentiell Proviren in ihrer gesamten Länge zu enthalten, aber innerhalb der Kapazität des Bakteriophagen-Vektors gtWES B (P. Leder, D. Tiemeier, L. Enquist, Science 196:175, 1977) enthielten, wurden vereinigt. Die Genbibliotheken wurden hergestellt und mit einer exogenen LTR-spezifischen Sonde (Mullins et al., Nature 319:333-336, 1984) geprüft. Ein EcoRI-Fragment des F6A-Provirus in seiner gesamten Länge und flankierende Wirtssequenzen wurde in pUC18 subkloniert. Deletionsklone wurden dann durch Verdauung mit Exonuklease BAL31 erzeugt, in M13mp18 ligiert, und durch die Didesoxykettenterminationsmethode sequenziert. Die vollständige Sequenz von 8440 Basenpaaren (bp) des Provirus F6A ist in Fig. 1 ebenso gezeigt wie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der zwei langen offenen Leserahmen. Eine vereinfachte Restriktionskarte mit der Lage der offenen Leserahmen (ORFs), die gag (die Nukleokapsidproteine codierend), pol (Protease, reverse Transkriptase und Endonuklease-Integrase codierend) und env (das extrazelluläre [gp70] und transmembrane [p15E] Hüllprotein codierend) in den Sequenzen von F6A entsprechen, ist in Fig. 2 gezeigt. Die wahrscheinlichen beginnenden Methionine (ATG) der gag- und env- Gene kommen an Nukleotidpositionen 906 bzw. 5981 vor. Allgemein spiegeln die proviralen Sequenzen von F6A ein typisches Genom von Retroviren vom Typ C wider. Besonderheiten der Sequenz sind in Donahue et al., (J. Virol. 162:722-731, 1988) diskutiert. Für die vorliegende Erfindung ist von Bedeutung, daß es signifikant ist, daß, wenn das abgeleitete gp70-Protein von F6A mit dem von zwei anderen Isolaten vom Typ A, F3A und FGA (Glasgow), verglichen wird, sie eine merklich starke (98%) Homologie teilen, trotzdem sie von natürlicherweise infizierten Katzen im Abstand von bis zu 13 Jahren und von weit getrennten geographischen Orten isoliert wurden: FGA wurde in Glasgow, Schottland, 1970 isoliert und für mehrere Jahre in Kultur gehalten, bevor es molekularem Klonieren unterzogen wurde; F3A wurde 1977 in New York City (E. Zuckerman und W.D. Hardy, Jr., persönliche Mitteilung) isoliert und wurde ebenfalls extensiv in Kultur vermehrt, bevor es kloniert wurde; und F6A wurde von DNA von Katzengewebe molekular kloniert nach einer in vivo-Passage eines Virus, das von einer Hauskatze 1983 isoliert und nie in vitro vermehrt wurde, bevor es kloniert wurde. Alle drei Proviren wurden molekular kloniert und sequenziert. Diese bemerkenswerte Konservierung der Sequenz kann stringente Selektion gegen Antigenänderungen in der ubiquitären, Virämie-induzierenden und horizontal übertragbaren Form von FeLV widerspiegeln. Diese Sequenzdaten und dieser Vergleich, zusammen mit der unten beschriebenen biologischen Aktivität von F6A zeigen, daß F6A einen Prototyp der hoch konservierten, horizontal übertragenen, minimal pathogenen Form der Untergruppe A von FeLV repräsentiert, die wahrscheinlich in allen natürlicherweise infizierten Katzen vorhanden ist.

