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Dokumentenidentifikation DE69111440T2 28.03.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0527760
Titel METHODEN UND ZUSAMMENSETZUNGEN ZUR IMPFUNG GEGEN HIV.
Anmelder Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., US
Erfinder BERMAN, Phillip, W., Portola Valley, CA 94028, US;
FENDLY, Brian, M., El Granada, CA 94018, US;
GREGORY, Timothy, J., Hillsborough, CA 94010, US;
WURM, Florian, M., Redwood City, CA 94061, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69111440
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 01.04.1991
EP-Aktenzeichen 919070771
WO-Anmeldetag 01.04.1991
PCT-Aktenzeichen US9102250
WO-Veröffentlichungsnummer 9115238
WO-Veröffentlichungsdatum 17.10.1991
EP-Offenlegungsdatum 24.02.1993
EP date of grant 19.07.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.03.1996
IPC-Hauptklasse A61K 39/21

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung der menschlichen Immunschwächevirus-(HIV-)Hüll-(env-)Polypeptide, die eine innere Spaltstruktur besitzen, die hierin als die "Spaltstelle" bezeichnet wird, die aber nicht an dieser Stelle gespalten sind. Die obige Verwendung betrifft die Impfung und Behandlung von HIV- infizierten Patienten.

Hintergrund der Erfindung

Die erworbene Immunschwächekrankheit AIDS wird durch ein als das menschliche Immunschwäche-Virus (HIV) identifizierte Retrovirus verursacht. Es wurden einige immunologische Abnormalitäten in Zusammenhang mit AIDS beschrieben, z.B. Abnormalitäten der B-Zellen-Funktion, eine abnormale Antikörperreaktion, mangelhafte Monozytenzellfunktion, eingeschränkte Cytokinproduktion, gehemmte Funktion natürlicher Killerzellen und zytotoxischer Zellen und eine mangelhafte Fähigkeit von Lmyphozyten, lösliche Antigene zu erkennen und darauf zu reagieren. Übere andere immunologische Abnormalitäten in Zusammenhang mit AIDS wurde ebenfalls berichetet. Zu den bedeutsameren immunologischen Mängeln bei Patienten mit AIDS zählt die Dezimierung der T4-Helfer/Inducer-Lymphozytenpopulation.

Trotz der bei AIDS beobachteten, ausgeprägten Immunschwäche herrscht bezüglich des oder der für die Immunschwäche verantwortlichen Mechanismus bzw. -en noch immer Unklarheit. Es gibt mehrere Theorien. Eine besagt, daß Mängel in der Immunreaktionsfähigkeit das Ergebnis der selektiven Infektion von Helfer-T-Zellen durch HIV sind, was zu einer Beeinträchtigung der Helfer-T-Zellen-Funktion und schließlich zur Dezimierung der Zellen führt, die für eine normale Immunreaktion erforderlich sind. In vitro- und in vivo-Untersuchungen zeigten, daß HIV auch Monozyten infizieren kann, die bekanntermaßen eine wesentliche Rolle als Hilfszellen bei der Immunreaktion spielen. HIV kann auch zur Immunschwäche führen, indem die normale Cytokinproduktion in einer infizierten Zelle gehemmt wird, wobei das Ergebnis die sekundäre Immunschwäche ist, z.B. IL-1- und IL-2-Mangel. Ein zusätzliches Mittel HIV- induzierter Immunschwäche besteht in der Produktion von Faktoren, die die Immunreaktion unterdrücken können. Keines dieser Modelle beantwortet die Frage, ob eine HIV-Komponente an sich und nicht eine Infektion durch ein replikatives Virus für die mit AIDS in Zusammenhang stehenden, immunologischen Abnormalitäten verantwortlich ist.

Das HIV-env-Protein wurde ausführlich beschrieben, und die Aminosäure- und RNA- Sequenzen, die für HIV-env kodieren, sind bei zahlreichen HIV-Stämmen bekannt (Modrow, S. et al., J. Virology 61(2): 570 (1987). Das HIV-Virion ist durch eine Membran oder Hülle bedeckt, die aus der Außenmembran von Wirtszellen stammt. Die Membran enthält eine Population von Hüll-Glykoproteinen (gp160), die mit ihrem carboxyl-terminalen Bereich in der Membran-Doppelschicht verankert sind. Jedes Glykoprotein enthält zwei Segmente. Das N-terminale Segment, das man aufgrund seines relativen Molekulargewichts von etwa 120 kd als gp120 bezeichnet, ragt in die das Virion umgebende wäßrige Umgebung hinein. Das als gp41 bezeichnete, C- terminale Segment überspannt die Membran. gp120 und gp41 sind durch eine Peptidbindung kovalent verbunden, die für proteolytische Spaltung besonders anfällig ist; siehe McCune et al., EP-A-0.335.635, Priorität 28. 3. 1988 und die dain angeführten Verweise.

Es wurden verschiedene Ansätze zur Entwicklung eines AIDS-Impfstoffes vorgeschlagen, darunter inaktivierte und virulenzverminderte Virenimpfstoffe, Subeinheit-Impfstoffe aus virusinfizierten Zellen, rekombinant produzierte virale Antigene, Impfstoffe auf der Grundlage synthetischer Peptide, anti-idiotypische Impfstoffe und Impfstoffe auf der Grundlage viraler Träger, doch keine bislang veröffentlichte Impfungsuntersuchung bot einen Schutz gegen Viren-Exposition. Mehrere Zusammenfassungen der HIV-Impfstoff- Entwicklung wurden veröffentlicht, z.B. Lasky, Critical Reviews in Immunology 9(3): 153-172 (1989), Newmark, Nature 333: 699 (23. Juni 1988), und Fauci et al., Annals of Internal Medicine 110(5): 41-50(1. März 1989).

Die Verwendung des gesamten (getöteten oder virulenzverminderten) Virus wirft mehrere Probleme auf, darunter die Sicherheit des den Impfstoff herstellenden Personals, das Risiko einer unvollständigen Inaktivierung des Virus für die Geimpften oder die Umwandlung eines virulenzverminderten Virus zu einer aktiven, virulenten Form. Sowohl Peptid- als auch Subeinheit-Impfstoffe könnten möglicherweise nur mit Schwierigkeiten ihre nativen Konformationen erzielen und nur humorale Reaktionen und vielleicht keine zell-vermittelte Immunität hervorrufen. Eine weitere große Schwierigkeit bei der Entwicklung eines AIDS-Wirkstoffs liegt in der unter den HIV- Stämmen herrschenden Variabilität, die aber auch im gleichen Stamm im Verlauf der Zeit festzustellen ist.

Von den durch das HIV-Genom kodierten Proteinen befinden sich die für die Impfstoffentwicklung am häufigsten verwendeten Moleküle auf der Oberfläche des Virus. Sie vermitteln die Anlagerung und die Ausbreitung des Virus durch Zellfusion (Synzytien-Bildung) und sind die viralen Proteine, die für Immunangriffe am zugänglichsten sind. Derzeit gilt gp120 als bester Kandidat für einen Subeinheit- Impfstoff, da: (i) gp120 bekanntermaßen die CD4-Bindungsdomäne besitzt, durch die sich HIV an seine Zielzellen anlagert, (ii) die HIV-Infektiosität in vitro durch Antikörper gegen gp120 neutralisiert werden kann, (iii) der Großteil der in vitro- Neutralisierungsaktivität, die im Serum von HIV-infizierten Menschen vorhanden ist, mit einer gp120-Affinitätssäule entfernt werden kann, und (iv) der gp120/gp41-Komplex für die Übertragung von HIV durch Zellfusion wesentlich zu sein scheint.

Die Impfung von Tieren verschiedener Spezies mit rekombinanten Vektoren, die HIV- env exprimieren, ist in der Literatur beschrieben. Diese Impfversuche riefen stammspezifische, humorale Immunreaktionen, sowie zellvermittelten Response hervor (siehe z.B. Van Eendenburg et al., AIDS Research an Human Retroviruses 5(1): 41-50 (1989); Hu et al., Nature 320: 537-540 (1986), Chakrabarti et al., Nature 320: 535-537 (1986); Zarling et al., Nature 323: 344-346 (1986); Hu et al., Nature 328: 721-724 (1987); Zagury et al., Nature 326: 249-250 (1987); Zagury et al., Nature 322: 728-731 (1988).

Schimpansen sind die einzigen nichtmenschlichen Primaten, die mit HIV infizierbar sind, weshalb sie das dem Menschen am nächsten kommende Modellsystem für Impfstoff-Expositions-Untersuchungen darstellen. Trotz des vielversprechenden Ansatzes der oben erwähnten Immunreaktionen konnten die veröffentlichten Impfstoff- Untersuchungen in keinem einzigen Fall Schimpansen vor einer HIV-Infektion schützen (siehe z.B. Hu et al., Nature 328: 721-724 (1987); (rekombinanter Vaccina-Virus-HIV- env-Impfstoff); Arthur et. al., J. Virol. 63 (12): 5046-5053 (1989); (gereinigtes gp120); Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200-5204 (1988) (rekombinantes Hüll- Glykoprotein gp120); und Prince et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6944-6948 (1988) (gereinigtes menschliches HIV-Immunglobulin).

Das Affen-Immunschwächevirus (SIV) ist ein Lentivirus, das von Natur aus in gesunden afrikanischen Affen vorkommt; SIV ist das Tier-Lentivirus, das HIV am ähnlichsten ist. Letvin et al., Vaccines 87, Cold Spring Harbor Lab 209-213 (1987) offenbaren einen erfolglosen Versuch, Makakenaffen unter Verwendung eines inaktivierten Virus- Impfstoffes gegen SIV zu immunisieren. Desrosiers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6353-6357 (1989) berichteten über den Schutz von 2 bis 6 Makakenaffen gegen SIV durch Immunisierung mit einem durch Detergens aufgebrochenen Vollvirus-SIV- Impfstoff. Murphey-Corb et al., Science 246: 1293-1297 (1989) offenbaren den Schutz von 8 bis 9 Rhesusmakaken-Affen gegen eine SIV-Exposition durch Impfung mit einem formalin-inaktivierten SIV-Vollvirus-Impfstoff.

Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Impfstoffe bereitzustellen, die eine schützende Immunreaktion gegen eine HIV-Infektion hervorrufen können.

Ein weiteres Ziel der Erfindung liegt darin, Verfahren zur Herstellung solcher HIV- Impfstoffe und geeignete Immunisierungsprogramme zur AIDS-Behandlung und -Prophylaxe bereitzustellen.

Andere Ziele, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und den beigelegten Ansprüchen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Ziele der Erfindung werden durch die Herstellung und Verabreichung eines HIV- Antigen-Präparats erreicht, das sich zur Verabreichung an einen menschlichen oder nichtmenschlichen Primaten mit einer HIV-Infektion oder dem Risiko einer solchen in einer Menge und gemäß einem Immunisierungsprogramm eignet, das ausreicht, eine schützende Immunreaktion gegen HIV hervorzurufen.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können alleine oder in Kombination mit anderen HIV-Antigenen und in einer oder mehreren Immunisierungsdosen verabreicht werden. Es werden bevorzugte Immunisierungsprogramme beschrieben, die im allgemeinen wenige Immunisierungen mit relativ langen Abständen dazwischen vorsehen, insbesondere eine Reihe von drei oder mehr Impfungen, die über einen Zeitraum von einem bis zwei oder mehreren Jahren verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft insbesondere Impfstoffe, welche die HIV-env-Polypeptide gp120 und/oder gp160 umfassen, die eine proteolytische Spaltstelle aufweisen, doch an dieser inneren Spaltstelle proteolytisch nicht gespalten wurden. Man vermutet, daß diese Spaltstelle von HIV zwischen den Aminosäureresten 315-316 des gp120 des in EP-A- 187.041 beschriebenen HIV-Stamms (allgemein als IIIB bekannt) oder im entsprechenden Bereich anderer HIV-Stämme liegt.

HIV-env-Präparate, die kein Material aufweisen, das die innere Spaltstelle enthält, eignen sich als Impfstoffe zur Immunisierung gegen die HIV-Infektion. Dieses ungespaltene HIV-env-Polypeptid, einschließlich seiner Variantenanalogen, eignet sich auch für diagnostische Assays auf HIV-neutralisierenden Antikörper in Patientenproben.

Es werden Verfahren zur Herstellung von ungespaltenem gp120 und gp160 bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden Fermentationsverfahren bereitgestellt, umfassend die Expression von gp120 in Säugetier-Zellkultur, die in einem Medium gezüchtet wird, die ein verringertes oder gar kein fötales Kalbs- oder Rinderserum aufweist; diese Fermentationsverfahren fördern die Expression und Gewinnung von ungespaltenen HIV-env-Polypeptiden. Es werden auch Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe geoffenbart.

Es werden monoklonale Antikörper verwendet, die durch ihre Ligandenaffinität, Epitopenbindung und die Fähigkeit gekennzeichnet sind, a) die CD4/gp120-Bindung zu blockieren, b) HIV-Virions zu neutralisieren, c) die Umkehr-Transkriptase-Aktivität in vitro zu reduzieren, und d) die Synzytien-Bildung zu inhibieren. Es werden monoklonale Antikörper bereitgestellt, die für jenen Bereich von gp120 spezifisch sind, der die innere Spaltstelle enthält. Diese Antikörper eignen sich zur Affinitätsreinigung von ungespaltenem gp120 oder gp160. Diese Antikörper eignen sich auch zum passiven Immunisieren von mit HIV infizierten Patienten.

Auf Epitope gerichtete Antikörper, die diese Spaltstelle überspannen, wurden bereits in der Literatur beschrieben. Es ist jedoch zu beachten, daß aufgrund der Vielzahl und der unter den Autoren herrschenden Uneinigkeit hinsichtlich des Numerierungssystems für HIV-env-Sequenzen nicht alle Antikörper, die gemäß der Literatur auf die Aminosäuren 315-316 umfassende Bereiche gerichtet sind, tatsächlich die hierin definierte Spaltstelle überspannen (siehe z.B. Matsushita et al., J. Virol. 62: 2107-2114 (1988); EP-A-339.504; Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 3198-3202 (1988); Looney et al., Science 241: 357-359 (1988).

Es werden Antikörper bereitgestellt, die die Bindung von rekombinantem gp120 an den T4-Zelloberflächenmarker CD4 zumindest teilweise blockieren können. In anderen Ausführungsformen wird ein Antikörper bereitgestellt, der zumindest teilweise fähig ist, die Synzytien-Bildung zwischen HIV-infizierten und nicht-infizierten Zellen zu blockieren und/oder die Umkehr-Transkriptase-Aktivität zu blockieren.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig.1 ist eine schematische Darstellung von gp120 aus dem IIIB-Isolat von HIV-1 mit Disulfiden und Glykosylierungsstellen, wobei die Aminosäurereste im Einzelbuchstaben-Code angeführt sind [SEQ.ID NO.1]. Römische Zahlen kennzeichnen die 5 disulfid-gebundenen Domänen. Die 5 hypervariablen Bereiche von Modrow et al., J. Virol. 61: 570-578 (1987) sind umrahmt und mit V1-V5 gekennzeichnet. Glykosylierungsstellen, die hohe mannoseartige und/oder hybridartige Oligosaccharidstrukturen enthalten, werden durch ein verzweigendes Y-Symbol und Glykosylierungsstellen, die komplexartige Oligosaccharidstrukturen enthalten, durch ein V-förmiges Symbol gekennzeichnet. Die Spaltstelle ist durch einen Pfeil angezeigt.

Fig.2 zeigt die Aminosäuresequenzen (a) des reifen HIV-env-Glykoproteins gp120 aus dem IIIB-Isolat von HIV-1 im Dreibuchstaben-Code [SEQ. ID NO.1] und (b) des N- terminalen Sequenzabschnitts der rekombinanten Fusionsglykoproteine (9AA [SEQ. ID NO.2] oder CL44 [SEQ.ID NO.3]) aus dem Herpes simplex-Virusprotein gD1. Fusionsstellen zwischen den gD1- und gp120-Segmenten in den 9AA- und CL44- Konstruktionen sind mit (*) bzw. (**) gekennzeichnet. Der Buchstabe T bezieht sich auf die beobachtete tryptische Spaltung des gp120-Segments, und die Peptide sind beginnend mit dem N-Terminus des Moleküls aufeinanderfolgend angeordnet. Kleinbuchstaben nach der T-Zahl zeigen andere, unerwartete, proteolytische Spaltungen an. Der Buchstabe H bezieht sich auf die beobachtete tryptische Spaltung des Herpes simplex-gD1-Proteinabschnitts von CL44. Peptid T2' enthält die Fusionsstelle in CL44.

Die Cysteinreste von gp120 sind schraffiert, und mögliche N-gebundene Glykosylierungsstellen sind mit einem Punkt oberhalb des entsprechenden Asn-Rests versehen.

Fig.3 zeigt die Zusammensetzung von rgp120- und sgp160-Immunogenen, die in der in Beispiel 1 beschriebenen Impfung verwendet werden.

Fig.3A ist eine schematische Darstellung des HIV-1-Glykoprotein-Vorläufers, gp160, und der beiden, in der vorliegenden Untersuchung verwendeten, von gp160 abgeleiteten Proteinvarianten rgp120 und sgp160. Beide Proteine unterscheiden sich am Aminoterminus von gp160 der Wildform. Im rgp120-Protein wurden die Signalsequenz und 31 Reste von gp160 durch die Signalsequenz und 25 Aminosäuren aus dem reifen N-Terminus des Herpes simplex-Virus-Typ1-Glykoproteins D (HSV-1 gD)³ ersetzt. Im sgp160-Protein wurden die Signalsequenz und 12 Aminosäuren von gp160 durch die Signalsequenz und 9 Aminosäuren aus dem reifen N-Terminus von HSV-1-gD ersetzt. Darüber hinaus wurde die normale gp120/gp41-Proteolysestelle durch eine Löschung der Aminosäurereste 502-511 entfernt.

Fig.3B zeigt silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel von gereinigtem rgp120 und sgp160 unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen. Beide rekombinanten Glykoproteine wurden aus wachstumskonditionierten Zellkultur-Überständen durch Immunaffinitäts-Chromatographie und Gelpermeations-Chromatographie auf eine Reinheit von mehr als 99% im Falle von rgp120 und von mehr als 95% im Falle von sgp160 gereinigt. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen enthielt das rgp120 weniger als 5% Dimer, während das sgp160 etwa 50% Dimer und Oligomere höherer Ordnung enthielt. Beide Proteine werden einer endoproteolytischen Spaltung zwischen Argininrest 315 und Alaninrest 316 im V3-Bereich des gp120-Abschnitts jedes Moleküls ausgesetzt. In rgp120 führt dies zur Bildung eines N-terminalen Fragments von 75 kD und eines C-terminalen Fragments von 50 kD, während in sgp160 die gleiche Spaltung in zwei Fragmenten von etwa 75 kD resultiert. Bei SDS-PAGE sind die Fragmente aufgrund der Disulfidbindung zwischen den Cysteinresten 296 und 331 nur unter reduzierenden Bedingungen sichtbar. Das rgp120-Präparat enthielt weniger als 5% der gespaltenen Form, während etwa 40% des sgp160 gespalten waren.

Fig.4 zeigt die Ergebnisse eines Immunblots, der die Kreuzreaktivität der erfindungsgemäßen Antikörper mit anderen Isolaten von HIV-1 neben IIIB darstellt.

Fig.5 ist ein Autoradiogramm, das die Analyse von 10 monoklonalen Antikörpern gegen sgp160 zeigt. Man sieht, daß drei Hauptbanden durch eines oder mehrere der untersuchten Seren spezifisch immunausgefällt wurden, eine sgp160 entsprechende Bande von 140 kD, eine rgp120 entsprechende Bande von 110-120 kD und eine Bande von 75 kD, die die proteolytischen Abbauprodukte von gp120 und sgp160 darstellt.

