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Dokumentenidentifikation DE69116413T2 30.05.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0451896
Titel Neue Hefestämme mit erhöhtem Trehalosegehalt, Verfahren zur Gewinnung solcher Hefen und Verwendung dieser Hefen
Anmelder Gist-Brocades N.V., Delft, NL
Erfinder Driessen, Marianne, NL-2382 EN Zoeterwoude-Rijndijk, NL;
Osinga, Klaas Anne, NL-2253 TC Voorschoten, NL;
Herweijer, Margareta Adriana, NL-1018 VG Amsterdam, NL
Vertreter Diehl, Glaeser, Hiltl & Partner, 80639 München
DE-Aktenzeichen 69116413
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 25.03.1991
EP-Aktenzeichen 912006863
EP-Offenlegungsdatum 16.10.1991
EP date of grant 17.01.1996
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.05.1996
IPC-Hauptklasse C12N 1/19
IPC-Nebenklasse A21D 8/04   C12P 19/12   C12N 15/54   C12N 15/56   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Hefe, speziell Bäckerhefe.

Hintergrund der Erfindung

Es ist gut bekannt, daß zur Gattung Saccharomyces gehörende Hefestämme unter anaeroben Bedingungen zur Fermentation von Zuckern zu gleichen Mengen Kohlendioxid und Ethanol fähig sind. Die treibende Aktivität der Hefe im Teig ist ein Ergebnis dieser Aktivität. Die Geschwindigkeit der Freisetzung von Kohlendioxid und Ethanol im Teig hängt neben der Aktivität der beteiligten Enzyme von der Empfindlichkeit der Hefe gegenüber der Zuckermenge ab, die im Teig vorkommt. In Zucker-reichen Teigen kann die treibende Aktivität der Hefe aufgrund eines mit der Gegenwart des Zuckers zusammenhängenden höheren osmotischen Drucks viel niedriger sein als in mageren (nicht-gezuckerten) Teigen.

Die im Handel erhältliche Bäckerhefe wird in mehreren Formulierungen hergestellt, die frische Hefe, getrocknete Hefe und gefrorene Hefe umfassen. Frische Hefe ist als gepreßte Hefe (27- 33 % Trockengewichtsanteil) und cremige Hefe (17-23 % Trockengewichtsanteil) erhältlich. Trockene Hefe ist als aktive Trockenhefe (ADY) und als Instanttrockenhefe (IDY) mit jeweiligen Feuchtigskeitsgehalten von 6-8 % und 3-6 % erhältlich. Die Verbesserung der fermentativen Kraft von Hefe ist ein andauernder Forschungsaufwand. Sowohl die getrocknete Hefe als auch die feuchte Hefe können verbessert werden, um ihre Kohlendioxid-bildende Fähigkeit in mageren (nicht-gezuckerten) als auch in reichen (gezuckerten) Teigen so zu steigern, daß die Treibzeit verringert werden kann und/oder die Verwendung von weniger Hefe, die einen beträchlichen Kostenfaktor beim Backen darstellt, ermöglicht wird.

Rolle der Trehalose in Hefezellen

Trehalose (alpha-D-glucopyranosyl-alpha-D-glucopyranosid) ist eine wichtige Speicherverbindung in vegetativen Zellen und Sporen von Pilzen und Hefen. Trehalose scheino als hauptsächliches Speicherkohlenhydrat während der Perioden zu dienen, in denen keine Vermehrung stattfindet. Dies gilt für den Lebenszyklus, den Zellzyklus und andere Zustände, unter denen das Wachstum eingestellt wird, wie (beispielsweise) bei Hungerzuständen (J.M Thevelein (1984) Microbiol. Rev, 48, 42-59).

Trehalose wird am Ende der Reproduktionsstadien angehäuft und scheint für die Lebensfähigkeit der ruhenden Zellen wichtig zu sein (Thevelein, siehe obige Literaturstelle). Die hohen Trehalosemengen in Pilzsporen dürften auch die Resistenz der Sporen unter extremen Umweltbedingungen erhöhen, wie hohe und niedrige Temperaturen und Austrocknung. Neben einer Rolle der Trehalose für die Lebensfähigkeit von Sporen fanden einige Forscher eine Beziehung zwischen dem intrazellulären oder extrazellulären Gehalt an Trehalose und der Streßresistenz: die Trehalosemenge korreliert positiv mit der Fähigkeit der Gasentwicklung von Trockenhefe (G. E. Pollock, C. D. Holstrom (1951) Cereal Chem. 28, 493-505). Ebenfalls wurde eine positive Korrelation der Trehalosemenge mit Osmotoleranz (K.F. Mackenzie, K.K. Sing, A.D Brown (1988), J. Gen. Microbiol. 134, 1661-1966) und mit Hitzetoleranz gefunden (T. Hottinger, T. Boller, A. Wiemken, (1987), FEBS Lett. , 220, 113-115). In einer weiteren Untersuchung wurde festgestellt, daß die Menge an exogen zugegebener Trehalose mit der Dehydrierungsresistenz bei Zellen in der stationären Phase , aber nicht bei Zellen in der exponentiellen Phase korrelierte (G.M. Gadd, K Chalmers, R.H. Reed, (1987), FEMS Microbiol. Lett., 48, 249-254).

Erhöhung der zellulären Trehalosemenge

Es besteht ein Bedarf zur Herstellung einer Hefe mit höherer Qualität, wie einer Hefe, die eine höhere Fähigkeit zur Gasentwicklung aufweist. Eine solche Hefe kann durch Erhöhung des zellulären Trehalosegehalts der Hefe erhalten werden. Dies verringert aie schädigenden Wirkungen von einigen Streßformen in der Hefe. Die Erhöhung des zellulären Trehalosegehalts tritt unter Bedingungen auf, die die Wachstumsrate erniedrigen, welche beispielsweise durch Hungern, erhöhte Temperaturen und im allgemeinen durch Streßformen, wie Trocknen und Einfrieren erreicht werden. Bei der Hefeherstellung kann die niedrigere Wachstumsrate durch Erniedrigung der Melassen erreicht werden, die am Ende der Fermentation gefüttert werden. Hohe Trehalosegehalte können auch durch Anwenden von ernsten Streßformen erhalten werden, wie dies vorher erwähnt wurde. Jedoch führen diese Bedingungen zu einer Hefe mit veränderten Eigenschaften und niedriger Qualität (beispielsweise Lebensfähigkeit, Fähigkeit zur Gasentwicklung) aufgrund von Nebenwirkungen der angewandten Bedingungen (J. Jimenez, T. Benitez (1988) Curr. Genet. 119, 541-547 und G.J. Morris, L. Winters, G.E. Contson, K.J. Clarke (1983) J. Gen. Microbiol. 129, 2023-2034).