Um die biologische Aktivität von F6A zu definieren, wurde eine Katzenembryofibroblastenzellinie (AH927) mit klonierter DNA von 61E transfiziert. Reverse Transkriptase (RT) wurde in den Kulturen nach 12 Tagen ebenso wie provirale DNA nachgewiesen. 16 acht Wochen alte SPF-Katzen wurden dann mit 10&sup5; Herd-bildenden Einheiten von 61E-abgeleitetem F6A-Virus (titriert durch Klon-81-Test, siehe unten) das von transfizierten Zellen abgeleitet ist, geimpft. Jede geimpfte Katze wurde innerhalb 2 bis 4 Wochen virämisch und jede ist seitdem virämisch geblieben. Keine entwickelte irgendwelche Zeichen von Immundefekt-Krankheit nach 10 Monaten bis mehr als 2 Jahre. Eine Katze entwickelte ein T&supmin;-Zelllymphosarkom nach 21 Monaten, aber die anderen blieben gesund, was anzeigt, daß F6A minimal pathogen, obwohl hoch infektiös, ist, und, wie andere chronische Retroviren, geeignet ist, Lymphosarkom mit einem langen Latenzstadium zu induzieren.

Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Veranschaulichung und nicht zu Zwecken der Beschränkung vorgebracht.

BEISPIELE Beispiel I Erzeugung von Zellinien, die FeLV-Subtyp A produzieren, durch Gentransfer eines molekularen Klons in empfängliche Katzenzellen

Um einen Impfstoff bereitzustellen, wurde das FeLV-61E-A-Provirus als ein EcoRI-Fragment (Figur 3) isoliert und in die EcoRI-Stelle von pUC18 (Figur 4) subkloniert. Das erhaltene Plasmid pUC18-61E wurde in die Katzenembryofibroblastenzellinie AH927 durch Transfektion gemäß dem Elektroporationsverfahren eingeführt, das durch Potter et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:7161-7165, 1984) beschrieben ist.

Es wurde gefunden, daß der Titer an infektiösem F6A-Virus, das von AH927-61E freigesetzt wurde, zwischen 4 bis 8 x 10&sup6; ffu/ml schwankte (Lee et al., J. Natl. Cancer Inst. 49:55-60, 1972).

Beispiel II

Die folgende Beschreibung repräsentiert Verfahren, die für die Inaktivierung, Konzentrierung und Versetzen von Zellinienflüssigkeit und Virusflüssigkeit mit Adjuvans im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind.

Binäre Ethylenimin (BEI)-Inaktivierung von Virusflüssigkeiten oder Zellinienflüssigkeiten

Gleiche Volumina einer 0,2 molaren Bromethylaminhydrobromid- Lösung und einer 0,4 molaren Natriumhydroxidlösung werden gemischt und bei etwa 37ºC für 60 Minuten inkubiert. Das sich ergebende zyklisierte Inaktivierungsmittel ist binäres Ethylenimin (BEI), das zu den Virusflüssigkeiten oder Zellinienflüssigkeiten zu 0,5 bis 4% (v/v) zugegeben wird. Die inaktivierenden Virus- oder Zellinienflüssigkeiten werden von 4ºC - 37ºC für 24 bis 72 Stunden unter periodischem Bewegen gehalten.

Die inaktivierten Virus- oder Zellinienflüssigkeiten werden dreimal in Zellkultur überführt und auf spezifisches Virenwachstum untersucht, um auf vollständige Inaktivierung zu testen.

Konzentrierung von Virus- oder Zellkulturflüssigkeiten

Die Virus- oder Zellkulturflüssigkeiten können um einen Faktor 2 bis 100 durch eine Anzahl von verfügbaren Techniken konzentriert werden, wie z.B. Amicon, pellicon (Millipore)-Konzentrierungsvorrichtungen, Präzipitationstechniken, wie z.B. Ammoniumchlorid oder Polyethylenglycol (PEG), Konzentrierung mit Carbowachs-Flüssigkeit oder Wachs zusammen mit Dialyseschläuchen, oder Adjuvanskonzentrierungstechniken, wie z.B. mit Aluminiumphosphat. Für das PEG-Konzentrierungsverfahren werden 80 ml von 50% PEG zu einem Liter von Virus- oder Zellinienflüssigkeiten gegeben, dann über Nacht bei 4ºC gemischt. Am nächsten Tag werden die PEG-Virusflüssigkeiten bei > 2500 Upm zentrifugiert, der Überstand wird verworfen, und das PEG-Viruspellet wird im richtigen Medienvolumen resuspendiert, um die erwünschte Konzentration zu erhalten.