Fig.6 zeigt die Herstellung von Antikörper gegen rgp120 und sgp160 in mit HIV-1- Impfstoffkandidaten immunisierten Tieren. Schimpansen wurden mit 300 ug pro Dosis rgp160 (x-247 und x-261), rgp120 (x-262 und x-265) oder Herpes simplex- Virusglykoprotein D (x-246) nach 0, 4 und 32 Wochen (Pfeile) immunisiert. Alle Immunogene wurden in Aluminiumhydroxid-Adjuvans eingebracht, das 2 mg Al&spplus;³- Äquivalente pro mg Protein enthielt. Blut wurde zu den angeführten Zeitpunkten entnommen, und die Seren wurden in den für jede der spezifischen Feldbeschreibungen beschriebenen Assays auf Antikörper gegen rgp120 oder sgp160 analysiert. Alle Tiere wurden nach 35 Wochen durch intravenöse Injektion 40 TSID&sub5;&sub0;-Einheiten HIV-1 exponiert. Die leeren und vollen Quadrate stellen die rgp120-immunisierten Tiere, x262 bzw. x265, dar. Die leeren und vollen Kreise stellen die rsgp160-immunisierten Tiere, x247 bzs. x261, dar. Das Vergleichstier, x246, ist durch leere Dreiecke dargestellt.

Fig.6A stellt den Nachweis von Antikörpern gegen rgp120 durch Immunfällung von ¹²&sup5;I- markiertem rgp120 in einem Flüssigphasen-Radioimmunfällungsassay dar.

Fig.6B zeigt den Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1-Proteine unter Verwendung eines im Handel (bei Genetic Systems) erhältlichen HIV-1-Antikörperassay-Sets (ELISA). Messungen erfolgten gemäß den Anweisungen der Hersteller.

Fig.7 zeigt die Immunblot-Analyse von Seren aus mit HIV-1-Impfstoffkandidaten immunisierten Tieren. Seren von Schimpansen, die mit sgp160 (x-247, x-261), rgp120 (x-262, x-265) oder HSV-1 gD (x-246) immunisiert worden waren, wurden verdünnt und mit im Handel (bei Dupont) erhältlichen Immunblot-Streifen inkubiert. Die Streifen wurden mit dem mit alkalischer Phosphatase gekuppeltem Ziegen-Anti-Menschen-IgG (Cappel) inkubiert und mit einem Phosphatase-Substratsystem der Kirkegaard und Perry Laboratories entwickelt. Die gezeigten Daten stellen die Ergebnisse dar, die am gleichen Tag unter Verwendung der gleichen Charge Assaystreifen erzielt wurden. Woche 35 stellt die Zeit der Exposition dar. Der positive Vergleich bestand aus Serum aus einem mit HIV-1 infizierten Patienten.

Fig.8 zeigt Antikörper, die die HIV-1-Infektiosität in vitro neutralisieren und sich an die spezifische neutralisierende Determinante des Haupttyps (MND) binden. Leere und volle Quadrate stellen Seren der rgp120-immunisierten Tiere 262 bzw. 265 dar. Die leeren und vollen Kreise stellen Seren der rsgp160-immunisierten Tiere 247 bzw. 261 dar. Das leere Dreieck stellt das Vergleichstier (x246) dar.

Fig.8A zeigt die in vitro-Neutralisierungsaktivität in Seren von Schimpansen, die in einem ähnlichen Neutralisierungsassay wie bei Robertson et al., J. Virol. Methods 20: 195-202 (1988) mit rgp120 und sgp160 immunisiert wurden. Verdünnte Serenproben wurden mit 100 TCID&sub5;&sub0;-Einheiten des Virus (IIIb-Isolat) 60 Minuten lang bei 20ºC inkubiert. Das Gemisch wurde auf Zellkulturplatten übertragen, die 5 x 10&sup4; MT4-Zellen enthielten, und 7 Tage lang inkubiert. Unter Verwendung von MTT als Vitalfärbung wurde die Virus-Lyse der infizierten Zellen nachgewiesen. Neutralisierungsassays fanden in doppelter Ausführung statt. Die Schwankungen der Wiederholungen lagen bei weniger als einer Verdünnung (zweifach). Seren von mit HIV-1 infizierten und nicht- infizierten Schimpansen wurden als positiver und negativer Vergleich herangezogen und ergaben neutralisierende Titer von 1:640 bzw. < 1:10.

Fig.8B zeigt Ergebnisse eines ELISA-Assays zur Bestimmung der relativen Konzentration von mit MND reaktiven Antikörpern, worin ein synthetisches Peptid, das aus der Sequenz NNTRKSIRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG [SEQ. ID NO. 4] besteht und den Aminosäureresten 301 bis 324 von gp120 aus dem IIIb-Isolat entspricht, in einer Konzentration von 2 ug pro ml auf eine Mikrotiter-Schale aufgeschichtet wurde. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die beschichteten Näpfe mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,05% Tween 20 gewaschen und mit einem Blockierungspuffer aus 0,8% Rinderserumalbumin in PBS behandelt. Jede Probe der Schimpansen-Seren, die in einem Bereich von 1:10 bis 1:10.240 seriell verdünnt worden waren, wurden mit 100 ul 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur in den Näpfen inkubiert. Die Näpfe wurden dann viermal mit PBS gewaschen, die 0,05% Triton X-100 enthielt. Mit markierter Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Menschen-IgG wurde 1 Stunde lang inkubiert und die Platten viermal mit PBS mit 0,05% Triton X-100 gewaschen. Die Antikörperbindung zeigt sich durch eine Farbänderung nach der Zugabe des Substrats o-Phenylendiamin-dihydrochlorid. Die kolorimetrische Reaktion wurde durch die Zugabe von 2,5 M H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und das Absorptionsvermögen bei 492 nm in einem Spektrophotometer mit Plattenablesung gemessen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

HIV-env ist hierin als Hüllpolypeptid des oben beschriebenen menschlichen Immunschwächevirus, gemeinsam mit seinen Aminosäuresequenz-Varianten und Derivaten, die durch hierin beschriebene kovalente Modifikation von HIV-env oder dessen Varianten in vitro erzeugt werden, definiert. Der Ausdruck "HIV-env" umfaßt hierin alle Formen von gp120 und/oder 160, z.B. Fragmente, Fusionen von gp160/120 oder deren Fragmente mit anderen Peptiden und unterschiedlich glykosyliertes oder unglykosyliertes HIV-env. Das erfindungsgemäße HIV-env wird frei von aktivem Virus gewonnen.

HIV-env und dessen Varianten werden herkömmlicherweise in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Siehe z.B. EP-A-187.041. Ab nun wird in rekombinanter Zellkultur hergestelltes gp120 hierin als rgp120 bezeichnet. Die rekombinante Synthese wird aus Gründen der Sicherheit und Wirtschaftlichkeit bevorzugt, doch es ist auch bekannt, Peptide durch chemische Synthese herzustellen und HIV-env aus viraler Kultur zu reinigen; solche env-Präparate sind hierin in der Definition von HIV-env enthalten.

Für HIV-env kodierende Gene stammen aus der genomischen cDNA eines HIV-Stamms oder aus erhältlichen subgenomischen Klonen, die das für HIV-env kodierende Gen enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft die HIV-env-Polypeptide gp120 oder gp160, vorzugsweise gp120, die eine innere Spaltungsstelle besitzen, die man hierin als "Spaltstelle" bezeichnet, die aber an dieser Stelle nicht gespalten sind. Diese Polypeptide werden hierin als "ungespaltenes HIV-env" und insbesondere als "ungespaltenes gp120" oder "ungespaltenes gp160" bezeichnet. Die Spaltstelle ist ein ein- oder zweibasiger, für proteolytische Spaltung anfälliger Rest.

Der Ausdruck "Spaltstelle" bezieht sich hierin nicht auf die gp120 und gp41 überbrückende Spaltungsstelle, sondern auf eine proteolytische Spaltstelle, die sich in gp120 von HTLV-IIIB zwischen Arg-Ala oder Arg-Val-Resten oder zwischen ähnlich positionierten Resten in HIV-Stämmen, die in den USA und in Afrika derzeit allgemein verbreitet sind, sowie in SIV-Stämmen befindet. Siehe Stephens et al., Nature 343: 219 (1990).

Wie dies durch den Pfeil in Fig.1 angezeigt ist, befindet sich die Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 285-286 der reifen HIV-1-gp120-Aminosäuresequenz, wobei Signalsequenzen oder andere stromauf befindlichen Bereiche nicht mitgezählt werden. Bei gp120-Sequenzen, die die native N-terminale HIV-IIIB-Signalsequenz enthalten, befindet sich die Spaltstelle zwischen den Resten 315-316; diese Numerierung wird in der gesamten Beschreibung angewendet, um die Reste, an denen sich die Spaltstelle befindet, in praktischer Weise zu kennzeichnen; man beachte jedoch, daß die Erfindung nicht auf die Spaltstellen an diesen spezifisch numerierten Resten beschränkt ist. Die gleichen Nukleotid- und Aminosäurerest-Nummern sind manchmal auf andere Stämme nicht anwendbar, wo stromauf befindliche Löschungen oder Einfügungen die Länge des viralen Genoms und HIV-env ändern, doch der für diesen Abschnitt von gp120 kodierende Bereich ist unter Anwendung der Lehren hierin problemlos zu identifizieren. Signalsequenzvarianten (z.B. jene, die aus einer Fusion mit einer weiter unten besprochenen, fragmentierten oder heterologen Signalsequenz entstehen) können zu einer etwas unterschiedlichen Numerierung führen, doch die Position der Spaltstelle wird bei allen Ausführungsformen durch Verweis auf die Position des in Fig.1 angezeigten Pfeils festgelegt.

Im Bedeutungsumfang von ungespaltenem HIV-env sind hierin auch HIV-env, deren Aminosäuresequenz-Varianten in Fig.1 oder 2 dargelegt sind, deglykosylierte oder nicht- glykosylierte Derivate von ungespaltenem HIV-env, homologe Aminosäuresequenz- Varianten der Sequenz aus Fig.1 oder 2, sowie homologe, in vitro-erzeugte Varianten und Derivate von ungespaltenem HIV-env enthalten, soferne alle derartigen Variationen die Spaltstelle nicht beeinträchtigen, wobei die Varianten fähig sind, eine biologische Aktivität aufzuweisen, die jener des HIV-env aus Fig.1 oder Fig.2 entspricht.

Die biologische Aktivität des gespaltenen oder ungespaltenen HIV-env- oder HIV-env- Fragments wird hierin als 1) immunologische Kreuzreaktivität mit zumindest einem Epitop von gespaltenem oder ungespaltenem HIV-env oder 2) Besitz von zumindest einer Haftungs- oder Auslöserfunktion definiert, die qualitativ dem gespaltenen oder ungespaltenen HIV-env entspricht. Beispiele für die qualitativen biologischen Aktivitäten des HIV-env umfassen die Fähigkeit von gp120, sich an den viralen Rezeptor CD4 zu binden, und die Fähigkeit von gp120 zur Wechselwirkung mit gb41, um die Fusion der viralen und der Wirtszellmembranen zu bewirken.

"Immunologisch kreuzreaktiv" bedeutet hierin, daß der Polypeptid-Kandidat die qualitative biologische Aktivität von gespaltenem oder ungespaltenem HIV-env konkurrierend hemmen kann, wobei diese Aktivität bei gegen das bekannte aktive Analog gerichteten, polyklonalen Antiseren besteht. Solche Antiseren werden in herkömmlicher Weise hergestellt, indem z.B. Ziegen oder Hasen subkutan das bekannte aktive Analog in vollständigem Freund'schen Adjuvans injiziert wird und diese danach eine intraperitoneale oder subkutane Auffrischungsinjektion in unvollständigen Freund'schen Adjuvantien erhalten.

Es wird derzeit bevorzugt, daß die ungespaltenen HIV-env-Präparate der Erfindung im wesentlichen frei von gespaltenen HIV-env-Fragmenten sind. Unter "im wesentlichen frei" ist zu verstehen, daß die Präparate zu mehr als 50%, vorzugsweise zu mehr als 60- 70%, noch bevorzugter zu mehr als 80%, am bevorzugtesten zu zumindest 90%, frei von gespaltenen HIV-env-Fragmenten sind.

Das gp120-Molekül besteht aus einem Polypeptidkern von 60.000 Dalton; eine weitreichende Modifikation durch N-gebundene Glykoslyierung erhöht das offensichtliche Molekulargewicht des Moleküls auf 120.000 (Lasky et al., Science 233: 209-212 (1986)). Die Aminosäuresequenz von gp120 enthält fünf relativ konservierte Domänen, zwischen denen fünf hypervariable Domänen angeordnet sind (Modrow, oben). Die hypervariablen Domänen enthalten umfangreiche Aminosäuresubstitutionen, -einfügungen und -löschungen. Sequenzvariationen in diesen Domänen führen zu einer bis zu 25%-igen Gesamt-Sequenzvariabilität zwischen gp120-Molekülen aus den verschiedenen viralen Isolaten. Trotz dieser Variation sind mehrere strukturelle und funktionelle Elemente von gp120 in hohem Maße konserviert. Darunter befinden sich die Fähigkeit von gp120 zur Bindung an den viralen Rezeptor CD4, die Fähigkeit von gp120 zur Wechselwirkung mit gp41, um die Fusion der viralen und der Wirtszellmembranen zu bewirken, die Positionen der 18 Cysteinreste in der gp120- Primärseqeuenz und die Position von 13 der etwa 23 N-gebundenen Glykosylierungsstellen in der gp120-Sequenz.

Ein durchschnittlich ausgebildeter Fachmann auf dem Gebiet kann das Disulfid- Bindungsmuster innerhalb von gp120 und die Positionen der tatsächlichen Oligosaccharid-Gruppen auf dem Molekül zur Steuerungt von Mutagenese und Fragmentationsvarianten verwenden. Es ist beabsichtigt, daß die Varianten der Erfindung ungespaltenes HIV-env, in dem einer oder mehrere Reste - mit Ausnahme jener an der Spaltstelle - in der env-Aminosäuresequenz substituiert wurden, Löschungen von einem oder mehreren Resten in der env-Sequenz (mit Ausnahme der Spaltstelle) und Einfügungen von einem oder mehreren Resten neben beliebigen Resten (außer innerhalb der Spaltstelle) enthalten.

Lasky et al., Science 233: 209-212 (1986) beschrieben die Expression von gp120 in chinesischen Hamstereierstock-Zellen (CHO-Zellen) als Fusionsprotein unter Verwendung des Signalpeptids des Herpes simplex-Typ1-Glykoproteins (gD1). Die Verwendung zweier derartiger Fusionsproteine wird bei der praktischen Anwendung der Erfindung bevorzugt. Ein rekombinantes Glykoprotein (CL44) wird als 498- Aminosäuren-Fusionsprotein exprimiert, das die ersten 27 Reste von gD1 enthält, die mit den Resten 31-501 von gp120 fusioniert sind. In dieser Konstruktion fehlt der erste Cysteinrest von reifem gp120. Ein weiteres, bevorzugtes, rekombinantes Fusionsprotein (9AA) enthält die ersten 9 Reste von gD1, die mit den Resten 4-501 von gp120 fusioniert sind. Dies stellt den ersten Cysteinrest Cys24 wieder her. Die carboxyterminale Analyse von CL44 unter Verwendung von Carboxypeptidase-Digesten zeigt, daß der Glutaminsäurerest 479 der Carboxyterminus des voll verarbeiteten, durch CHO-Zellen sekretierten Moleküls ist (Daten nicht dargestellt). Die Aminosäuresequenzen dieser zwei Konstruktionen sind in Fig.2 dargestellt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Aminosäuresequenz-Varianten des ungespaltenen HIV-env. Aminosäuresequenz-Varianten werden mit mehreren Zielsetzungen hergestellt, z.B. Erhöhung der Affinität des ungespaltenen HIV-env für einen Liganden oder Antikörper, Erleichterung der Stabilität, Reinigung und Herstellung des ungespaltenen HIV-env, Modifikation seiner Plasma-Halbwertszeit, Verbesserung der therapeutischen Effizienz und Verringerung der Heftigkeit oder des Auftretens von Nebenwirkungen während der therapeutischen Anwendung des ungespaltenen HIV- env. In der nachstehenden Beschreibung werden Aminosäuresequenz-Varianten des ungespaltenen HIV-env als Beispiele für die auswählbaren Varianten bereitgestellt.

Aminosäuresequenz-Varianten von ungespaltenem HIV-env fallen in eine oder mehrere von drei Klassen: Einfügungs-, Substitutions- oder Löschungsvarianten. Diese Varianten werden üblicherweise durch stellenspezifische Mutagenese von Nukleotiden in der für ungespaltenes HIV-env kodierenden DNA, durch welche DNA-Kodierung die Variante entsteht, und durch anschließendes Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Fragmente mit bis zu etwa 100-150 Aminosäureresten werden jedoch praktischerweise durch in vitro-Synthese hergestellt. Die folgende Beschreibung betrifft jegliches ungespaltenes HIV-env, soferne sie auf seine Struktur oder Funktion Bezug hat.

Die Aminosäuresequenz-Varianten des ungespaltenen HIV-env sind vorbestimmte, nicht natürlich vorkommende Varianten oder natürlich vorkommende Allele. Die ungespaltenen HIV-env-Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische - z.B. antikörperbindende - Aktivität wie das in der Natur vorkommende ungespaltene HIV-env oder das ungespaltene HIV-env-Analog auf. Ungespaltene HIV- env-Varianten und Derivate, die sich nicht an Antikörper binden können, sind trotzdem in folgenden Fällen nützlich: (a) als Reagens in diagnostischen Assays auf HIV-env oder Antikörper gegen HIV-env, (b) nach Insolubilisierung gemäß bekannter Verfahren als Mittel zur Reinigung von Anti-ungespaltenes-HIV-env-Antikörpern aus Antiseren oder Hybridomkultur-Überständen und (c) als Immunogene zum Züchten von Antikörpern gegen ungespaltenes HIV-env oder als Immunassay-Setkomponenten (markiert als konkurrierendes Reagens für das native HIV-env oder unmarkiert als Standard für den HIV-env-Assay), solange zumindest ein HIV-env-Epitop aktiv bleibt.

Während die Stelle zum Einbringen einer Aminosäuresequenz-Variation vorbestimmt ist, muß die Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Um z.B. die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, erfolgt eine Zufalls- oder Sättigungsmutagenese (worin alle 20 möglichen Reste eingefügt werden) am Zielcodon, wonach die exprimierte HIV-env-Variante hinsichtlich der optimalen Kombination erwünschter Aktivitäten gescreent wird. Ein solches Screenen ist auf dem Gebiet bekannt.

Aminosäure-Einfügungen bewegen sich üblicherweise in der Größenordnung von 1 bis 10 Aminosäureresten; Substitutionen werden typischerweise als einzelne Reste eingebracht; Löschungen reichen etwa von 1 bis 30 Resten. Löschungen oder Einfügungen erfolgen vorzugsweise an benachbarten Paaren, d.h. eine Löschung von 2 Resten oder Einfügung von 2 Resten. Aus der folgenden Beschreibung geht eindeutig hervor, daß Substitutionen, Löschungen, Einfügungen oder eine beliebige Kombination davon durchgeführt oder kombiniert werden, um zu einem Endkonstrukt zu gelangen.

Einfügungs-Aminosäuresequenzvarianten von ungespaltenem HIV-env sind jene, worin ein oder mehrere, nicht zu HIV-env zählende Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle (mit Ausnahme der Spaltstelle) im ungespaltenen HIV-env eingebracht werden und die die zuvor bestehenden Reste verschieben.

Üblicherweise sind Einfügungsvarianten Fusionen heterologer Proteine oder Polypeptide mit dem Amino- oder Carboxylterminus des ungespaltenen HIV-env. Solche Varianten werden als Fusionen des ungespaltenen HIV-env und eines Polypeptids bezeichnet, das eine andere Sequenz enthält als jene, die man normalerweise im ungespaltenen HIV-env an der Einfügungs-Position vorfindet. Mehrere Gruppe von Fusionen werden hierin beschrieben.

Die neuen erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich zur Diagnose oder zur Reinigung der Antikörper oder Liganden nach bekannten Immunaffinitätsverfahren.

