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Dokumentenidentifikation DE68924243T2 28.03.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0371253
Titel Verfahren und Reagenzien zum Nachweis von Amphetamin und/oder d-Methamphetamin in biologischen Proben.
Anmelder Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill., US
Erfinder Heiman, Daniel Feulner, Libertyville, IL 60048, US;
Hsiang-Yun, Yang Hu, Libertyville, IL 60048, US;
Johnson, Sharon Ann, Kenosha, WI 53140, US
Vertreter Schieber und Kollegen, 80469 München
DE-Aktenzeichen 68924243
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 24.10.1989
EP-Aktenzeichen 891197014
EP-Offenlegungsdatum 06.06.1990
EP date of grant 13.09.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.03.1996
IPC-Hauptklasse G01N 33/94
IPC-Nebenklasse G01N 33/542   G01N 33/58   C07K 14/435   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für Amphetamin und d- Methamphetamin und Reagenzien, die für dieses nützlich sind. Sie stellt einen Vorinkubationsschritt zur Verfügung, der zur Ausschaltung der Kreuzreaktivität mit β-Hydroxyaminen wirksam ist. Zusätzlich betrifft sie die Ausschaltung von möglicher Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin und mögliche Interferenz durch endogenes Tyramin. Darüber hinaus schließen die besonderen Verfahren der chemischen Synthese der neuartigen chemischen Reagenzien, die in dem neuartigen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Notwendigkeit der Verwendung von einer Kontrolle unterliegenden Substanzen als Ausgangsmaterialien aus und vermeiden daher die wesentliche Zeit, die wesentliche Anstrengung und die wesentlichen Ausgaben, die notwendig sind, um den Vorschriften der United States Drug Enforcement Agency (USDEA) zu genügen.

Hintergrund der Erfindung

Amphetamin und Methamphetamin, deren Strukturformeln unten angegeben sind, sind sympathomimetische Phenethylaminderivate, die eine stimulierende Wirkung auf das Zentralnervensystem ausüben.

Diese Wirkstoffe wurden zur Behandlung von Fettsucht, Narcolepsie und Hypotonie eingesetzt. Jedoch kann übermäßiger oder verlängerter Gebrauch dieser Wirkstoffe zu Toleranz und physischer Abhängigkeit führen. Aufgrund ihrer stimulierenden Wirkung werden diese Wirkstoffe gemeinhin illegitim verkauft und mißbraucht. Die physiologischen Symptome, die oft im Zusammenhang mit wirklich großen Mengen eingenommenen Amphetamins und Methamphetamins auftreten, umfassen erhöhten Blutdruck, erweiterte Pupillen, Hyperthermie, Krämpfe und akute Amphetaminpsychose.

Die biologische Flüssigkeit, die am häufigsten auf den Mißbrauch von Amphetamin und Methamphetamin untersucht wird, ist Urin. Andere biologische Flüssigkeiten wurden nicht in ausgedehnter Weise für die Verwendung in Assays zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin untersucht.

In der Vergangenheit wurden Amphetamine mittels einer Mehrzahl von Verfahren nachgewiesen, einschließlich der Dünnschichtchromatographie (TLC), der Gaschromatographie (GC) und der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese Verfahren umfassen allgemein chemische Extraktionen des Wirkstoffs, welche komplizierte Verfahren sind, die hochgradig ausgebildetes Personal und lange Assayzeiten erfordern. Dünnschichtchromatographie ist arbeitsintensiv und wenig empfindlich. Gaschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, die beide auch sehr arbeitsaufwendig sind, erfordern hochqualifiziertes Personal, um die Extraktionen des Analyten aus der biologischen Matrix auszuführen. Darüber hinaus benötigt die Gaschromatographie normalerweise einen Derivatisierungsschritt.

Allgemein liefern Konkurrenzbindungsimmunoassays eine bevorzugenswerte Alternative zu den physikalischen Verfahren wie der Gaschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.

Fluoreszenzpolarisationsimmunoassayverfahren stellen ein zuverlässiges quantitatives Mittel zum Messen der Menge an Tracer-Antikörperkomplex zur Verfügung, der sich in einem homogenen Konkurrenzbindungsassay gebildet hat.

Typischerweise werden Konkurrenzbindungsimmunoassays zum Messen von Liganden in einer Testprobe eingesetzt. Allgemein ist ein "Ligand" eine Substanz von biologischem Interesse, die quantitativ mittels einem Konkurrenzbindungsimmunoassayverfahren bestimmt werden soll. Die Liganden konkurrieren mit einem markierten Reagens oder "Ligandenanalogon" oder "Tracer" um eine beschränkte Anzahl von Rezeptorbindungsstellen auf Antikörpern, die für den Liganden und das Ligandenanalogon spezifisch sind. Die Konzentration an Ligand in der Probe bestimmt die Menge an Ligandenanalogon, das an den Antikörper bindet. Die Menge an Ligandenanalogon, die an den Antikörper bindet, ist zu der Konzentration an Ligand in der Probe umgekehrt proportional, weil der Ligand und das Ligandenanalogon jeweils proportional ihrer jeweiliger Konzentration an den Antikörper binden.

Die Fluoreszenzpolarisation liefert ein quantitatives oder qualitatives Mittel zum Messen der Menge an Tracer- Antikörperkonjugat, das sich bei einem Konkurrenzbindungsimmunoassay gebildet hat. Die Fluoreszenzpolarisationsverfahren beruhen auf dem Prinzip, daß eine fluoreszent markierte Verbindung, wenn sie durch planarpolarisiertes Licht angeregt wurde, eine Fluoreszenz emittiert, die einen Polarisationsgrad aufweist, welcher in umgekehrter Beziehung zu ihrer Rotationsgeschwindigkeit steht. Daher bleibt, wenn ein Tracer-Antikörperkonjugat, der eine fluoreszente Markierung trägt, mit planar-polarisiertem Licht angeregt wird, daß emittierte Licht hochgradig polarisiert, weil das Fluorophor in der Zeit, zwischen der das Licht absorbiert und emittiert wird, an der Rotation gehindert wird. Wenn umgekehrt ein ungebundener Tracer durch planar-polarisiertes Licht angeregt wird, ist seine Rotation wesentlich schneller als die des entsprechenden Tracer-Antikörperkonjugates und eine angeregte Molekülpopulation unterliegt schneller einer Zufallsverteilung. Als Ergebnis dessen, ist das Licht, das von den nicht-gebundenen Tracer-Molekülen emittiert wird, depolarisiert.

Solche Fluoreszenz-Polarisationsverfahren wurden im US- Patent Nr. 4420568 von Wang et al. angewendet, wobei das Patent auf die Verwendung einer Triazinylaminofluoresceingruppe als das Fluorophor gerichtet ist.

Ein genaues und zuverlässiges Immunoassay zum Nachweis des Mißbrauches von Amphetamin und d-Methamphetamin erfordert, daß die Antikörper-"Kreuzreaktivität" (die Erkennung von Verbindungen, die nicht die gewünschten Liganden oder der gewünschte Ligand sind) auf ein Minimum reduziert ist.

Insbesondere das l-Enantiomere hat eine weniger anregende Aktivität und ist in geringen Mengen in einigen rezeptfreien Präparaten enthalten, obwohl das d- und das l-Enantiomere von Methamphetamin beides von der USDEA nach Stufe II kontrollierte Substanzen sind, und daher beide als potentiell mißbräuchlich eingestuft werden. Daher wird es für ein Assay, das zum Nachweis von Arzneimittelmißbrauch verwendet wird, als unerwünscht angesehen, wenn es auf in einer Probe alleinig vorhandenes l- Methamphetamin anspricht. Daher sollte die Kreuzreaktivität für l-Methamphetamin in einem solchen Assay so nahe wie möglich bei Null liegen. Die Kombination neuartiger Antiseren und Tracer, die bei dem Immunoassay der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vermindert die Kreuzreaktivität von l-Methamphetamin auf unter 5,1%.

Es ist ebenfalls bekannt, daß Derivate von β- Phenethylamin, insbesondere β-Hydroxyphenethylaminverbindungen stark interferierende Stoffe bei einem Immunoassay für Amphetamin und Methamphetamin sein können. Ein solches β- Hydroxyphenethylamin, der Wirkstoff Phenylpropanolamin wird häufig in rezeptfreien Dekongestionsmitteln aufgefunden. Das US- Patent Nr. 3856469 offenbart die Entfernung der β- Hydroxyphenethylamininterferenz aus einer Probe, die zur Analyse auf Amphetamin oder Methamphetamin bestimmt ist, durch die Behandlung der Probe bei einem pH über 8,0 mit einer Menge an wäßrigem Perjodat in Anwesenheit von Ammoniumhydroxid. Zusätzlich zum Erfordernis der Probenbehandlung bei einem basischen pH-Wert wird von der wäßrigen Vorbehandlung im US- Patent Nr. 3856469 ausgesagt, daß sie nur nützlich ist, wenn sie vor der Probenbeurteilung durch Dünnschichtchromatographie und Immunoassay durch Radioimmunoassay, Elektronen- Spinnresonanzverfahren oder Enzymverfahren durchgeführt wird.

Darüber hinaus kann Tyramin, welches natürlicherweise in einer biologischen Probe, die auf Amphetamin und/oder Methamphetamin analysiert wird, vorhanden sein kann ebenfalls ein starkes Interferens bei einem Immunoassay auf Amphetamin und d-Methamphetamin sein. Das unerwünschte Ergebnis, das im Zusammenhang mit der Tyramininterferenz auftritt, ist dasjenige, daß falsche positive Ergebnisse erhalten werden können. Jedoch verbessert die Kombination von neuartigen Antiseren und Tracern, die beim Immunoassay der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, die Selektivität dieses Immunoassays auf Amphetamin und d-Methamphetamin im Gegensatz zu Tyramin im Vergleich mit solchen Verfahren, die im Stand der Technik beschrieben sind, so wesentlich, daß es die Kreuzreaktivität des Immunoassays für Tyramin bei ungefähr 0,4% hält.

Darüber hinaus schalten die besonderen Verfahren für die chemische Synthese der neuartigen chemischen Reagenzien, die bei dem neuartigen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, die Notwendigkeit der Verwendung "kontrollierter Substanzen" als Startmaterialien aus und schließen daher den wesentlichen Zeit-, Arbeits- und Ausgabenaufwand aus, der notwendig ist, um den Bestimmungen der Buridesdrogenverfolgungsbehörde zu genügen.

Zuletzt liefert das Immunoassay der vorliegenden Erfindung ein schnelleres und genaueres Amphetamin/d- Methampethamin-Assayverfahren als die Verfahren nach dem Stand der Technik, da zur Analyse keine Probenbehandlung mehr erforderlich ist und da das Assaysystem eine minimale Kreuzreaktivität gegen l-Methamphetamin oder andere Amphetaminähnliche Verbindungen aufweist.

Als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung von Interesse ist EP-A-0279213, die ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay auf Amphetamin und Methamphetamin offenbart, das para-substituierte Amphetaminvorläufer, Tracer, Immunogene und von diesen erhaltene Antiseren in Kombination mit para-substituierten Methamphetaminvorläufern, Tracern, Immunogenen und von diesen erhaltenen Antiseren verwendet.

Für den weiteren Stand der Technik, der den Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin in biologischen Proben betrifft, siehe US-Patent Nr. 3996344 (Phenethylamin-antigenische Konjugate, ihre Herstellung, Antikörper und Verwendung); US- Patent Nr. 4016146 (Phenethylamin-antigenische Konjugate, ihre Herstellung, Antikörper und Verwendung); US-Patent Nr. 4041076 (Immunoassay auf pharmakologisch aktive Phenethylamine); US- Patent Nr. 4329281 (Haptenzusammensetzungen, die bei der Herstellung von Immunogenen verwendet werden, die bei der Züchtung von Antikörpern, die auf Amphetamin und Methamphetamin selektiv sind, verwendet werden); US-Patent Nr. 3966764 (Ligandenbestimmung von Spin-markierten Verbindungen durch Rezeptoraustausch-Amphetaminanaloga); US-Patent Nr. 4067774 (Verbindungen für Enzym-Verstärkungsassays); US-Patent Nr. 3878187 (Polypeptidderivate von Amphetamin und Analoga für Immunoassays); FEBS LETTERS 36., 3 (1973) (Radioimmunoassayverfahren zur Messung von Amphetaminen im Urin); Chem. Pharm. Bull. 25(4), 840 (1977) (Radioimmunoassay auf Methamphetamin); Forensic Science International 27, 49 (1985) (ein Latex-Agglutinations-Inhibitionsreaktionstest zur Untersuchung von Amphetamin in Urin); Analytical Biochemistry 161. 117 (1987) (die Induktion von Methamphetamin-spezifischen Antikörpern unter Verwendung von biologisch abbaubarem Carboxymethylchitin); Journal of Medicinal Chemistry, Bd. 19, Nr. 1 (1976) (Bestimmung der Spezifität eines Antikörpers der gegen d-(S)-Methamphetamin gerichtet ist); Clin. Chem. 32/9, 1677 (1986) (ein homogenes Fluoroimmunoassay zum Nachweis von Amphetaminen im Urin); Jpn. J. Legal Med. 37(4), 417 (1983) (Festphasen-Mikro-ELISA auf Methamphetamin); Journal of Forensic Sciences, Bd. 32, Nr. 3, 658 (1987) (histochemischer Nachweis von Methamphetamin durch Immunocytochemie); Chem. Pharm. Bull. 25(4), 838 (1977) (Herstellung eines spezifischen Antikörpers gegen Methamphetamin); Clinical Toxicology, 18(1), 91 (1981) (Analyse von amphetaminverwandten Aminen durch EMIT bei verschiedenen Konzentrationen); Analytical Biochemistry 60, 551 (1974) (Radioimmunoassay von 3,4,5-Trimethoxyphenethylamin (Mescalin) und 2,5-Dimethoxy-4-methylphenylisopropylamin); und Clinical Toxicology, 18(3), 299 (1981) (Analyse von Amphetaminverwandten Aminen durch RIA).