Die genetische Modifizierung der Trehalosemenge wurde durch Hefestämme erreicht, die im RAS2-Gen mutiert waren. Hefe-RAS-Proteine sind Guaninnukleotid-bindende Proteine und sind bei der cAMP Bildung beteiligt und möglicherweise auch beim Stoffumsatz der Inositolphospholipide. Sowohl RAS1 als auch RAS2 Proteine zeigen Aktivitäten bei der Bindung von Guaninnukleotiden wie auch bei der Hydrolysierung von GTP, während diese letztere Aktivität in RASval19 Mutanten ausgelöscht ist, worin die neunzehnte Aminosäure (Glycin) zu Valin verändert ist.

Die RASval19 Mutanten zeigen mehrere dominante Phänotypen, die beinhalten: (1) Unfähigkeit zur Anhäufung von Speicherkohlenhydraten, wie Glycogen und Trehalose, (2) ineffiziente Sporulation, (3) Empfindlichkeit gegenüber Nährstoffmangel und (4) Empfindlichkeit gegenüber Hitzeschockbehandlung. Stämme, denen das RAS2 Gen fehlt zeigen praktisch entgegengesetzte Phänotypen, die beinhalten: (1) Anhäufung von Speicherkohlenhydraten und (2) Sporulation sogar auf Vollmedien. Diese Mutanten können nicht effizient auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen wachsen und Zellen, die für die RAS2-Zerstörung homozygot sind, sporulieren auf Vollmedien (K. Tatchell, siehe obige Literatutstelle). Diese Phänotypen sind zu den Phänotypen der Hefen ähnlich, die im cAMP Weg betroffen sind (F. Tamanoi (1988) Biochim. Biophys. Acta., 948, 1-15).

Es sind gegensätzliche Daten veröffentlicht, die den Bezug zwischen Trehalosemengen und Trehalaseaktivität in der Zelle betreffen.

Spezifische Mutationen im RAS2 Gen führten zu niedrigen Mengen an neutraler Trehalase, dem Trehalose-mobilisierenden Enzym, und erhöhten Mengen an angehäufter Trehalose bei Zellen in der frühen stationären Phasa im Fall einer ras2&supmin; Mutation (K. Tatchell, L.C. Robinson, M. Breitenbach (1985), Proc Natl. Acad. Sci., 82, 3785-3789). Große Mengen an neutraler Trehalase und keine Anhäufung von Trehalose bei Hefezellen in der stationären Phase tritt mit einer RAS2val19 Mutation auf (T. Toda, I. Uno, T. Ishikawa, S. Powers, T. Kataoka, D. Broek, S. Cameron, J. Broach, K. Matsumoto, M. Wigler (1985), Cell, 40, 27-36). Die Resistenz gegen verschiedene Streßformen wurde in den oben genannten Mutanten nicht getestet.

In einer weiteren Untersuchung wurden Mutanten mit Defekten in der cAMP-abhängigen Proteinkinasekaskade verwendet. Eine bcyl- Mutation (cAMP unabhängige Proteinkinase) führte zu einer großen Menge an neutraler Trehalase und geringen Mengen an Trehalose, während eine cyrl-2 (ts) Mutation (thermolabile Adenylatcyclase und niedrige Mengen an cAMP) zu einer geringen Menge an neutraler Trehalase und einer normalen Menge an Trehalose im Gegensatz zu den mit den ras2-Mutanten erhaltenen Ergebnissen führte. (I. Uno, K. Matsumoto, K. Adachi, T. Ishikawa (1983) J. Biol. Chem., 258, 10867-10872).

Wie bei den physiologisch oder durch die Umgebung induzierten Modifizierungen des Trehalosegehalts der Hefe, wie das Wachstum bei höheren Temperaturen oder Hungerzuständen, haben die oben erwähnten genetisch induzierten Modifizierungen negative Nebenwirkungen neben der Erhöhung des Trehalosegehalts. Daher ist die Modifizierung des Trehalosegehalts genetisch über diese Mutationen nicht für die industrielle Anwendung brauchbar.

Entgegengesetzte Ergebnisse über die Existenz einer direkten Beziehung zwischen der Menge an neutraler Trehalase und der Trehalosemenge in der Hefe wurden von zwei verschiedenen Forschergruppen präsentiert, beispielsweise lassen sich ras2&supmin; Mutanten, die einen niedrigeren Gehalt an neutraler Trehalase aufweisen und einen höheren Gehalt an Trehalose mit cyr1-2(ts) Mutanten, die einen niedrigeren Gehalt an neutraler Trehalase aufweisen aber keinen höheren Trehalosegehalt, vergleichen.

Regulation des Trehalosemetabolismus in der Hefe

Die Trehalose wird unter Katalyse durch die Trehalose-6- phosphatsynthase aus Glucose-6-phosphat und UDP-Glucose unter Bildung von Trehalose-6-phosphat synthetisiert, das dann zu Trehalose durch die Trehalose-6-phosphatphosphatase umgewandelt wird. Panek und Mitarbeiter (A.C Panek, P.S. De Araujo, V. Moura-Neto und A.D. Panek (1987) Curr. Genet. 11, 459-465) beschreiben, daß die Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität durch die cAMP-abhängige Proteinkinase inaktiviert wird Andere beschreiben jedoch, daß die Trehalose-6-phosphatsynthase nicht von der cAMP-abhängigen Proteinkinase beinfußt wird (A. Vandercammen, J. Francois und H. Hers (1989) Eur. J. Biochem., 182, 613-620). Die Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität wurde in stationären Zellen gemessen und scheint von ATP, cAMP und cAMP-abhängiger Proteinkinase unabhängig zu sein.