Erwünschte Fusionen von ungespaltenem HIV-env, die ebenfalls immunologisch aktiv sein können oder nicht, umfassen Fusionen der reifen Sequenz von ungespaltenem HIV- env mit einer zum Bindungspartner heterologen Signalsequenz, wie dies oben erwähnt ist. Signalsequenzfusionen dienen dazu, die Sekretion des ungespaltenen HIV-env zu fördern. Das heterologe Signal ersetzt das native HIV-env-Signal, und wenn die resultierende Fusion erkannt wird, d.h. verarbeitet und durch die Wirtszelle gespalten wird, wird das ungespaltene HIV-env abgesondert. Signale werden im Hinblick auf die beabsichtigte Wirtszelle ausgewählt und können bakterielle Hefe-, Säugetier- und Viralsequenzen enthalten. Das native HIV-env-Signal oder das Herpes-gD- Glykoproteinsignal eignet sich zur Verwendung in Säugetier-Expressionssystemen.

C-terminale oder N-terminale Fusionen des ungespaltenen HIV-env oder ungespaltenen HIV-env-Fragments mit einem immunogenen Hapten oder heterologen Polypeptid eignen sich als Impfstoffkomponenten zur Immunisierung von Patienten gegen HIV- Infektion. Fusionen des Haptens oder heterologen Polypeptids mit ungespaltenem HIV- env oder seinen aktiven Fragmenten, die T-Zellen-Bindungsaktivität bewahren, eignen sich auch beim Richten zytotoxischer T-Zellen gegen Zielzellen, worin das Hapten oder heterologe Polypeptid fähig ist, sich an einen Zielzellen-Oberflächenrezeptor zu binden. Beispielsweise befindet sich auf der Oberfläche vieler fester (nicht hämatopoietischer), neoplastischer Tumore membrangebundener transformierender Wachstumfaktor-α (TGF-α). Antikörper, die TGF-α binden können, sind bekannt und können mit ungespaltenem HIV-env verbunden werden, z.B. durch kovalentes Vernetzen gemäß allgemein bekannter Verfahren oder durch Expression in rekombinanter Zellkultur als N- oder C-terminale Fusion mit ungespaltenem HIV-env oder einem aktiven Fragment, und werden dazu verwendet, ungespaltenes gp120 auf TGF-α zu richten.

Die genaue Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist variabel; bestimmte HIV-env-Stellen sind wohlbekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, die Sekretion oder die Bindungseigenschaften des ungespaltenen HIV-env zu optimieren. Die optimale Stelle für eine bestimmte Anwendung wird durch Routineversuche ermittelt.

Substitutionsvarianten sind jene, worin zumindest ein Rest in der Sequenz aus Fig.1 oder 2 (mit Ausnahme jener Reste an der Spaltstelle) entfernt und ein unterschiedlicher Rest stattdessen eingefügt wurde. Solche Substitutionen erfolgen im allgemeinen gemäß folgender Tabelle 1, wenn gewünscht wird, die Eigenschaften des ungespaltenen HIV- env geringfügig zu modulieren.

TABELLE 1
Ursprünglicher Rest Beispiele für Substitutionen

Neuartige Aminosäuresequenzen sowie isosterische (Aminosäure- oder andere) Analoge liegen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.

Beträchtliche Änderungen der Funktion oder immunologischen Identität erfolgen durch Selektion von Substitutionen, die weniger konservativ als jene in Tabelle 1 sind, d.h. durch die Selektion von Resten, die sich in ihrer Auswirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Polypeptid-Rückgrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette deutlicher unterscheiden. Die Substitutionen, von denen man im allgemeinen erwarten kann, daß sie die größten Änderungen der Eigenschaften von ungespaltenem HIV-env herbeiführen, sind jene, worin (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert ist, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) irgendeinen anderen Rest substituiert ist; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z.b. Glutamyl oder Asparagyl substituiert ist; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen ohne Seitenkette substituiert ist, z.B. Glycin.

Einige Löschungen, Einfügungen und Substitutionen bewirken keine einschneidenden Änderungen der Eigenschaften des ungespaltenen HIV-env-Moleküls. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Auswirkung der Substitution, Löschung oder Einfügung vor deren Durchführung vorherzusagen, beispielsweise bei der Modifikation eines Immunepitops, ist es für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig, daß die Auswirkung durch Routine-Screeningassays zu ermitteln ist. Beispielsweise entsteht eine Variante typischerweise durch stellenspezifische Mutagenese der für HIV-env kodierenden Nukleinsäure, Expression der Nukleinsäurevariante in rekombinanter Zellkultur und gegebenenfalls durch Reinigung aus der Zellkultur beispielsweise durch Immunaffinitätsadsorption an eine polyklonale Anti-ungespaltenes-HIV-env-Säule (um die Variante mittels zumindest eines verbleibenden Immunepitops zu adsorbieren). Die Aktivität des Zellysats oder der gereinigten ungespaltenen HIV-env-Variante wird dann in einem geeigneten Screeningassay hinsichtlich der erwünschten Eigenschaften gescreent. Beispielsweise wird eine Änderung der immunologischen Eigenschaft des ungespaltenen HIV-env, wie z.B. die Affinität für T-Zellenbindung, durch einen Immunassay vom Konkurrenztyp gemessen. Je mehr über die in vivo-Funktionen des ungespaltenen HIV-env bekannt wird, desto mehr Assays werden für ein derartiges Screenen zur Verfügung stehen. Modifikationen von Proteineigenschaften, wie z.B. Redox- oder Thermostabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder Tendenz zur Anlagerung an Träger oder zu Multimeren, werden nach für den Fachmann auf dem Gebiet bekannten Verfahren geprüft.

Eine weitere Klasse von ungespaltenen HIV-env-Varianten sind Löschungsvarianten. Löschungen sind durch die Entfernung von einem oder mehreren Aminosäureresten (mit Ausnahme der Spaltstelle) aus der HIV-env-Sequenz gekennzeichnet. Typischerweise dienen Löschungen dazu, die biologischen Aktivitäten des ungespaltenen HIV-env zu beeinflussen; es sind jedoch auch Löschungen geeignet, die die biologische Aktivität oder Immun-Kreuzreaktivität des ungespaltenen HIV-env bewahren.

Löschungen von Cystein oder anderen labilen Resten können auch erwünscht sein, z.B. zur Erhöhung der Oxidationsstabilität des ungespaltenen HIV-env. Die Löschungen oder Substitutionen potentieller Proteolysestellen, z.B. ArgArg, erfolgen durch Löschen eines der basischen Reste oder durch Substituieren eines davon durch Glutaminyl- oder Histidylreste.

Man beachte, daß einige Varianten eine verringerte oder fehlende biologische Aktivität aufweisen können. Diese Varianten eignen sich trotzdem als Standards in Immunassays auf HIV-env, solange sie zumindest ein Immunepitop von HIV-env bewahren.

Man ist derzeit der Ansicht, daß die dreidimensionale Struktur der ungespaltenen HIV- env-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für deren hierin beschriebene Funktionsweise wichtig ist. Daher sind alle verwandten Strukturanaloge, die die aktive Struktur jener durch die hierin beanspruchten Zusammensetzungen gebildeten imitieren, speziell im Schutzbereich der Erfindung enthalten.

Glykosylierungsvarianten sind im Bereich von ungespaltenem HIV-env enthalten. Sie umfassen Varianten, die einen völligen Mangel an Glykosylierung aufweisen (unglykosyliert), Varianten, die zumindest eine glykosylierte Stelle weniger als die native Form aufweisen (deglykosyliert) und Varianten, in denen die Glykosylierung geändert wurde. Es sind deglykosylierte und unglykosylierte Aminosäuresequenz- Varianten, deglykosyliertes und unglykosyliertes ungespaltenes HIV-env mit der nativen, unmodifizierten Aminosäuresequenz von HIV-env, sowie andere Glykosylierungsvarianten enthalten. Die Substitutions- oder Löschungsmutagenese dient z.B. dazu, die N- oder O-gebundenen Glykosylierungsstellen von ungespaltenem HIV- env zu eliminieren, z.B. wird ein Asparaginrest (nicht an der Spaltstelle) gelöscht oder durch einen weiteren basischen Rest, wie z.B. Lysin oder Histidin, substituiert. Alternativ dazu werden flankierende Reste, die die Glykosylierungsstelle bilden, substituiert oder gelöscht, wobei allerdings die Asparaginreste unverändert bleiben, um die Glykosylierung durch Eliminierung der Glykosylierungs-Erkennungsstelle zu verhindern.

Unglykosyliertes ungespaltenes HIV-env, das die Aminosäuresequenz des nativen HIV- env besitzt, wird in rekombinanter prokaryotischer Zellkultur erzeugt, da Prokaryoten keine Glykosylierung in Polypeptide einbringen können.

Glykosylierungsvarianten werden durch Selektion geeigneter Wirtszellen oder nach in vitro-Verfahren hergestellt. Hefe beispielsweise bringt eine Glykosylierung ein, die sich deutlich von jener von Säugetiersystemen unterscheidet. Ebenso werden Säugetierzellen, die einen anderen Spezies- (z.B. Hamster, Mäuse, Insekten, Schweine, Rinder oder Schafe) oder Gewebeursprung (z.B. Lunge, Leber, Lymphe, Mesenchym, Epidermis) besitzen als die Quelle des HIV-env-Antigens, routinemäßig auf die Fähigkeit hin gescreent, eine Glykosylierungsvariante einzubringen, die z.B. durch hohe Werte von Mannose oder unterschiedliche Anteile von Mannose, Fucose, Sialinsäure und anderer, typischerweise in Säugetier-Glykoproteinen vorgefundener Zucker gekennzeichnet ist. In vitro-Verarbeitung des ungespaltenen HIV-env erfolgt typischerweise durch enzymatische Hydrolyse, z.B. Neuraminidase-Spaltung.

Kovalente Modifikationen des ungespaltenen HIV-env-Moleküls, die die Spaltstelle nicht modifizieren, sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten. Solche Modifikationen werden durch Umsetzen von Ziel-Aminosäureresten des gewonnenen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren kann, oder durch den Einsatz von Mechanismen der posttranslationalen Modifikation eingebracht, die in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen funktionieren. Die resultierenden, kovalenten Derivate eignen sich für Programme zum Identifizieren von Resten, die für die biologische Aktivität, für Immunassays auf HIV-env oder für die Bildung von Anti-ungespaltenes-HIV-env- Antikörpern zur Immunaffinitäts-Reinigung des rekombinanten ungespaltenen HIV-env wichtig sind. Beispielsweise würde die vollständige Inaktivierung der biologischen Aktivität des Proteins nach der Reaktion mit Ninhydrin nahelegen, daß zumindest ein Arginyl- oder Lysylrest für dessen Aktivität entscheidend ist, wonach die unter den ausgewählten Bedingungen modifizierten, einzelnen Reste durch Isolierung eines den modifizierten Aminosäurerest enthaltenden Peptidfragments identifiziert werden. Solche Modifikationen sind für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig und werden ohne aufwendige Versuche durchgeführt.

Die Derivatisierung mit bifunktionellen Agentien eignet sich zur Herstellung intermolekularer Aggregate des ungespaltenen HIV-env mit Polypeptiden, sowie zur Vernetzung des ungespaltenen HIV-env mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Assay oder zur Affinitätsreinigung seiner Liganden. Weiters bietet eine Untersuchtung der Vernetzungen innerhalb der Ketten direkte Informationen über die Konformationsstruktur. Üblicherweise verwendete Vernetzer sind Sulfhydrylreagenzien, 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich von Disuccinimidylestern, wie z.B. 3,3'- Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunkionelle Maleimide, wie z.B. Bis-N- maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie z.B. Methyl-3-[(p- azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in Gegenwart von Licht Vernetzungen bilden können. Alternativ dazu werden reaktive, wasserunlösliche Matrizen, die in den US Patentschriften 3.959.080; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; und 4.330.440 beschrieben sind, zur Proteinimmobilisierung und Vernetzung verwendet.

Polymere werden hierin im allgemeinen durch einen multifunktionellen Vernetzer, der mit dem Polymer und einem oder mehreren Aminosäure- oder Zuckerresten des Proteins reagiert, kovalent mit dem Peptid verbunden. Es liegt jedoch auch im Schutzbereich der Erfindung, das Polymer direkt durch Umsetzen eines derivatisierten Polymers mit dem Peptid zu vernetzen, oder umgekehrt. Die kovalente Bindung an Aminogruppen wird nach bekannten chemischen Verfahren auf der Grundlange von Cyanurchlorid, Carbonyldiimidazol, reaktiven Aldehydgruppen erzielt (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Essigsäureanhydrid oder PEG-Chlorid plus das Phenoxid von 4-Hydroxybenzaldehyd, aktive Succinimidylester, aktiviertes Dithiocarbonat-PEG, 2,4,5-Trichlorphenylchlorameisensäure- oder aktivierten p-Nitrophenylchlorameisensäure-PEG-Ester). Carboxylgruppen werden durch Ankoppeln von PEG-Amin unter Verwendung von Carbodiimid derivatisiert.

Bestimmte posttranslationale Derivatisierungen sind die Folge der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutamyl- und Asparagylresten deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Schutzbereich der Erfindung.

Andere posttranslationale Modifikationen sind die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung der Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 [1983]), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung des C-terminalen Carboxyls.

Für ungespaltenes HIV-env kodierende DNA wird nach in vitro-Verfahren synthetisiert oder problemlos aus cDNA-Sammlungen gewonnen. Die Mittel zur synthetischen Bildung der für ungespaltenes HIV-env kodierenden DNA (entweder händisch oder mit automatischen Geräten) sind besonders angesichts der hierin enthaltenen Lehren für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig. Beispiele für den Stand der Technik auf dem Gebiet der Polynukleotid-Synthese finden sich in Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1984), und Horvath et al., An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynucleoside 3'-Phosphoramidites, Methods in Enzymology 154: 313-326, 1987.

Um alternativ dazu für ungespaltenes HIV-env kodierende DNA zu erhalten, muß man lediglich ein Hybridisierungsscreenen mit markierter DNA durchführen, die entweder für das HIV-env oder ungespaltene HIV-env-Fragmente davon (üblicherweise mehr als 20 und normalerweise etwa 50 bp) kodiert, wie dies in Figuren 1 und 2 dargestellt ist, um Klone zu entdecken, die homologe Sequenzen in den cDNA-Sammlungen enthalten, die aus Zellen oder Geweben eines bestimmten Tieres stammen; daran schließt sich die Analyse der Klone durch Restriktionsenzymanalyse und Nukleinsäuresequenzieren an, um Klone voller Länge zu identifizieren. Wenn Klone voller Länge in der Sammlung nicht vorhanden sind, werden geeignete Fragmente aus den verschiedenen Klonen gewonnen und an den Fragmenten gemeinsamen Restriktionsstellen ligiert, um ein Klon voller Länge zusammenzusetzen. Für HIV-env aus verschiedenen Isotypen und Stämmen kodierende DNA wird durch Sondieren von Sammlungen aus Wirten solcher Spezies mit den Sequenzen aus Fig. 1 oder 2 oder durch Synthetisieren der Gene in vitro gewonnen. DNA für andere Isotypen oder Stämme mit bekannten Sequenzen kann unter Anwendung analoger Routine- Hybridisierungsverfahren gewonnen werden.

Im allgemeinen werden zum Klonieren von DNA-Sequenzen bei der Konstruktion der für die Erfindung nützlichen Vektoren Prokaryoten verwendet. Besonders geeignet ist beispielsweise E.coli K12 Stamm 294 (ATCC NR. 31446). Andere brauchbare Mikrobenstämme sind E.coli B und E.coli X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele sind veranschaulichend und nicht einschränkend. Alternativ dazu sind in vitro- Klonierverfahren geeignet, z.B. Polymerase-Kettenreaktion.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden direkt in rekombinanter Zellkultur als N- terminales Methionylanalog oder als Fusion mit einem zum Hybrid/Abschnitt heterologen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des Hybrids/Abschnitts, exprimiert. Beispielsweise wird bei der Konstruktion eines prokaryotischen Sekretions- Expressionsvektors für ungespaltenes HIV-env das native HIV-env-Signal bei Wirten verwendet, die dieses Signal erkennen. Wenn der Sekretionsleader vom Wirt "erkannt" wird, kann die Wirtssignal-Peptidase eine Fusion des Leaderpolypeptids spalten, das an seinem C-Terminus mit dem gewünschten, reifen ungespaltenen HIV-env fusioniert ist. Für Wirt-Prokaryoten, die das HIV-env-Signal nicht besitzen, wird das Signal durch ein prokaryotisches Signal substituiert, das beispielsweise aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leader ausgewählt wird. Zur Sekretion durch Hefe kann das HIV-env-Signal durch die Hefeinvertase-, α- Faktor- oder saure Phosphatase-Leader substituiert werden. Zur Expression durch Säugetierzellen ist das native Signal für ungespaltenes Säugetier-HIV-env ausreichend, obwohl andere Säugetier-Sekretionsproteinsignale ebenso geeignet sind wie virale Sekretionsleader, beispielsweise das Herpes simplex-gD-Signal.

Ungespaltenes HIV-env kann in jeder beliebigen Wirtszelle exprimiert werden, wird jedoch vorzugsweise in Säugetierwirten synthetisiert. Wirtszellen aus Prokaroyten, Pilzen, Hefe, Insekten u.dgl. werden auch zur Expression verwendet. Beispiele für Prokaryoten sind die zum Klonieren geeigneten Stämme, sowie E.coli W3110 (F&supmin;, λ&supmin;, prototroph, ATCC Nr. 27325), andere Enterobacteriaceae, wie z.B. Serratia marcesans, Bazillen und andere Pseudomonas. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen absondern.

Typischerweise werden Expressionswirte mit DNA transfomiert, die für das ungespaltene HIV-env kodiert und in einen Expressionsvektor ligiert wurde. Solche Vektoren tragen üblicherweise eine Replikationsstelle (obwohl dies nicht erforderlich ist, wenn chromosomale Integration eintritt). Expressionsvektoren enthalten auch Markersequenzen, die für eine phenotype Selektion in transfomierten Zellen sorgen, wie dies weiter unten besprochen wird. Beispielsweise wird E.coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem aus einer E.coli-Spezies stammenden Plasmid (Bolivar et al, Gene 2: 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und bietet somit ein leichtes Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen, zum Zwecke des Klonierens wie auch des Exprimierens. Expressionsvektoren enthalten optimalerweise auch Sequenzen, die für die Steuerung der Transkription und Translation geeignet sind, z.B. Promotoren und Shine-Dalgarno- Sequenzen (für Prokaryoten) oder Promotoren und Enhancer (für Säugetierzellen). Die Promotoren können (müssen aber nicht) induzierbar sein; selbst starke, konstitutive Promotoren, wie z.B. der CMV-Promotor für Säugetierwirte, können ungespaltenes HIV- env ohne Toxizität für die Wirtszellen erzeugen. Obwohl es vorstellbar ist, daß Expressionsvektoren keine Expressionssteuerung, replikativen Sequenzen oder Selektionsgene enthalten müssen, kann ihre Abwesenheit doch die Identifizierung von Transformanten und das Erreichen einer starken Peptidexpression erschweren.

Beispiele für Promotoren, die zur Verwendung bei prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275: 615 [1978]; und Goeddel et al., Nature 281: 544 [1979]), alkalische Phosphatase, das Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980) und EP-A-36.776) und Hybridpromotoren, wie z.B. der tac-Promotor (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]). Es sind jedoch auch andere funktionale Bakterien-Promotoren geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen sind allgemein bekannt, wodurch ein Fachmann auf dem Gebiet in der Lage ist, sie operabel mit für ungespaltenes HIV-env kodierender DNA zu ligieren (Siebenlist et al., Cell 20: 269 [1980]), wobei Linker oder Adaptoren zur Anwendung kommen, um allenfalls erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S.D.-)Sequenz, die mit für ungespaltenes HIV-env kodierender DNA operabel verbunden ist.

Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefe- oder Fadenpilze, brauchbar. Saccharomyces cerevisiae ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch eine Anzahl anderer Stämme allgemein zur Verfügung steht. Das Plasmid YRp7 ist ein geeigneter Expressionsvektor in Hefe (Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10: 157 (1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe liefert, der sich in Tryptophan nicht vermehren kann, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Merkmal des Hefe- Wirtszellengenoms bietet dann eine wirkungsvolle Umgebung zum Nachweis von Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.

Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung bei Hefewirten enthalten die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17: 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd- 3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.

Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription sind, sind die Promotorbereiche für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme im Zusammenhang mit dem Stickstoff-Stoffwechsel, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefe-Expression sind ausführlicher in R. Hitzeman et al., EP-A- 73.657 beschrieben.