Demgemäß besteht ein Bedarf an der Schaffung eines Verfahrens und an Reagenzien zur Durchführung eines zuverlässigen und genauen Fluoreszenzpolarisationsassays sowohl für Amphetamin als auch für d-Methamphetamin in biologischen Flüssigkeiten wie Urin. Die vorliegende Erfindung ist insofern ein Fortschritt der Technik, als daß neuartige Reagenzien, die spezifisch bei Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays auf Amphetamin und d-Methamphetamin nützlich sind und eine neuartige Kombination solcher Reagenzien bei solchen Immunoassays zur Verfügung gestellt werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit und zur Bestimmung der ungefähren Menge von sowohl Amphetamin als auch d-Methamphetamin in biologischen Proben unter Anwendung von Fluoreszenzpolarisationsverfahren. Insbesondere umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Vorinkubation einer Urinprobe, die auf Amphetamin und/oder d- Methamphetamin getestet werden soll, ohne die Einstellung des pH's der Probe auf alkalische Bedingungen. Insbesondere wird eine Probe allein mit einer wäßrigen Perjodatlösung, die einen pH von ungefähr 4,0 bis 7,5 aufweist, behandelt, um unerwünschte Verbindungen auszuschließen, die mit den Antikörpern kreuzreagieren, die spezifisch für Amphetamin und/oder d- Methamphetamin und Ligandenanaloga dieser sind.

Die behandelte Probe wird mit einer Zusammensetzung vermischt, die eine erste Fluorescein- oder eine Fluoresceinderivat-Tracerverbindung aufweist, die an ein Ligandenanalogon von Amphetamin-gekoppelt ist, sowie eine zweite Fluorescein- oder Fluoresceinderivat-Tracerverbindung, die an ein Ligandenanalogon von d-Methamphetamin gekoppelt ist, einen ersten Antikörper, der zur spezifischen Erkennung und Bindung von Amphetamin und der ersten Tracerverbindung in der Lage ist, und einen zweiten Antikörper, der zur spezifischen Erkennung und Bindung von d-Methamphetamin und der zweiten Tracerverbindung in der Lage ist, enthält. Die Menge an erster und zweiter Tracerverbindung, die an den ersten und zweiten Antikörper jeweils gebunden ist, wird mittels Fluoreszenzpolarisationsverfahren als Maß für die Menge an Amphetamin und d-Methamphetamin in der biologischen Probe ermittelt.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Ausschaltung von möglicher Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin (Vitamin B&sub2;). Riboflavin, das für den Menschen essentiell ist, ist der hitzestabile Bestandteil des Vitamin-B- Komplexes, 6,7-Dimethyl-9-[1'-D-ribityl]isoalloxazin, C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub0;N&sub4;O&sub6;, und kommt in Milch, Muskeln, Leber, Nieren, Eiern, Gras, Malz, blättrigem jungem Gemüse und verschiedenen Algen vor. Riboflavin-bindendes Protein (RBP) wird entweder direkt zu jeder Probe oder zu einem oder mehreren der beim Assay verwendeten Reagenzien hinzugegeben, wodurch es alles Riboflavin, das vorhanden ist, unter Bildung von Riboflavin- Bindungsprotein/Riboflavin-Proteinkomplexen bindet, wodurch die Fluoreszenzinterferenz eliminiert wird. Andere Fluoreszenzlöschende Substanzen können ebenfalls zu diesem Zweck eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Ausschaltung von möglicher Interferenz durch endogenes Tyramin. Tyrosin ist eine Aminosäure, die in den meisten Proteinen vorkommt und die im Stoffwechsel aus Phenylalanin synthetisiert wird. Tyramin ist das Decarboxylierungsprodukt von Tyrosin und erscheint bei der Urinausscheidung. Es ist ebenfalls ein Bestandteil von einigen Nahrungsmitteln wie verschiedenen Käsen und es ist ein Produkt von bakteriellem Abbau. Da sogar ein geringes Ausmaß an Kreuzreaktivität (Beispiel 2%) des Antiserums, das in einem Immunoassay für Amphetamin und d- Methamphetamin bei in einer Probe der biologischen Flüssigkeit vorhandenem Tyramin eingesetzt wird, zu einem falschen positiven Ergebnis für Amphetamin und/oder d-Methamphetamin führen kann, wenn eine Urinprobe eine wesentliche Menge an Tyramin enthält, erfordert ein genaues und zuverlässiges Immunoassay auf Amphetamin und d-Methamphetamin, daß die Antikörper- Kreuzreaktivität gegenüber Tyramin auf ein Minimum beschränkt ist. Es wurde unerwarteterweise festgestellt, daß die Kombination von dem neuartigem Antiserum und den neuartigen Tracern, die bei dem Immunoassay der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Selektivität dieses Immunoassays für Amphetamin und d-Methamphetamin gegenüber Tyramin im Vergleich mit den Verfahren, die in der Technik beschrieben sind, wesentlich erhöht, und daß diese Kombination die Kreuzreaktivität des Immunoassays für Tyramin bei ungefähr 0,4% hält.

Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein stabilisiertes Reagenzienkit, das zur Bestimmung von Amphetamin und d-Methamphetamin in einem einzelnen Assay nützlich ist, das neuartige Tracer und Salze dieser umfaßt, die als Reagenzien bei dem neuartigen Verfahren der vorliegenden. Erfindung nützlich sind. Andere Bestandteile des Reagenzienkits in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfassen eine Lösung, die Riboflavin-Bindungsprotein enthält, eine wäßrige Vorbehandlungslösung, die eine Menge an Perjodat aufweist, die zum Ausschluß unerwünschter Kreuzreaktivität gegenüber β- Hydroxyphenethylaminen wirkungsvoll ist, und ein Antikörperreagens mit einer Zusammensetzung, die einen ersten Antikörper umfaßt, der zum spezifischen Erkennen und Binden von Amphetamin in der Lage ist und einen zweiten Antikörper, der zum spezifischen Erkennen und Binden von d-Methamphetamin in der Lage ist. Im Falle eines automatisierten Fluoreszenzpolarisationsassays, das eine automatisierte Ausgabevorrichtung wie eine Pipette verwendet, liefert die vorliegende Erfindung nach dem Vermischen einen Auswaschungsschritt der Ausgabevorrichtung mit einer wäßrigen Propylenglykol- und Salzlösung um die Wirkstoffverschleppung von einer zur anderen Probe, die durch das Anhaften an der Ausgabevorrichtung hervorgerufen wird, auf ein Minimum zu beschränken. Die bevorzugte wäßrige Vorbehandlungslösung enthält von ungefähr 0,1 bis 0,25 Molar Natriumperjodat.

Weitere Aufgaben und offensichtliche Vorteile der Erfindung werden am besten aus der Betrachtung der nachfolgenden eingehenden Beschreibung zusammen mit den Zeichnungen und den Beispielen verständlich.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Definitionen

Der Ausdruck "Ligand", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Molekül, in Bezug auf das ein Bindungsprotein, wie ein Rezeptor oder ein Antikörper, erhalten oder gebildet werden kann. Die bei der vorliegenden Erfindung interessierenden Liganden sind Phenethylamine, insbesondere Amphetamin und d- Methamphetamin. Solche Liganden sind proteinfreie Verbindungen niedrigen Molekulargewichts, die üblicherweise keine Antikörperbildung induzieren, wenn sie einem Tier gespritzt werden, die aber gegenüber Antikörpern reaktiv sind. Liganden die chemisch zur Konjugation an ein Trägerprotein modifiziert sind, werden Haptene genannt. Antikörper gegen Haptene werden allgemein gezüchtet, indem zunächst die Haptene an einen Träger konjugiert werden und das Konjugatprodukt anschließend einem Tier injiziert wird. Die resultierenden Antikörper können mittels herkömmlichen gut bekannten Isolationsverfahren für Antikörper isoliert werden.

Der Ausdruck "Ligandenanalogon", wie er hierin verwendet wird, betrifft ein mono- oder polyvalentes Radikal, von dem ein wesentlicher Anteil die gleiche räumliche und polare Struktur wie der Ligand aufweist, wodurch eine oder mehrere determinante oder epitopische Stellen definiert werden, die zur Konkurrenz mit dem Liganden um die Bindungszentren eines Rezeptors in der Lage sind. Eine Eigenschaft eines solchen Ligandenanalogons ist, daß es genügend strukturelle Ähnlichkeit mit dem interessierenden Liganden besitzt, daß es von dem gegen den Liganden gerichteten Antikörper erkannt zu werden vermag. Allgemein hat das Ligandenanalogon die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Struktur und Ladungsverteilung (räumliche und polare Struktur) wie der Ligand oder die Liganden von Interesse sind (für die Zwecke der vorliegenden Erfindung: Amphetamin und d-Methamphetamin), und zwar dies alles in Bezug auf einen wesentlichen Anteil der molekularen Oberfläche. Oft wird die Verknüpfungsstelle für ein Hapten sowohl bei der Präparation des Antigens zur Herstellung von Antikörpern als auch im Tracer zur Verknüpfung mit dem Liganden verwendet, wobei der gleiche Bereich des Ligandenanalogons, der die Schablone für den Antikörper liefert, vom Ligandenanalogon im Tracer angeboten wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fluorescein und von Derivaten von Fluorescein. Eine notwendige Eigenschaft von Fluorescein und seinen Derivaten für die Nützlichkeit der hier verwendeten Tracerverbindung ist die Fluoreszenz von Fluorescein. Fluorescein existiert in beiden der unten gezeigten tautomeren Formen in Abhängigkeit von der Säurekonzentration (pH) der Umgebung.

ALTERNATIVE STRUKTURFORMELN UND NAMEN DER FLUORESCEINFUNKTION, DIE IN DEN NEUARTIGEN TRACERN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG ENTHALTEN IST

Die offene (Säure-)Form weist eine Anzahl von konjugierten Doppelbindungen auf, die diese Form des Fluoresceins (und die Verbindung die eine Fluoresceinfunktion enthalten) dazu befähigen, blaues Licht zu absorbieren und nach einer Lebensdauer des angeregten Zustands von ungefähr 4 Nanosekunden eine grüne Fluoreszenz zu emittieren. Wenn die offene und die geschlossene Form koexistieren, kann die relative Konzentration der Moleküle in der offenen und geschlossenen Form leicht durch Einstellen des pH-Wertes verändert werden. Allgemein existieren die Tracerverbindungen der vorliegenden Erfindung in Lösung als Salze wie Natrium-, Kalium-, Ammoniumsalze und dgl., die den Verbindungen die Existenz in der offenen fluoreszenten Form erlauben, wenn sie in den neuartigen analytischen Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Das jeweilig anwesende Salz hängt von dem zur Einstellung des pH-Wertes verwendeten Puffer ab. Daher existiert z. B. in Gegenwart eines Natriumphosphatpuffers die Verbindung der vorliegenden Erfindung allgemein in der offenen Form ihres Natriumsalzes.

Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "Fluorescein" entweder eine individuelle Verbindung oder den Bestandteil einer größeren Verbindung, der sowohl die offene als auch die geschlossene Form umfaßt, wenn diese für das besondere Molekül existieren, außer im Zusammenhang mit der Fluoreszenz. Es ist die offene Form notwendig, damit die Fluoreszenz auftritt.

Die Numerierung der Kohlenstoffatome des Fluoresceinmoleküls verändert sich je nach dem, ob die offene oder geschlossene Form des Moleküls betrachtet wird. Demgemäß ist die Fluorescein und seine Verbindungen betreffende Literatur, was die Numerierung der Kohlenstoffatome angeht, nicht einheitlich. In der geschlossenen Form wird das Kohlenstoffatom in Para-Stellung bezüglich der Carbonsäuregruppe in dem isolierten Phenylring mit 5 bezeichnet. Für die Zwecke dieser Offenbarung wir die Numerierung der geschlossenen Form angewendet, da die bei der Synthese verwendeten Rohmaterialien üblicherweise nach diesem System durchnumeriert werden. Das Kohlenstoffatom in Para-Stellung zu der Carboxylgruppe bei Fluorescein und seinen Derivaten wird daher für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung mit "6" numeriert.

Ein Tracer in Lösung, der nicht an einen Antikörper komplexiert ist, kann in geringerer als der Zeit, die für die Absorption und die Reemission von Fluoreszenzlicht notwendig ist, frei rotieren. Als Folge davon ist das reemittierte Licht relativ zufällig orientiert, so daß die Fluoreszenzpolarisation eines Tracers, der nicht an einen Antikörper komplexiert ist, gering, näherungsweise Null ist. Bei der Komplexierung mit einem spezifischen Antikörper nimmt der so gebildete Tracer- Antikörperkomplex die Rotationsgeschwindigkeit des Antikörpermoleküls an, die geringer als diejenige des relativ kleinen Tracermoleküls ist, wodurch ein Anstieg der Polarisation beobachtet werden kann. Daher nimmt, wenn ein Ligand mit dem Tracer um Antikörperbindungsstellen konkurriert, die beobachtete Polarisation der Fluoreszenz der resultierenden Mischung von freiem Tracer und Tracer-Antikörperkomplex einen Zwischenwert zwischen demjenigen des Tracers und demjenigen des Tracer- Antikörperkomplexes an. Wenn eine Probe eine hohe Ligandenkonzentration enthält, ist der beobachtete Polarisationswert demjenigen des freien Tracers näher, d. h. er ist niedrig. Wenn sie eine niedrige Konzentration des Liganden enthält, ist der Polarisationswert demjenigen des gebundenen Tracers näher, d. h. er ist hoch. Durch aufeinanderfolgendes Anregen der Reaktionsmischung eines Immunoassays mit vertikal und dann mit horizontal polarisiertem Licht und durch alleinige Analyse der Vertikalkomponente des emittierten Lichtes kann die Polarisation der Fluoreszenz in der Reaktionsmischung genau bestimmt werden. Das genaue Verhältnis zwischen Polarisation und Konzentration des zu bestimmenden Liganden wird durch Messung der Polarisationswerte von Eichlösungen bekannter Konzentrationen bestimmt. Die Konzentration des Liganden kann aus einer auf diese Art und Weise erhaltenen Standardkurve extrapoliert werden.