Der Trehaloseabbau wird durch eine neutrale, cytoplasmatische Trehalase durchgeführt, deren Aktivierung durch Phosphorylierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase vermittelt wird. Die nichtphosphorylierte Form ist inaktiv (I. Uno, K. Matsumoko, K. Adachi, T. Ishikawa (1983), J. Biol Chem., 258, 10867-10872). Zusätzlich enthält die Vakuole eine sogenannte saure Trehalase, deren Funktion noch nicht bekannt ist (S.D. Harns, D.A. Cotter (1988) Can. J. Microbiol. 34, 835-838).

Nach einem Glucoseschub beobachtet man einen beträchtlichen Anstieg in der intrazellulären Konzentration des cyclischen AMP in den ersten Minuten während der lag-Phase, die dem Wachstum vorausgeht. Diesem folgt ein 6-8facher Anstieg der neutralen Trehalaseaktivität zusammen mit dem schnellen Abbau der Trehalose. Nach etwa einer Stunde wird die neutrale Trehalaseaktivität auf die Aktivitätsmenge gesenkt, die vor der Aktivierung gemessen wurde (J.B. Van der Plaat, P. Van Solingen (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm. 56, 580-587).

Während ein verringertes Wachstum mit der Trehaloseanhäufung einhergeht hängt die Induktion des Wachstums bei Ruhestadien mit der schnellen Mobilisierung der Trehalose aufgrund der Aktivierung der Trehalase zusammen. Der Zusatz einer Stickstoffquelle fördert den Trehaloseabbau und verhindert die erneute Synthese (cf. Thevelein (1984) Microbiol. Rev., 48, 42-59).

Die Literaturdaten lassen stark vermuten, daß während der Perioden, in denen die Trehalosesynthese notwendig ist, nur die Trehalose-6-phosphatsynthase aktiv ist, während die neutrale Trehalase inaktiv ist und daher wird es verhindert, daß die Trehalosesynthese und deren Abbau zur selben Zeit stattfinden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert eine transformierte Hefe, die zumindest ein Gen enthält, das für eine neutrale Trehalase kodiert, wobei das Gen durch Zerstörung des entsprechenden Wildtypgens modifiziert wurde, das für eine neutrale Trehalase kodiert, wobei die Hefe als Ergebnis einen höheren Trehalosegehalt verglichen mit der untransformierten Elterhefe aufweist. Die erfindungsgemäße transformierte Hefe weist eine verbesserte Streßresistenz verglichen mit dem untransformierten Hefestamm auf, wobei keine der vorher erwähnten negativen Nebenwirkungen auftreten. Ferner liefert die Erfindung ein effizientes Verfahren zur Trehaloseherstellung.

Detaillierte Beschreibung

Mit "Streßresistenz" ist in der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Toleranz gegenüber Streßbedingungen gemeint, beispielsweise höheren osmotischen Druck, erhöhte Temperatur oder Austrocknungsbedingungen.

Mit "Fermentationsausbeute" sind die Gramm trockene Biomasse gemeint, die pro Gramm konsumierter Zucker gebildet werden.

Mit "neutraler Trehalase" ist die cytoplasmatische Trehalase gemeint, die für den Trehaloseabbau verantwortlich ist,

Mit "stringenter Hybridisierung" sind Hybridisierungsbedingungen gemeint, wie sie in Maniatis et al. (T. Maniatis, E.E. Fritsch, J. Sambrook (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Seiten 387-389 beschrieben werden.

Überraschenderweise wurde jetzt festgestellt, daß sowohl die neutrale Trehalase als auch die Trehalose-6-phosphatsynthase aktiv sind, wenn während der Herstellung von Bäckerhefe Trehalose gebildet wird. Dies ist unerwartet, da während der Trehalosesynthese die neutrale Trehalase nicht aktiv sein sollte. Diese Feststellung wird auf die Erhöhung des Trehalosegehalts von Hefe durch Modifizierung der zellulären Trehalasemenge angewendet.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die neutrale Trehalaseaktivität in der Hefezelle durch die Manipulierung des neutralen Trehalasegens erniedrigt, wobei der intrazelluläre Trehalosegehalt erhöht wird. Die so erhaltene Hefe weist eine erhöhte Streßresistenz auf.

Dieser Ansatz hat den Vorteil, daß Nebenwirkungen, die bis jetzt gleichzeitig mit der Trehaloseerhöhung als Ergebnis von anderen genetischen oder physiologischen Modifizierungen aufgetreten sind, in der Hefe mit einem modifizierten zellulären Gehalt an neutraler Trehalase nicht auftreten. Daher ist eine Hefe mit einer erhöhten Trehalosemenge aufgrund eines modifizierten Trehalasegehalts für die industrielle Verwendung geeignet.

Gemäß der Erfindung werden Hefestämme mit verbesserten Eigenschaften unter Produktions- und Anwendungsbedingungen bereitgestellt. Mit verbesserten Eigenschaften, wie es in der Beschreibung im Zusammenhang mit den vorliegenden (modifizierten) Hefestämmen verwendet wird, ist ein besseres Backvermögen, speziell verbesserte Austrocknungsresistenz verglichen mit dem entsprechenden untransformierten (Wildtyp) Stamm und/oder eine höhere Zuckerresistenz relativ zum entsprechenden untransformierten (Wildtyp) Stamm gemeint.

Daher werden Verfahren zur Konstruktion von Hefestämmen geliefert, die einen höheren Trehalosegehalt verglichen mit dem Elterstamm aufweisen. Diese Verfahren umfassen die Verwendung von Genen, die für Enzyme kodieren, welche im Trehalosestoffwechsel beteiligt sind, wie Trehalose-6-phosphatsynthase, Trehalose-6- phosphatphosphatase und Trehalase. Auf diesem Weg ist es möglich den Trehalosegehalt der Zelle ohne Wechselwirkung mit anderen Stoffwechselprozessen (wie sie vorher beschrieben wurden) zu regulieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde das für neutrale Trehalase kodierende Gen isoliert. Die Verfügbarkeit dieses Gens ermöglicht die Verringerung der Trehalaseaktivitat in der Zelle über eine Tut bekannte Technik der Genzerstörung (R.J. Rothstein (1983) in Methods in Enzymology, 101, 202) der jeweiligen Gene. Beispielsweise können in einem diploiden Hefestamm eines oder sogar beide Allele des Trehalasegens inaktiviert werden (unter der Annahme, daß in einem haploiden Genom eine Kopie des Trehalasegens vorliegt).