Es sind Expressionssteuer-Sequenzen für Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaroytischen Gene besitzen einen AT-reichen Bereich, der etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle der Transkriptionsinitiation angeordnet ist. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstart vieler Gene befindet, ist ein CXCAAT-Bereich, worin X jedes beliebige Nukleotid sein kann. Am 3'- Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodiersequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden in Säugetier-Expressionsvektoren eingefügt.

Geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription von Vektoren in Säugetier- Wirtszellen werden problemlos aus mehreren Quellen gewonnen, beispielsweise aus den Genomen von Viren, wie z.B. dem Polyoma-Virus, SV40, Adenovirus, MMV (steroid-induzierbar), Retroviren (z.B. dem LTR von HIV), Hepatitis-B-Virus und am bevorzugtesten dem Cytomegalovirus, oder aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. dem β-Actinpromotor. Die frühen und späten Promotoren von SV40 werden ohne Schwierigkeiten als ein SV40-Restriktionsfragment gewonnen, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Fiers et al., Nature 273: 113 (1978). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird problemlos als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982).

Die Transkription einer für ungespaltenes HIV-env kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird durch Einfügung einer Enhancer-Sequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind cis-aktive Elemente der DNA (üblicherweise von etwa 10-300 bp), die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Laimins et al., PNAS 78: 993 [1981]) und 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 [1983]) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 [1983]), sowie innerhalb der Kodiersequenz selbst (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 [1984]) festgestellt. Viele Enhancer-Sequenzen sind mittlerweile aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man jedoch einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der frühe Promotor-Enhancer von Cytomegalovirus, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.

Expressionvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Menschen- oder Kernzellen aus anderen multizellularen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die für die Termination der Transkription notwendig sind und die mRNA-Expression beeinträchtigen könnten. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Abschnitt der für das Hybrid- Immunoglobulin kodierenden mRNA transkribiert. Die 3'-untranslatierten Bereiche enthalten auch Transkriptionsterminations-Stellen.

Expressionvektoren können ein Selektionsgen enthalten, das man auch als auswählbaren Marker bezeichnet. Beispiele für geeignete auswählbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), Thymidinkinase (TK) oder Neomycin. Wenn solche auswählbaren Marker erfolgreich in eine Säugetier-Wirtszelle übertragen werden, kann die transformierte Säugetier-Wirtszelle überleben, wenn sie einem Selektionsdruck ausgesetzt ist. Es bestehen zwei allgemein verwendete, unterschiedliche Kategorien von selektiven Systemen. Die erste Kategorie beruht auf dem Zellstoffwechsel und der Verwendung einer Mutantenzellinie, der die Fähigkeit fehlt, sich unabhängig von einem ergänzten Medium zu vermehren. Zwei Beispiele sind CHO-DHFR&supmin;-Zellen und Mäuse-LTK&supmin;-Zellen. Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit, sich ohne die Zugabe von Nährstoffen wie Thymidin oder Hypoxanthin zu vermehren. Da diese Zellen einen Mangel an bestimmten Genen aufweisen, die für einen vollständigen Nukleotid-Syntheseweg notwendig sind, können sie nur dann überleben, wenn die fehlenden Nukleotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zur Ergänzung des Mediums ist das Einbringen eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen, denen die jeweiligen Gene fehlen, wodurch ihre Wachstumsbedingungen geändert werden. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transfomiert wurden, sind nicht in der Lage, in nicht-ergänzten Medien zu überleben. In bevorzugten Ausführungsformen werden hierin DHFR&spplus;-CHO-Zellen zur rekombinanten Expression von gp120 verwendet.

Die zweite Kategorie selektiver Systeme ist die dominante Selektion, die sich auf ein in jedem Zelltyp verwendetes Selektionsschema bezieht und nicht die Verwendung einer Mutantenzellinie erfordert. Diese Schemata sehen üblicherweise die Verwendung eines Arzneimittels zum Wachstumsabbruch einer Wirtszelle vor. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert wurden, exprimieren ein Protein, das Arzneimittel-Resistenz verleiht und überleben somit das Selektionssystem. Beispiele für eine solche dominante Selektion ziehen die folgenden Arzneimittel heran: Neomycin (Southern et al., Molec. Appl. Genet. 1: 327 [1982]), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209: 1422 [1980]) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 [1985]). Die drei oben angeführten Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Steuerung, um Resistenz gegenüber dem geeigneten Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.

"Verstärkung" bzw. "Amplifizierung" bezieht sich auf die Steigerung oder Replikation eines isolierten Bereichs innerhalb der chromosomalen DNA einer Zelle. Die Amplifizierung erfolgt mittels eines Selektionsmittels, z.B. Methotrexat (MTX), das DHFR inaktiviert. Die Amplifizierung oder die Herstellung aufeinanderfolgender Kopien des DHFR-Gens führt zur Herstellung größerer Mengen an DHFR angesichts größerer Mengen an MTX. Amplifizierungsdruck wird trotz der Gegenwart von endogener DHFR durch Hinzufügen von noch größeren MTX-Mengen zum Medium ausgeübt. Die Amplifizierung eines gewünschten Gens kann durch Cotransfizieren einer Säugetier- Wirtszelle mit einem Plasmid erreicht werden, das eine für ein gewünschtes Protein kodierende DNA und das DHFR- oder Amplifizierungsgen aufweist, das Cointegration ermöglicht. Man stellt sicher, daß die Zelle mehr DHFR benötigt, welche Bedingung durch die Replikation des Selektionsgens erfüllt wird, indem nur Zellen ausgewählt werden, die sich in Gegenwart einer immer höheren MTX-Konzentration vermehren können. Solange das für ein gewünschtes heterologes Protein kodierende Gen zusammen mit dem Selektionsgen cointegriert wird, führt die Replikation dieses Gens zur Replikation des für das gewünschte Gen kodierenden Proteins. Das Ergebnis: vermehrte Kopien des Gens, d.h. ein amplifiziertes Gen, das für das gewünschte heterologe Protein kodiert, exprimieren mehr des gewünschten Proteins.

Geeignete eukaryotische Wirtszellen zur Expression von ungespaltenem HIV-env sind: die Affennieren-CV1-Linie, die mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) transformiert wurde; die menschliche Embryonieren-Linie (293-Zellen oder 293-Zellen, die zum Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham, F.L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59 [1977]); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); chinesische Hamster- Eierstockzellen-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77: 4216, [1980]); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23: 243-251 [1980]); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); afrikanische Meerkatzen-Nierenzellen (VERO- 76, ATCC CRL-1587); menschliche Gebärmutterhalskrebs-Zellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Brusttumorzellen (MMT 060562, ATCC CCL51); und TRI- Zellen (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 [1982]).

Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die gewünschten Kodier- und Steuersequenzen enthalten, sieht die Anwendung von Standard-Ligationsverfahren vor. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und erneut in der gewünschten Form ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.

Zur Analyse, um die korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden zu bestätigen, werden die Ligationsgemische dazu verwendet, E.coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) und erfolgreiche Transformanten zu transformieren, die im Bedarfsfall nach Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert werden. Plasmide aus den Transformanten werden nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499 (1980) hergestellt, durch Restriktion analysiert und/oder sequenziert.

Wirtszellen werden mit den Expressionsvektoren der Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifizierung der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene zweckmäßig modifiziert werden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH-Wert u.dgl., sind die zuvor bei der zur Expression ausgewählten Wirtszelle eingesetzten und für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig.

Um die Ausbeute an ungespaltenem HIV-env zu maximieren, wird derzeit bevorzugt, daß die Zellkulturen in Medien, die einen niedrigen Serumgehalt, vorzugsweise 0-3% Serum, aufweisen, noch bevorzugter in etwa 1%-igem fötalem Rinderserum oder einem anderen geeigneten Serum gezüchtet werden.

Die in dieser Beschreibung angeführten Wirtszellen umfassen Zellen in in vitro-Kultur sowie Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstiers befinden.

"Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. Soferne nicht anders angegeben, ist das hierin zur Transformation der Wirtszellen angewendete Verfahren das Verfahren nach Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52: 456-457 (1973). Andere Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, z.B. durch Kerninjektion oder durch Protoplasten-Fusion, sind auch geeignet. Wenn eine oder mehrere prokaryotische Zellen, die substantielle Zellwand- Konstruktionen aufweisen, verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren die Kalziumbehandlung unter Verwendung von Kalziumchlorid nach Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).

"Transfektion" bezieht sich auf das Einbringen von DNA in eine Wirtszelle, ob nun Kodiersequenzen letztendlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Transfektionsverfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, z.B. CaPO&sub4; und Elektroporation. Die Transformation der Wirtszelle ist das Anzeichen für erfolgreiche Transfektion.

Das neuartige, erfindungsgemäße Polypeptid wird nach bekannten Verfahren aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt; Beispiele für solche Verfahren sind: Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, saure Extraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphozellulose-Chromatographie, Immunaffinitäts-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Lectin- Chromatographie. Siehe z.B. die in EP-A-187.041 beschriebenen Reinigungsverfahren. Außerdem eignen sich Umkehrphasen-HPLC und Chromatographie unter Verwendung von Liganden für ungespaltenes HIV-env zur Reinigung. Derzeit werden vorzugsweise Gelpermeations-Chromatographie und Anionenaustausch-Chromatographie eingesetzt; noch bevorzugter werden Kationenaustausch- und hydrophobe Wechselwirkungs- Chromatographie (HIC) gemäß Standardvorgangsweisen angewandt.

Zusätzlich wird ungespaltenes HIV-env durch das Leiten durch eine Säule aus Antikörper gegen ungespaltenes HIV-env, der nach einem Standardverfahren mit Aldehydsilika kovalent gebunden wird (Roy et al., Journal of Chromatography 303: 225- 228 [1984]), Waschen der Säule mit einer Salzlösung und Analysieren des Eluats nach Standardverfahren, wie z.B. quantitative Aminosäureanalyse, gewonnen und gereinigt. Verfahren unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die mit glyzerin-beschichtetem Glas gesteuerter Porengröße gekoppelt sind, eignen sich zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung. Gegebenenfalls können niedrige Konzentrationen (etwa 1-5 mM) von Kalziumionen während der Reinigung vorhanden sein. Ungespaltenes HIV- env kann vorzugsweise in Gegenwart eines Protease-Inhibitors, wie z.B. PMSF, gereinigt werden.

Ungespaltenes HIV-env wird gemeinsam mit notwendigen Cofaktoren in pharmazeutisch annehmbare, sterile, isotonische Formulierungen eingebracht und gegebenenfalls nach auf dem Gebiet wohlbekannten Standardverfahren verabreicht. Die Formulierung ist vorzugsweise flüssig und üblicherweise eine physiologische Salzlösung, die einen anderen Puffer als Phosphat mit pH 6,8-7,6 enthält, kann aber auch lyophilisiertes Pulver sein.

Die bei der Therapie zu verwendenden ungespaltenen HIV-env-Zusammensetzungen werden formuliert und Dosierungen festgelegt. Dies geschieht in Einklang mit der guten medizinischen Praxis und unter Berücksichtigung der zu behandelnden Störung, des Zustands des einzelnen Patienten, der Abgabestelle des ungespaltenen HIV-env- Polypeptids, des Verabreichungsverfahrens und anderer den Praktikern bekannter Faktoren.

Ungespaltenes HIV-env wird durch Vermischen von ungespaltenem HIV-env im erwünschten Reinheitsgrad mit Adjuvantien oder physiologisch annehmbaren Trägern zur Verabreichung vorbereitet, d.h. mit Trägern, die für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch sind. Adjuvantien und Träger sind Substanzen, die selbst keine Immunepitope mit dem Ziel-Antigen teilen, die jedoch die Immunreaktion auf das Ziel-Antigen anregen. Üblicherweise umfaßt dies das Kombinieren von ungespaltenem HIV-env mit Puffern, niedermolekularen Polypeptiden (mit weniger als etwa 10 Resten), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich von Glukose oder Dextranen, Chelatbildnern, wie z.B. EDTA, und anderen Exzipienten. Üblicherweise wurde für diesen Zweck das Freund'sche Adjuvans (eine Mineralöl-Emulsion), sowie eine Vielzahl toxischer mikrobieller Substanzen, wie z.B. mycobaterielle Extrakte und Cytokine, z.B. den Tumornekrose-Faktor und Interferon-γ (beschrieben in der US-PS-4.963.354) verwendet. Obwohl das Antigen günstigerweise mit einem Adjuvans verabreicht wird, benötigen Auffrischungsimpfungen mit Antigen in Situationen, wo die anfängliche Impfung mit einem Adjuvans vorgenommen wird, möglicherweise kein Adjuvans. Träger wirken oft als Adjuvantien, unterscheiden sich aber im allgemeinen dahingehend von diesen, daß sie wasserunlösliche makromolekulare Teilchenstrukturen umfassen, die zu einer Zusammenballung des Antigens führen. Typische Träger sind Aluminiumhydroxid, Latex-Teilchen, Bentonit und Liposome.

Es wird erwartet, daß Injektionen (intramuskulär oder subkutan) die wichtigste therapeutische Verabreichungsart der erfindungsgemäßen Impfstoffe sind, wobei intravenöse Verabreichung oder die Verabreichung durch Katheter oder andere chirurgische Kanäle auch möglich sind. Alternative Wege sind beispielsweise Tabletten u.dgl., im Handel erhältliche Zerstäuber für flüssige Formulierungen, sowie die Inhalation lyophilisierter oder aerosolisierter Rezeptoren. Flüssige Formulierungen können nach der Rekonstitution aus Pulverformulierungen verwendet werden.

Das neuartige Polypeptid kann auch über Mikrokügelchen, Liposome, andere Mikroteilchen-Abgabesysteme oder Formulierungen mit verzögerter Freisetzung in bestimmten Geweben, einschließlich von Blut, verabreicht werden. Geeignete Beispiele für Träger mit verzögerter Freisetzung sind halbdurchlässige Polymermatrizen in Form von Formgegenständen, wie z.B. Zäpfchen, oder Mikrokapseln. Implantierbare oder mikrokapselartige Matrizen mit verzögerter Freisetzung sind u.a. Polylactide (US-A- 3.773.919, EP-A-58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al., Biopolymers 22(a): 547-556 [1985]), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) und R. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 [1982]) Liposome, die das ungespaltene HIV-env enthalten, werden nach wohlbekannten Verfahren hergestellt: DE-A-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP-A-52.322; 36.676; 88.046; 143.949; 142.541; JP-A- 83-11808; US-A-4.485.045 und 4.544.545; und UP-A-102.342. Üblicherweise sind es Liposome vom kleinen (etwa 200-800 Å), unilamellaren Typ, worin der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Anteil hinsichtlich der optimalen Rate des Polypeptid-Austritts eingestellt wird.

Die verabreichte Impfdosis des ungespaltenen HIV-env ist abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Impfstoffs, z.B. von seiner Bindungsaktivität und in vivo- Plasma-Halbwertszeit, der Konzentration des ungespaltenen HIV-env in der Formulierung, der Verabreichungsart, der Stelle und Rate der Dosierung, der klinischen Toleranz des jeweiligen Patienten, des pathologischen Zustands des Patienten u.dgl., wie dies für den Arzt offenkundig ist. Im allgemeinen sind Dosen von 300 ug ungespaltenes HIV-env pro Patient und Verabreichung vorzuziehen, obwohl die Dosierungen von etwa 10 ug - 1 mg pro Dosis reichen können. Unterschiedliche Dosierungen werden während einer Reihe aufeinanderfolgender Impfungen angewendet; der Praktiker kann eine anfängliche Impfung vornehmen und dann mit relativ kleineren Dosen an ungespaltenem HIV-env-Impfstoff auffrischen.

Die erfindungsgemäßen ungespaltenen HIV-env-Impfstoffe können auf unterschiedliche Arten und an verschiedene Rezipientenklassen verabreicht werden. Die Impfstoffe dienen zur Impfung von Individuen, die dem Risiko einer HIV-Infektion ausgesetzt sein können oder nicht, wobei die Impfstoffe zusätzlich günstigerweise an seropositive Individuen verabreicht werden, sowie an Individuen, die bereits HIV ausgesetzt wurden (siehe z.B. Salk, Nature 327: 473-476 (1987); und Salk et al., Science 195: 834-847 [1977]).

Das ungespaltene HIV-env kann in Kombination mit anderen Antigenen in einem einzigen Impf-"Cocktail" verabreicht werden. Die Impfstoffe mit ungespaltenem HIV- env können auch als ein Teil einer Reihe von im Laufe der Zeit vorgenommenen Impfungen verabreicht werden. Eine solche Reihe kann die Impfung mit den gleichen oder anderen Präparaten von HIV-Antigenen oder anderen Impfstoffen umfassen.

Die Eignung der ausgewählten Impfparameter, z.B. Dosis, Zeitplan, Wahl des Adjuvans u.dgl., wird durch die Entnahme von Aliquoten des Patientenserums und Untersuchung von Antikörper-Titern während des Immunisierungsprogramms ermittelt. Alternativ dazu kann die Präsenz von T-Zellen nach herkömmlichen Verfahren (siehe Beispiel 1) kontrolliert werden. Zusätzlich wird der klinische Zustand des Patienten hinsichtlich der erwünschten Wirkung, z.B. anti-infektiöser Wirkung, kontrolliert. Wenn eine unzulängliche Impfung erzielt wurde, kann der Patient eine Auffrischungsimpfung mit weiteren ungespaltenen HIV-env-Impfungen erhalten, wobei die Impfparameter so modifiziert werden können, daß man erwarten kann, daß die Immunreaktion potenziert wird, z.B. durch Steigerung der Menge an Antigen und/oder Adjuvans, Komplexieren des Antigens mit einem Träger oder Konjugieren derselben an ein immunogenes Protein, sowie durch Variieren der Verabreichungsart.

Die Erfindung betrifft auch optimierte Immunisierungsschemata zur Steigerung einer schützenden Immunreaktion gegen die HIV-Infektion. Es wird derzeit bevorzugt, zumindest drei getrennte Impfungen mit ungespaltenem HIV-env zu verabreichen, wobei eine zweite Impfung mehr als 2, vorzugsweise 3 bis 8, noch bevorzugter etwa 4, Wochen nach der ersten Impfung vorgenommen wird. Es wird bevorzugt, eine dritte Impfung mehrere Monate nach der zweiten "Auffrischungs"-Impfung, vorzugsweise zumindest mehr als 5 Monate nach der ersten Impfung, noch bevorzugter 6 Monate bis 2 Jahre nach der ersten Impfung, am bevorzugtesten 8 Monate bis 1 Jahr nach der ersten Impfung, zu verabreichen. Periodische Impfungen nach der dritten sind auch wünschenswert, um das "Immungedächtnis" des Patienten zu verbessern. Siehe Anderson et al., J. Infectious Diseases 160(6): 960-969 (Dez. 1989) und die darin angeführten Verweise. Im allgemeinen sind weniger häufige Immunisierungen mit ungespaltenem HIV-env in relativ langen Abständen mehr zu bevorzugen als häufige Immunisierungen, um maximale Antikörper-Responses und eine Schutzwirkung zu erzielen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können gegebenenfalls gemeinsam mit anderen pharmakolgischen Mitteln verabreicht werden, die zur Behandlung von AIDS oder ARC oder anderer, mit HIV in Zusammenhang stehender Erkrankungen und Infektionen heranzogen werden, wie z.B. mit AZT, CD4, Antibiotika, Immunmodulatoren, wie z.B. Interferon, entzündungshemmenden Mitteln und Antitumor-Mitteln.

Antikörper

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung monoklonaler Antikörper (siehe Beispiel 2 weiter unten) und Antikörper-Hybridome, die bei der ATCC hinterlegt sind (unten beschrieben). Monoklonale Antikörper, die ein Epitop von ungespaltenem HIV-env oder antigen-aktiven, zelloberflächen-exponierten Fragmenten davon (z.B. aus gp120, gp41 ausgewählte Epitope) spezifisch binden, werden aus kontinuierlichen Hybridzellinien isoliert, die durch die Fusion von antigen-geprimten, immunen Lymphozyten mit Myelomzellen gebildet werden. Günstigerweise binden die monoklonalen Antikörper, die HIV-env und ungespaltenes HIV-env binden, jene Domäne dieses Proteins, die auf der Zelloberfläche exponiert ist.