Von den besonderen Tracern, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung gebildet wurden, wurde festgestellt, daß sie überraschend gute Assays liefern, wie dies weiter unten gezeigt ist.

Die Reagenzien

Die Verordnung über die der Kontrolle unterliegenden Substanzen ist ein Bundesgesetzwerk, das die Verschreibung und die Abgabe von psychoaktiven Arzneimitteln einschließlich Schlafmitteln in fünf Stufen reguliert, gemäß ihrem Mißbrauchspotential, der medizinischen Verträglichkeit und ihrer Fähigkeit, eine Abhängigkeit hervorzurufen. Diese Verordnung legt ebenfalls ein Regelsystem für die Herstellung, die Lagerung und den Transport von Wirkstoffen auf jeder Stufe fest. Arzneimittel, die unter diese Verordnung fallen, umfassen Opium und seine Derivate, Opiate, Hallucinogene, Antidepressiva und Stimulanzien. Wenn kontrollierte Substanzen oder Substanzen, die die Fähigkeit zur Verhaltensbeeinflussung aufweisen, und die unter das Gesetz hinsichtlich dem Besitz und der Verwendung fallen, wie etwa Amphetamin und Methamphetamin, als Ausgangsmaterialien zur Synthese von chemischen Verbindungen verwendet werden, oder als Zwischenstufen oder Endprodukte in einer solchen chemischen Synthese auftreten, muß ein wesentlicher Zeitbedarf und Aufwand für die Vorbereitung und die Antragstellung im Rahmen der Verwaltungsvorschriften bei der Bundesbeteubungsmittelbehörde aufgewendet werden. Darüber hinaus müssen die unter Kontrolle stehenden Substanzen auf kontrollierte oder stark reglementierte Weise verwendet werden, was eine außerordentliche Sicherheit bei der Handhabung in Laboratorien und in Herstellungsanlagen erfordert. Daher ist es extrem wünschenswert, die Verwendung oder Herstellung von kontrollierten Substanzen bei der Durchführung chemischer Reaktionen und der Synthese chemischer Verbindungen zu vermeiden, um den Zeitverlust, den Aufwand und die Ausgaben zu vermeiden, die notwendig sind, um den verschiedenen Erfordernissen der Bundesarzneimittelbehörde, wie der Führung genauer Inventarien und dem Verschluß aller kontrollierten Substanzen, zu genügen. Die besonderen Verfahren für die chemische Synthese der neuartigen chemischen Reagenzien, die bei dem neuartigen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der vorliegenden Erfindung verwenden werden sind, insoweit vorteilhaft, als daß sie die Notwendigkeit der Verwendung kontrollierter Substanzen als Ausgangsmaterialien ausschließen und daher den wesentlichen Zeitbedarf, den Aufwand und die Ausgaben vermeiden, die zur Erfüllung der Vorschriften der Bundesarzneimittelbehörde notwendig sind.

Das Ziel beim Entwurf eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays ist die Erzeugung einer Konkurrenz zwischen den gewünschten Phenethylaminen und den Tracern um die Erkennungsstellen auf dem Antikörper. Es sind große strukturelle Veränderungen bei den Haptenen und Tracern möglich, um dieses Ziel zu erreichen. Für die Zwecke dieser Erfindung sind "Haptene" Vorläufer der Immunogene oder Tracer, die allgemein ein substituiertes Phenethylaminderivat und eine Verknüpfungsgruppe zum Proteinträger oder zur fluoreszierenden Verbindung oder zu einem Derivat dieser, umfassen.

1. Vorbehandlungsreagenz

Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Ausschaltung der Kreuzreaktivität gegenüber β- Hydroxyphenethylaminen in einem Fluoreszenz-Polarisationsassay durch Vorbehandlung der Testprobe mit einer wirksamen Menge einer wäßrigen Perjodatlösung. Insbesondere bewirkt die wäßrige Perjodatlösung die Spaltung der Seitenkette zwischen dem alpha- und beta-Kohlenstoffatom, wenn eine Hydroxylgruppe (-OH) an dem alpha-Kohlenstoffatom vorhanden ist. Daher konkurriert die Verbindung nicht mehr länger und die Bindungsstellen mit.

Das Vorbehandlungsreagens in Übereinstimmung mit dem Reagenzkit der vorliegenden Erfindung enthält eine wäßrige Perjodatlösung mit einem pH von ungefähr 4 bis 7,5. Vorzugsweise umfaßt die Vorbehandlungslösung 0,1 bis 0,25M Natriumperjodat mit einem pH-Bereich von ungefähr 4,0 bis 5,0. Besonders bevorzugterweise enthält die Natriumperjodatlösung ungefähr 0,20M Natriumperjodat mit einem pH von ungefähr 4,5. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Vorbehandlung einer Testprobe ohne die Notwendigkeit der pH-Einstellung der Testprobe auf alkalische Bedingungen durchgeführt werden kann, wenn Verbindungen wie Hydroxide eingesetzt werden.

2. Die Tracer a) Die Struktur der Tracer

Die erste neuartige Amphetamin-Tracerverbindung der vorliegenden Erfindung hat die Formel 1:

Formel 1

Die neuartige d-Methamphetamin-Tracerverbindung der vorliegenden Erfindung hat die Formel 2:

Formel 2

Der Tracer ist ein Phenylethylaminderivat, das an ein Fluoresceinderivat über eine Amidogruppe, wie unten gezeigt, gebunden ist. Die Tracer werden hergestellt, indem das geeignete Fluoresceinderivat an ein Phenylethyhlaminderivat gebunden wird, das eine Amino- oder Carbonsäuregruppe enthält, wie dies im Zusammenhang mit dem synthetischen Verfahren und den Beispielen unten beschrieben wird. Die, Verknüpfungsgruppen, die zur Kupplung der Fluoresceingruppe an das Phenylethylaminderivat eingesetzt werden können, sind unten vorgestellt. Das Symbol "Fl" bezeichnet eine Fluoresceingruppe.

Verknüpfgungsgruppen

-NH-CO-Fl

-CO-NH-Fl

Die nachfolgenden sind die Fluoresceinderivate, die zur Synthese der neuartigen Tracer der vorliegenden Erfindung verwendet werden können:

Fl-NH Fluoresceinamin

Fl-CO-H Carboxyfluorescein

Beispielhafte Strukturen einiger der Haptene, die zur Bildung der neuartigen Tracer und Immunogenverbindungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind in den Fig. 1 bis 3 vorgestellt.

Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3

b) Die Synthese der Tracer.

Die Tracer der vorliegenden Erfindung werden durch Kupplung einer Fluoresceingruppe oder eines Fluoresceinderivats an ein Phenethylaminderivat dargestellt.

Die Fluoresceingruppe kann an die Amino- oder Carboxylfunktion über eine Amidbindung gebunden werden, wie oben gezeigt. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform für Amphetamin kann das Fluoresceinderivat, welches 6- Aminofluorescein ist, an einen Vorläufer des unten gezeigten Tracers gekuppelt werden.

Das 3-Carboxyamphetamintrifluoracetamid wird durch Behandlung mit Oxalylchlorid in das korrespondierende Säurechlorid überführt und wird an 6-Aminofluorescein in Acetonitrillösung gekoppelt. Andere aktivierende Reagenzien wie Chlorameisensäureester oder Säurechloride oder Anhydride (die gemischte Anhydride mit dem Carbonsäurevorläufer ausbilden) oder 1-Hydroxybenzotrazol, p-Nitrophenol, Pentafluorphenol, Imidazol und dgl. können zusammen mit einem dehydratisierenden Reagens verwendet werden. Andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid und Dimethoxyethan können verwendet werden. Die Reaktanten werden vorzugsweise unter Bedingungen gekuppelt, die zur Ausbildung von Amidbindungen geeignet sind. Am meisten wird bevorzugt, daß ein Verfahren verwendet wird, das die Überführung in ein Säurechlorid vorsieht. Die Verbindung wird dann vorzugsweise durch Hydrolyse mit Kaliumcarbonat in wäßriger methanolischer Lösung entschützt. Andere Reagenzien, die für die Hydrolyse von Trifluoracetamiden geeignet sind, wie tertiäre Aminbasen, Natriumcarbonat oder ein Alkalimetallhydroxid oder dgl., können für den Entschützungsschritt eingesetzt werden.

Für den d-Methamphetamintracer ist das Fluoresceinderivat 6-Carboxyfluorescein. Dieses wird an den unten gezeigten Vorläufer gekuppelt:

Das 6-Carboxyfluorescein wird vorzugsweise mit dem 4- Amino-d-methamphetamintrifluoracetamid durch Behandlung mit Bis (2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid in Gegenwart einer tertiären Aminbase in Acetonitrillösung gekuppelt. Andere aktivierende Reagenzien wie Chlorameisensäureester oder Säurechloride oder Anhydride (die gemischte Anhydride mit dem Carbonsäurevorläufer ausbilden) oder 1-Hydroxybenzotriazol, p- Nitrophenol, Pentafluorphenol, Imidazol und dgl. können zusammen mit einem dehydratisierenden Reagens verwendet werden. Die Reaktanten werden vorzugsweise unter Bedingungen gekuppelt, die zur Bildung von Amidverknüpfungen geeignet sind. Am meisten ist bevorzugt, daß ein Verfahren angewendet wird, das Bis(2-oxo-3- oxazolidinyl)phosphinchlorid einsetzt. Die Verbindung wird dann vorzugsweise durch Hydrolyse mit Kaliumcarbonat in wäßriger methanolischer Lösung entschützt. Andere Reagenzien, die für die Hydrolyse von Trifluoracetamiden geeignet sind, wie eine tertiäre Aminbase, Natriumcarbonat oder ein Alkalimetallhydroxid oder dgl., können für den Entschützungsschritt verwendet werden.

Kombination von Tracern

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das bevorzugte Tracerreagens eine Zusammensetzung, die Salze eines ersten und eines zweiten Tracers enthält. Allgemein ist der erste Tracer das Salz eines Liganden, der zu Amphetamin analog ist, und der zweite Tracer ist das Salz eines Liganden, der zu d- Methamphetamin analog ist. Die Kombination einzelner Tracer für Amphetamin und Methamphetamin liefert den Vorteil des Nachweises beider Wirkstoffe (Amphetamin/d-Methamphetamin), während die hohe Spezifität, die niedrige Kreuzreaktivität und die hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit gewahrt bleiben.

Vorzugsweise sind der erste und zweite Tracer Natrium-, Kalium-, Ammoniumsalze und dgl. Besonders bevorzugterweise liegen der erste und zweite Tracer in der Reagenslösung als Natriumsalze vor. Die derzeitig bevorzugte Tracer-Formulierung umfaßt eine ungefähr 90 nanomolare Konzentration der gemischten Tracer in 0,1M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,5, 0,1% Natriumazid und 0,01% Rinder-gamma-Globulin.

3. Die Antikörper

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden durch Auslösung einer Antwort in Tieren auf die unten beschriebenen Immunogene hergestellt. Das Immunogen wird den Tieren, wie Kaninchen oder Schafen, in einer Reihe von Injektionen auf eine dem Fachmann gut bekannte Weise verabreicht.

A) Die Struktur der Immunogene

Immunogene, die aus Phenethylaminverbindungen, die in der Para-Position funktionalisiert sind, hergestellt werden, können die Antikörperproduktion in Tieren anregen. Solche Antikörper sind in einem Assay auf Phenethylamine gemäß der Erfindung nützlich, wenn sie mit den Tracern nach den Formeln 1 und 2 kombiniert werden.

Die Antikörper gegen Amphetamin und d-Methamphetamin, die bei dem Assay eingesetzt werden, werden als Immunantwort auf Amphetamin- und d-Methamphetaminderivate gezüchtet, die an einem Proteinträger (Immunogene) gebunden sind, wobei der Proteinträger Rinderthyroglobulin ist. Die neue immunogene Amphetaminverbindung der vorliegenden Erfindung hat die Formel 3:

Formel 3
Rinderthyroglobulin

Die neue immunogene Methamphetaminverbindung der vorliegenden Erfindung hat die Formel 4:

Formel 4
Rinderthyroglobulin

Die Immunogene der vorliegenden Erfindung werden durch Kupplung einer Phenethylamin-Haptenvorläuferverbindung mit Rinderthyroglobulin hergestellt, wie dies im Zusammenhang mit dem synthetischen Verfahren und den Beispielen weiter unten beschrieben wird.

Die bevorzugten Immunogen-Vorläuferverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind in den Fig. 1 und 3 gezeigt.

B) Die Synthese der Immunogene

Die Immunogene der vorliegenden Erfindung werden durch Kupplung eines Amphetamin- oder d-Methamphetaminderivats an Rinderthyroglobulin hergestellt. Das Hapten kann aus einer der beispielhaft oben gezeigten Strukturen ausgewählt sein. Diese Reaktanten werden vorzugsweise unter Bedingungen gekuppelt, die üblicherweise zur Bildung von Azo- und Sulfonamidbindungen verwendet werden, und solche Bedingungen sind dem Fachmann gut bekannt.

Vor der Kupplung des Haptens an das Rinderthyroglobulin wird das Amin in der Seitenkette geschützt. Die Schutzgruppen, z. B. Trifluoracetyl oder BOC (t-Butylcarbamat), werden unter dem Fachmann bekannten Bedingungen zugegeben.

Die Immunogene werden durch Kupplung eines Haptens, dessen Phenethylaminogruppe geschützt ist, und das eine -NH&sub2;- Gruppe in der 3-Position, im Falle des Amphetaminderivats, oder eine SO&sub2;Cl-Gruppe in 4-Position, im Falle eines d- Methamphetaminderivats, trägt, an Rinderthyroglobulin hergestellt. Das Sulfonylchlorid erzeugt eine Sulfonamidbindung. Dies wird durch direkte Kupplung des Haptens an das Rinderthyroglobulin erreicht.