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das neutrale Trehalasegen so modifiziert werden, daß eine Phosphorylierungsstelle der Trehalase modifiziert wird und keine Phosphorylierung mehr stattfinden kann. Es ist aus der Literatur bekannt, daß die neutrale Trehalase durch eine Phosphorylierung aktiviert wird, wobei die Aktivierung durch eine cAMP-abhängige Proteinkinase katalysiert wird. Nicht phosphorylierte Trehalase hat eine viel geringere Aktivität. Die Erkennungsstelle für die von cyclischem AMP-abhängige Proteinkinase kann so modifiziert werden, daß keine Phosphorylierung mehr stattfinden kann. Dies erzeugt ein Gen, das eine veränderte neutrale Trehalase kodiert, die nicht mehr über eine Phosphorylierung aktiviert werden kann. Jede Restaktivität der nicht-phosphorylierten Trehalase kann für die Physiologie der Zelle wichtig sein. Dieser alternative Ansatz ist daher in dem Fall der Ansatz der Wahl, in dem eine Mobilisierung von Trehalose während der Biomassenbildung oder der initialen Periode der Bäckerhefenleistung im Teig essentiell ist.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das für neutrale Trehalase kodierende Gen per Zufall mutagenisiert. Es werden Gene isoliert, die für Trehalase mit einer geringeren Aktivität kodieren und für Genaustausche der unmodifizierten Gene eines Hefestamms verwendet. Dieser Ansatz führt ebenfalls zu einer insgesamt niedrigeren Trehalaseaktivität und daher zu einer höheren Trehalosemenge.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das für neutrale Trehalase kodierende Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gebracht, wobei die kontrollierte Expression des Gens erlaubt wird. Dies macht es möglich, das Gen unter Bedingungen aktiv zu halten, bei denen Trehalaseaktivität für die Zelle nützlich ist und dessen Genexpression unter Bedingungen abzuschalten, bei denen eine stabil große Menge an Trehalose gewünscht wird, beispielsweise am Ende der Hefebiomassenproduktion.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das für neutrale Trehalase kodierende Gen unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, der schwächer ist als der Promotor dieses bestimmten Gens.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Expression des neutralen Trehalasegens über einen anti-sense RNA Ansatz reguliert werden. In diesem Fall wird anti-sense RNA der neutralen Trehalase (oder Teilen hiervon) in der Zelle hergestellt, indem man die kodierende Region (oder Teile hiervon) in entgegengesetzter Richtung hinter einen Promotor kloniert. Die von diesem Gen synthetisierte RNA kann mit der normalen RNA der neutralen Trehalase basenpaaren und hierbei ihre Translation verhindem. Die Effizienz mit der die doppelsträngige RNA gebildet wird bestimmt letztlich den Grad der Synthese der neutralen Trehalase. Daher ist dieser Ansatz eine Alternative zur Regulation der Genexpression und ist interessant, wenn das Genom eine Familie an Trehalasegenen enthält. Da anti-sense RNA in trans wirken kann, kann eine solche Genfamilie auf einfachem Weg reguliert werden.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Gen isoliert, das für die saure Trehalase der Vakuole kodiert. Mit diesem Gen als Werkzeug kann diese Art der Trehalaseaktivität modifiziert werden, beispielsweise über Genzerstörungstechniken, Proteinengeneering oder den Austausch der Promotoren (induzierbar, schwächer). Dieser Ansatz ist sinnvoll wenn in Abwesenheit jeder neutralen Trehalaseaktivität immer noch eine wesentliche Mobilisierung der Trehalose über die saure Trehalase stattfindet. Daher kann dieser Ansatz verwendet werden, um eine optimale Trehalosemenge in der Zelle zu erhalten.

Bei einer weiteren Ausführungsform werden Gene kloniert, die Enzyme kodieren, welche direkt in der Synthese der Trehalose involviert sind, wie die Trehalose-6-phosphatsynthase und die Trehalose-6-phosphatphosphatase. Die Steigerung der Trehalosebiosyntheserate ist ein weiterer direkter Ansatz zur Erhöhung der Trehalosemenge. Eine solche Erhöhung kann über gentechnische Methoden erhalten werden, die auf diese Trehalosebiosynthesegene angewendet werden (Erhöhung der Genkopiezahl, Proteinengeneering, um die spezifischen Aktivitäten zu verändern, Verwendung von anderen Promotoren und dergleichen).

Alle diese oben erwähnten Ausführungsformen haben die Verwendung von Genen gemeinsam, die für Enzyme kodieren, welche direkt im Trehalosemetabolismus beteiligt sind, um die Trehalosemenge in der Zelle zu erhöhen. Eine so erhöhte Menge ist unter Streßbedingungen, wie Hitze, osmotischer Druck, Austrocknung, gefrorener Teig und dergleichen von Vorteil.

Die mit den oben erwähnten Techniken erhaltenen Hefen können in Stammverbesserungsprogrammen verwendet werden, indem man Techniken anwendet wie DNA vermittelte Transformationstechniken und auch Techniken, wie Protoplastenfusion, Massen-Mating oder Mutation. Ebenfalls sind Kombinationen dieser Techniken möglich. Beispielsweise können transformierte Hefen mit einem anderen Stamm (Produktionsstamm) gekreuzt werden. Die bei solchen Verbesserungsprogrammen erhaltenen Hefestämme sind im Umfang der Erfindung enthalten.

Gemäß der Erfindung wird ein zur Gattung Saccharomyces oder zur Gattung Kluyveromyces gehörender Stamm verwendet, vorteilhafterweise wird ein Stamm angewendet, der zu S. cerevisiae gehört.