Die Antikörper werden durch Routinescreenen erhalten. Ein Assay wird zum Screenen monoklonaler Antikörper hinsichtlich ihres zytotoxischen Potentials als Ricin A-Kette mit Immunotoxinen angewendet. Der Assay umfaßt das Behandeln von Zellen mit Verdünnungen des Versuchs-Antikörpers, gefolgt von einem Fab-Fragment eines mit der Ricin A-Kette gekoppelten, sekundären Antikörpers ("indirekter Assay"). Die Zytotoxizität des indirekten Assays wird mit jener des direkten Assays verglichen, worin der monoklonale Antikörper mit der Ricin A-Kette gekoppelt ist. Durch den indirekten Assay kann die Wirksamkeit eines bestimmten monoklonalen Antikörpers als Immunotoxin genau vorhergesagt werden, der sich daher zum Screenen monoklonaler Antikörper hinsichtlich der Verwendung als Immunotoxine eignet; siehe auch Vitetta et al., Science 238: 1098-1104 (1987) und Weltman et al., Cancer Res. 47: 5552 (1987).

Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, da sie gegen eine einzige antigene Stelle gerichtet sind. Im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörper-Präparaten, die typischerweise unterschiedliche, gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper enthalten, ist jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Monoklonale Antikörper dienen dazu, die Selektivität und Spezifität diagnostischer und analytischer Assayverfahren unter Verwendung von Antigen-Antikörper-Bindung zu verbessern. Ein zweiter Vorteil monoklonaler Antikörper liegt darin, daß sie durch die Hybridomkultur synthetisiert werden und nicht durch andere Immunoglobuline kontaminiert sind. Monoklonale Antikörper können aus Überständen kultivierter Hybridomzellen oder aus Aszites gebildet werden, die durch intraperitoneale Impfung von Hybridomazellen in Mäuse induziert werden.

Das ursprünglich von Kohler und Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976) beschriebene Hybridomverfahren wurde in großem Umfang angewendet, um Hybridzellinien zu erzeugen, die große Mengen monoklonaler Antikörper gegen viele spezifische Antigene sekretieren.

Ein Antikörper, der ein Epitop blockieren oder binden kann, das die proteolytische gp120-Spaltstelle überspannt, wird durch Immunisieren von Mäusen, wie z.B. Balb/c, vorzugsweise C57 BL/6, gegen gp120 und Screenen hinsichtlich eines klonalen Antikörpers gebildet, der, wenn er mit ungespaltenem gp120 vorinkubiert wird, dessen Bindung an gespaltenes gp120 verhindert. Die 10F6-, 11G5- und 10D8-Antikörper sind Beispiele für einen derartigen Antikörper, doch sie sind nicht die einzigen, da andere Antikörper mit der gleichen qualitativen Aktivität nach den hierin beschriebenen Verfahren gebildet werden können; wie bereits beschrieben sind Antikörper, die die Spaltstelle überspannen, in der Literatur bekannt. "Qualitative" Aktivität bedeutet in diesem Zusammenhang, daß sich der Antikörper an ein Epitop bindet, das die Spaltstelle von HIV-env überspannt. Ein Trypsin-Digest von gp120 zeigte, daß die 10F6-, 11G5- und 10D8-Antikörper das Peptid banden, das etwa die Reste 301-321 überspannt - sie überspannen demnach die Spaltstelle. Andere monoklonale Antikörper als 10F6, 11G5 und 10D8, bei denen dies zutrifft, eignen sich trotz der Unterschiede bezüglich Affinität, Immunoglobulin-Klasse, Ursprungsspezies oder gp120-Epitop für die praktische Durchführung der Erfindung; das gleiche gilt für Antikörper, die in rekombinanter Zellkultur exprimiert werden oder die vorbestimmte Aminosäuresequenz-Varianten der 10F6-, 11G5- und 10D8-Antikörper sind, z.B. Chimären des variablen Bereichs der 10F6-, 11G5- und 10D8-Antikörper und eines menschlichen, konstanten Bereichs.

Die Art und das Schema der Immunisierung des Wirtstiers oder der daraus stammenden, kultivierten, antikörper-produzierenden Zellen stehen im allgemeinen in Einklang mit etablierten und herkömmlichen Verfahren zur Antikörperstimulierung und -herstellung. Die Anmelder verwendeten Mäuse als Versuchsmodell, obwohl zu erwarten ist, daß jeder Säugetier-Proband, einschließlich menschlicher Versuchspersonen oder antikörper-produzierender Zellen darvon, gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren manipuliert werden kann, um als Produktionsbasis von Säugetier-(einschließlich Human-)Hybridzellinien zu dienen.

Nach der Immunisierung werden immune Lymphzellen mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridzellinie zu erzeugen, die kultiviert und unbegrenzt subkultiviert werden kann, um große Mengen an monoklonalen Antikörpern herzustellen. Für die Zwecke der Erfindung sind die zur Fusion ausgewählten, immunen Lymphoidzellen Lymphozyten und ihre normalen, differenzierten Nachkommen, die entweder aus dem Lymphknotengewebe oder Milzgewebe von immunisierten Tieren entnommen werden. Die Anmelder ziehen es vor, immune Milzzellen zu verwenden, da sie hinsichtlich des Mäusesystems eine konzentriertere und praktischere Quelle antikörper-produzierender Zellen darstellen. Die Myelomzellen bilden die Grundlage zur kontinuierlichen Vermehrung des fusionierten Hybrids. Myelomzellen sind aus Plasmazellen gewonnene Tumorzellen.

Es ist möglich, Zellen einer Spezies miteinander zu fusionieren. Es ist jedoch vorzuziehen, daß die Quelle der immunisierten, antikörper-produzierenden Zellen und der Myelomazellen von der gleichen Spezies stammen.

Die Hybridzellinien können in vitro in Zellkulturmedien in Kultur gehalten werden. Die Zellinien der Erfindung können selektiert und/oder in einer Zusammensetzung am Leben erhalten werden, welche die kontinuierliche Zellinie in Hypoxanthin- Aminopterin-Thymidin-(HAT-)Medium umfaßt. Sobald die Hybridomzellinie erzeugt wurde, kann sie in einer Vielzahl ernährungsmäßig adäquater Medien am Leben erhalten werden. Außerdem können die Hybridzellinien auf eine beliebige, herkömmliche Weise gelagert und konserviert werden, z.B. durch Einfrieren und Lagern unter flüssigem Stickstoff. Gefrorene Zellinien können neu belebt und unbegrenzt kultiviert werden, wobei die Synthese und Sekretion monoklonaler Antikörper wieder einsetzt. Der sekretierte Antikörper wird nach herkömmlichen Verfahren, wie z.B. Fällung, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie o.dgl., aus dem Gewebekultur-Überstand gewonnen. Die hierin beschriebenen Antikörper werden auch aus Hybridomzellkultur nach herkömmlichen Verfahren zur Reinigung von IgG oder IgM gewonnen, die bislang dazu verwendet wurden, diese Immunoglobuline aus gepooltem Plasma zu reinigen, z.B. nach Ethanol- oder Polyethylenglykol- Fällungsverfahren. Die gereinigten Antikörper werden steril filtriert und zur Verwendung in diagnostischen Assays von HIV in Versuchsproben gegebenenfalls an einen nachweisbaren Marker, wie z.B. einen Enzym- oder Spinmarker, konjugiert.

Obwohl die Erfindung anhand von monoklonalen Mäuse-Antikörpern beschrieben wird, ist sie nicht darauf beschränkt, denn es eignen sich dazu auch menschliche Antikörper, die sich manchmal als zweckmäßiger herausstellen. Solche Antikörper werden unter Verwendung menschlicher Hybridome gebildet (Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 [1985]). Für die vorliegende Erfindung eignen sich Verfahren, die zur Herstellung chimärer Antikörper entwickelt wurden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452 (1985)), indem die Gene aus einem Mäuse- Antikörpermolekül geeigneter Antigenspezifität gemeinsam mit Genen aus einem menschlichen Antikörpermolekül geeigneter biologischer Aktivität (z.B. mit der Fähigkeit, menschliche Komplementäre zu aktivieren und ADCC zu vermitteln) gespleißt werden; solche Antikörper sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten.

Als Alternative zum Zellfusionsverfahren werden immortalisierte EBV-.B-Zellen dazu eingesetzt, die monoklonalen Antikörper der Erfindung zu erzeugen. Andere Verfahren zur Bildung monoklonaler Antikörper, wie z.B. mit rekombinanter DNA, sind auch denkbar.

Die in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von ungespaltenem HIV-env verwendeten Antikörper sind auf ein die Spaltstelle überspannendes Epitop gerichtet. Das Verfahren umfaßt die folgenden allgemeinen Schritte: erstens, das In-Kontakt- Bringen eines ersten HIV-env-Präparats mit einem auf ein die Spaltstelle überspannendes HIV-env-Epitop gerichteten Antikörper über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bildung eines zweiten, antikörper-gebundenen HIV-env-Präparats zu ermöglichen; zweitens, das Abtrennen des zweiten Präparats von jeglichem HIV-env, das nicht antikörper-gebunden ist; und drittens, die Gewinnung des ungespaltenen HIV- env aus dem zweiten Präparat. Diese Verfahren werden mit Standardschritten zur Affinitäts-Reinigung und Affinitäts-Chromatographie angewendet und können einen Antikörper verwenden, der auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisiert ist, wie dies oben besprochen wurde. Jede bekannte Verfahrensweise zur Immobilisierung monoklonaler Antikörper ist für diesen Zweck geeignet.

Zum besseren Verständnis der folgenden Beispiele werden einzelne, häufig angeführte Methoden und/oder Ausdrücke erklärt.

"Plasmide" werden durch ein kleines p gekennzeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die hierin verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, öffentlich uneingeschränkt verfügbar oder können gemäß veröffentlichter Verfahren aus erhältlichen Plasmiden konstruiert werden. Außerdem sind auf dem Gebiet äquivalente Plasmide bekannt und für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig.

Es ist besonders vorzuziehen, daß diese Plasmide einige der folgenden Eigenschaften aufweisen: daß sie (1) eine minimale Anzahl an Wirtsorganismen-Sequenzen besitzen; (2) im erwünschten Wirt stabil sind; (3) in einer hohen Kopienanzahl im gewünschten Wirt vorhanden sein können; (4) einen regulierbaren Promotor besitzen; und (5) zumindest eine DNA-Sequenz aufweisen, die für ein selektierbares Merkmal kodiert, das auf einem Abschnitt des Plasmids vorhanden ist, der von jenem getrennt ist, in den die neue DNA-Sequenz eingefügt wird. Die Änderung der Plasmide zur Entsprechung der obigen Kriterien ist für den Fachmann auf dem Gebiet auf der Grundlage der verfügbaren Literatur und der hierin angeführten Lehren keine Schwierigkeit. Man beachte, daß auch zusätzliche Kloniervektoren bereits bestehen oder entdeckt werden können, welche die oben aufgezählten Eigenschaften besitzen und sich daher zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen; diese Vektoren liegen ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung liegen.

"Digestion" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Bedingungen waren so, wie sie ein Fachmann auf dem Gebiet auswählen würde. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Zum Zwecke des Isolierens von DNA-Fragmenten zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 50 ug DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen digeriert. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC sind üblich, sie können jedoch gemäß den Angaben des Herstellers variieren. Nach der Digestion wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, um das erwünschte Fragment zu isolieren.

Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente erfolgt unter Verwendung von 8%- igem Polyacrylamidgel (beschrieben durch Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)).

"PCR" ("polymerase chain reaction", Polymerase-Kettenreaktion) bezieht sich auf ein Verfahren, wodurch ein Stück DNA amplifiziert wird. Oligonukleotid-Primer, die dem 3'- und 5'-Ende (sense- oder antisense-Strang-Prüfung) des Segments der zu amplifizierenden DNA entsprechen, werden unter geeigneten Bedingungen hybridisiert und die Enzym-Taq-Polymerase oder ein äquivalentes Enzym dazu verwendet, Kopien der zwischen den Primern befindlichen DNA zu synthetisieren.

"Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren verhindert, daß die beiden restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments "ringschließen", d.h. eine geschlossene Schleife bilden, die die Einfügung eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Verfahren und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind herkömmlich. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning S. 133-134 (1982). Reaktionen unter Verwendung von BAP erfolgen in 50 mM Tris bei 68ºC, um die Aktivität jeglicher Exonukleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sind. Die Reaktionen dauern 1 Stunde. Nach der Reaktion wird das DNA-Fragment gelgereinigt.

Der Ausdruck "Oligonukleotide" bezieht sich entweder auf ein einstrangiges Polydesoxynukleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynukleotid-Stränge, die chemisch synthetisiert werden können. Solche synthetische Oligonukleotide besitzen kein 5'-Phosphat und ligieren demnach ohne die Zugabe eines Phosphats mit einem ATP in Gegenwart einer Kinase nicht an ein anderes Oligonukleotid. Ein synthetisches Oligonukleotid ligiert an ein Fragment, das nicht dephosphoryliert wurde.

"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren der Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäure-Fragmenten (Maniatis, T. et al., oben, S. 146). Soferne nicht anders angegeben, erfolgt die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Liase ("Ligase") pro 0,5 ug etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.

"Füllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf Verfahren, nach denen das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer restriktionsenzym-gespaltenen Nukleinsäure zu einem Doppelstrang umgewandelt wird. Dies eliminiert den kohäsiven Terminus und bildet ein stumpfes Ende. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Instrument zur Umwandlung eines restriktionsgespaltenen Endes, das mit den Enden kohäsiv sein kann, die nur durch eines oder einige weitere Restriktionsenzyme gebildet werden, zu einem Terminus, der mit jeder stumpfspaltenden Restriktionsendonuklease oder einen anderen, gefüllten, kohäsiven Terminus kompatibel ist. Typischerweise erfolgt das Abstumpfen durch Inkubieren von 2-15 ug der Ziel-DNA in 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) bei etwa 37ºC in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und 250 uM jedes der vier Desoxynukleosid-Triphosphate. Die Inkubation ist im allgemeinen nach 30- minütiger Extraktion mit Phenol und Chloroform und Ethanolfällung abgeschlossen.

Man beachte, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein bestimmtes Problem oder eine bestimmte Situation angesichts der hierin enthaltenen Lehren innerhalb der Möglichkeiten eines Fachmanns auf dem Gebiet liegen. Beispiele für die Produkte der vorliegenden Erfindung und für repräsentative Verfahren zu deren Isolierung, Verwendung und Herstellung sind unten angeführt, sollen die Erfindung jedoch nicht einschränken.

Hinterlegung von Materialien

Die folgenden Kulturen wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt.

Stamm ATCC Hinterlegungsnr. Hinterlegungsdatum JULI

Diese Hinterlegungen erfolgten gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren und der diesbezüglichen Bestimmungen (Budapester Abkommen). Dies garantiert die Aufrechterhaltung lebensfähiger Kulturen über einen Zeitraum von 30 Jahren ab dem Hinterlegungsdatum. Die Organismen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens zur Verfügung gestellt, wobei dies einer Vereinbarung zwischen Genentech, Inc. und ATCC unterliegt, was eine dauerhafte und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kulturen für die Öffentlichkeit ab der Veröffentlichung der betreffenden US Patentschrift oder ab der Offenlegung aller amerikanischen oder ausländischen Patentanmeldungen (je nachdem, welcher Fall zuerst eintritt) gewährleistet und weiters die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für denjenigen sicherstellt, der laut Entscheidung des US Kommissars für Patente und Marken gemäß 35 USC §122 und den damit in Einklang stehenden Regeln des Kommissars (einschließlich 37 CFR § 1.12 unter bsonderem Hinweis auf 886 OG 638) dazu berechtigt ist.

Bezüglich jener Bezeichnungen, unter denen ein europäisches Patent angestrebt wird, wird eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus bis zur Veröffentlichung der Mitteilung der Erteilung des europäischen Patents oder bis zum Tag, an dem die Anmeldung zurückgewiesen oder zurückgezogen wurde oder als zurückgezogen gilt, verfügbar gemacht, wobei dies durch die Ausgabe einer solchen Probe nur an einen Sachverständigen erfolgt, der durch die die Probe anfordernde Person benannt wird (Regel 28(4) EPÜ).

Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung willigte ein, daß im Falle des Absterbens, des Verlusts oder der Zerstörung der unter geeigneten Bedingungen kultivierten hinterlegten Kulturen diese nach einer Mitteilung durch ein lebensfähiges Exemplar der gleichen Kultur umgehend ersetzt werden. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stamms darf nicht als Bewilligung einer Durchführung der Erfindung ausgelegt werden, die den Rechten zuwiderläuft, die gemäß den Vollmachten jeder Regierung in Einklang mit deren Patentgesetzen gewährt werden.

BEISPIELE BEISPIEL 1 SCHIMPANSEN-IMPFUNGS-UNTERSUCHUNG

Laut bisher veröffentlichter Literatur entwickelten mit rekombinantem gp120 (rgp120) immunisierte Schimpansen eine humorale und zelluläre Immunität gegenüber Virus- Proteinen, doch die Impfung mit diesem Präparat konnte in vivo keinen Schutz vor HIV- 1-Infektion bieten (z.B. Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200-5204, 1988 und ander Verweise, unten). Überraschenderweise zeigt die vorliegende Untersuchung einen Impfstoff, der sehr wohl Schutz bot.

Die in dieser Untersuchung verwendeten Proteine waren gereinigte Präparate von rekombinantem Protein, das in Säugetier-Zellkultur exprimiert und an Aluminiumgel adsorbiert wurde.

Das rgp120-Protein (Fig.3A) besteht aus dem gp120-Fragment des HIV-1-Hüll- Glykoproteins, das an eine kurze, N-terminale Sequenz des Herpes simplex-Virus- Glykoproteins D fusioniert wurde, um die Expression zu erleichtern. Das sgp160-Protein ist eine Variante von gp160, worin die Transmembran-Domäne und der zytoplasmische Schwanz gelöscht wurden, um zu ermöglichen, daß das Protein von Säugetierzellen sekretiert wird. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise wie das authentische, virale gp120 glykosyliert und binden sich mit hoher Affinität an CD4, den Zell-Rezeptor für HIV-1.

Die in dieser Untersuchung verwendeten Immunogene (rgp120 und sgp 160) wurden mittels unterschiedlicher monoklonaler Antikörper für jedes Antigen wie oben beschrieben durch Immunaffinitäts-Chromatographie gereinigt. Neben der Abwesenheit kontaminierender Proteine besteht ein Hauptunterschied zwischen dem in der vorliegenden Untersuchung und in früheren Untersuchungen verwendeten gp120 darin, daß die vorliegende Untersuchung gp120 verwendete, das nicht proteolytisch gespalten worden war. Die Bewertung des in früheren Untersuchungen verwendeten Materials zeigt, daß etwa 50% des gp120 in rekombinanten Präparaten bei Aminosäure 315 proteolytisch gespalten wurde, um Peptide zu ergeben, die auf SDS-PAGE-Gelen mit Mobilitäten von 50 kD und 75 kD wanderten. Die Autoren bestimmten, daß diese Proteolysestelle in der Mitte eines haupttyp-spezifischen, neutralisierenden Epitops angeordnet ist (in Fig.1 als IV dargestellt). In der vorliegenden Untersuchung wurde ungespaltenes gp120 verwendet, doch das verwendete sgp160-Präparat zeigte etwa 50% Proteolyse an dieser Position.

In der vorliegenden Untersuchung wurden zwei Schimpansen mit dem 140-150 kD- sgp160-Protein und zwei Schimpansen mit dem 120-130 kD-rgp120-Protein immunisiert. Ein Plazebo-Vergleichstier wurde mit der gleichen Menge an rekombinantem Glykoprotein D (gD-1) des Herpes simplex-Virus-Typ1 immunisiert, das in Säugetier-Zellkultur exprimiert, nach einem ähnlichen Verfahren wie das rgp120 gereinigt (Berman et al., Science 277: 1490-1492 (1985)) und auf Aluminiumgel adsorbiert worden war. Genauer gesagt wurden alle Tiere mit 1 ml eines Antigenpräparats mit einer Dosis von 300 ug Protein pro Tier und Immunisierung immunisiert.