Nach der Kupplung des Seitenketten-amingeschützten Haptens an das Protein wird die Schutzgruppe entfernt, um das freie Amin oder das Amin in einer Salzform zu erhalten. Wenn die verwendete Schutzgruppe Trifluoracetyl ist, kann sie durch Behandlung mit wäßriger Base durch in-Kontakt-Bringen mit wäßrigem Natriumborhydrid oder anderen dem Fachmann bekannten Reaktionsbedingungen entfernt werden. Wenn die Schutzgruppe BOC (t-Butylcarbamat) ist, kann sie durch wäßrige Säuren, nichtwäßrige Säuren oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren entfernt werden.

Die Synthesen obiger Haptene werden auf sehr ähnliche Arten und Weisen durchgeführt. Die idealen Ausgangsmaterialien sind ein Phenylethylamin wie Norephedrin oder Ephedrin oder eine Verbindung, die in ein Phenethylamin überführt werden kann, wie ein Benzaldehyd oder ein Phenylpropanol. Wenn die Seitenketten- Aminfunktion von Anfang an anwesend war, oder nachdem sie eingeführt wurde, muß sie mittels einer Schutzgruppe unreaktiv gemacht werden. Nach der katalytischen Reduktion der Nitrogruppe zu einer Aminogruppe wird diese dann durch Reaktion mit kalter salpetriger Säure diazotiert. In dem Fall, in dem das Hapten eine SO&sub2;Cl-Gruppe trägt, wird die Proteinkupplung mittels in- Kontakt-Bringen einer wäßrigen oder organisch-wäßrigen Lösung des Proteins mit dem Chlorsulfonylphenylethylaminderivat durchgeführt. Nach der Konjugation werden die Schutzgruppen mittels dem Fachmann bekannten Verfahren entfernt, und die Immunogene werden entweder durch Siebchromatographie oder Dialyse aufgereinigt.

C) Kombination der Antikörper

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das bevorzugte Antikörperreagenz eine Zusammensetzung, die einen ersten Antikörper umfaßt, der als Antwort auf ein Immunogen gezüchtet wurde welches oben beschrieben ist, und der zur Erkennung und Bindung an Amphetamin in der Lage ist, und einen zweiten Antikörper, der zur Erkennung und Bindung von d-Methamphetamin in der Lage ist.

Kaninchen-, Schaf- oder jegliches andere Tierserum kann als Quelle für Antikörper für das Antikörperreagenz dienen. Die bevorzugten Antiserumformulierungen umfassen Schafserum, das mit 0,1M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,5; 0,1% Natriumazid; 0,01% Rinder-gamma-Globulin; 2% Propylenglycol (Volumen/Volumen) und 15 mg/ml Riboflavin-Bindungsprotein verdünnt ist.

4. Waschreagenz

Es wurde überraschend festgestellt, daß die zur Verfügungstellung eines Phenethylaminfluoreszenz- Assayreagenzienkits mit einer wäßrigen 5%igen Propylenglykollösung und 0,45%igen NaCl-Waschreagenslösung die Assayzuverlässigkeit und -genauigkeit steigert. Insbesondere wurde herausgefunden, daß die zur Verfügungstellung einer Waschlösung mit ungefähr 5% Propylenglycol und 0,45% NaCl die Urinanhaftung an der Ausgabevorrichtung, wie der Sonde, der Pipette oder Spritze, vermindert. Man muß sich vor Augen führen, daß die Urinanhaftung an der Ausgabevorrichtung zu einer Probenverschmutzung führen kann, die falsche positive Resultate für Proben ergibt, die nachfolgend auf eine solche getestet werden, die Phenethylamin enthält. Im Falle einer hoch automatisierten Assayvorrichtung wie dem ABBOTT LABORATORIES TDx® Clinical Analyzer oder dem ABBOTT LABORATORIES ADxTM Abused Drug System, von denen beide große Probenanzahlen nacheinander untersuchen können, ist das Ausschalten der Urinkontamination zwischen den Proben sehr wünschenswert. Vorzugsweise wird das Reagenzienkit mit einer Waschlösung zur Verfügung gestellt, die ungefähr 5% Propylenglykol und 0,45% NaCl enthält.

Das Assay

Die besonderen neuartigen Tracer und Antikörper der vorliegenden Erfindung erzeugen hervorragende Resultate bei Fluoreszenzpolarisationsassays für das gewünschte Phenethylamin. Wie oben beschrieben, wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Kombination dieser neuartigen Tracer und Antikörper in einem Immunoassay auf Amphetamin und d-Methamphetamin die mögliche Interferenz durch endogenes Tyramin ausschaltet. Die Kombination von Antiserum und neuartigen Tracern, die bei dem Immunoassay der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, erhöht wesentlich die Selektivität dieses Immunoassays auf Amphetamin und d-Methamphetamin im Vergleich mit den in der Technik beschriebenen Methoden, und zwar derart, daß es die Kreuzreaktivität des Immunoassays für Tyramin bei ungefähr 0,4% und Kreuzreaktivität für l-Methamphetamin unterhalb 5% hält.

Die Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin (Vitamin B&sub2;) kann die Mengenbestimmungsergebnisse eines jeden Amphetaminund/oder Methamphetaminassays ungenau machen. Daher ist ein anderer wesentlicher Vorteil des Assays der vorliegenden Erfindung die Ausschaltung der möglichen Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin. Dies kann durch Betrachtung der in der Tabelle 1 unten enthaltenen Werte geschlossen werden. Während die zweite und dritte Spalte Daten darstellen, die vor der Zugabe des Tracers zu einer drogenfreien Urinprobe (Fluroeszenzintensität) erhalten wurden, zeigen die vierte und fünfte Spalte die Werte an, nachdem der Tracer zu einer solchen Probe hinzugegeben wurde (Polarisation).

TABELLE 1
Probennummer Hintergrundrauschen (kein Riboflavinbindungsprotein) Hintergrundrauschen 15 mg/ml Riboflavinverbindungsprotein (mP) Polarisation (kein Riboflavin Bindungsprotein (mP) Polarisation (15 mg/ml Riboflavin Bindungsprotein)

Darüber hinaus liefert das Assay der vorliegenden Erfindung eine schnellere und genauere Amphetamin und/oder d- Methamphetamin-Assaymethode als die Verfahren gemäß dem Stand der Technik, da es keine Probenbehandlung vor der Analyse erfordert.

Die allgemeinen Strukturen aus der Klasse der Phenethylamine, die quantitativ und/oder qualitativ in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, sind in den Formeln 5 und 6 gezeigt:

Formel 5
Formel 6

wobei für beide Formeln 5 und 6:

(1) R&sub1; und R&sub2; Wasserstoff, Chlor, Methyl oder Methoxy sind, oder zusammengenommen eine Methylendioxybrücke ausbilden, und

(2) wobei R&sub3; gleich Methyl oder Ethyl ist.

Das Assay der vorliegenden Erfindung ist ein besonders wünschenswertes Assay für Amphetamin und/oder d-Methamphetamin, da es Amphetamin und d-Methamphetamin sowie auch gewisse "Designer-Drogen" im Sinne der Stufe 1 lt. USDEA (Wirkstoffe, die speziell chemisch entworfen wurden, um nicht von den besonderen Wirkstoffkategorien erfaßt zu werden, die durch die USDEA reglementiert sind), wie 3,4-Methylendioxyamphetamin, 3,4- Methylendioxyethylamphetamin und 3,4- Methylendioxymethamphetamin. Darüber hinaus weist es keine (1) amphetaminartigen stimulierenden legitimen verschreibungspflichtigen Wirkstoffe nach (nicht von der USDEA reglementierte Wirkstoffe, welche als falsche Positive betrachtet werden können); und (2) keine nicht-stimulierenden Wirkstoffe.

Die Kreuzreaktivität wurde für Amphetamine und Methamphetamine und Amphetaminmetaboliten überprüft. Die Verbindungen wurden einem Assay unterzogen, indem eine bekannte Menge der Testverbindung zu Wirkstoff-freiem Normal-Humanurin hin zugegeben wurde und ein Assay auf Amphetamin/Methamphetamin gemäß der vorliegenden Erfindung auf einem Abbott Laboratories TDx® Clinical Analyzer durchgeführt wurde. Der Prozentsatz an Kreuzreaktivität wurde mittels der folgenden mathematischen Formel ermittelt:

%Kreuzreaktivität = 100 · gefundene Konzentration der Testverbindung/Konzentration der zu gegebenen Testverbindung

Die repräsentativen Werte sind in Tabelle 2 unten gezeigt.

TABELLE 2
Testverbindung Zugegebene Konzentration (ug/mL) Gefundene Konzentration (ug/mL) % Kreuzreaktivität l-Amphetamin d-Methamphetamin
TABELLE 2 (Fortsetzung)
Testverbindung Zugegebene Konzentration (ug/mL) Gefundene Konzentration (ug/mL) % Kreuzreaktivität 3.4-Methylen dioxyamphetamin 3,4-Methylen dioxyethylamphetamin 3,4-Methylen dioxymethamphetamin 4-Methyl-2,5-dimethoxyamphetamin 4-Ethyl-2,5-dimethoxyamphetamin
TABELLE 2 (Fortsetzung)
Testverbindung Zugegebene Konzentration (ug/mL) Gefundene Konzentration (ug/mL) % Kreuzreaktivität p-Hydroxyamphetamin 4-Chloramphetamin

Wie aus der Untersuchung der in Tabelle 3 gezeigten Werte ersichtlich, weist das Assaysystem der vorliegenden Erfindung eine minimale Kreuzreaktivität gegenüber gewissen Amphetaminartigen Verbindungen auf. Die Kreuzreaktivität wurde mit Verbindungen getestet, die ähnliche chemische Strukturen wie Amphetamin und d-Methamphetamin aufweisen. Viele Amine, die natürlicherweise im Urin vorkommen, wurden ebenfalls getestet. Die repräsentativen Werte sind in Tabelle 3 unten gezeigt.

TABELLE 3
Testverbindung Zugegebene Konzentration (ug/mL) Gefundene Konzentration (ug/mL) % Kreuzreaktivität Fenfluramin Isomethepten Isoxsuprin Labetalol
TABELLE 3 (Fortsetzung)
Testverbindung Zugegebene Konzentration (ug/mL) Gefundene Konzentration (ug/mL) % Kreuzreaktivität Mephentermin Methoxyphenamin 5-Methoxytryptamin Nylidrin Phenethylamin Phenmetrazin Phentermin Propylhexedrin Tranylcypromin Trimethobenzamid Tyramin Tryptamin

Die Verbindungen, die in Tabelle 4 gezeigt sind, ergaben Ergebnisse, die geringer als die Assayempfindlichkeit (0,10 ug/ml) waren, wenn sie bis zu den gezeigten Konzentrationen hin getestet wurden.

TABELLE 4

Getestete Verbindung Getestete Konzentration

Acetaminophen

Acetanilid

Acetaphenazin

Acetazolamid

N-Acetyl-l-cystein

Acetylsalicylsäure

Allopurinol

Alpha-Methyl-L-Dopa

Alphaprodin

Alprazolam

Amantadin

Aninoglutethimid

Aminopyrin

Amitriptylin

cis-10-OH-Amitriptylin

trans-10-OH-Amitriptylin

Ammoniumchlorid

Amobarbital

Amoxapin

Amoxicilin

Ampicilin

Anileridin

Anilin

Apomorphin

Aprobarbital

Ascorbinsäure

Aspartam

Atenolol

Atropin

Barbital

Barbitursäure

Bemegrid

Benactyzin

Benzathin

Benzocain

Benzoesäure

Benzoylecgonin

Benztropin

Bromcriptinmesylat

Coffein

Calcium Hypochlorit

Carbamazepin

Carbamazepin-10-11-Epoxid

Carbamyl-3-methyl-Cholin-Chlorid

Carisoprodol

Carphenazin

Cephalexin

Cephaloridin

Cephradin

Chloramphenicol

Chlordiazepoxid

Chloroquin

Chlorothiazid

Chlorpheniramin

Chlorpromazin

Chlorpropamid

Chlorprothixen

Chlorthalidon

Cholesterol

Cimetidin

Clindamycin

Clomipramin

Clonidin

Cocain

Codein

Cloxacillin

1-Cortinin

Colchicin

Cortison

3-Cortol

Cyclizin

Cyclobenzaprin

Cyclophosphamid

Cyproheptadin

Deoxycorticosteron

Desipramin

Dextromethorphan

TABELLE 4 (Fortsetzung)

Getestete Verbindung Getestete Konzentration (ug/mL)

Brompheniramin

Butabarbital

Butalbital

Butethal (Butobarbital)

Digitoxin

Digoxin

Dihydrocodein

Dihydromorphin

Diphenhydramin

Diphenoxylat

Dipyridamol

Disopyramid

Disulfiram

L-Dopa

Dopamin

Dothiepin

Doxapram

Doxepin

Doxylamin

Ecgonin

EPPD Methordonmetabolit

Ephedrin

d,1-Epinephrin

Estinyl

Estriol

Estron

Estron-3-sulfat

Ethambutol

Ethamivan

Ethinamat

Ethosuximid

Ethylmorphin

Fentanyl

Fluphenazin

Furosemid

Gentinsäure

Glutethimid

Glycopyrrolat

Dicetylmorphin

Diazepam

Dibenzepin

Diflunisal 5-Hydroxyphenyl-5-phenylhydantoin

Hydroxyzin

Ibuprofen

Imidazol-4-Essigsäure

Imipramin

d,1-3-Indolmilchsäure

Iproniazid

Isoprotereol

Kanamycin

Ketamin

Ketoprofen

Levallorphan

Levorphanol

Levothyroxin

Lidocain

Lithium Carbonat

Loxapin

Maprotilin

Mazindol

Mebendazol

Mefenamsäure

MEGX

Melphalan

Meperidin

Mephenytoin

Meprobamat

Mescalin

d,1-Metanephrin

Metaproterenol

6-Mercaptopurin

Methadon

Methaqualon

Methocarbamol

Methotrimeprazin

TABELLE 4 (Fortsetzung)