Die vorliegende Erfindung liefert auch Verfahren zur Herstellung von Teigen (normaler und gefrorener Teig), Brot und ähnlichen Produkten mittels der erfindungsgemäßen Hefe zur Erzeugung von Kohlendioxid.

Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Hefe mit einem hohen Gehalt an intrazellulärer Trehalose, was einen effizienten Weg zur Trehaloseproduktion erlaubt.

Klonierungtechniken

Für die allgemeinen Klonierungstechniken wird auf das Handbuch von Maniatis et al verwiesen (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual). Die Restriktionsenzyme werden verwendet, wie dies vom Hersteller empfohlen wird und werden entweder von New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Boehringer Mannheim (Boehringer) bezogen. Im allgemeinen werden 1 bis 5 Enzymeinheiten benötigt, um 1 ug DNA zu schneiden.

Die Transformation von E. coli wird mittels der CaCl&sub2;-Technik ausgeführt (T. Maniatis et al., siehe obige Literaturstelle).

In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein rekombinantes Plasmid oder einen rekombinanten Vektor, der zumindest einen Teil eines neutralen Trehalasegens umfaßt und worin das neutrale Trahalasegen wahlweise so modifiziert wurde, daß das Gen für eine Trehalase mit einer Aktivität kodiert, die niedriger ist als die des entsprechenden Wildtypgens. Sie liefert auch ein rekombinantes Plasmid oder einen rekombinanten Vektor, der zumindest einen Teil eines Trehalose-6-phosphatsynthasegens enthält und worin das Trehalose-6-phosphatsynthasegen optional auf eine solche Weise modifiziert wurde, daß das Gen für eine Trehalose-6-phosphatsynthase mit einer Aktivität kodiert, die größer ist als die des entsprechenden Wildtypgens.

Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert sind, werden hiermit so eingeführt, wie wenn bei jeder einzelnen Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln darauf hingewiesen wird, daß sie hiermit eingeführt ist.

Obwohl die vorliegende Erfindung im Detail durch Erläuterungen und Beispiele zum Zweck der Klarheit und der Verständlichkeit beschrieben wurde ist es für den Fachmann in Anbetracht der erfindungsgemäßen Beschreibungen ersichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifizierungen gemacht werden können ohne sich vom Gedanken und Umfang der beigefügten Patentansprüche zu entfernen.

Die folgenden experimentellen Daten werden zur Erläuterung der Erfindung angegeben. Es ist verständlich, daß ein Fachmann, der mit den Verfahren vertraut ist, andere Hefestämme und Vektoren verwenden kann, die genauso für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden können. Diese Veränderungen sind im Umfang der Erfindung enthalten.

Hinterlegungsliste (Klone, Stämme und Hybridomzellinie)

Der folgende Phagenklon, die Stämme oder die Zellinie wurden beim CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures Oosterstraat 1, 3742 SA Baarn, Niederlande) und bei der ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS-Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4, OJG, GB) hinterlegt.

Lambda gt 11 Klon Hinterlegungsnummer Hinterlegungsdatum Lambda November Stämme Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli mit einem Gehalt an Plasmid pTRE16.1.1 Hybridomzellinie, die den monoklonalen Antikörner 41-2F10 bildet März Februar September Dezember

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Figur 1 zeigt die Struktur des Plasmids pTRE16G418-2. Die Pfeile zeigen die Transkriptionsrichtung an. Die Orientierung des 16.1.1 Segments ist noch nicht bekannt.

Abkürzungen: G418-res, Tn5 Gen, das Resistenz gegenüber G418 verleiht; ADH-Promotor, Saccharomyces cerevisiae Promotor des ADHI Gens an G418-res gebunden, f1 ori, Replikationsursprung des Phagen f1; ampR, Ampicillinresistenzgen; 16.1.1, Hefeinsertion, die auch in Lambda TRE16.1.1 vorkommt, die einen Teil des neutralen Trehalasegens enthält; ferner sind relevante Restriktionsschnittstellen gezeigt. Die zwei EcoRI Stellen an den Grenzen des 16.1.1 Segments kommen nicht unbedingt an der entsprechenden Position im Genom von Saccharomyces cerevisiae vor. Zumindest eine der Schnittstellen resultiert aus der Konstruktionsweise der Lambda gt 11 cDNA-Bank. Im inneren Kreis ist die Länge in Basenpaaren angegeben.

BEISPIEL 1 Trehalaseaktivität und Trehalosegehalte der Bäckerhefe Aerobe (fed-batch) Fermentation

Es wird eine Hefepaste mittels des Saccharomyces cerevisiae Hefestamms 227 Ng hergestellt.

Eine lyophilisierte Kulturprobe wird auf herkömmliche Weise bis zur gewünschten Menge der Animpfhefe kultiviert. Zur Kultivierung der Hefe werden Laborfermenter mit einem Volumen von 10 Litern (Nettovolumen 6 Liter) verwendet, die mit einer Vorrichtung zur kontinuierlichen Zudosierung von Melassen und einer assimilerbaren Stickstoffquelle ausgerüstet sind. Die Fermenter sind ebenfalls mit einer Vorrichtung zur Regulation des pH und zur Temperaturkontrolle ausgerüstet. Die Fermentationen werden im wesentlichen gemäß G. Reed und H.J. Peppler, Yeast Technology, The AVI Publlshing Company Inc., Westport Conneticut, USA, 1973 ausgeführt. Die Kultivierungsbedingungen sind im einzelnen:

- Melassengemisch, das 80 Gewichtsprozent Rübenmelassen und 20 Gewichtsprozent Zuckerrohrmelassen berechnet auf der Grundlage von 50 % Zucker enthält.

- Melassendosierung (gemäß Reed und Peppler, Seiten 78/79) gemäß Tabelle 1,

- Die erforderliche Menge Phosphat wird in Form von Monoammoniumphosphat vor dem Beimpten zugegeben,

- Die erforderliche Menge Stickstoff wird als 10 %ige NH&sub3;-Lösung in Wasser gemäß Tabelle 1 zudosiert,

- Die Temperatur wird während der gesamten Fermentationsdauer auf 30ºC gehalten,

- Der pH (Reed und Peppler, Seiten 67/68) wird während der gesamten Fermentationszeit auf 5,0 gehalten),

- Vitamin B&sub1; wird in einer Menge von 6 mg/kg Melassen ad 50 % Zucker im Anfangsstadium der Fermentation zugegeben.