Alle Antigene wurden in einem Aluminiumhydroxid-(Alum-)Adjuvans (Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200-5204 (1988) (0,5 mg/ml Al³&spplus;) in phosphatgepufferter Salzlösung (0,016 M PO&sub4;, pH 6,2, 0,15 M NaCl, 0,004 M KCl) formuliert, wobei dies das einzige Adjuvans ist, das derzeit in den Vereinigten Staaten für Impfstoffprodukte zugelassen ist.

Das verwendete Immunisierungsprogramm unterschied sich von allen veröffentlichten HIV- oder SIV-Impfstoffversuchen, ähnelte jedoch jenem des Hepatitis B-Virus- Impfstoffs, der gute Ergebnisse bei Dosisintervall-Untersuchungen anderer Primaten erbrachte (Anderson et al., J. Infect. Diseases 160: 960-969 (1989). Die Tiere erhielten eine primäre Immunisierung mit ungespaltenem rgp120 oder sgp 160 zum Zeitpunkt 0, gefolgt von Auffrischungs-Immunisierungen nach 4 und 32 Wochen. Versuchs- und Vergleichspräparate wurden an zwei Stellen intramuskulär verabreicht (0,5 ml/Stelle).

Von jedem Tier wurden in zweimonatlichen Intervallen Blutproben entnommen und mittels einiger Assays analysiert. Neben immunologischen Assays (z.B. Antikörper-Titer für gp120, Lymphozytenproliferations-Assays) wurden der Wert der T-Zellen- Untergruppen, die Enzym-Werte im Serum und die klinische Chemie kontrolliert. Wie bereits erwähnt stellten die Anmelder bei den Lymphozyten-Untergruppen, der Lymphozytenfunktion, den Enzym-Werten im Serum oder der Blutchemie keine Anomalien aufgrund der Immunisierung mit diesen Proteinen fest. Bedenken, daß die Immunisierung mit rgp120 oder sgp160 zu unerwünschten Nebenwirkungen führten könnte (z.B. Immunsuppression oder Autoimmunität), konnten daher durch diese Untersuchungen nicht bestätigt werden.

Nach der primären Immunisierung wurden geringe Mengen von Antikörpern gegen sgp160 (doch nicht gegen rgp120) durch im Handel erhältliche HIV-1-Immunblot- Assays (Dupont or Biorad), aber nicht (Fig.6A) mittels eines Flüssigphasen- Radioimmunfällungsassays (RIA) oder einem im Handel erhältlichen HIV-1- Antikörpertests (ELISA, Genetic Systems), nachgewiesen. Eine zweite Immunisierung nach 4 Wochen bewirkte eine mäßige humorale und zelluläre Immunreaktion auf beide von HIV-1 stammenden Immunogene, die in einem Flüssigphasen- Radioimmunfällungsassay (RIP) (Fig.6A) und Immunblot-Assays (Daten nicht dargestellt), jedoch nicht durch ELISA nachgewiesen werden konnten. Die dritte Immunisierung nach 32 Wochen (d.h. 7 Monate nach der zweiten Immunisierung) führte zu einer deutlichen Zunahme der in allen drei Antikörperassays offensichtlichen Antikörper-Titer (Figuren 6 und 7). Die Immunblot-Analyse (Fig.7) des 3 Wochen nach der letzten Auffrischung (Woche 35) entnommenen Serums zeigte, daß die Empfänger von rgp120 stark auf HIV-1-g120 und weniger stark auf gp160 reagierten. Mit rgp160 immunisierte Tiere reagierten wie beabsichtigt auf virales gp160 und g41 sowie gp120. In Immunblots waren auch Antikörper zu erkennen, die mit Proteolyse-Abbauprodukten von gp120 reagierten. Die Zellimmunität (angezeigt durch die Fähigkeit von rgp120, die Lymphozytenproliferation zu stimulieren) konnte zu diesem Zeitpunkt in den mit rgp120 und sgp160 immunisierten Tieren, jedoch nicht im Vergleichstier festgestellt werden (Tabelle 2).

Die Zunahme der Antikörper-Titer für rgp120 und sgp160, die man nach der dritten Immunisierung beobachten konnte, fiel mit dem Auftreten neutralisierender Antikörper zusammen (Robertson et al., J. Virol. Methods 20: 195-202 (1988)) (Fig.8A). Die für das Erreichen des Maximums des neutralisierenden Titers erforderliche Zeit variierte zwischen 2 und 4 Wochen nach der Auffrischung, jedoch konnte kein signifikanter Unterschied in der Größenordnung der Maxima der in vitro-neutralisierenden Titer zwischen den mit rgp120 und mit sgp160 immunisierten Tieren festgestellt werden. Ein Tier aus jeder Gruppe zeigte ein Maximum an neutralisierenden Titern von 1:640, während die übrigen Tiere in jeder Gruppe Titer-Maxima von 1:320 besaßen. Offensichtlich waren diese neutralisierenden Responses weitaus größer als die zuvor beobachteten (Berman et al., 1988, oben), worin die Neutralisierungsaktivität von Seren für rgp120 nur bei einer Verdünnung von 1:5 in einem Neutralisierungsassay mit vergleichbarer Empfindlichkeit nachgewiesen werden konnte. Somit bewirkten die in der vorliegenden Untersuchung verwendeten Immunogene und Immunisierungsverfahren eine neutralisierende Reaktion, die 1 bis 2 Größenordnungen stärker war, als zuvor beobachtet.

Auf der Grundlage signifikanter Mengen neutralisierender Antikörper fuhren die Anmelder mit einer Virusexposition dieser Tiere fort. Allen 5 Tieren wurden 3 Wochen nach der letzten Immunisierung (Woche 35) etwa 40 infektiöse Gewebskultur- Dosiseinheiten (TCID&sub5;&sub0;) des Virus aus einem Standard-Impfmaterial des IIIb-Isolats von HIV-1 intravenös injiziert (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. L. Arthur, National Cancer Institute, National Institute of Health, Bethesda Maryland, USA), das für viele andere Schimpansen-Infektiositätsuntersuchungen verwendet worden war (Arthur et al., oben und Prince et al., oben). Das Hüllprotein aus diesem Isolat ist bezüglich der Aminosäuresequenz zu 98% mit jenem oben beschriebenen identisch, das zur Herstellung der rgp120- und sgp160-Immunogene verwendet wurde.

Nach der Virusexposition unterschied sich die Größenordnung und Dauer der Anti-rgp-120-Antikörperreaktion in den mit rgp120 immunisierten Tieren deutlich von den anderen Tieren in der Untersuchung. Der Titer von Anti-gp120-Antikörpern in diesen Tieren (gemessen mittels RIA) erhöhte sich nach der Virusexposition nicht, sondern sank allmählich auf die Ausgangswerte (Tabelle 2). Der Titer der Anti-gp120-Antikörper in den mit sgp160 immunisierten Tieren stieg jedoch etwa 7-8 Wochen nach der Virusexposition leicht an, stieg dann auf einen Titer, der etwas höher war als das durch Hyperimmunisierung erzielte Maximum und pendelte sich dann bei einem mittleren Titer ein. Diese Ergebnise legten nahe, daß die HIV-1-Exposition der mit sgp160 immunisierten Tiere zu einer viralen Infektion und zur Produktion von ausreichenden Mengen an viralem Protein führte, um eine anamnetische Immunreaktion zu stimulieren. Die Beobachtung, daß der Titer von Antikörpern gegen gp120 in den mit rgp120 immunisierten Tieren nach der Exposition nicht zunahm, sondern im Verlauf der Zeit verschwand, deutet darauf hin, daß keine produktive Infektion eintrat. Mit rgp120 reagierende Antikörper wurden im Vergleichstier mittels RIA 16 Wochen nach der Exposition festgestellt, was darauf hindeutet, daß auch dieses Tier mit HIV-1 infiziert wurde.

Die Analyse dieser Seren mittels ELISA unter Verwendung eines im Handel erhältlichen HIV-1-Antikörperassays (Fig.6B) zeigt ein Aktivitätsmuster, das sich jenem beim Anti- gp120-RIA erhaltenen unterscheidet. In diesem Assay wurden Antikörper gegen HIV-1 erst nach der dritten Immunisierung nachgewiesen, und die Antikörperreaktion war in den mit rgp160 immunisierten Tieren deutlich höher als in den rgp120-Tieren. Die Differenz spiegelt die Tatsache wider, daß die im Handel erhältlichen HIV-1- Antikörperassays typischerweise weniger gp120 als gp41 besitzen. Seren aus den mit rgp160 immunisierten Tieren ergaben in diesem Assay eine heftige Reaktion, da sie Antikörper gegen gp41, sowie gp120 enthielten. Das Vergleichstier zeigte zu keinem Zeitpunkt vor der HIV-1-Infektion Anzeichen von mit HIV-1 reagierenden Antikörpern. Die HIV-1-Antikörpertiter in den mit rgp160 immunisierten Tieren nahm über einen Zeitraum von etwa 6-7 Wochen nach der Virusexposition ab und stieg dann auf einen ähnlichen Wert wie er durch Hyperimmunisierung erzielt wurde, um dann auf mittlere Werte zu sinken. ELISA-Titer in den mit rgp120 immunisierten Tieren stiegen hingegen nicht, sondern sanken nach der Exposition innerhalb von 7 Wochen allmählich auf die Basiswerte ab (Tabelle 2, Fig.6B). Dieses Ergebnis war eine weitere Bestätigung, daß es in den mit rgp120 immunisierten Tieren keine ausreichende Replikation von HIV-1 gab, um eine Immunreaktion auf irgendein virales Antigen hervorzurufen, das im HIV-1- Antikörperassay enthalten war. Das Vergleichstier war am Ende der Exposition in diesem Assay negativ, wurde aber als Reaktion auf die virale Infektion 13 Wochen nach der Exposition positiv, was anzeigte, daß dieses Tier mit HIV-1 infiziert war.

Die Immunblot-Analyse von Schimpansen-Seren zeigte, daß zum Zeitpunkt der Exposition die Seren der mit rgp120 und sgp160 immunisierten Tiere Antikörper gegen die HIV-1-Hüll-Glykoproteine, jedoch nicht gegen die Kernproteine aufwiesen (z.B. p17, p24 und p55). Serologische Beweise für die HIV-1-Infektion in den beiden mit sgp160 immunisierten Tieren wurden erstmals 5 Wochen nach der Exposition festgestellt, als eine schwache p24-Bande sichtbar wurde (Daten nicht dargestellt). Antikörper gegen p17 und p55 wurden zu späteren Zeitpunkten sichtbar (Tabelle 2, Fig. 7). Antikörper gegen p24 wurden in den Seren des Vergleichstiers zum ersten Mal 9 Wochen nach der Exposition nachgewiesen (Daten nicht dargestellt), und die Reaktivität mit p17, p55 und gp120 konnte zu späteren Zeitpunkten festgestellt werden. Interessanterweise war die Intensität der Antikörperreaktion auf HIV-1-Strukturproteine (z.B. p55, p24 und p17) in den mit sgp160 immunisierten Tieren (Fig.7) viel größer als im Vergleichstier. Antikörper gegen gp120 waren zum Zeitpunkt der Exposition in den mit rgp120 immunisierten Tieren vorhanden, waren jedoch 13 Wochen nach der Exposition größtenteils verschwunden (Fig.7). Es ist bedeutsam, daß bei den mit rgp120 immunisierten Tieren ab 26 Wochen nach der Exposition keine Serumsumwandlung zu irgendeinem der HIV-1-kodierten Proteine mit Ausnahme von gp120 festzustellen war, was nahelegt, daß sie gegenüber HIV-1-Infektion resistent waren.

Veränderungen in der Konzentration neutralisierender Antikörper nach HIV-1-Exposition ensprachen den in den Anti-gp-120-Titern beobachteten (Figuren 6A und 7). Somit bewirkte die 32 Wochen-Immunisierung eine große Menge an neutralisierenden Antikörpern in den mit rgp120 und sgp 160 immunisierten Tieren, die über den Zeitraum der HIV-1-Infektion nach 35 Wochen anhielt (Tabelle 2). Die neutralisierenden Titer in den mit rgp120 immunisierten Tieren erzielte zum Zeitpunkt der Virenexposition maximale Titer, und das n näherte sich nach 60 Wochen stetig dem Wert der Seren vor der Immunisierung. Die neutralisierenden Titer in beiden mit sgp160 immunisierten Tieren sanken über mehrere Wochen, stiegen aber 7 Wochen nach der Exposition rasant an - vermutlich als Reaktion auf die Produktion viraler Proteine. Die neutralisierenden Titer stiegen in einem der sgp160-Tiere innerhalb von 13 Wochen nach der Exposition auf Werte von 1:1280 an. Neutralisierende Antikörper wurden im Vergleichstier erst 17 Wochen nach der Exposition nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Assays lieferten weitere Beweise, daß sich HIV-1 nicht in den mit rgp120 immunisierten Tieren, jedoch im Vergleichstier und den mit sgp160 immunisierten Tieren replizierte.

Es erfolgten Virus-Cokultivierungs-Untersuchungen, um zu bestimmen, ob lebensfähiges Virus aus einem der immunisierten Tiere gewonnen werden könnte. HIV-1 konnte aus dem Vergleichstier und den mit sgp160 immunisierten Tieren 6-7 Wochen nach der Exposition gewonnen werden (Tabelle 2), wurde aber zu keinem Zeitpunkt bis zu 6 Monaten nach der Exposition aus einem der beiden mit rgp120 immunisierten Tiere gewonnen. Weitere Beweise für die HIV-1-Infektion im Vergleichstier und den beiden mit sgp160 immunisierten Tieren lieferte die PCR-Analyse (Tabelle 2), worin provirale DNA in diesen Tieren, jedoch nicht in den mit rgp120 immunisierten Tieren nachgewiesen werden konnte. Zusammengefaßt weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß die Immunisierung mit rgp120 eine schützende Immunreaktion hervorrief, die die Infektion dieser Tiere durch HIV-1 bedeutend verzögerte oder völlig verhinderte.

Da die Mengen neutralisierender Antikörper, die in den mit rgp120 und sgp160 immunisierten Schimpansen vorhanden waren, während des Zeitraums von 4 Wochen nach der letzten Auffrischungsimpfung im wesentlichen identisch waren, war es überraschend, daß nur die mit rgp120 immunisierten Tiere vor HIV-1-Infektion geschützt waren. Eine Erklärung für die Differenz der Anfälligkeit gegenüber HIV-1- Infektion zwischen den beiden Gruppen von Tieren besteht darin, daß am eigentlichen Tag der Virusexposition die mit sgp160 immunisierten Tiere etwas niedrigere Neutralisierungstiter (d.h. 1:160) aufwiesen als die mit rgp120 immunisierten Tiere, die Neutralisierungstiter von 1:320 und 1:640 aufwiesen. Falls die Menge der am eigentlichen Expositionstag vorhandenen Antikörper von essentieller Bedeutung ist, legen die Daten der Anmelder nahe, daß Titer von > 1:160 zur Verhinderung von Infektion erforderlich sind. In Abwägung aller Faktoren erachteten es die Anmelder als unwahrscheinlich, daß es eine solche klare Schwelle beim Schutz vor Infektion gibt und postulierten, daß auch andere Faktoren beteiligt sein können.

Zusätzliche Untersuchungen dienten der Bestimmung, ob Antikörper gegen spezifische Epitope mit funktionaler Bedeutung mit dem Schutz besser korrelieren. Die Anmelder waren der Ansicht, daß Antikörper, die die Bindung von gp120 an CD4 blockieren können, möglicherweise eine wichtige Rolle spielen. Es wurde bereits angemerkt (Berman et al., J. Virol. 63: 3489-3498 (1989); Lasky et al., Cell 50: 975-985 (1987)), daß sowohl rgp120 als auch sgp160 bei der Bildung von Antikörpern, die diese Wechselwirkung störten, wirkungsvoll waren. Die Analyse der Seren zum Expositionszeitpunkt zeigte, daß alle Tiere mit den von HIV-1 stammenden Immunogenen Antikörper besaßen, die die CD4-Bindung blockierten und daß der Blockierungstiter mit dem Schutz vor Infektion oder dem Neutralisierungstiter nicht korrelierte (Tabelle 2). Eine weitere in Betracht gezogene Möglichkeit bestand in der Klärung der Frage, ob eine Subpopulation neutralisierender Antikörper für den Unterschied bezüglich des Schutzes zwischen den mit rgp120 und sgp160 behandelten Tieren verantwortlich ist. In diesen Untersuchungen wurden die Seren auf Antikörper geprüft, die mit einem Peptid innerhalb der V3-Domäne von gp120 reagieren, die bekanntermaßen die haupttyp-spezifische Neutralisierungsdeterminante (MND) enthält (Matsushita et al., J. Virol. 62: 2104-2114 (1988)).

Antikörper gegen dieses Epitop wurden mittels eines ELISA-Assays nachgewiesen, der ein synthetisches MND-Peptid, RP135, enthielt, wie dies durch Matsushita, ebda., beschrieben ist. Beim Vergeich der Seren der mit rgp120 und sgp160 immunisierten Tiere stellte sich heraus, daß sich der an das MND-Peptid bindende Antikörper zwischen den zwei Tiergruppen beträchtlich unterschied (Tabelle 2, Fig.8B). Zum Zeitpunkt der Exposition bestand eine fast zehnfache Differenz in der Menge der Antikörper gegen die MND in den mit rgp120 immunisierten Tieren im Vergleich zu den mit sgp160 immunisierten. Besonders interessant war die Beobachtung, daß ein Tier, das den niedrigsten mittels RIA festgestellten Anti-gp120-Titer aufwies, den höchsten Titer für MND besaß und vor Infektion geschützt war. Somit schien die Korrelation zwischen dem Schutz und der Menge der Antikörper gegen MND stärker zu sein als die Korrelation zwischen neutralisierenden Antikörpern und dem Schutz.

Der Unterschied in der Bildung von Antikörpern gegen die MND kann auf das unterschiedliche Ausmaß an proteolytischer Verarbeitung (Fig.3) zwischen den beiden Präparaten zurückzuführen sein (d.h. 40% für sgp160 und 5% für rgp120), besonders da die Spaltstelle - in diesem Fall Argininrest 312 - innerhalb einer disulfid-gebundenen Schleife angeordnet ist, die die MND enthält. Man beachte, daß die Proteolyse an dieser Position keine grundlegende Konformations-Änderung in rgp120 oder sgp160 hervorzurufen scheint, da sich proteolytisch gespaltenes Material mit hoher Affinität an CD4 binden kann (Berman und Gregory, unveröffentlichte Ergebnisse). Wie bei den RIA-Titern und den HIV-1-Antikörper-Titern stellte sich heraus, daß die Konzentration von Antikörpern gegen dieses Epitop in den rgp120-Tieren kurz nach der letzten Immunisierung (nach 32 Wochen) Maximalwerte erreichte und dann allmählich auf die Ausgangswerte sank. Antikörper aus den mit sgp160 immunisierten Tieren erreichten kurz nach der letzten Injektion ein Maximum, fielen dann über mehrere Wochen ab, stiegen dann an und blieben bei mehr als 25 Wochen nach der Exposition positiv. Antikörper gegen MND erschienen im Vergleichstier 15 Wochen nach der Infektion.