Getestete Verbindung Getestete Konzentration (ug/mL)

Grifulvin

Guaiacolglyzerinether

Halsberidol

Hippursäure

Hycralazin

Hydrochlorethiazid

Hydrocodein

Hydroceden

Hydrocortison

Hydromorphen

5-Hydroxyindol-3-essigsäure

Nalarphin

Naloxen

Naltrexon

Nabroxen

Neomycinsulfat

Niacinamid

Nicotin

Nicotinsäure

Nifedipin

Nikethamid

p-Nitrophenol

Nomifensin

Norcodein

Nordarvon

Norepinephrin

Noresthisteron (Norethindron)

Noroxymorphon

Nortriptylin

cis-10-CH-Nortriptylin

trans-10-OH-Nortriptylin Noscapin

Octopamin

Opipramol

Orotc Acid

Orphenadrin

Oxazepam

3-Methoxytyramin

Methoxypromazin

Methsuximid

Methyprylon

Metroprolol

Mianserin

6-Monoacetylmorphin

morphin

Morphin-B-3-D-100 glucuronid

Nadolol

Phenacetin

Phenelzin

Phenformin

Pheniramin

Phenobarbital

Phenothiazin

Phenylaceton

d,1-Phenylalanin

Phenylbutazon

Phenylephrin

Phenylpropanolamin

Phenytoin

Picotoxin

Piperacetazin

Piroxicam

Kaliumchlorid

Kaliumjodid

Prazosin

Prednisolon

Prednison

Pregnenolon

Primidon

Probenecid

Procainamid

Procain

Prochlorperazin

Progesteron

TABELLE 4 (Fortsetzung)

Gestestete Verbindung Getestete Konzentration (ug/mL)

Oxycodon

Oxymetazolin

Oxymorphon

Oxyphenbutazon

Papaverin

Paramethason

Pargylin

Pemolin

Penicillin

Pentazocin

Pentobarbital

Perphenazin

Phencyclidin

Phendimetrazin

1-Phenylcyclohexylamin

4-OH-Piperidin - Phencyclidin

1-Piperidincyclohexan

Secobarbital

Serotonin

Strychnin

Sudoxicam

Sulfamethazin

Sulfathiazol

Sulfisoxazol

Sulindac

Talbutal

Terbutalin

Testosteron

Tetracyclin

Tetrahydrozolin-9-Tetrahydrocannabinol-9-carbonsäure

Thebain

Theophyllin

Thiamin

Thiopropazat

Thioridazin

Thiothixen

Promazin

Promethazin

Proplomazin

Propoxyphen

Propranolol

(+)Pseudoephedrin

(-)Pseudoephedrin

Protriptylin

Pyridoxin

Pyrilamin

Chinidin

Chinin

Rauwolfia serpentina Indian

Reserpin

Salbutamol

Salicylat

Scopolamin

Tolbutamid

Trazodom

Triamcinolon

Triamteren

Triethylperazin

Trifluoperazin

Triflupromazin

Trihexyphenidyl

Trimethadion

Trimethoprim

Trimepramin

Tripelennamin

Triprolidin

Tryptophan

Tyrosin

Harnsäure

Harnstoff

Verapamil

Warfarin

Zomepirac

Die Verschleppung wurde bestimmt, indem eine d- Amphetaminlösung in Normal-Humanurin bei 350 ug/ml gefolgt von einer Probe Wirkstoff-freiem Normal-Humanurin getestet wurde. Der Prozentsatz der Verschleppung = 100 · (der gemessenen Konzentration an Amphetamin, die in dem Wirkstoff-freien Urin gefunden wurde, geteilt durch die Konzentration der d- Amphetaminlösung). Der Prozentsatz an Verschleppung wurde als kleiner oder gleich 0,02% bestimmt.

Das Amphetamin/Methamphetaminassay in Übereinstimmung mit den analytischen Verfahren der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Vorbehandlung einer Urinprobe, die Amphetamin und/oder d-Methamphetamin enthält, oder im Verdacht steht diese zu enthalten, mit einer wirksamen Menge einer wäßrigen Perjodatlösung, die einen pH von ungefähr 4 bis 7,5 aufweist, das Ganze eine Zeit lang, die zum Ausschalten der unerwünschten Kreuzreaktivität ausreichend ist. Vorzugsweise wird die Probe mit 0,1 bis 0,25 molarer wäßriger Natriumperjodatlösung ungefähr 1 bis 9 Minuten lang behandelt, und zwar besonders bevorzugterweise 4 bis 5 Minuten lang bei einem Temperaturbereich von ungefähr 31 bis ungefähr 36ºC.

Die vorbehandelte Probe wird dann mit Tracer und Antikörperreagenzien, die für Amphetamin und d-Methamphetamin spezifisch sind, vermischt. Amphetamin oder -Methamphetamin und die Tracer konkurrieren um die beschränkten Antikörper- Bindungsstellen, was zur Bildung von Antikörper- Ligandenkomplexen führt. Durch Einhalten einer konstanten Tracer- und Antikörperkonzentration ist das Verhältnis von Antikörperkomplex zu Tracer-Antikörperkomplex, das sich bei der Inkubation ausgebildet hat, zu der Menge an Amphetamin und/oder d-Methamphetamin in der Probe direkt proportional. Daher kann man nach Anregen der Mischung mit planar polarisiertem Licht und dem Messen der Fluoreszenzpolarisation, die von einem Tracer und einem Tracer-Antikörperkomplex emittiert wird, quantitativ oder qualitativ die Menge an Amphetamin und/oder d-Methamphetamin in der Probe bestimmen.

Die Ergebnisse können als Netto- Millipolarisationseinheiten, als Bereichsbreite (in Millipolarisationseliheiten) und als relative Intensität dargestellt werden. Die Messung der Millipolarisationseinheiten zeigt das Maximum der Polarisation an, wenn eine maximale Menge des Tracers an den Antikörper in Abwesenheit von Amphetamin und d-Methamphetamin gebunden ist. Die Menge des Tracers, die an den Antikörper gebunden ist, ist zur Netto-Millipolarisation direkt proportional. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Netto-Millipolarisationswert über 190 ideal, aber ein Wert im Bereich von ungefähr 150 bis ungefähr 220 ist verträglich. Die Bereichsbreite ist eine Anzeige für den Unterschiedes zwischen der Netto-Millipolarisation bei maximaler und bei minimaler Menge an von an den Antikörper gebundenem Tracer. Eine größere Bereichsbreite liefert eine bessere quantitative Analyse der Werte. Für die Zwecke dieser Erfindung wird eine Bereichsbreite von wenigstens ungefähr 60 Millipolarisationseinheiten bevorzugt. Die Intensität ist ein Maß für die Amplitude des Fluoreszenzsignals, das höher als der Fluoreszenzhintergrund ist. Daher ergibt eine höhere Intensität eine genauere Messung. Die Intensität wird für die bevorzugten Tracer der Erfindung als die Summe der vertikal polarisierten Intensität plus zweimal der horizontal polarisierten Intensität bestimmt. Die Intensität kann von einem Signal von ungefähr 3mal dem Untergrundrauschen bis hin zu 30mal dem Untergrundrauschen reichen, in Abhängigkeit der Konzentration des Tracers und anderer Assayvariablen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine Intensität, die wenigstens 8 bis 20mal so groß wie das Hintergrundrauschen ist, bevorzugt.

Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse, die mit den Antikörpern, die als Antwort auf die Immunogene und Tracer-Verbindungen gezüchtet wurden, als Bereichsbreite und Millipolarisatonseinheiten erhalten wurden. Wie aus den Werten in Tabelle 5 ersichtlich, liefert ein Assay, das den Antikörper verwendet, der mit dem Immunogen nach Formel 4 produziert wurde, in Kombination mit dem Tracer nach Formel 1 ausgezeichnete Ergebnisse für ein Amphetaminassay. Für Assays auf d- Methamphetamin liefert eine Kombination der Antiseren, die von einem Immunogen nach Formel 3 abgeleitet sind, mit dem Tracer nach Formel 2 ausgezeichnete Ergebnisse.

Ein Aspekt des vorliegenden Assays, der einzigartig ist, ist die Kombination von Antiseren, die mit Immunogenen nach Formel 4 und Formel 3 hergestellt wurden mit Tracern nach Formel 1 und Formel 2 unter Erzeugung eines Assays mit einer Nettopolarisation von 213 mP und einer Bereichsbreite über 73 mP sowohl für Amphetamin als auch Methamphetamin.

TABELLE 5
Immunogen für der Antikörper Tracer Probenvolumen Nettopolarisation Bereichsbreite Formel

Der pH, bei dem das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, muß ausreichend sein, um der Fluoresceinfunktion der Tracer zu erlauben, in ihrer offenen Form vorzuliegen. Der pH kann von ungefähr 3 bis ungefähr 12 reichen, üblicherweise liegt er im Bereich von ungefähr 5 bis 10, und bevorzugterweise von ungefähr 6 bis 8. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den pH während des Assayvorgangs einzustellen und konstant zu halten. Beispielhafte Puffer umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. Der im besonderen verwendete Puffer ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, aber Phosphatpuffer wird bevorzugt. Der Kationenanteil des Puffers bestimmt allgemein den Kationenanteil des Tracersalzes in Lösung.

Das bevorzugte Verfahren des verbesserten Assays der vorliegenden Erfindung wird im Detail in Beispiel 5 diskutiert. Das Assay ist ein "homogenes Assay" was bedeutet, daß die Polarisationsablesung am Ende aus einer Lösung vorgenommen wird, in der der gebundene Tracer von dem ungebundenen Tracer nicht abgetrennt wird. Dies ist ein besonderer Vorteil gegenüber heterogenen Immunoassayverfahren bei denen der gebundene Tracer von dem ungebundenen Tracer abgetrennt werden muß.

Wie hier zuvor beschrieben, umfassen die Reagenzien für das Fluoreszenz-Polarisationsassay der vorliegenden Erfindung Antikörper, die gegen Amphetamin und d-Methamphetamin spezifisch sind, in einer Lösung, die Riboflavin-Bindungsprotein, Fluorescein-Traceranaloga von Amphetamin und d-Methamphetamin und eine Perjodat-Vorbehandlungslösung enthält. Zusätzlich werden herkömmliche Amphetamin/d-Methamphetamin-Assaylösungen einschließend einem Verdünnungspuffer, d-Amphetamin und d- Amphetamin-Eich- und -Blindwerte, vorzugsweise hergestellt.

Das bevorzugte Verfahren ist besonders zur Verwendung im Zusammenhang mit dem ABBOTT LABROATORIES TDx® Clinical Analyzer und dem ABBOTT LABORATORIES ADxTM Abused Drug System ausgelegt, die beide von Abbott Laboratories, Irving, Texas, erhältlich sind. Es ist anzuerkennen, daß sowohl wenn der ABBOTT LABROATORIES TDx® Clinical Analyzer oder der ABBOTT LABORATORIES ADxTM Abused Drug System verwendet werden, das Assay von der Vorbehandlung bis zur Endablesung völlig automatisiert ist. Jedoch kann auch ein manuelles Assay durchgeführt werden. Im Falle von automatisierten und manuellen Assays wird die Probe mit der Vorbehandlungslösung in Verdünnungspuffer vermischt und eine Untergrundablesung wird vorgenommen. Der Tracer wird dann mit dem Assay vermischt. Der Antikörper wird dann zuletzt mit der Testlösung vermischt. Nach der Inkubation wird eine Polarisationsablesung vorgenommen und verarbeitet. Im Falle sowohl des manuellen als auch des automatisierten Assays schließt das vorliegende Verfahren den Bedarf für die pH- Einstellung der Probe aus.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die vorliegende Erfindung und veranschaulichen sie eingehender. Sowohl eine Erklärung hinsichtlich verschiedener Gesichtspunkte der Erfindung als auch die diesbezügliche Vorgehensweise sind angegeben/beschrieben, wo dies geeignet erscheint.

BEISPIEL 1 Herstellung von Amphetamin-tracern 3-(2-Nitro-1-propen-1-yl)benzoesäure

Zu einer Lösung von 1,902 g (12,68 mmol) von 3- Carboxybenzaldehyd in 10 ml Eisessig wurden 2,848 ml (2,970 g, 38,04 mmol) Nitroethan und 1,080 g (13,98 mmol) Ammoniumacetat hinzugefügt. Die Lösung wurde unter Erhitzen, unter Rühren und unter Stickstoff auf einem 110ºC warmen Ölbad erwärmt. Dabei ging der gesamte Feststoff bei ungefähr 60ºC in Lösung und die Mischung nahm eine dunkelgelbe Farbe an. Nach 3 Stunden zeigte die Dünnschichtchromatographie mit 3 : 1 Hexan/EtOAc an, daß kein Ausgangsmaterial mehr verblieben war. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und dann zwischen Wasser und Methylenchlorid verteilt, wobei bis ungefähr pH 2 mit 6M HCl angesäuert wurde. Die organische Schicht wurde mit 6M HCl gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösungsmittel wurden dann am Rotationsverdampfer entfernt und es ergaben sich 2,768 g (98%) an Rohmaterial, das ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt wurde, aufgrund der Schwierigkeiten die bei der Chromatographie der stark polaren Carbonsäure auftreten.