Die durch diese Fermentationen erhaltene Hefe wird konzentriert und mit Leitungswasser in einer Laborzentrifuge gewaschen.

Zeit g Melassen ad 50 % Zucker (gesamt) g Ammoniak ad 10 % (gesamt)

Es werden die Enzymmengen in Proben bestimmt, die während der gewünschten Fedbatch-Fermentationen entnommen werden.

Nach der Filtration werden die Pellets in Extraktionspuffer (MES 25 nM , CaCl&sub2; 2,5 mM, PMSF 1 mM, pH = 7) resuspendiert. Die Zellextrakte werden durch Zugabe von Ballotinikügelchen (3 g/ml) und Schütteln in einem Vibrax VXR Röhrchenschüttler dreimal für 3 Minuten und Kühlen zwischen den Schüttelperioden (0ºC) hergestellt. Die Extrakte werden 10 Minuten bei 12 000 x g zentrifugiert und über Nacht gegen Puffer dialysiert (MES 5 mM, CaCl&sub2; 2,5 mM, pH = 7).

Die Bestimmung der Trehalaseaktivität in den zellfreien Extrakten wird gemäß J.M. Thevelein, A.J. Van Laere, M. Beullens, J.A. Van Assche, A.R. Carlier (1983) J. Gen. Microbiol., 129, 716- 726 mit der Ausnahme durchgeführt, daß Tetramethylbenzidin anstelle von o-Dianisidin als Glucosereagenz verwendet wird. 1 E Trehalaseaktivität wird als Bildung von 1 umol Glucose pro Minute definiert.

Der Trehalosegehalt der Zellen wird folgendermaßen mit HPLC bestimmt: Die Fermentationsproben werden filtriert, gewaschen und anschließend gekocht. Nach der Zentrifugation zur Entfernung von großen Zellfragmenten wird der Überstand mit Acetonitril und Wasser auf eine Endkonzentration von 50 % (V/V) Acetonitril verdünnt. Die Probe wird filtriert (0,45 um) bevor sie auf eine Kohlenhydratsäule mlt RCSS Vorsäule aufgetragen wird und mit Acetonitril/Wasser 4:1 eluiert wird. Die Trehalosegehalte werden mit Hilfe eines Refraktometers und eines Integrators bestimmt.

Das Protein der zellfreien Extrakte wird durch das BCA Verfahren bestimmt (Pierce). RSA dient als Standard.

Die neutrale Trehalase scheint während der Fedbatch-Fermentation konstant aktiv zu sein, sogar wenn die Trehaloseanhäufung nach etwa 9 Stunden Fermentation beginnt (siehe Tabelle 2). Dieses Ergebnis ist unerwartet, da vermutet wurde, daß die Trehalase während der Trehalosesynthese inaktiv ist.

Die Idee der Verringerung der Aktivität der neutralen Trehalase der Zelle basiert auf der unerwarteten Erkenntnis, daß die Trehalase während der Fedbatch-Fermentation aktiv ist.

Tabelle 2
Stunden Trehalose % (G/G) Trehalase (mE/g Trockengewicht)

Beispiel 2 Isolierung von Lambdaphagenklonen, die einen Teil des Gens enthalten, das für die neutrale Trehalase kodiert

Es wird eine für neutrale Trehalase kodierende DNA durch ein Immunscreening einer Lambda gt11 cDNA Expressionsgenbank isoliert. Es wird ein monoklonaler Antikörper (abgekürzt 41-2F10) verwendet, der gegen die 80 kDa Untereinheit der neutralen Trehelase gerichtet ist. Dieser monoklonale Antikörper wurde am 14. Dezember 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC,) PHLS-Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4, OJG, GB unter der Hinterlegungsnummer 90121901 hinterlegt. Dieser monoklonale Antikörper reagiert mit einer 80 kDa Bande bei einem Western-Blot, der aus einem SDS- PAGE Gel hergestellt wird, auf das ein zellfreier Extrakt von Saccharomyces cerevisiae aufgetragen wurde. Nach der Inkubation des an Agarosekügelchen gekuppelten monoklonalen Antikörpers (Afti-Gel Hz Hydrazid, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) mit einem zellfreien Extrakt von Saccharomyces cerevisiae wird die neutrale Trehalaseaktivität spezifisch an das Gelmaterial gebunden. Nach dem Abzentrifugieren der Kügelchen ist weniger als 1 % der neutralen Trehalaseaktivität im Überstand detektierbar.

Die Lambda gt11 Hefe-cDNA-Bank wurde von Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Pab Alto, California 94903 USA erhalten. Diese Genbank mit der Katalognummer YL 1005b, Lot-Nummer 3411 wird mit dem monoklonalen Antikörper 41-2F10 gemäß Verfahren gescreent, wie sie im Protoblot Immunscreeningsystem von Promega (Katalognummer S371o) beschrieben sind. Für Screeningverfahren siehe auch T.V. Huynh, R.A. Young und R.W. Davis (1985) in : DNA cloning, A practical approach, Band 1 (Herausgeber D.M. Glover) Seiten 49-78, IRL Press, Oxford.

Es werden einige positiv reagierende Klone isoliert. Lambda TRE16.1.1 wird weiter analysiert (siehe später). Dieser Phagenklon wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, 3742 SA Baarn, Niederlande am 22. November 1990 unter der Hinterlegungsnummer CBS 512.90 hinterlegt.

Ein geeignetes Verfahren zur Vermehrung des hinterlegten Phagenklons wurde in T.V. Huynh et al (siehe oben) beschrieben. Der E. coli Stamm Y1090 (ATCC Nr. 37197) wurde auch als Wirt zur Vermehrung des Phagenklons verwendet (siehe auch T.V. Huynh, obige Literaturstelle).