Versetzen von Virus- oder Zellkulturflüssigkeiten mit Adjuvans

Die folgenden Adjuvanzien können getrennt oder in Kombination mit zwei oder mehr Adjuvanzien in Abhängigkeit von interdermalen Verhärtungsreaktionen bei Tieren und Adjuvansmischkompatibilität verwendet werden.

Ethylenmaleinsäureanhydrid (EMA), das in einer Konzentration von 1 % (w/v) in Wasser hergestellt ist, wird zu den inaktivierten Virus- oder Zellinienflüssigkeiten zu 0,01 % (v/v) bis 6 % (v/v) zugegeben (Konzentration getrennt oder in Kombination mit anderen Adjuvanzien). Der pH der sich ergebenden Flüssigkeiten wird auf 7,1 bis 7,7 durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxid eingestellt.

Neocryl A640 ist eine Handelsbezeichnung für eine Latexemulsion eines Copolymers (A oder Styrol und eine Mischung von Acrylsäure und Methacrylsäure). Neocryl A640 ist ein nichtkoalesziertes wässriges Acrylcopolymer mit Styrol, das einen pH von 7,5 und eine Viskosität von 100 cps (Brookfiled 25ºC) aufweist, dessen Gewicht wie geliefert 8,6 lbs pro Gallone beträgt, und das 40 Gew.-% Feststoffe und 38 Vol.-% Feststoffe enthält. Die Ziffer A640 bezeichnet eine Sorte davon. Andere zweckdienliche Neocryl-Sorten sind 520, 625 und 966. Die Bezeichnung "CSMA" wird im folgenden verwendet, um ein Copolymer aus Styrol und einer Mischung von Acrylsäure und Methacrylsäure zu bezeichnen. CSMA, das in einer Suspension von 50 % (v/v) in Wasser hergestellt ist, wird zu den inaktivierten Virus - oder Zellinienflüssigkeiten zu 0,2 bis 10 Vol.-% getrennt oder in Kombination mit anderen Adjuvanzien zugegeben. Gewöhnlicherweise besteht kein Bedarf, den pH einzustellen, da das CSMA einen neutralen pH aufweist.

Modern Veterinary Products (Omaha, Nebr.) Emulsigen-Adjuvans für Kleintiere ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die getrennt oder in Kombination mit anderen Adjuvanzien mit 1 bis 20 % (v/v) in Virus- oder Zellinienflüssigkeiten verwendet wird.

Avridine wird getrennt oder in Kombination mit anderen Adjuvanzien mit 5 bis 30 mg pro Dosis verwendet. 2,4 g Avridine werden in 18 ml absolutem Ethylalkohol gelöst, dann werden 1,8 ml Tween-80 zugegeben und die Mischung durch einen 0,2 u-Filter gegeben. Anschließend werden 20,2 ml Intralipid-Sojabohnenöl aseptisch zum Avridine zugegeben. 7 bis 50 % (v/v) dieses Adjuvanz werden dann zu den Virus- oder Zellinienflüssigkeiten zugegeben.

Rohes oder gereinigtes Saponin wird getrennt oder in Kombination mit anderen Adjuvanzien mit 0,05 mg bis 5 mg pro Dosis verwendet. Saponin wird mit einer Konzentration von 200 mg/ml hergestellt, durch Filtrieren sterilisiert und dann den Virus - oder Zellinienflüssigkeiten zu 0,05 bis 20 % (v/v) zugegeben.

Aluminiumphosphat mit 0,01 bis 5 mg pro Dosis oder Aluminiumhydroxid mit 0,5 bis 20 mg pro Dosis kann auch getrennt oder in Kombination mit anderen Adjuvanzien verwendet werden.