Ein weiteres bedeutsames Ergebnis dieser Untersuchungen besteht darin, daß es zumindest zwei Antikörper-Populationen gibt, die HIV-1-Infektion in vitro neutralisieren können. Eine Population wird durch rgp120 hervorgerufen und ist vermutlich auf MND gerichtet. Eine zweite Population wird durch Immunisierung mit rsgp160 hervorgerufen und auf andere Stellen als die MND gerichtet. Obwohl die Hypothese, daß in vivo- Schutz von der Präsenz von Antikörpern gegen MND abhängt, durch die Daten der mit rgp120 immunisierten Tiere unterstützt wird, kann man nicht sicher sein, daß der Mangel an Schutz in den mit sgp160 immunisierten Tieren auf einen niedrigen Wert von Antikörpern gegen MND zurückzuführen war. Eine andere Erklärung, die auch den Daten der Anmelder entsprechen würde, ist die, daß die durch sgp160 hervorgerufenen Antikörper gegen andere Stellen als MND tatsächlich in vivo-Schutz bieten können, daß aber ein anderer Faktor ihre Schutzwirkung beeinträchtigt oder aufhebt. Es wurden zahlreiche Berichte über Antikörper gegen HIV-1 veröffentlicht, die die virale Infektion in vitro eher verstärken als hemmen (Homsy et al., Science 244: 1357-1359 (1989); Robinson et al., Lancet 1: 790-794 (1988). Ein in sgp160, jedoch nicht in rgp120 enthaltenes Epitop könnte für den beobachteten Unterschied im Schutz verantwortlich sein. Diese Möglichkeit würde mit der Beobachtung übereinstimmen, daß die mit sgp160 immunisierten Tiere (x-247 und x-261) früher zu HIV-1-Kernproteinen serokonvertierten (5 Wochen nach Exposition) als das Vergleichstier (x-246), das 11 Wochen nach der Exposition serokonvertierte (Tabelle 2), und daß die Intensität der Immunreaktion, die duch den Immunblot-Assay visualisiert wurde, bei diesen Tieren viel größer war als beim Vergleichstier (Fig.7). Kürzlich wurden zwei unterschiedliche, verstärkende Epitope in einem Bereich von gp41 kartiert (Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (in Druck)), der im sgp160-Immunogen, jedoch nicht im rgp120- Immunogen vorhanden war.

Mehrere Faktoren können für den Erfolg von rgp120 in der derzeitigen Untersuchung im Vergleich zu der früheren Untersuchung der Anmelder (Berman et al., oben), worin rgp120 keinen Schutz gegen HIV-1-Infektion bieten konnte, ausschlaggebend sein. Ein beträchtlicher Unterschied bestand darin, daß die Tiere gemäß einem optimierten Immunisierungsschema immunisiert wurden, während davor ein Immunisierungsschema zum Einsatz kam, das für Untersuchungen mit Nagetieren verwendet worden war. Ein weiterer bedeutender Unterschied bestand darin, daß das in der früheren Untersuchung verwendete rgp120 nur zu 50% rein und etwa zu 50% gespalten war, während das in den vorliegenden Untersuchungen verwendete rgp120 zu < 5% gespalten war (Fig.3). Ein dritter Unterschied bestand darin, daß in der frühreren Untersuchung die Tiere 100 TCID&sub5;&sub0;-Einheiten (25 CID&sub5;&sub0;) HIV-1 exponiert wurden, während die Tiere in der vorliegenden Untersuchung 40 TCID50-Einheiten Virus (10 CID&sub5;&sub0;) exponiert wurden. Eine letzte Erklärung für den Unterschied zwischen der vorliegenden und der früheren Untesuchung betrifft die Versuchsdurchführung. Da die Verfügbarkeit von Schimpansen die Größe der Behandlungsgruppen auf einige wenige Tiere beschränkt, ist die Möglichkeit des Aufzeigens einer statistischen Signifikanz in Effizienzuntersuchungen bei Schimpansen limitiert. Somit sind negative Ergebnisse nicht interpretierbar und lassen auch keine Feststellung zu, ob das in den früheren Untersuchungen verwendete rgp120 oder das in der vorliegenden Untersuchung eingesetzte sgp160 tatsächlich einen signifikanten Wert an schützender Immunität verlieh oder nicht.

Dem Wissensstand der Anmelder zufolge stellt die vorliegende Anmeldung den ersten Bericht über einen AIDS-Impfstoffkandidaten dar, dem es gelang, Schimpansen vor HIV- 1-Infektion zu bewahren. Es ist bedeutsam, daß der hierin beschriebene Impfstoff der rekombinanten Untereinheit aus einem einzigen gereinigten Protein besteht, das gänzlich aus nicht-infektiösen Materialien gebildet wird und in einem zur Anwendung bei Menschen zugelassenen Adjuvans wirkungsvoll ist.

Tabelle 2 Immunologische und virologische Eigenschaften von Schimpansen vor und nach HIV-1-Infektion*
I. Eigenschaften zum Zeitpunkt der Virusexposition (35 Wochen) VERGLEICH Anti-gp120 Titer Antikörper gegen gp41 HIV-1 ELISA Titer Proliferation zu rgp120 Neutralisierungstiter CD4-blockierende Antikörper Anti-MND Titer II. Eigenschaften nach HIV-1-Exposition Cokultivierung von HIV-1 Zeit bis anti-p24 (Wochen) Zeit bis p17 (Wochen)

* Legende zu Tabelle 2: Antikörper-Titer gegen gp120 wurden in einem Flüssigphasen- RIA bestimmt; die dargestellten Daten zeigen log-Werte aus Verdünnungs- Endpunkttitrationen (siehe Beschreibung von Fig.6A). Die Präsenz von Antikörpern gegen gp41 und der Zeitpunkt des Auftauchens von Antikörpern gegen p24 und p17 wurden durch Immunblot-Analyse aufeinanderfolgender Blutentnahmen unter Verwendung von im Handel erhältlicher Western Blot-Streifen (Dupont und Biorad) bestimmt. Antikörper, die die Bindung von gp120 an CD4 blockieren, wurden wie oben gemessen; die Daten stellen den Logarithmus der Verdünnungs-Endpunkttitrationen dar. HIV-1-ELISA-Titer wurden in einem im Handel erhältlichen HIV-1-Antikörper-Assayset bestimmt (siehe Beschreibung von Fig.6B). Die Cokultivierung von HIV-1 und die Proliferation von Schimpansen-Lymphozyten zu rgp120 erfolgten wie bereits beschrieben. In vitro neutralisierende Antikörper wurden nach dem Verfahren von Robertson et al., oben, gemessen (siehe Beschreibung von Fig.8). Anti-MND-Titer wurden durch den oben beschriebenen ELISA-Assay bestimmt. Die PCR-Reaktivität wurde mittels des Verfahrens nach Kellog und Kwok in PCR Protocols (Innis et al., Hrsg.) 337-347 (Academic Press, New York, 1990) ermittelt. Kurz gesagt wurden gefrorene Lymphozyten in PCR-Lysepuffer verarbeitet und die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine DNA-Probe (entsprechend der Menge in 150.000-300.000 Zellen) wurde 40 Zyklen PCR unter Verwendung der SK68- und SK69-Primer unterworfen. Proben wurden auf 25 mM NaCl eingestellt und in Lösung 30 min lang bei 55ºC an 0,5 pMol Primer SK70 hybridisiert, der mit γ- markiertem [³²P]-ATP markiert war. Die Proben wurden auf einem 10%-Acrylamid- Minigel in TBE-Puffer aufgetrennt. Das Gel wurde dann getrocknet und dann dazu verwendet, einen Röntgenfilm zu belichten. Positive Vergleichs-DNA wurde aus einer gp160 exprimierenden, transfizierten CHO-Zellinie präpariert. Die DNA-Proben wurden auf ihre Fähigkeit getestet, mittels Sonden auf β-Globin amplifiziert zu werden. Die Proben galten als HIV-1-positiv, wenn der markierte Primer an eine Bande von 141 Basenpaaren hybridisierte.

BEISPIEL 2 ERZEUGUNG VON ANTIKÖRPERN 1. Erzeugung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper

Lösliche Formen von rekombinantem gp120 und gp160 wurden in chinesischen Hamstereierstock-Zellen (CHO-Zellen) gemäß den Verfahren nach Lasky et al., Science 223: 209 (1986) exprimiert und durch Affinitäts-Chromatographie aus wachstumskonditioniertem Zellkulturmedium der zuvor beschriebenen D531- und D583.DC.9-Zellinien gereinigt. Die lösliche Form von rekombinantem gp160 (sgp160 oder 683DC.7) enthielt zwei Löschungen. Die erste eliminierte 10 Aminosäuren, die die gp120/41-Spaltstelle überspannten, und die zweite löschte den hydrophoben und zytoplasmischen Transmembran-Schwanz.

Für ELISA-Assays wurde ein gp41-Fusionsprotein (LE41), das aus einem aminoterminalen Fragment des Trp E-Gens bestand, das mit 100 Aminosäuren aus dem Aminoterminus von gp41 fusioniert worden war, in E.coli exprimiert und wie oben gereinigt. Reduziertes und carboxymethyliertes rgp120 und sgp160 wurden durch Dialyse von sgp160 und rgp120 gegen Tris/HCl-Puffer gebildet, der Harnstoff und EDTA enthielt. Dithiothreitol (DTT) wurde hinzugefügt, um ein Endvolumen mit 10 mM zu ergeben, und die Proteine wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur vermischt. Iodessigsäure wurde bis zu einem Endvolumen mit 25 mM hinzugefügt, und die Proben wurden gegen Ammoniumbicarbonat-Puffer dialysiert. Diese Proteine wurden zur Beschichtung von ELISA-Platten mit 1,0 ug/ml vewendet und die gereinigten, monoklonalen Antikörper nach einer herkömmlichen ELISA-Vorschrift gescreent.

Beide löslichen Formen des HIV-env-Proteins wurden affinitätsgereinigt und dann dazu verwendet, im Handel erhältliche Balb/c-Mäuse zur Produktion monoklonaler Antikörper (MAbs) zu verwenden. Jede Maus wurde mit 20 ug rgp120 oder sgp160 (683ΔC.7) intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.v.) immunisiert und 3 Tage vor der Fusion aufgefrischt. Die Maus mit dem höchsten Antiseren-Titer wurde zur Fusion ausgewählt. Die Mäuse-Myelomlinie NP3x63-Ag8.653 wurde mit Milzzellen in einem Verhältnis von 4:1 unter Verwendung von 50%-igem Polyethylengykol fusioniert, obwohl auch andere im Handel erhältliche Myelomlinien gemäß festgelegter Verfahrensweisen verwendet werden können. Hybride wurden hinsichtlich Wachstum mit Medien selektiert, die mit Hypoxanthin und Azaserin ergänzt waren. Positive Stamm-Überstände wurden durch Screenen einzelner Näpfe gegen rgp120 oder sgp160 in einem enzymgebundenen Immunabsorptions-Assay (ELISA) identifiziert. Zellen aus reaktiven Näpfe wurden vermehrt, durch Grenzverdünnung kloniert und die Hybridomazellen in zuvor geprimte Balb/c-Mäuse injiziert. Es wurde Bauchwsser entnommen und durch Protein-A-Säulenchromatographie gereinigt.

10 stabile, monoklonale Antikörper produzierende Zellinien gegen 683DC.7 und 11 Zellinien wurden über mehrere Fusionen erzeugt. Sie waren anfänglich auf ihre Fähigkeit gescreent worden, rekombinantes gp120/gp160 in Festphasen-ELISAs zu binden. 17 der MAbs reagierten mit gp120, während die übrigen mit dem gp41- Abschnitt des Moleküls reagierten. Die Festphasen-ELISAs wurden wie folgt durchgeführt: ELISA-Mikrotiter-Platten wurden mit rekombinantem sgp160, rgp120 oder LE41 mit 1,0 ug/ml beschichtet. Nach dem Blockieren mit 0,5% BSA/PBS (Rinderserumalbumin/phosphatgepufferte Salzlösung) wurden 100 ul gereinigter Antikörper bei einer Konzentration von 10 ug/ml gemäß einem Standard-ELISA- Verfahren getestet.

Nachfolgende Assays erfolgten, um die relative Stärke der Bindung von gp120 an CD4 zu titrieren und relative Affinitäten zu ermitteln. Gereinigte Antikörper wurden gegen rgp120 oder sgp160 titriert und halbmaximale O.D. anhand einer Titrationskurve errechnet (Ergebnisse nicht dargestellt).

Ein zusätzlicher Antigen-Erfassungsassay diente dazu, Antikörper höherer Affinität auszuwählen, die lösliches Antigen binden. Näpfe mit entfernbaren Streifen aus Polystyrol von Dynatech wurden mit 0,5 ug Ziegen-Anti-Mäuse-IgG beschichtet und mit 0,5% BSA/PBS blockiert. Nach dem Waschen wurden 100 ul gereinigter Antikörper mit 10 ug/ml hinzugefügt und 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die Streifen wurden gewaschen und mit ¹²&sup5;I-683ΔC.7, 10&sup6; cpm pro Napf, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur markiert. Schließlich wurden die Näpfe gewaschen, auseinandergebrochen und auf einem Gammazähler gezählt (Ergebnisse nicht dargestellt).

19 MAbs waren Vertreter des IgG1-Isotyps, während die übrigen beiden zu IgG2a zählten. Die Isotypen wurden mittels des MonoAb-ID-EIA-Sets von Zymed (South San Francisco, CA, USA) gemäß den Angaben des Händlers zur Isotypen-Bestimmung ermittelt. Die Platten wurden mit 1,0 ug/ml mit gp160 beschichtet.

2. Epitopenkartierung monoklonaler Antikörper

Die oben beschriebenen MAbs definierten etwa 11 Epitope auf gp160. Im allgemeinen stimmten zahlreiche Epitopen-Kartierverfahren in ihren Ergebnissen überein. Auf der Grundlage von Western-Daten, ELISA-Assays mit reduziertem und carboxymethyliertem (RCM) gp160/120 und λ-gt11-Kartierung scheint die Mehrzahl der Antikörper lineare Epitope zu binden. Ein Antikörper, 6E10, scheint sich an ein Konformations-Epitop zu binden, obwohl er bei der Western Blot-Analyse eine gewisse Reaktivität bewahrt. Die Verfahren und Ergebnisse sind wie folgt.

1. Western-Immunblots: Die natürlich vorkommende proteolytische Spaltung von gp120 löst 3 Hauptpolypeptide in einem 7,5%-igen Polyacrylamid-SDS-Gel auf. Getrennt werden eine N-terminale Bande von 75.000 Dalton und eine C-terminale Bande von 55.000 Dalton, die gp120 umfassen. Eine weitere Spaltung innerhalb der C-terminalen Bande von 55.000 Dalton ergibt eine COOH-terminale Bande von 35.000 Dalton. Die Western Blot-Analyse der monoklonalen Antikörper mit diesen proteolytischen Spaltungs-Fragmenten von gp120 war für die anfängliche Kartierung der Epitope nützlich.

2. Epitopen-Kreuzkonkurrenz-ELISA: Die MAbs wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, um Epitopen-Bindungsstellen, sowohl auf dem gp120- als auch dem 160-Protein zu konkurrieren. ELISA-Mikrotiter-Platten wurden mit sgp160 oder rgp120 mit 1,0 ug/ml beschichtet. Nach dem Blockieren mit BSA/PBS wurde 50 ul gereinigter MAbs mit 100 ug/ml hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ohne Waschen wurden 50 ul jedes mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Antikörpers für eine weitere Stunde hinzugefügt. Die Platte wurde gewaschen, Substrat hinzugefügt und bei 490 nm abgelesen.

3. λ-gt11-Kartierung: Eine Sammlung wurde konstruiert, die zufällig exprimierte Abschnitte des gp160-Vorläufers, mit β-Galactosidase fusioniert, enthielt. Kurz gesagt wurde der 3,5 kb-HTLV-IIIB-bp160-Bereich mit zunehmenden Mengen an DNAse I behandelt (beschrieben in WO90/07572, veröffentlicht am 12. Juli 1990), mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase und 4 Desoxynukleotid-Triphosphaten abgestumpft und an EcoRI-Oligonukleotid-Linker ligiert. Das Material wurde auf einem 5%-igen Acrylamidgel laufen gelassen und der 100-1100 bp-Abschnitt des Gels isoliert. Die DNA in diesem Abschnitt wurde eluiert und an 1 ug von mit EcoR1 geschnittenen λ-gt11-Phage-Armen ligiert. Die ligierte DNA wurde in vitro gepackt und in E.coli 1088 amplifiziert. Die Sammlung bestand aus 1,6 x 10&sup7; unabhängigen Phagen.

Die Sammlung wurde durch Plattieren von etwa 4 x 10³ Phagen auf E.coli Y1090-Zellen gescreent. Nach der Bildung von Flecken wurde ein mit Isopropylthiogalactosid imprägniertes Nitrozellulose-Filter auf die Platte gelegt und über Nacht inkubiert. Die Filter wurden blockiert und mit MAbs inkubiert. Der kolorimetrische Nachweis des Antikörpers erfolgte mittels des an Meerrettich-Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti- Mäuse-Antikörpers.

Positiv reagierende Phagen wurden fleck-gereinigt und die DNA isoliert. Doppelstrangiges λ-DNA-Sequenzieren erfolgte bei 50ºC mit Klenow-DNA-Polymerase und Didesoxynukleotiden in Gegenwart der folgenden für das β-Galactosidase-Gen spezifischen Oligonukleotid-Primer: 5'-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3' (Umkehr- oder Carboxy-Terminus) und 5'- ATGGGGATTGGTGGCGACTCCTGGAGCCCG-3' (vorderer oder Amino-Terminus). Die beobachtete DNA-Sequenz führte zu den Koordinaten des eingefügten gp120- Fragments.

4. Peptide: Peptide aus verschiedenen Bereichen von gp120 wurden entweder synthetisiert oder durch Affinitätsreinigung verschiedener Digeste isoliert. Die Peptide wurden auf Nitrozellulose getropft und dann mit den verschiedenen monoklonalen Antikörpern umgesetzt. Ziegen-Anti-Mäuse-IgG, das an Meerrettich-Peroxidase oder iodiertes Protein A konjugiert war, wurde als Sonde für die Reaktivität monoklonaler Antikörper mit den Peptiden verwendet.

5. RCM 160/120: Die MAbs wurden mittels ELISA gegen reduziertes carboxymethyliertes (RCM) gp160/120 gescreent, um zu bestimmen, ob sie mit linearen oder Konformations-Epitopen reagierten. 683ΔC.7 und rgp120 wurden gegen Tris/HCl dialyisiert, die Harnstoff und EDTA enthielt. Am folgenden Tag wurde Dithiothreitol (DTT) hinzugefügt, um ein Endvolumen mit 10 mM zu ergeben; die Proteine wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur vermischt. Iodessigsäure wurde zu einem Endvolumen mit 25 mM hinzugefügt und die Proben 30 min lang in Dunkelheit vermischt. DTT wurde bis zu einem Endvolumen mit 100 mM hinzugefügt und die Proben gegen Ammoniumbicarbonat dialysiert. Die Proteine dienten dazu, ELISA- Platten mit 1,0 ug/ml zu beschichten, und die MAbs wurden nach einem Standard- ELISA-Verfahren gescreent.

Die Ergebnisse der Epitopen-Kartierung sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

TABELLE 3*
Western Epitop Peptide * Kursiv gedruckte MAbs wurden gegen gp120 gebildet. Alle anderen wurden gegen 683ΔC.7 gebildet.

Um die Spezifität dieser Antikörper weiter zu untersuchen und die Möglichkeit zu berücksichtigen, daß die bevorzugte Reaktivität mit gp120 oder gp160 ein für die ELISA- Assays typisches Charakteristikum darstellt, wurde die Bindung dieser Antikörper in einem Flüssigphasen-Radioimmunfällungs-Assay (RIP) analysiert. Für diese Versuche wurden rgp120 und sgp160 metabolisch mit [³&sup5;S]-Methionin markiert. Beide Proteine wurden miteinander vermischt und mit den monoklonalen Antikörpern umgesetzt. Die resultierenden Antikörper-Antigen-Komplexe wurden dann an mit Glutaraldehyd fixierten S. aureus absorbiert und die spezifisch immungefällten Proteine wie bereits beschrieben durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Fig. 5 zeigt ein Autoradiogramm, worin die 10 monoklonalen Antikörper gegen sgp160 analysiert wurden. Man sieht, daß 3 Hauptbänder durch eines oder mehrere der untersuchten Seren spezifisch immungefällt worden waren - ein Band von 140 kD, das sgp160 entsprach, ein Band von 110-120 kD, das rgp120 entsprach und ein Band von 75 kD, das die proteolytischen Abbauprodukte von gp120 und sgp160 darstellt. Vorherige, oben erwähnte Untersuchungen zeigten, daß die in rekombinanter Zellkultur produzierten gp120 und sgp160 oft zwischen den Aminosäureresten 315-316 gespalten werden. Im Fall von gp120 ergibt die Proteolyse an diesem Rest ein aminoterminales Fragment von 75 kD und ein carboxyterminales Fragment von 50 kD, das seinerseits zu kleineren Fragmenten proteolytisch gespalten wird. Die Proteolyse von sgp160 an diesem Rest ergibt 2 Fragmente mit einer 75 kD-Mobilität (gp75a und gp75b). Der Vergleich der Daten in den Tabellen 1 und 2 mit jenen in Fig.4 zeigte, daß die RIP- Daten sehr gut mit den ELISA-Daten übereinstimmen und daß die monoklonalen Antikörper 9E3, 10C1, 14F12 und 15G7 alle ausschließlich mit gp160 reagierten. Dieses Ergebnis legt nahe, daß diese Antikörper mit Epitopen auf gp41 oder mit Epitopen reagierten, die von der Wechselwirkung zwischen gp41 und gp120 abhängig waren. Man kann daraus schließen, daß die beobachtete Selektivität nicht auf ein Charakteristikum im ELISA-Format zurückzuführen war.