Beispiel 3 Konstruktion von rekombinanten Plasmiden a) pTRE16.1.1

Die Hefeinsertion von Lambda TRE16.1.1 wird in den im Handel erhältlichen Vektor pTZ19R (Pharmacia) kloniert. Dieser Vektor wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande unter der Hinterlegungsnummer 405.87 hinterlegt. Das Klonierungsverfahren ist folgendes:

Zuerst wird die Hefeinsertion amplifiziert. Dies wird im wesentlichen ausgeführt, wie es in "PCR Protocols, a guide to methods and applications (Herausgeber M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky und T.J. White 1990), Seiten 253-258" beschrieben ist, mit folgenden Modifizierungen: Es werden Plaques statt einer Plaquesuspension verwendet, der 10fach Taq-Polymerasepuffer enthält 20 mM 4 MgCl&sub2;, der Temperaturzyklus ist: 94ºC für 2 Minuten, 55ºC für 2 Minuten, 72ºC für 3 Minuten. Die in dieser Reaktion verwendeten Oligonukleotidprimer sind zu DNA Sequenzen komplementär, die die EcoRI Klonierungsstelle des Lambda gt11 Vektors umgeben. Ihre Sequenzen sind 5'-GGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3' und 5'-CACCAGACCAACTGGTAATGG-3'. Nach der Inkubation passiert das Gemisch eine BIO-RAD PDP Minisäule, um die DNA zu reinigen (Entfernung von Nukleotiden).

Als zweites wird das PCR Produkt mit EccoRI verdaut und in pTZ19R x EcoRI unter Bildung von Plasmid pTRE16.1.1 kloniert. Dieser Klon wurde beim CBS unter der Hinterlegungsnummer 115.91 (am 19. Februar 1991) hinterlegt.

b) Konstruktion von pTRE16G418-2

Um pTRE16.1.1 mit einem dominanten Selektionsmarker auszustatten wird die folgende Ligation durchgeführt. Ein 1,9 kb BglII Fragment, das das G418res Gen unter der Kontrolle des ADHI Promotors enthält, wird nach dem Verdau des Plamids pRBN3 mit BglII isoliert. pRBN3 wurde ausführlich in der EP-A-0 306 107 beschrieben. Dieses 1,9 kb BglII Fragment wird in die BamHI Schnittstelle von pTRE16.1.1 kloniert. Dies ergibt pTRE16G418-2 (siehe Figur 1).

Beispiel 4 Konstruktion von Hefestämmen mit einem zerstörten neutralen Trehalasegen, was zu einer niedrigeren neutralen Trehalaseaktivität führt

Die Hefeinsertion in pTRE16.1.1 steuert, wenn sie in einem Expressionsvektor vorkommt, die Synthese eines Polypeptids, das immunologisch gegen einen monoklonalen Antikörper aktiv ist, der gegen neutrale Trehalase erzeugt wurde. Die Insertion hat eine Größe von etwa 1100 bp und stammt von einer cDNA Bank (siehe Beispiele 2 und 3). Sie wurde mit einigen Restriktionsenzymen charakterisiert, wie dies in Figur 1 gezeigt ist. Zu diesem Zeitpunkt war nicht bekannt von welchem Teil des Gens die Insertion stammte. Unter Betrachtung des ermittelten Molekulargewichts des neutralen Trehalaseproteins auf einem denaturierenden Gel (etwa 80 kDa (H. App und H. Holzer, J. Biol. Chem. 264, 17583, 1989) enthält die 1100 bp Hefteinsertion wahrscheinlich nicht das gesamte Gen.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Hefestamm mit einer verringerten neutralen Trehalaseaktivität bereitgestellt. Ein Weg zur Erlangung einer solchen Hefe ist die Zerstörung des Gens, das die neutrale Trehalase kodiert. Im allgemeinen existieren mehrere Verfahren zur Zerstörung des bestimmten Gens, wenn man ein Gen oder einen Teil eines Gens kloniert hat (siehe Methods in Enzymology, Band 185, Kapitel 23: Manipulating yeast genome using plasmid vectors von T. Stearns, H. Ma und D. Botstein, 1990, Academic Press).

Bei einem Ansatz wird die von einem Plasmid stammende Kopie des Gens ( das heißt die neutrale Trehalase) so verkürzt, daß ihr beide Enden fehlen (die tatsächlichen aminoterminalen und carboxyterminalen Regionen fehlen). Die Integration dieses Konstrukts in das Chromosom an der Stelle der neutralen Trehalase führt zu zwei nicht-funktionsfähigen Kopien des Gens, bei der bei einer das 5'- Ende und bei der anderen das 3'-Ende fehlt. Dieser Ansatz wurde auch von uns verfolgt. Es zeigte sich, daß die 1100 bp Insertion wahrscheinlich nicht die tatsächlichen 5' und 3' Enden enthält, sondern nur Gen-interne Sequenzen. Daher wurde das Plasmid pTRE16G418-2 hergestellt und mit NsiI verdaut. NsiI schneidet zweimal in Plasmid PTRE16G418-2, beidemale im Teil des neutralen Trehalasegens (siehe Figur 1). Dieser Verdau erzeugt rekombinierande Enden und steuert die Integration an der entsprechenden Stelle im Genom.

Die Analyse der erhaltenen Transformanden ist später ausführlich beschrieben, an dieser Stelle wird aber erwähnt, daß die Transformanden tatsächlich eine verringerte neutrale Trehalaseaktivität aufweisen. Dies beweist, daß

1) die Hefeinsertion Teil des neutralen Trehalasegens ist und

2) der Hefeinsertion, wie sie in pTRE16.1.1 vorkommt (und in pTRE16G418-2) tatsächlich beide Enden der neutralen Trehalase fehlen und sie ein Gen-internes Segment enthält. In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, daß diese Insertion aus einer cDNA Bank isoliert wurde. Fast alle der bekannten Gene in Saccharomyces cerevisiae enthalten keine Introns und daher wird angenommen, daß auch das neutrale Trahelasegen nicht gespalten wird. In diesem Fall ist der isolierte cDNA Klon colinear mit dem entsprechenden genomischen Gensegment. Wenn das neutrale Trehalasegen Introns haben dürfte der gewählte Ansatz zur Zerstörung des Trehalasegens auch funktionieren.