3-(2-Nitro-1-propenyl)benzoesäuremethylester

Eine Lösung von 2,768 g 3-(2-Nitro-1-propenyl)benzoesäure in 30 ml Bortrifluoridmethanolkomplex wurde 2 Stunden lang bei Rühren unter Stickstoff zum Rückfluß erhitzt und dann über Nacht unter Rühren auf Raumtemperatur kommen lassen. Die präparative Dünnschichtchromatographie mit 3 : 1 Hexan/EtOAc zeigte an, daß kein Ausgangsmaterial mehr verblieben war. Die Mischung wurde zwischen Methylenchlorid und 5%ig Natriumbicarbonat verteilt. (Aufgrund des Schläumens war Vorsicht geboten.) Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und die Lösemittel wurden am Rotationsverdampfer entfernt, wobei sich 2,40 g des rohen Esters ergaben. Das Rohprodukt wurde an einer 40·2,5 cm Silikagelsäule nach dem Flash-Verfahren gereinigt, mit 4 : 1 Hexan/EtOAc eluiert und ergab 1,036 g (37%) der obengenannten Verbindung als blaßgelben kristallinen Feststoff.

3-(2-Aminopropyl)benzylalkohol

In einen im Trockenschrank getrockneten Kolben wurden unter Stickstoffatmosphäre 12,15 ml (12,15 mmol) 1,0M Boranlösung in THF eingetragen. Die Mischung wurde auf einem Eisbad gekühlt. Eine Lösung von 596 mg (2,7 mmol) 3-(2-Nitro-1- propenyl)benzoesäuremethylester in 10 ml trockenem THF wurde über eine Spritze zu der gerührten Lösung hinzugegeben. Festes Natriumborhydrid (51,3 mg, 1,35 mmol) wurde dann schnell zu der Mischung zugegeben. Die Mischung wurde zusätzliche 5 Minuten auf dem Eisbad gerührt, dann noch eine Viertelstunde bei Raumtemperatur. Die gelbe Farbe verblaßte zur Farblosigkeit nach ungefähr 5 Minuten bei Raumtemperatur. Die Lösung wurde dann unter leichtem Rückfluß unter Stickstoff über Nacht erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und durch die tropfenweise Zugabe von 500 ml Wasser gelöscht und erneut zu leichtem Rückfluß 2 Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde erneut auf Raumtemperatur abgekühlt und abfiltriert und der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinten Filtrate und Waschflüssigkeiten wurden dann mit KOH- Perlen bis zu pH 14 basisch gemacht. Methylenchlorid wurde zur Extraktion des Produktes verwendet, wobei der Extraktionsschritt 3mal (3·5 ml) wiederholt wurde. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und flüchtige Materialien wurden am Rotationsverdampfer entfernt. Das rohe Amin wog 273 mg (57%). Es wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt.

3-2(Trifluoracetamidopropyl)benzylalkohol

Zu einer Lösung von 254 mg (1,44 mmol) 3-(2- Aminopropyl)benzylalkohol in 4 ml MeOH wurden 254 ul (302 mg, 2,13 mmol) Ethyltrifluoracetat und 220 ul (1,567 mmol) Triethylamin (7,17M) hinzugegeben. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Dünnschichtchromatographie mit Chloroform/MeOH zeigte an, daß kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden war. Die Lösung wurde dann zwischen 6M HCl und EtOAc verteilt und die organische Phase wurde getrocknet (Natriumsulfat) und am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, was 321 mg (86%) des geschützten Aminoalkohols ergab.

3-(2-Trifluoracetamidopropyl)benzoesäure

Zu einer Lösung von 321 mg (1,23 mmol) 3-(2- Trifluoracetamidopropyl)benzylalkohol in 4 ml Aceton wurden 55 ul (1,48 mmol) von Jones Reagens (2,7M) hinzugegeben. Da die Dünnschichtchromatographie mit Hexan/EtOAc nach 45 Minuten anzeigte, daß noch intermediärer Aldehyd vorhanden war, wurden nochmals 55 ul des Jones Reagens hinzugegeben. Die Dünnschichtchromatographie nach 30 zusätzlichen Minuten zeigte einen einzigen Fleck. Es wurden drei Tropfen Isopropanol zu der Reaktionsmischung hinzugegeben, um überschüssiges Chrom (VI) zu verbrauchen und man rührte 30 Minuten weiter. Die Reaktionsmischung wurde dann mit einem gleichen Volumen an Methylenchlorid verdünnt und durch eine geringe Menge Silikagel filtriert. Die flüchtigen Substanzen wurden an einem Rotationsverdampfer entfernt, was 224 mg (66%) der Benzoesäure als blaßweißen Feststoff ergab.

6-[3-(2-Trifluoracetamidoprop-1-yl)benzamido]fluorescein Verfahren A: Verwendung von Oxalylchlorid

Dichlorethan (1 ml) wurde zu 37 mg (0,1345 mmol) von 3-(2- Trifluoracetamidoprop-1-yl)benzoesäure in einem 5-ml-Kolben hinzugegeben (ist nicht besonders gut löslich). 16,5 ul (0,188 mmol, 1,4 Äquivalente) Oxalylchlorid wurden hinzugegeben, gefolgt von 0,5 ul DMF. Der Kolben wurde mit einem Septum verschlossen und die Gasentwicklung wurde über einen Blasenzähler beobachtet, der über eine Spritzennadel angeschlossen war. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, wobei der Kolben ab und zu geschwenkt wurde, um den Feststoff von den Wänden herunterzuwaschen. Zwei kleine zusätzliche Mengen an Oxalylchlorid wurden hinzugegeben, als die Gasentwicklung aufhörte, bevor das gesamte Ausgangsmaterial sich gelöst hatte. Als alle Feststoffe sich endlich aufgelöst hatten, und nachdem die Gasentwicklung beendet war (ungefähr nach 2 bis 3 Stunden) wurde das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom verdampft und hinterließ einen Feststoff mit ungefähr der gleichen Farbe wie die Ausgangssäure. Fluoresceinamin-IsomerII (3 mg, 0,107 mmol, 0,8 Äquivalente) wurde hinzugegeben zusammen mit 1 ml trockenem Acetonitril, und die Mischung wurde gerührt und über Nacht mit einem Septum (14 Stunden) bei Raumtemperatur verschlossen. Die Überprüfung durch Dünnschichtchromatographie (Chloroform/MeOH) zeigte an, daß der Großteil des Fluoresceinamins verbraucht worden war. Die Mischung wurde mit ein wenig Methanol verdünnt, um alles in Lösung zu bringen und auf zwei 20·20 cm·1 mm Silicaplatten aufgebracht, welche zweimal mit Chloroform/MeOH entwickelt wurden. Die Eluierung der Hauptproduktbande erzeugte 41 mg eines roten Feststoffs nach sorgfältiger Entfernung des Lösungsmittels. Eine zweite Chromatographie auf vier 20·20 cm·0,5 mm Silikaplatten, die ebenfalls mit Chloroform/MeOH (1 : 1 : 1 Benzol/EtOAc/Aceton anstelle dessen auch verwendet werden, entwickelt wurde, ergab 35 mg die nur eine Spur von Material mit höherem Rf-Wert enthielt. Eine dritte Chromatographie an vier 20·20 cm·0,5 mm Platten, wie oben, ergab 28 mg an geschütztem Tracer, der, wie weiter unten beschrieben, entschützt wurde.

Verfahren B: Verwendung von Isobutylcarbonat-gemischtem Anhydrid

Eine Probe von 9,6 mg 3-(2-Trifluoracetamidoprop-1- yl)benzoesäure (0,035 mmol) wurde in 0,30 ml trockenem Acetonitril (Aldrich Gold Label) gelöst, auf einem Eiswasserbad gekühlt und mit 5,4 ul Triethylamin (0,0385 mmol, 1,1 Äquivalente) und 5,0 ul Isobutylchlorameisensäurester (0,0385 mmol, 1,1 Äquivalente) behandelt. Die Mischung wurde verschlossen, S Stunde auf dem Eisbad gerührt, und dann S Stunde bei Raumtemperatur. Das feste Fluoresceinamin-Isomer II (10,4 mg, 0,03 mmol, 0,86 Äquivalente) wurde hinzugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Kontrollen mittels Dünnschichtchromatographie zeigten nach 2 Stunden eine bessere Ausbeute an dem gewünschten Produkt als nach 23 an. Die Hydrolyse wurde mit 100 ul Methanol, 25 ul Wasser und 25 ul konzentriertem wäßrigen Ammoniak 2 und S Stunde lang durchgeführt und das Produkt wurde durch dreimalige Chromatographie an Silikagel zweimal mit 5 : 1 Chloroform/Methanol und einmal mit 1 : 1 : 1 Benzol/Ethylacetat/Aceton gereinigt.

Verfahren C1: Verwendung von BOP-Cl

Eine Lösung von 104 mg (0,38 mmol) von 3-(2- Trifluoracetamidoprop-1-yl)benzoesäure in 3,0 ml Acetonitril wurde mit 53 ul (0,38 mmol) Triethylamin (7,17M), 114 mg (0,33 mmol) an Fluoresceinamin-Isomer II und 97 mg (0,38 mmol) Bis(2-oxo-3- oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP-Cl) bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. (Das BOP-Cl wurde als letztes hinzugegeben.) Die präparative Dünnschichtchromatographie mit 1 : 1 : 1 Benzol/EtOAc/Aceton zeigte noch nicht abreagiertes Fluoresceinamin an; jedoch erschien die Zugabe von mehr BOP-Cl die Reaktion nicht zu beeinflussen. 1,0 ml MeOH, 250 ul Wasser und 250 ul Ammoniak wurden dann für die Hydrolyse der 0-acylierten Fluoresceinderivate zugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren wurden die flüchtigen Substanzen im Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde dann erneut in Methanol aufgelöst und das Lösemittel zweimal unter Stickstoff entfernt. Das Material wurde dann auf zwei 20·20 cm·2 mm Silicaplatten aufgebracht und zweimal mit 1:1:1 Benzol/EtOAc/Aceton entwickelt. (Für die Substanz wäre eine zusätzliche Chromatographie an dünneren Platten, z. B. 0,5- mm-Platten günstiger gewesen.)

Verfahren C2: Verwendung von BOP-Cl

eine 27, 5-mg-Probe von 3-(2-Trifluoracetamidoprop-1- yl)benzoesäure (0,1 mmol) wurde in 1,0 ml trockenem Acetonitril (Aldrich Gold Label) (nicht alles löst sich) aufgenommen und mit 6,9 ul Pyridin (0,085 mmol, 0,85 Äquivalente) und 25,5 mg BOP-Cl (0,1 mmol, 1,0 Äquivalente) unter Rühren bei Raumtemperatur 15 Minuten lang behandelt. Das Fluoresceinamin- Isomer II (29,5 mg, 0,085 mmol, 0,85 Äquivalente) wurde dann hin zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit fortgesetzt. Aufarbeitung und Chromatographie wurden unter entsprechender Maßstabsanpassung wie oben durchgeführt.

6-[3-(2-Aminopropyl)benzamido]fluorescein

Die gesamte Probe des geschützten Tracers aus dem Versuch, der bei Verfahren C1 beschrieben ist, wurde über Nacht durch Rühren in 1600 ul Methanol und 800 ul Kaliumcarbonat (1,0M wäßrig) entschützt. Nach 24 Stunden zeigte die Dünnschichtchromatographie, daß fast kein geschützter Tracer mehr übrig war. Die Reaktionsmischung wurde dann auf vier 20·20 cm·0,5 mm Silikagelplatten aufgebracht und zweimal mit 1 : 1 Chloroforn/MeOH+2% Ammoniak entwickelt. Die Platten waren irgendwie streifig, so daß das Chromatographieverfahren wiederholt werden mußte.

17,8 mg (0,343 mmol) des Tracers wurden durch Entfernen der Lösungsmittel erhalten. Das Material wurde in 4 ml MeOH erneut aufgelöst und mit 10 ul Triethylamin und 9,3 ml (0,0428 mmol) Ditert-butyldicarbonat (BOC) über Nacht bei Raumtemperatur abreagieren lassen. Die präparative Dünnschichtchromatographie zeigte, daß kein polares Material mehr verblieben war. Die Lösungsmittel wurden dann unter Stickstoff entfernt, und die Reaktionsmischung wurde in einem kleinen Volumen an Methanol wieder aufgelöst und auf zwei 20·20 cm·0,5 mm Silikagelplatten aufgebracht. Die Platten wurden zweimal mit 5 : 1 Chloroform/MeOH entwickelt. Die zweitgrößte Bande vom Anfang der Platten an wurde abgekratzt und mit Methanol eluiert. Die Substanz wurde zur Trockne aufkonzentriert und in 2,0 ml Trifluoressigsäure wieder aufgelöst. Die präparative Dünnschichtchromatographie in 5 : 1 Chloroform/MeOH nach 35 Minuten zeigte kein verbleibendes Ausgangsmaterial mehr an. Das Lösungsmittel/Reagens wurde unter Stickstoff entfernt und der Rückstand wurde in MeOH wieder aufgelöst und zweimal unter Stickstoff gespült, um das meiste der verbleibenden Trifluoressigsäure zu entfernen.

BEISPIEL 2 Darstellung des d-Methamphetamintracers (1R,2S)-1-Phenyl-1-hydroxy-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan

Zu einer Lösung von 13,55 g (82,00 mmol) von (1R,2S)-(-)- Ephedrin in 75 ml Methanol, die unter Stickstoff in einem Eiswasserbad gerührt wurde, wurden 12,23 ml (14,55 g, 102,5 mmol) Ethyltrifluoracetat und 11,71 ml (90,2 mmol) Triethylamin hinzugegeben. Die Lösung wurde auf einem Eisbad 2 Stunden lang gerührt und dann noch 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. Die präparative Dünnschichtchromatographie mit 5 : 1 Hexan/EtOAc zeigte an, daß kein Ausgangsmaterial mehr verblieben war. Die Reaktionsmischung wurde zwischen 6M HCl und Ethylacetat verteilt. Die organische Phase wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, wo sich 14,934 g (70%) des geschützten Ephedrins als farbloses Öl ergaben. Es war keine Reinigung der Verbindung notwendig.