Zell- und Viruswachstumsmedium

Bei der Impfstoffherstellung können Zellen in minimalem essentiellen Medium (MEM) kultiviert werden, das mit Vitaminen, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Natriumbicarbonat (Gibco, Grand Island, NY), das 10 bis 25 mM Hepes-Puffer, 30 g/ml Polymycin und 30 g/ml Neomycin enthält, supplementiert ist und das durch Filtrieren sterilisiert und bei 4ºC gelagert worden ist. Vor der Zugabe zu Zellen wird 2 mM L-Glutamin und Rinderserum dem Medium zugesetzt. Für Zellwachstum wird das Rinderserum zu 10% zugesetzt. Für Erhaltung der Zellen wird Rinderserum zu 0,05% zugesetzt. Die durchschnittliche Ernte beträgt vorzugsweise mehr als 10&sup4; Partikel/ml.

Beispiel III Verwendung von Virus F6A von der Zellinie AH927-61E als ein Impfstoff, der Freundsches Adjuvans verwendet

Zu Zwecken der Impfstoffherstellung wurden AH927-61E-Zellen wie folgt kultiviert. Zellüberstände, die F6A-Virus enthielten (2 x 10&sup5; ffu/ml), wurden gesammelt, in einigen Fällen konzentriert, und mit 0,1% bis 2% Formalin oder binärem Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Inaktivierte virale Präparate wurden mit vollständigem oder unvollständigem Freundschem Adjuvanz formuliert und SPF-Katzen durch intramuskuläre Impfungen von 1 ml (?) verabreicht.

Für die in Tabelle 1 beschriebenen Studien reichte das Alter der Katzen zu Beginn der Impfung von 4 bis 10 Monate. 2 bis 3 Impfstoffdosen wurden in dem beschriebenen Zeitintervall verabreicht. Kontrollimmunisierungen schlossen den Norden LEUKO- CELL-Impfstoff oder ausschließliches Adjuvans ein. Katzen wurden entweder mit F6A-Virus von AH927-61E (10&sup5; - 10&sup6; ffu intraperitoneal verabreicht) oder FeLV-CSU-Feldisolatvirus #05821 (10&sup5; ffu intranasal verabreicht) immungetestet. Der Immunitätstest wurde oder wurde nicht durch eine Behandlung der Katzen mit Corticosteroiden begleitet, wie in Tabelle 1 vermerkt. Katzen wurden durch die Vena jugularis nach dem Immunitätstest zur Ader gelassen und auf FeLV-Virämie durch ELISA-Antigen- Nachweis von p27 im Serum und durch Immunofluoreszenz in Blutzellen bewertet. Katzen mit persistenter Virämie gelten als durch den Immunitätstest erfolgreich infiziert. Katzen, die persistenter Virämie widerstehen, gelten als nicht infiziert, d.h., sie haben dem Immunitätstest widerstanden. Wenn Katzen immunsupprimiert sind, entwickeln 75% bis 83% der Kontrolltiere nach dem Immunitätstest persistente Virämie. Ohne Immunsuppression entwickeln 60% der Tiere Virämie. In nachfolgenden Studien wurden die Virusdosen im Immunitätstest erhöht, um 100% Virämie bei den Kontrolltieren herzustellen. Nur 5% aller 61E-immunisierten Tiere entwickelten persistente Virämie. In einer Studie (CSUJJ4) widerstanden im Immunitätstest mit einem heterologen FeLV-Isolat (05821) vom Subtyp AB 100% der 61E- Katzen der Virämie, während nur 25% der Kontrollkatzen dem Immunitätstest widerstanden. Dies bestätigt die Fähigkeit des Impfstoffpräparates auf der Basis von 61e, in einem heterologen Immunitätstest, analog demjenigen, wie er in der Natur vorkäme, zu schützen. In Studie CSUFD1 bedurfte es nur zweier Impfungen, um 100% der Tiere vor Virämie zu schützen (60% der Kontrolltiere virämisch).