3. Funktion monoklonaler Antikörper

6 der monoklonalen Antikörper hemmten die Bindung von gp120 an den CD4- Rezeptor. Von diesen 6 waren 3 in der Lage, HIV-Virionen zu neutralisieren, wie dies durch eine Reduktion der Umkehr-Transkriptase-Aktivität in vitro angezeigt wird. 3 andere monoklonale Antikörper neutralisierten ebenfalls infektiöse Virionen in den in vitro-Umkehr-Transkriptase-Assays. Die Assays erfolgten gemäß den folgenden Verfahrensweisen.

1. CD4/gp120-Bindung: Monoklonale Antikörper wurden in einem Lösungsphasen- ELISA-Assay untersucht, um die CD4/gp120-Blockierungsfähigkeit zu bestimmen. ELISA- Mikrotiter-Platten wurden mit Antikörper gegen CD4 (L104.5) mit 1,0 ug/ml beschichtet. In einer getrennten Reaktionsplatte wurden gp160- oder -120-Antikörper mit löslichem rgp120 über Nacht bei 4ºC inkubiert. Lösliches CD4 wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur hinzugefügt und der resultierende Komplex auf eine mit L104.5- beschichtete Platte übergeführt. Nichtblockiertes CD4 wurde mit an Meerrettich- Peroxidase konjugiertem Anti-CD4-Antikörper nachgewiesen (Leu3a-HRP). Falls die CD4/120-Bindungsstelle durch einen gp160/120-Antikörper blockiert wäre, würde sich lösliches CD4 an die Platte binden und durch das Peroxidasekonjugat nachgewiesen werden.

2. Synzytien-Inhibierungsassay: Monoklonale Antikörper wurden nach bekannten Vorschriften auf ihre Fähigkeit untersucht, die Synzytien-Bildung mit HIV(IIIB)- infizierten Zellen zu hemmen.

3. Umkehr-Transkriptase-Assay: Monoklonale Antikörper wurden auf in vitro- Neutralisierung von HIV in Umkehr-Transkriptase-(RT-)Assays untersucht. In diesem Assay wurden verschiedene Verdünnungen von Antiseren mit einer Stammlösung des IIIb-Isolats von HIV-1 inkubiert. Das mit Antikörper behandelte Virus wurde dann - wie dies in der Literatur bereits beschrieben wurde - zu einer Kultur von H9-Zellen hinzugefügt und der umkehr-transkriptase-spezifische Einbau von Thymidin nach 7 Tagen gemessen. Von den 10 untersuchten Antikörpern wurde bei 4 festgestellt, daß sie die HIV-1-Infektiosität in diesem Assay hemmten. Stark verringerte Werte der Umkehr- Transkriptase-Aktivität in infizierten CD4&spplus;-T-Lymphozytenkulturen zeigen möglicherweise die Neutralisierung des Virus durch den monoklonalen Antikörper an. Ein positives Ergebnis zeigt eine RT-Inhibierung von mehr als 50% bei einer minimalen Verdünnung von 1:10 an (etwa 50-100 ug/ml).

Die Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

TABELLE 4*
Synzytien RT Assay Hemmt * Kursiv gedruckte MAbs wurden gegen gp120 gebildet. Alle anderen wurden gegen 683ΔC.7 (gp160) gebildet.

4. Besprechnung

Von den 21 monoklonalen Antikörpern, die 11 verschiedene Epitope von gp160 definieren, identifizierten 9 auf der Grundlage der verfügbaren Assays funktionale Epitope von gp120. 6 dieser Antikörper blockierten die gp120/CD4-Wechselwirkung. Von diesen 6 banden 3 Anti-rgp120- und ein Anti-683ΔC.7-MAb einen Bereich von gp120, der als entscheidend für die CD4-Bindung definiert wurde (Lasky et al., oben). Die beiden anderen blockierenden Antikörper 6E10 und 5B3, die gegen 683ΔC.7 gebildet wurden, scheinen Bereiche zu binden, die nicht in enger sequentieller Nähe zum bereits besprochenen CD4-Bindungsbereich stehen. Ob sie sterisch oder durch eine bestimmte andere Wechselwirkung blockieren, ist nicht bekannt. Das Interesse an 6E10- und 5B3-Antikörpern wird weiters durch deren Fähigkeit erhöht, das Virus zu neutralisieren, wie dies in den Umkehr-Transkriptase-Assays angezeigt wird. Es ist möglich, daß diese Antikörper andere für die Infektiosität entscheidende Bereiche von gp120 definieren.

Die 10D8-, 11G5- und 10F6-Antikörper, die auch gegen 683ΔC.7 gebildet wurden, binden einen Bereich von 24 Aminosäuren (Aminosäuren 301-324), der in früher veröffentlichten Berichten als RP-135 bezeichnet wird (Matsushita et al., J. Virol. 62(6): 2107-2114, 1988). Die Daten aus dem Synzytien-Inhibierungsassay stimmten mit anderen Berichten über die Antikörper gegen dien RP-135-Bereich überein. Es ist nicht genau bekannt, wie dieser Bereich an der Neutralisierung beteiligt ist, doch ist bekannt, daß er außerhalb der gp120/CD4-Bindungsstelle liegt. Noch bedeutsamer ist, daß dieser Bereich die innere gp120-Spaltstelle (der Aminosäuren 315-316) überspannt. Diese Antikörper oder andere Antikörper gegen diesen Bereich dienen dazu, gespaltenes gp120 abzutrennen, wenn ein Präparat von ungespaltenem gp120 gewünscht wird.

Andere monoklonale Antikörper banden Epitope von gp120, die unter den verschiedenen Isolaten in hohem Maße konserviert sind, jedoch wurde für diese Bereiche noch keine Funktion festgestellt. Obwohl einige rgp120- und sgp160-MAbs das gleiche Epitop zu binden scheinen, zeigen nur die gegen sgp160 gerichteten funktionale Aktivität. Dies legt nahe, daß das 683ΔC.7-Molekül jene Konformations- Struktur bewahren kann, die für die Erzeugung neutralisierender MAbs entscheidend ist.

In den Untersuchungen erforschten die Autoren die Kreuzreaktivität von Antikörpern gegen das IIIb-Isolat von HIV-1 mit anderen Isolaten. Da die Sequenz von gp120 für eine große Anzahl an HIV-1-Isolaten bestimmt wurde, könnten die Daten bezüglich der Kreuzreaktivität für Epitopenkartierungs-Untersuchungen nützlich sein. Für diese Untersuchungen wurden die env-Gene von 5 verschiedenen Isolaten von HIV-1 mutagenisiert, um in der Nähe des authentischen Terminus von gp120 ein Stopcodon einzufügen. Zur Verstärkung der Expression in Säugetierzellen wurden die Signalsequenzen gelöscht und durch jene von Glykoprotein D des Herpes simplex- Virus-Typ1 ersetzt (siehe oben). Die Reaktivität dieser Isolate mit den monoklonalen Antikörpern gegen sgp160 wurde auf zweierlei Weise gemessen: in einem Dot-Blot- Assay mittels eines teilweise gereinigten, an Nitrozellulose gebundenen Hüll- Glykoproteins und in einem Radioimmunfällungs-Assay.

Zur Messung der Reaktivität der monoklonalen Antikörper mit authentischen, von HIV-1 stammenden, viralen Proteinen wurden Immunoblot-Streifen von Dupont verwendet. In diesen Untersuchungen wurden 10 ul Aszites in Blockierungspuffer auf 3 ml verdünnt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit den Nitrozellulose-Streifen inkubiert. Die Streifen wurden dann dreimal mit 3 ml Blockierungspuffer gewaschen und dann 1 Stunde lang mit einer 1:1000-Verdünnung von an alkalischer Phosphatase konjugiertem, affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Mäuse-Immunoglobulin inkubiert. Die Streifen wurden anschließend dreimal gewaschen und mit einem Phosphatase-Entwicklungsset eingefärbt, das bei Kirlegaar und Perry erhältlich ist. Die Ergebnisse dieser Vorgangsweise sind in Fig.4 dargestellt.

Wie aus Fig.4 zu erkennen, konnten die monoklonalen Antikörper 13H8 und 5B3 mit allen untersuchten Isolaten reagieren. Eine ähnliche Analyse erfolgte mit einer Vielzahl der zuvor beschriebenen monoklonalen Antikörper gegen gp120. In diesen Untersuchungen stellte sich heraus, daß ein weiterer Antikörper (6D8) mit allen untersuchten Isolaten reagierte.

Zur Untersuchung, ob diese monoklonalen Antikörper an zytotoxische Agentien gekoppelt und als Immunotoxin-Konjugate verwendet werden können, wurde die Fähigkeit dieser Antikörper gemessen, sich in Gegenwart menschlicher Seren, die hohe Werte an Antikörpern gegen gp120 enthalten, an env-Glykoproteine zu binden. Um zu ermitteln, ob monoklonale Antikörper gegen gp120 durch die in den Seren von mit HIV-1 infizierten Individuen vorhandenen Antikörper gehemmt werden, erfolgten kompetitive Bindungsassays. ELISA-Mikrotiter-Platten wurden mit gp160 mit 1 ug/ml beschichtet, blockiert und gewaschen. Normale menschliche Seren wurden dann 1:10 oder 1:100 hinzugefügt und eine aktive Fraktion von Seren aus mit HIV-1 infizierten Individuen mit 100 ug/ml hinzugefügt. Die Seren wurden 1 Stunde lang vor- und dann mit verschiedenen Konzentrationen gereinigter monoklonaler Antikörper mit 100 ug/ml inkubiert. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Platten gewaschen und Antikörper mit GAM-HRP nachgewiesen.

Die Autoren stellten fest, daß die monoklonalen Antikörper selbst in Gegenwart unverdünnter, menschlicher Seren zur Bindung fähig waren. Dieses Ergebnis war etwas überraschend und legt nahe, daß entweder die monoklonalen Antikörper gegen andere Epitope gerichtet waren als jene, die durch Antikörper in menschlichen Seren erkannt werden, oder daß die Konzentration und/oder Affinität eines monoklonalen Antikörpers gegen ein bestimmtes Epitop viel höher ist als die Konzentration und/oder Affinität von Antikörpern gegen ein bestimmtes Epitop in menschlichen polyklonalen Seren. Somit könnten diese monoklonalen Antikörper passiv übertragen werden und binden sich vermutlich in Gegenwart hoher Konzentrationen menschlicher Seren an HIV-1- Glykoproteine.

BEISPIEL 3 HERSTELLUNG VON UNGESPALTENEM GP120 DURCH REKOMBINANTE ZELLKULTUR

Es wurden rekombinante Zellkultur-Verfahren entwickelt, die ungespaltene HIV-env- Polypeptide liefern (in diesem Beispiel rgp120), die im wesentlichen frei von gespaltenen gp120-Fragmenten sind. Aktuelle Ansätze zur Zellkultur-Optimierung finden sich bei Mather, Methods in Enzymology, Bd. 185, Kapitel 43, S. 567-577 (1990).

Chinesische Hamster-Eierstockzellen, die mit einem HIV-Hüllengen-Expressionsplasmid transfiziert worden waren (CHO-DHFR&spplus;) (Lasky, L.A. et al., Science 223: 209; 1986) wurden zur Herstellung des in diesem Beispiel verwendeten rgp120 herangezogen. Eine Ausgangs-Vorratsrotationskultur wurde mit etwa 3,11 x 10&sup5; Zellen/ml initiiert und in 1,5 Litern eines selektiven Mediums gezüchtet, das einen niedrigen Glukose-Wert (3,2 g/l), 7,5% diafiltriertes fötales Rinderserum und 3,7 ml 1,0 mM Methotrexat enthielt. Die Kultur wurde auf einem magnetischen Rührer in einem 37ºC-(30-41ºC-)Inkubator bei etwa 40-50 U/min aufbewahrt. Nach 4 Tagen erreichte die Kultur eine Dichte von etwa 15,0 x 10&sup5; Zellen/ml (etwa 98% Lebensfähigkeit). Etwa 800 ml dieser Rotationsvorratskultur wurde in Rollflaschen gefüllt, die etwa 7200 ml des gleichen selektiven Mediums wie oben enthielten. Die Rollflaschen wurden 4 Tage lang auf Rollgestelle mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,3 U/min bei 37ºC (36-40ºC) gelegt. "Dulbecco's modified Eagle's Medium" oder "Ham's F12/DME GHT&supmin; Medium" sind ebenso geeignet wie im Handel erhältliche Medien, die für das Wachstum von Zellen bestimmt sind, die häufig zur Expression rekombinanter Proteine verwendet werden, wie z.B. CHO, (z.B. das CHO-Medium von Hana Biologicals).

Nach 4 Tagen wurde das selektive Medium aus den Rollflaschen geleert; die Flaschen wurden ausgespült und dann mit etwa 300 ml des nicht-selektiven Mediums gefüllt, das einen hohen Glukose-Wert (4,3 g/l), Methotrexat wie oben und 1 % fötales Rinderserum enthielt. Es ist derzeit vorzuziehen, daß dieser Schritt der Zellkultivierung bei einem niedrigen Serumgehalt erfolgt, vorzugsweise in Medien, die etwa 0-3% Serum, noch bevorzugter 1% Serum, enthalten. Die Rollflaschen wurden bei 2-4 psi etwa 1-3 Sekunden lang durch sterile Pipetten mit 100% CO&sub2; gefüllt und dann auf Rollgestelle mit etwa 0,3 U/min und 37ºC (36-40ºC) gelegt.

Nach etwa 3 Tagen wurden Kulturen gewonnen. Zu diesem Zweck wurden die Medien in den Rollflaschen ausgeleert und durch ein 5,0 um-Millipore-Autoklaven- und ein 0,45 um-Sartorius-Filter filtriert; dann wurden 0,2 g/l Natriumazid hinzugefügt und die Ausbeute bei 2-8ºC gelagert. Zusätzliche 300 ml nicht-selektiver Medien wurden in die Rollflaschen gefüllt, und die Kulturen wurden wie oben weitere 3 Tage lang inkubiert und dann wie oben ein zweites Mal abgenommen.

Die gewonnenen Materialien wurden durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Affinitäts-Chromatographie (siehe Lasky et al., oben, 1986) gereinigt. Es erfolgten zusätzliche Reinigungsschritte, darunter Gelpermeations- Chromatographie und Anionenaustausch-Chromatographie, doch es war vorzuziehen, die Kationenaustausch- und hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie (HIC) gemäß oben beschriebener Standardvorschriften anzuwenden.

Es wurden auch Reinigungsverfahren unter Verwendung der oben geoffenbarten monoklonalen Antikörper, insbesondere 10F6, 6E10, 10D8 und 11G5, die an glyzerin- beschichtetes Glas gesteuerter Porengröße gekoppelt waren, gemäß veröffentlichter Verfahrensweisen durchgeführt.

SEQUENZAUFLISTUNG (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN

(i) ANMELDER: Genentech, Inc.

(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren und Zusammensetzungen zur Impfung gegen HIV

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4

(iv) GESCHÄFTSADRESSE:

(A) ADRESSAT: Genentech, Inc.

(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd

(C) STADT: South San Francisco

(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien

(E) STAAT: USA

(F) POSTLEITZAHL: 94080

(v) COMPUTERLESBARE FORM:

(A) TYP DES MEDIUMS: 5,25 Zoll, 360 Kb Diskette

(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patin (Genentech)

(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:

(A) ANMELDUNGSNUMMER:

(B) EINREICHUNGSDATUM:

(C) KLASSIFIZIERUNG (vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:

(A) ANMELDUNGSNUMMER: U.S.S.N. 07/504.785

(B) EINREICHUNGSDATUM: 3. April 1990

(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:

(A) NAME: Adler, Carolyn R.

(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 32.324

(C) KENNZEICHEN/AKTENZAHL: 633

(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:

(A) TELEFON: 415/266-2614

(B) TELEFAX: 415/952-9881

(C) TELEX: 910/371-7168

(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID NR.1: (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 479 Aminosäuren

(B) TYP: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.1:

(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID NR.2: (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren

(B) TYP: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.2:

(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID NR.3: (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren

(B) TYP: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.3:

(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID NR.4: (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren

(B) TYP: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.4:


Anspruch[de]

1. Ungespaltenes HIV-env zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Behandlung von AIDS.

2. Ungespaltenes HIV-env nach Anspruch 1, das ein gp 120 voller Länge oder ein Fragment davon enthält.

3. Ungespaltenes HIV-env nach Anspruch 1, das ein gp 160 voller Länge oder ein Fragment davon enthält.

4. Verwendung von ungespaltenem HIV-env zur Herstellung eines Impfstoffes gegen HIV.

5. HIV-Impfstoff, umfassend ungespaltenes HIV-env in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

6. Impfstoff nach Anspruch 5, worin ein Aminosäurerest innerhalb des ungespaltenen HIV-env mit der Ausnahme jenes an der Spaltstelle substituiert oder gelöscht ist oder das eine benachbarte Einfügung eines weiteren Aminosäurerests aufweist.

7. Impfstoff nach Anspruch 6, worin ein Fragment, das zwischen 1 und 30 N-terminale Aminosäurereste umfaßt, gelöscht ist.

8. Ungespaltenes HIV-env-Präparat, das im wesentlichen frei von gespaltenen HIV-env- Fragmenten ist.

9. Präparat nach Anspruch 8, das zumindest zu 50% frei von gespaltenen HIV-env- Fragmenten ist.

10. Zusammensetzung, die ungespaltenes gp120 umfaßt.

11. Zusammensetzung, die ungespaltenes gp160 umfaßt.

12. Verfahren zur Herstellung von ungespaltenem HIV-env, das die folgenden Schritte umfaßt:

a. In-Kontakt-Bringen eines ersten Präparats von HIV-env mit einem auf ein HIV- env-Epitop, das die Spaltstelle überspannt, gerichteten Antikörper für einen ausreichenden Zeitraum, um die Bildung eines zweiten, an den Antikörper gebundenen, ungespaltenen HIV-env-Präparats zu ermöglichen;

b. Trennen des zweiten Präparats von jedem nicht an den Antikörper gebundenen HIV-env; und

c. Gewinnen des ungespaltenen HIV-env aus dem zweiten Präparat.

13. Verfahren zum Isolieren von ungespaltenem HIV-env unter Anwendung von Affinitätschromatographie, worin ein auf ein HIV-env-Epitop, das die Spaltstelle überspannt, gerichteter Antikörper an eine Trägermatrix gebunden wird und eine HIV- env und ungespaltenes HIV-env enthaltene Lösung über eine Säule geschickt und ungespaltenes HIV-env selektiv an den matrix-gebundenen Antikörper adsorbiert wird, die Matrix mit adsorbiertem Antikörper und ungespaltenem HIV-env gewaschen wird, um nicht-adsorbiertes Material zu entfernen, und das ungespaltene HIV-env eluiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin der Antikörper die Eigenschaften eines aus 10F6, 11G5 und 10D8 ausgewählten, monoklonalen Antikörpers aufweist.

15. Verfahren zur Herstellung von ungespaltenem HIV-env, umfassend das Vermehren einer Säugetierzelle, die mit DNA transformiert ist, die für ungespaltenes HIV-env kodiert, und ungespaltenes HIV-env replizieren und exprimieren kann, wobei die Zelle in Medien mit geringem Serumgehalt vermehrt wird, sowie die Gewinnung des ungespaltenen HIV-env.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das Medium etwa 0 - 3% Serum enthält.

17. Verwendung von ungespaltenem HIV-env oder eines Fragments davon zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Behandlung von AIDS.







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