(S)-1-Phenyl-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan

Eine Lösung von 13,28 g (50,1 mmol) von (1R,2S)-1-Phenyl-1- hydroxy-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan in 55 ml THF mit 7,33 ml (51,9 mmol) Trifluoressigsäureanhydrid wurde auf einer Hydriervorrichtung mit 1,4 g 10%igem Palladium auf Kohle geschüttelt. Nach 3 Tagen fiel der Druck auf 159 kPa (23 psi). Die Reaktionsmischung wurde dann durch Diatomeenerde filtriert und an einem Rotationsverdampfer eingeengt. Die präparative Dünnschichtchromatographie mit 3 : 1 Hexan/EtOAc zeigte an, daß einiges des Ausgangsmaterials noch vorhanden war. Die Reaktion wurde dann erneut in 55 ml THF gelöst und zusätzliche 24 Stunden mit zusätzlichen 7,33 ml Trifluoressigsäureanhydrid und 1,4 g 10%igem Palladium auf Kohle als Katalysator geschüttelt. Der Druck fiel auf 186 kPa (27 psi). Die Reaktionsmischung wurde erneut filtriert und an einem Rotationsverdampfer eingeengt. Die präparative Dünnschichtchromatographie und das ¹HNMR zeigten kein Ausgangsmaterial mehr an. Die Reaktion ergab 10,928 g (89%) der obengenannten Verbindung als farbloses Öl, welches ohne weitergehende Reinigung eingesetzt wurde.

(S)-1-(2-Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan. (S)-1-(3-Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan und (S)-1-(4-Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan

Zu einer Lösung von 2,297 g (9,38 mmol) (S)-1-Phenyl-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan in 8 ml Trifluoressigsäureanhydrid, die auf einem Eisbad gerührt wurde, wurden 615 ul (9,56 mmol) 70%ige salpetrige Säure (15,55M) über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugegeben. Die Reaktion wurde dann auf dem Eisbad 3 weitere Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit einem Stickstoffstrom bis zur Trockne ausgeblasen und der Rückstand wurde zwischen Methylenchlorid und 5%igem wäßrigen Natriumbicarbonat verteilt. (Aufgrund des Schäumens ist Vorsicht notwendig.) Die organische Phase wurde dann über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, was 1,39 g des Rohmaterials ergab, das nach dem Flash-Verfahren an einer Silikagelsäule unter Verwendung einer Mischung von Hexan/Ethylacetat als mobiler Phase gereinigt wurde. Das 2-Nitro- war das mobilste und das 4-Nitro- war das am wenigsten mobile der drei gebildeten Isomere. Die Chromatographie isolierte 260 mg von reinem (S)-1-(2- Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan und 512 mg von reinem (S)-1-(4-Nitrophenyl)-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan, wobei die meiste Substanz von der Säule in gemischten Fraktionen heruntergespült wurde. Die Vereinigung solcher mittlerer Fraktionen ergab 60 mg an unreinem (S)-1-(3-Nitrophenyl)-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan, das durch erneute Chromatographie auf Dünnschichtplatten mit Hexan/Ethylacetat weiter aufgereinigt wurde, was 34 mg an reinem Material ergab.

(S)-1-(4-Aminophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan

Eine Lösung von 107 mg (S)-1-(4-Nitrophenyl)-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan in 10 ml Ethanol wurde auf einer Hydriervorrichtung mit 11 mg 10%igem Palladium auf Kohle geschüttelt. Nach 1 Stunde war der Druck auf 41 kPa (6 psi) abgefallen und die Reaktionsmischung wurde entfernt und durch Diatomeenerde gefiltert. Die sich ergebende Lösung wurde dann zur Trockne aufkonzentriert und ergab 73 mg der obengenannten Verbindung als fast farbloses Öl.

(S)-6-[2-Trifluoracetyl(methyl)amido-1-propyl-(4- phenylaminocarbonyl)]fluorescein

Eine Lösung von 73 mg (0,280 mmol) von (S)-1-(4- Aminophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan in 2,0 ml trockenem Acetonitril wurde mit 84 mg (0,224 mmol) von 6- Carboxyfluorescein und 39 ul (0,280 mmol) Triethylamin und 107 mg (0,420 mmol) Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP-Cl) bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. (Das BOP-Cl wurde zum Schluß hinzugegeben. Die Reaktion war wahrscheinlich nach 16 bis 18 Stunden des Rührens abgeschlossen.) Die präparative Dünnschichtchromatographie mit 5 : 1 Chloroform/Methanol zeigte eine ungefähr 40%ige Umwandlung in geschützten Tracer an, und da keine Substanz mit höherem Rf-Wert beobachtet wurde, wurde keine Hydrolyse angezeigt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit einem gleichen Volumen Methanol verdünnt und auf zwei 20·20 cm·2 mm Silicagelplatten gestrichen, die viermal mit 5 : 1 Chloroform/Methanol entwickelt wurden. Die Haupttracerbande von jeder Platte wurde dann abgekratzt und mit Methanol eluiert und auf vier 20·20 cm·0,55 mm Silicagelplatten erneut chromatographiert, die zweimal mit 5 : 1 Chlorform/Methanol entwickelt wurden.

(S)-6-(2-Methylaminoprop-1-ylphen-4-ylaminocarbonyl)fluorescein

Die gesamte Probe an geschütztem Tracer aus dem vorhergegangenen Versuch wurde über Nacht durch Rühren in 2,0 ml Methanol mit 1,0 ml 1M wäßrigem Kaliumcarbonat geschützt. Nach 24 Stunden zeigte die analytische Dünnschichtchromatographie an, daß fast kein geschützter Tracer mehr verblieben war. Die Reaktionsmischung wurde auf vier 20·20 cm·0,5 mm Silicagelplatten aufgetragen, die zweimal mit 1 : 1 Chloroform/Methanol+2%ig Ammoniak entwickelt wurden. Die Elution mit Methanol ergab eine Lösung der obengenannten Verbindung.

(S)-1-(2-Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan (Ausgangsverbindung für die Beispielssynthese und (S)-1-(4- Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan (Ausgangsverbindung für die Synthese des Tracers nach der Erfindung)

Zu einer Lösung von 2,297 g (9,38 mmol) von (S)-1-Phenyl-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan in 8 ml Trifluoressigsäureanhydrid, die auf einem Eiswasserbad gerührt wurden, wurden 0,615 ml (9,56 mmol) 70%ige salpetrige Säure über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann zusätzliche 3 Stunden auf einem Eisbad gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter einem Stickstoffstrom getrocknet und der Rückstand wurde zwischen Methylenchlorid und 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat verteilt. Die organische Phase wurde dann über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne aufkonzentriert, was 1,39 g des Rohmaterials ergab, das nach dem Flash-Verfahren an einer Silikagelsäule unter Verwendung von Hexan/EtOAc als Elutionsmittel gereinigt wurde. Das 2-Nitro- war das am meisten mobile, und das 4-Nitrowar das am wenigsten mobile der drei Isomere, die sich gebildet hatten. Die Chromatographie isolierte 260 mg an reinem (S)-1-(2- Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan und 512 mg an reinem (S)-1-(4-Nitrophenyl)-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan, wobei viel Substanz in gemischten Fraktionen von der Säule heruntergewaschen wurde.

(S)-1-(2-Aminophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan (beispielhafte Synthese)

(S)-1-(2-Nitrophenyl)-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan (247 mg) wurde in 10 ml Ethanol gelöst und über 25 mg 10%igem Palladium auf Tierkohle in einem Parr-Schüttler hydriert. Nach 1 bis 1S Stunden blieben nach Filtration und Entfernen des Lösungsmittels 220 mg eines farblosen Glases zurück.

(S)-5-[2-(2-Trifluoracetyl(methyl)amido-1-propyl)phenylaminocarbonyl]fluorescein und (S)-6-[2-(2- Trifluoracetyl(methyl)amido-1-propyl)phenylaminocarbonyl]fluorescein (beispielhafte Synthese)

Eine Lösung von 10,0 mg Carboxyfluorescein (Kodak, Gemisch aus 5- und 6-Isomeren) in 0,13 ml Dimethylformamid wurde auf einem Eiswasserbad gekühlt und mit 12 mg Isobutylchlorameisensäureester und 0, 0122 ml Triethylamin behandelt. Die Lösung wurde 1 bis 3/4 Stunden lang gerührt, wobei sie sich langsam auf Raumtemperatur erwärmte. (S)-1-(2- Aminophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan (7,6 mg) wurde als Lösung in zusätzlichen 0,13 ml Dimethylformamid hinzugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 17 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde mit 0,13 ml Methanol und 0,03 ml Wasser verdünnt und mit 0,03 ml konzentriertem wäßrigem Ammoniak unter Rühren bei Raumtemperatur 2 Stunden lang hydrolisiert. Die flüchtigen Substanzen wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt, und die Produkte wurden durch Chromatographie an einer Dünnschichtsilicagelplatte isoliert, die mit Chloroform/Methanol entwickelt wurde.

(S)-5-[2-(2-Methylamino-1-propyl)phenylaminocarbonyl]fluorescein (nicht der Tracer der Erfindung)

Eine Hälfte der Probe von (S)-5-[2-(2- Trifluoracetyl(methyl)amido-1- propyl)phenylaminocarbonyl]fluorescein wurde durch Auflösen in 0,4 ml Methanol und Behandlung mit 0,2 ml 1M wäßrigem Kaliumcarbonat bei 16-stündigem Rühren bei Raumtemperatur hydrolisiert. Die Chromatographie auf einer Dünnschichtsilikagelplatte, die mit Chloroform/Methanol/Ammoniak entwickelt wurde, ergab das reine Produkt.

(S)-6-[2-(2-Methylamino-1-propyl)phenylaminocarbonyl]fluorescein (nicht der Tracer der Erfindung)

Diese Verbindung wurde aus (S)-6-[2-(2- Trifluoracetyl(methyl)amido-1- propyl)phenylaminocarbonyl]fluorescein genau wie in dem unmittelbar zuvor beschriebenen Beispiel bereitet.

(S)-6-[4-(2-Methylamino-1-propyl)phenylaminocarbonyl]fluorescein (der Tracer der Erfindung)

Diese Verbindung wurde in zwei Schritten aus 10 mg (S)-1- (4-Nitrophenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan auf die oben beschriebene Art und Weise dargestellt.

BEISPIEL 3 Darstellung der Amphetamin-Immunogene 1-(3-Nitrophenyl)-2-nitropropen

Eine Mischung von 7,56 g (50 mmol) 3-Nitrobenzaldehyd, 11,25 g (150 mmol) Nitroethan und 4,24 g (55 mmol) Ammoniumacetat wurde in 2 ml Essigsäure in einem 110ºC warmen Ölbad 2S Stunden lang erhitzt. Die nachfolgende Analyse der Mischung durch präparative Dünnschichtchromatographie mit Hexan/Ethylacetat zeigte, daß fast kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden war. Die flüchtigen Substanzen wurden am Rotationsverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan und Wasser verteilt, wobei die organische Phase zweimal mit 10%igem Natriumbicarbonat gewaschen wurde. Es war Vorsicht notwendig, da während der ersten Bicarbonatwäsche Gasentwicklung einsetzte. Die Trocknung wurde mit Magnesiumsulfat durchgeführt. Nach Filtration und Entfernen des Lösemittels blieben 9,13 g Rohprodukt zurück. Die Hälfte davon wurde an einer 3·35 cm Flash- Silicagelsäule, die mit Hexan gepackt worden war und mit 7 : 1 Hexan/Ethylacetat eluiert wurde, chromatographiert, was 1,66 g (32%) der reinen obigen Verbindung ergab.

(R,S)-3-(2-Trifluoracetamidoprop-1-yl)nitrobenzol

24 ml von 1,0M Boran-THF-Lösung (14 mmol) wurden in einen trockenen 100-ml-Kolben überführt, der auf einem Eiswasserbad unter Stickstoffatmosphäre gekühlt wurde. Eine Lösung von 1,66 g 1-(3-Nitrophenyl)-2-nitropropen in 22 ml trockenem THF wurde hinzugegeben, gefolgt von 151 mg (4 mmol) festem Natriumborhydrid. Es trat eine heftige Gasentwicklung ein, und die gelbe Farbe der Lösung verschwand innerhalb von 5 Minuten. Das Eisbad wurde entfernt, und der Kolben wurde 15 Minuten lang auf Raumtemperatur kommenlassen. Er wurde dann 8 Stunden lang in einem 70ºC heißem Ölbad erhitzt. (Mehr als 8 Stunden Erhitzen auf einem 70ºC warmen Ölbad sind für die maximale Ausbeute notwendig.) Die Reaktion wurde durch sorgfältige tropfenweise Zugabe von 1,4 ml Wasser gelöscht. Dann wurde die Mischung unter Rühren eine zusätzliche Stunde in dem 70ºC warmen Ölbad erhitzt. Die Lösungsmittel wurden aus der Mischung mit einem Rotationsverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde zwischen 0,5M wäßrigem Natriumhydroxid und Dichlormethan verteilt. Die Mischung wurde dann mit Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Entfernen des Lösungsmittels ergaben 1,48 g rohen (R,S)-3-(2- Aminopropyl)nitrobenzols, das vor der Reinigung wie folgt geschützt wurde.

Die gesamte Probe des rohen (R,S)-3-(2- Aminopropyl)nitrobenzols wurde in 15 ml Methanol aufgelöst, mit 1,39 ml (10 mmol) Triethylamin und 1,28 g (1,01 ml, 10 mmol, 1,25 Äquivalente) Methyltrifluoracetat behandelt und bei Raumtemperatur 2S Tage (länger als notwendig) behandelt. Entfernen des Lösungsmittels und der überschüssigen Reagenzien ergab 2,74 g Rückstand, der an einer Flash-Silicasäule chromatographiert wurde, die mit Hexan gepackt worden war und mit Hexan/Etyhlacetat eluiert wurde. Die Ausbeute an reinem (R,S)-3-(2-Trifluoracetamidoprop-1-yl)nitrobenzol betrug 1,022 g (47%). Es hatte einen Schmelzpunkt von 141 bis 142ºC, nach Umkristallisation aus Hexan-Ethylacetat. Das NMR-Spektrum bei 200 MHz in einer Mischung aus Deuterochloroform und Deuteromethanol zeigt Signale bei 1,3 ppm (Dublett, 3H), 2,95 ppm (komplexes Multiplett, 2H), 4,3 ppm (komplexes Multiplett, 1H), 7,6 ppm (Multiplett, 2H) und 8,1 ppm (Multiplett, 2H).