Impfatoffbezeichnung Verbezeichnung Impfatoff verabreicht in den Wochen Gesamtzahl der Dosen Immunitätatest in Woche Nr. Immunitätstestvirus Verstärkung des Immunitätatests mit Corticosteroiden verwendet in den Wochen Alter der Katzen zu Beginn der Impfung (Monate) Anzahl der Katzen mit persistenter Virämie./Anzahl der immungetesteten Katzen Prozent der Katzen, die persistente Virämie entwickelten (Progressoren) Prozent der Katzen, die persistente Virämie entwickelten (Progressoren) Gemittelte Prozent virämisch Prozent der Katzen, die Virämie widerstanden (Regressoren) Gemittelte Prozent resistent Norden Leukocell Adjuvans-Kontrollen keine . - konsistent positiv für gag (P27)-Antigen in Plasma durch ELISA und in Blutzellen durch Immunofluoreszenz

Beispiel IV Erzeugung von FeLV-induziertem Krankheitsmodell

In der Darm-DNA-Präparation, von der der molekulare Klon 61E isoliert wurde, wurde eine gleiche Kopienzahl von unterschiedlichen Genomen (wie durch Restriktionsenzympolymorphismus definiert; siehe Fig. 2) beobachtet. Ein molekularer Klon, der einem Prototyp des Genoms von "Variante A" entspricht, der als 61C bezeichnet wurde, wurde in einem Bakteriophagenvektor isoliert und anschließend in einen Plasmidvektor inseriert (Fig. 4B). Das Plasmid wurde verwendet, um Katzenfibroblasten- und - T-Lymphozytenkulturen in vitro zu transfizieren. Die Sequenz versagte beim Codieren von infektiösem Virus. FeLV-61C war hoch infektiös, wenn es mit pFeLV-61E co-transfiziert wurde und die sich ergebende Mischung war für T-Lymphozyten zytopathisch.

Ein chimäres Virus wurde in vitro zwischen pFeLV-61E und pFeLV-61C konstruiert, wobei Sequenzen auf jeder Seite der einzigen Xho I-Restriktionsstelle ausgetauscht wurden, die in jedem Provirus etwa an Nukleotidposition 5817 gefunden wurde. Die 5'-terminalen Sequenzen wurden von pFeLV-61E abgeleitet und die 3'-Sequenzen wurden von FeLV-61C abgeleitet. Das als pFeLV-EECC bezeichnete Plasmid (Fig. 4C) wurde verwendet, um Katzen-T-Lymphozytenkulturen in vitro zu transfizieren und es wurde gezeigt, daß es infektiöses zytopathisches Virus codiert.

Sowohl von FeLV-61E/61C-Virusmischung als auch von FeLV-EECC ist gezeigt worden, daß sie tödliche Immundefekt-Krankheit (Hoover, Blood 70:1880-1892, 1987; Overbaugh, Science 239:906- 910, 1988) in allen geimpften und persistent virämischen Katzen induzieren. Die replikationskompetenten FeLV-EECC und ähnliche Chimären induzieren Krankheit mit kürzerem Latenzzeitraum mit Überlebenszeiten, die von 20 bis 60 Tagen nach Impfung von Katzen in der Entwöhnungsphase reichen. Überlebenszeiten für Tiere, die mit der FeLV-61E/61C-Mischung geimpft wurden, reichen von 90 bis 120 Tagen.

Die Nukleotidsequenz des Teils des 61C-Genoms, das in der FeLV-EECC Chimäre gefunden wurde, wurde bestimmt und die relativ zu FeLV-61E abweichende Sequenz identifiziert (Fig. 3) Die Mischung und die Chimäre stellen die ersten vollständig definierten Retroviren dar, von denen gezeigt wurde, daß sie tödliche Immundefekt-Krankheit in irgendeinem Organismus induzieren. Sie können deshalb verwendet werden, für die Identifizierung genetischer Sequenzen, die für die Induktion von AIDS bei Katzen verantwortlich sind, für die Bewertung der Wirksamkeit antiviraler Medikamente, als Immunitätstestviren für die Bewertung der Wirksamkeit von Impfstoffen hinsichtlich Verhindern von Virämie und Krankheit und in der Entwicklung von Impfstoffen, um Immunität gegen Katzenleukämieviren anzuregen.

Obwohl die vorhergehende Erfindung in einigen Einzelheiten zu Zwecken der Veranschaulichung und Beispiele zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses beschrieben worden sind, wird es offensichtlich sein, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges der beigefügten Ansprüche vorgenommen werden können.