(R,S)-3-(2-Trifluoracetamidoprop-1-yl)aminobenzol

Eine Lösung von 152 mg 3-(2-Trifluoracetamidoprop-1- yl)nitrobenzol in 10 ml Ethylacetat wurde auf einem Parr- Schüttler bei Raumtemperatur mit 20 mg Palladium auf Tierkohle 10%ig und einem anfänglichem Überdruck von 240 kPa (35 psi) geschüttelt. Es trat ein Druckabfall von 34 kPa (5 psi) innerhalb von 30 Minuten ein, und die Reaktionsmischung wurde nach 1 Stunde und 15 Minuten aus dem Schüttler entfernt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch einen Bausch Diatomeenerde entfernt, und das Lösungsmittel wurde entfernt, was eine quantitative Ausbeute an obengenannter Verbindung in Form eines klaren farblosen Öls hinterließ. Es wieß die folgenden NMR-Signale bei 200 MHz in Deuterochloroform auf: 1,2 ppm (Dublett, 3H), 2,8 ppm (komplexes Multiplett, 2H), 4,2 ppm (komplexes Multiplett, 1H), 6,2 ppm (breites Singulett, 1H), 6,6 ppm (mehrere Multipletts, 3H) und 7,1 ppm (anscheinend Triplett, 1H).

d,l-AMPHETAMIN-IMMUNOGEN

(R,S)-3-(2-Trifluoracetamidoprop-1-yl)aminobenzol (48 mg, 0,195 mmol) wurde in 3 ml Wasser und 2 ml Aceton bei 0ºC durch Behandlung mit 14,8 mg (0,214 mmol) Natriumnitrit und 0,158 ml 3M wäßriger HCl diazotiert. Nach 15-minütigem Rühren wurde diese Mischung zu einer gut gerührten Lösung von 200 mg Rinderthyroglobulin in 12 ml 2M Natriumhydroxid hinzugegeben und ebenfalls auf einem Eisbad gekühlt. Die Schutzgruppe wurde unter fortwährendem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre entfernt. Die Lösung wurde dann gegen 0,1M Natriumchlorid bei 2 bis 8ºC dialysiert.

BEISPIEL 4 Darstellung von Methamphetamin-Immunogenen (S)-1-(4-Chlorsulfonylphenyl(-2- [trifluoracetyl(methyl)amido]propan

Saubere Chlorsulfonsäure (1,5 ml) wurde zu 164 mg (S)-1- Phenyl-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan in einem kleinen Kolben hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt und wurde dann in einem 40ºC warmen Bad 1,5 Stunden lang erhitzt. Sie wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 40 ml Dichlormethan verdünnt und in eine Mischung von Eis und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung in einem Scheidetrichter gegossen. Die organisches Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch ein kleines Silicagelbett filtriert. Das Entfernen des Lösemittels hinterließ 175 mg eines fast farblosen Glases, welches NMR- Resonanzpeaks in Deuterochloroform bei 1,3 ppm (zwei Dubletts) für die terminale Methylgruppe, und bei 2,0 ppm (zwei Singuletts und ein Multiplett) für das N-Methyl und das benzylische Methylen, und bei 4,3 und 4,9 ppm (ein kleineres und ein größeres Multiplett) für das Methin und bei 7,45 ppm (zwei Dubletts) und bei 7,95 ppm (zwei Dubletts) für den para-disubstituierten Aromaten zeigte.

d-Methamphetaminsufonamid-Immunogen

Rinderthyroglobulin (390 mg) wurde in 19,5 ml 0,1M Dinatriumphosphat gelöst und es wurden 3,9 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Eine Lösung von 39 mg (S)-1-(4- Chlorsulfonylphenyl)-2-[trifluoracetyl(methyl)amido]propan in 3,9 ml Dimethylformamid wurde dann eingerührt, wobei das Rühren bei Raumtemperatur über Nacht fortgesetzt wurde. Der pH der Lösung wurde mit 10M Natriumhydroxid auf 13 eingestellt und die Reaktion wurde weitere 16 Stunden lang gerührt, um die Trifluoracetyl-Schutzgruppe zu hydrolisieren. Die Substanz wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert.

BEISPIEL 5 Amphetamin/Methamphetaminassay A. Reagenzien

(1) Vorbehandlungslösung -Eine Lösung, die ungefähr 0,20 Natriumperjodat (pH 4,5) enthält.

(2) Tracer: Bestehend aus dem Tracer, der in Beispiel 3 (Formel 1) dargestellt worden ist, und dem Tracer, der in Beispiel 4 dargestellt worden ist (Formel 2). Jede Verbindung liegt in 0,1M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,5 vor, der 0,01 Gewicht/Volumen-% an Rinder-gamma-Globulin und 0,1 Gewicht/Volumen-% Natriumazid enthält.

(3) Antikörper: Kaninchen- oder Schafantiserum, das aus Antiserum besteht, das gegen Amphetamin und d- Methamphetamin gezüchtet wurde, und das geeignet in 0,1M Natriumphosphatpuffer, 0,1%ig Natriumazid, 2%ig Propylenglycol und 1 5 mg/ml Riboflavin-Bindungsprotein verdünnt ist.

(4) Verdünnungspuffer: 0,1M Natriumphosphat, pH 7,5, 0,01%ig Rinder-gamma-Globulin und 0,1%ig Natriumazid.

(5) Eichlösungen: Vereinigte Normal-Human-Urinproben, die mit 0,1% Natriumazid konserviert sind und folgende d- Amphetaminniveaus aufweisen: 0,00; 0,15; 0,30; 1,0; 3,0 und 8,0 ug/ml.

(6) Blindlösungen: Vereinigte Normal-Human- Urinproben, die mit 0,1% Natriumazid konserviert sind und 0,5; 1,50 oder 4,0 ug/ml d-Amphetamin enthalten.

(7) Waschlösung: Eine Lösung, die ungefähr 5%ig Propylenglykol in 0,45%igem NaCl enthält.

Alle Fluoreszenzpolarisationsmessungen wurden unter Verwendung des ABBOTT LABORATORIES TDx® Clinical Analyzers durchgeführt.

B. ASSAYVORSCHRIFT

(1) Gleiche Anteile einer unbekannten Probe und der Vorbehandlungslösung werden in eine Vorverdünnungsvertiefung pipettiert. Ein ausreichendes Volumen an Verdünndungspuffer wird hinzugefügt, um das Volumen auf ungefähr 500 ul anzuheben. Diese Mischung wird 4 bis 6 Minuten lang inkubiert.

(2) Eine Probe aus der Vorverdünnungsvertiefung und 25 ul Antikörper werden in die Küvette pipettiert. Eine Untergrundintensitätsablesung wird durchgeführt.

(3) Je 25 ul an Tracer und Antikörper und eine Probe aus der Vorverdünnungsvertiefung werden zu der Küvette hinzugegeben. Ausreichend Verdünnungspuffer wird hinzugegeben, um das Endvolumen auf 2,0 ml anzuheben.

(4) Die Fluoreszenzpolarisation, die von der Tracer- Bindung an den Antikörper hervorgerufen wird, wird durch abziehen der Fluoreszenzpolarisationsintensität des Hintergrundes von den End-Fluoreszenzpolarisationsintensitäten der Mischung erhalten.

(5) Die Polarisationswerte, die erhalten werden, sind zu der Amphetamin- und/oder Methamphetaminkonzentration einer jeden Probe umgekehrt proportional.

(6) Der Polarisationswert für eine Probe wird mit einer Standardkurve verglichen, die unter Verwendung der Eichlösung bekannten Amphetamin- oder d- Methamphetamingehaltes erhalten wurde.

BEISPIEL 6 NATRIUMPERJODAT-VORBEHANDLUNGSLÖSUNG

Proben, die 100 und 1000 ug/ml Phenylpropanolamin enthielten, wurden mit dem ABBOTT LABORATORIES TDx® Clinical Analyzer mit und ohne Vorinkubationsbehandlung, wie in Beispiel 5B oben beschrieben, einem Assay unterzogen. Das Assay verwendete die kombinierten Amphetamin/d-Methamphetamin-Tracer nach Formeln 1 und 2 und die Antikörper, die mittels den Immunogenen nach den Formeln 3 und 4 hergestellt worden waren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 unten gezeigt.

TABELLE 6

ug/ml Phenylpropanolamin Antwort äquivalent zu

100 ohne Vorbehandlung 1,39 ug/ml Amphetamin

1000 mit Vorbehandlung < 0,1 ug/ml Amphetamin

Die oben gezeigten Ergebnisse legen dar, daß die Natriumperjodatbehandlung von Proben ohne die Zugabe von Bestandteilen, die den pH erhöhen, wie einer Base, zur Ausschaltung von β-Hydroxyphenethylamin-Kreuzreaktivität wirksam ist und für einen solchen Zweck bei Amphetamin/Methamphetamin- Fluoreszenz-Polarisationsassays auch nützlich.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder zum Nachweis der Menge von Amphetamin und/oder d-Methamphetamin in einer Testprobe biologischer Flüssigkeit mittels Fluoreszenzpolarisationsassay, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Vorbehandeln der Probe mit einer wirksamen Menge an wäßriger Perjodatlösung, die einen pH von 4,0 bis 7,5 aufweist, für einen Zeitraum, der zur Ausschaltung von zu Amphetamin und d-Metamphetamin kreuzreaktivem beta-Hydroxyphenethylamin ausreichend ist;

(b) Vermischen der Probe mit:

(1) einem Salz eines ersten Tracers mit der Struktur:

(2) einem Salz eines zweiten Tracers mit der Struktur:

(3) einem Antikörper, der gegen ein Immunogen der Struktur

Rinderthyroglobulin

gezüchtet wurde, und der zur spezifischen Erkennung und Bindung von Amphetamin oder des ersten Tracers fähig ist; und

(4) einem Antikörper, der gegen ein Immunogen der Struktur

Rinderthyroglobulin

gezüchtet wurde, und der zur spezifischen Erkennung und Bindung von d-Methamphetamin oder des zweiten Tracers fähig ist; und

(c) Bestimmen der Menge an Tracern mittels Fluoreszenzpolarisationsverfahren, die als Maß für die Menge an Amphetamin und d-Methamphetamin in der Probe an Antikörper gebunden ist, wodurch das Verfahren eine erhöhte Spezifität für Amphetamin und d-Methamphetamin und eine verminderte Kreuzreaktivität aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Menge von Riboflavin-Bindungsprotein der Probe zugegeben wird, die zur Verminderung der Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin wirksam ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Amphetamin und/oder d-Methamphetamin in Testproben biologischer Flüssigkeit mittels Fluoreszenzpolarisationsassay unter Verwendung einer automatischen Assayvorrichtung mit einer Proben- und Reagenzausgabevorrichtung, wobei das Verfahren eine erhöhte Spezifität für Amphetamin und d-Methamphetamin und eine verminderte Kreuzreaktivität aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Vorbehandeln der Probe mit einer wirksamen Menge an wäßriger Perjodatlösung, die einen pH von 4,0 bis 7,5 aufweist, für einen Zeitraum, der zur Ausschaltung von zu Amphetamin und d-Metamphetamin kreuzreaktivem beta-Hydroxyphenethylamin ausreichend ist;

(b) Vermischen der so erhaltenen Probe mit:

(1) einem Salz eines ersten Tracers mit der Struktur:

(2) einem Salz eines zweiten Tracers mit der Struktur:

(3) einem Antikörper, der gegen ein Immunogen der Struktur

Rinderthyroglobulin

gezüchtet wurde, und der zur spezifischen Erkennung und Bindung von Amphetamin oder des ersten Tracers fähig ist; und

(4) einem Antikörper, der gegen ein Immunogen der Struktur

Rinderthyroglobulin

gezüchtet wurde, und der zur spezifischen Erkennung und Bindung von d-Methamphetamin oder des zweiten Tracers fähig ist; und

(c) Bestimmen der Menge an Tracern mittels Fluoreszenzpolarisationsverfahren, die als Maß für die Menge an Amphetamin und d-Methamphetamin in der Probe an Antikörper gebunden ist, und

(d) Waschen der Ausgabevorrichtung in einer Lösung von 5% Propylenglykol in 0, 45%iger NaCl-Lösung, um das Anhaften von Probe an der Ausgabevorrichtung auf ein Minimum zu beschränken.

4. Reagenzkit, das zur Bestimmung von Amphetamin und d- Methamphetamin in biologischen Proben nützlich ist, das folgendes umfaßt:

(a) ein Salz eines ersten Tracers der Struktur:

(b) ein Salz eines zweiten Tracers der Struktur:

(c) einen Antikörper, der gegen ein Immunogen der Struktur:

Rinderthyroglobulin

gezüchtet wurde, und der zur spezifischen Erkennung und Bindung von Amphetamin oder des ersten Tracers fähig ist; und

(d) einen Antikörper, der gegen ein Immunogen der Struktur:

Rinderthyroglobulin

gezüchtet wurde, und der zur spezifischen Erkennung und Bindung von d-Methamphetamin oder des zweiten Tracers fähig ist.

5. Tracerreagenz zur Verwendung in den Ansprüchen 1, 3 und 4, das eine Verbindung der Struktur

umfaßt.

6. Immunogen zur Züchtung von Antikörpern in Säugern zur Verwendung in den Ansprüchen 1, 3 und 4, wobei das Imunogen eine Verbindung mit der Struktur:

Rinderthyroglobulin

oder

Rinderthyroglobulin

umfaßt.







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