Die in der vorhergehenden Beschreibung, in den Ansprüchen und/oder in den begleitenden Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in Kombination davon Gegenstand für Realisierung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.


Anspruch[de]

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines FeLV-Impfstoffes, wobei das Verfahren Transfektion einer Säugerwirtszelle mit einem rekombinanten Plasmid, das geeignet ist, die Expression des proviralen Genoms eines FeLV-A-Subtyps oder eines biologischen Derivats davon zu leiten, wobei besagtes Plasmid eine DNA-Sequenz umfaßt, die das provirale Genom eines FeLV-A-Subtyps oder eines biologischen Derivats davon codiert, Kultivieren besagter Wirtszelle in einem geeigneten Medium, Ernten der Immunogene des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivates, und Inaktivieren des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivats davon umfaßt.

2. Ein Verfahren zur Herstellung eines FeLV-Impfstoffes, wobei das Verfahren Transfektion einer Säugerwirtszelle mit einem rekombinanten Plasmid, das geeignet ist, die Expression des proviralen Genoms eines FeLV-A-Subtyps oder eines biologischen Derivats davon zu leiten, wobei besagtes Plasmid eine DNA-Sequenz, die vom Klon 61C, Klon EECC oder Klon 61E abgeleitet ist und eine DNA-Sequenz umfaßt, die von einem FeLV-Klon abgeleitet ist, der replikationskompetent ist, Kultivieren besagter Wirtszelle in einem geeigneten Medium, Ernten der Immunogene des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivates, und Inaktivieren des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivates davon umfaßt.

3. Eine Zusammensetzung, die einen inaktivierten FeLV-A-Subtyp als den einzigen FeLV-Subtyp oder ein biologisches Derivat davon, das durch ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 herstellbar ist, in Kombination mit einem physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.

4. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Zusammensetzung ein geeignetes Adjuvans einschließt.

5. Ein Impfstoff gegen FeLV-induzierte Krankheit, welcher einen inaktivierten FeLV-A-Subtyp als den einzigen FeLV-Subtyp oder ein biologisches Derivat davon, das durch ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 herstellbar ist, in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans umfaßt.

6. Ein Impfstoff nach Anspruch 5, wobei besagter FeLV-A-Subtyp durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die von Klon 61E abgeleitet ist.

7. Ein Impfstoff gegen FeLV-induzierte Krankheit, wobei der Impfstoff einen inaktivierten auf rekombinantem Wege produzierten FeLV-A-Subtyp, der durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die von Klon 61E abgeleitet ist, in Verbindung mit einem inaktivierten FeLV-A-Subtyp, der durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die von Klon 61C, als dem einzige FeLV-Subtyp, abgeleitet ist, und einen physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.

8. Ein Impfstoff gegen FeLV-induzierte Krankheit, wobei der Impfstoff einen inaktivierten auf rekombinantem Wege hergestellten FeLV-A-Subtyp, der durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die von Klon 61E, als dem einzigen FeLV-Untertyp, abgeleitet ist, und einen physiologisch akzeptabler Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.

9. Ein Verfahren zur Herstellung eines FeLV-Impfstoffes, wobei das Verfahren Co-Transfektion einer Säugerwirtszelle mit einem rekombinanten Plasmid, das geeignet ist, die Expression des proviralen Genoms eines FeLV-A-Subtyps oder eines biologischen Derivats davon zu leiten, wobei besagtes Plasmid eine DNA-Sequenz umfaßt, die von Klon 61C abgeleitet ist, und mit einem rekombinantem Plasmid, das geeignet ist, die Expression des proviralen Genoms eines FeLV-A-Subtyps oder eines biologischen Derivats davon zu leiten, wobei besagtes Plasmid eine DNA-Sequenz umfaßt, die von einem FeLV-Klon abgeleitet ist, der replikationskompetent ist, Kultivieren besagter Wirtszelle in einem geeigneten Medium, Ernten der Immunogene des FeLV-A-Subtyps oder biologischen Derivates, und Inaktivieren des FeLV-A- Subtyps oder biologischen Derivats davon umfaßt.







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