Das Transformationsverfahren selbst wird ausgeführt wie es in der EP-A-0 306 107 beschrieben ist. Zwei Saccharomyces cerevisiae Stämme werden als Wirt verwendet: Saccharomyces cerevisiae 237 Ng (hinterlegt beim CBS unter der Hinterlegungsnummer 158.86) und Saccharomyces cerevisiae GRD 11-21, ein diploider Stamm (hinterlegt beim CBS unter der Hinterlegungsnummer 154.91). Zur Selektion der Transformanden wird das Aminoglycosid G418 verwendet.

Diese zwei Saccharomyces cerevisiae Stämme werden mit pTRE16G418-2 x NsiI transformiert. Aus jeder Transformation wird ein Transformand detaillierter untersucht. Der Transformand des Stamms 237 Ng wird als ApTRE-dis abgekürzt, der Transformand des Stamms GRD11-21 wird als GpTRE-dis abgekürzt.

Southern-Blot Analysen der genomischen DNA dieser Transformanden bestätigen, daß die Integration tatsächlich am vorhandenen Trehalasegen stattgefunden hat. Bei beiden Transformanden wurde ein Allel auf diese Weise zerstört. Zu erwähnen ist, daß in den Transformanden auch zumindest ein Allel noch unverändert ist, da beide Eltern zumindest diploid sind (nicht gezeigt).

Mehrere Experimente unterstützen die Schlußfolgerung, daß tatsächlich das neutrale Trehalasegen in den Transformanden zerstört wurde (siehe auch Beispiel 5). Bei einem Satz Experimente werden die Aktivitäten der neutralen Trehalase des Elterstamms A und dessen Transformand ApTRE-dis gemessen. Dies wird folgendermaßen durchgeführt. Die Hefen werden über Nacht in Schüttelkolben entweder in YEP-2,5 % Glucose oder in YEP-2,5 % Glycerin, 0,2 % Glucose angezogen. Die neutrale Trehalaseaktivität wird bestimmt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die gemessenen Aktivitäten sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Es kann geschlossen werden, daß nie neutrale Trehalaseaktivität in ApTRE-dis deutlich erniedrigt ist, worin ein zerstörtes Trehalasegen enthalten ist. Daraus ist zu schließen, daß die Hefeinsertion, die in Klon Lambda TRE16.1.1 isoliert wurde, einen Teil des Gens enthält, das die neutrale Trehalase kodiert.

Tabelle 3 Neutrale Trehalaseaktivität in Stamm A und dessen Transformand Ap-TRE-dis (mE/mg zellfreies Extraktprotein)
C-Quelle Stamm Glucose Glucose + Glycerin

Das oben erwähnte Beispiel zeigt eine Möglichkeit zur Veränderung der Menge an neutraler Trehalase. Alternative Verfahren sind ebenfalls möglich. Einige Möglichkeiten sind unten beschrieben.

Die Hefeinsertion des isolierten Phagenklons ist geeignet, um Genzerstörungsexperimente auszuführen. Dies kann folgendermaßen ausgeführt werden: Irgendwo in einer solchen Hefesequenz kann ein DNA Segment kloniert werden, das ein Gen enthält, welches als Selektionsmarker während der Hefetransformation dienen kann. Beispiele sind das Ura3 Gen (im dem Fall, wenn der Empfängerwirtsstamm eine ura3&supmin; Auxotrophie aufweist) und sogenannte dominante Selektionsmarker. Die letzteren verleihen Resistenz gegenüber Antibiotika, wie Gentamycin, Hygromycin B und Phleomycin oder gegenüber Herbiziden, wie Sulfometuronmethyl. Beispiele sind das G418 Gen, das eine Resistenz gegenüber Gentamycin verleiht und unter die Kontrolle eines S. cerevisiae Promotors gebracht wurde (siehe beispielsweise EP 0 306 107) und das SMR1-410 Gen von 5. cerevisiae, das eine Resistenz gegenüber Sulfometuronmethyl verleiht (siehe G. Casey, W. Xiao und G.H. Rank, J. Inst. Brew. 1988, 94, 93-97). Auf diesem Weg können Plasmide konstruiert werden, die ein zerstörtes Trehalasegen enthalten, das durch die Selektionsmarker DNA unterbrochen ist (siehe oben). Eine solche Kassette kann dann vom Vektorrückgrat freigesetzt werden und in Genaustauschexpenmenten verwendet werden, die für Hefe gut beschrieben sind (R.J. Rothstein, siehe obige Literaturstelle). Auf diesem Weg kann ein Trehalasegen zerstört werden, was zu einer geringeren Trehalaseaktivität und so zu einem höheren Trehalosegehalt führt. Es ist ersichtlich, daß wenn der Wirtsstamm mehrere Trehalasegene enthält, das Genersetzungsverfahren mehrere Male wiederholt werden kann (beispielsweise durch Verwendung von verschiedenen Selektionsmarkern). So veränderte Gene können in das Genom der Hefe mittels Genaustauschtechniken integriert werden.

Mit der Hefeinsertion 16.1.1 als Sonde kann eine genomische Bank von Saccharomyces cerevisiae gescreent werden. Dies führt schließlich zur Isolierung von Klonen, die das gesamte neutrale Trehalasegen und dessen flankierende Sequenzen enthalten (Promotor/Terminatorregionen). Dann kann unter Verwendung von Standardverfahren der natürliche Trehalasepromotor durch einen anderen Promotor ersetzt werden, vorzugsweise durch einen homologen Promotor. So veränderte Gene können mittels Genaustauschtechniken in das Genom integriert werden (R.J. Rothstein, siehe obige Literaturstelle). Dies erlaubt die Veränderung der Expression des neutralen Trehalasegens so, daß letztlich eine geringere Menge an Trehalase gebildet wird.

Mittels Standardverfahren kann das Gen so mutagenisiert werden, daß es für eine veränderte neutrale Trehalase kodiert, die nicht mehr phosphoryliert werden kann.

Selbstverständlich sind die oben angegebenen Verfahren nicht erschöpfend.

Beispiel 5 Mengen an Trehalaseaktivität in den Stämmen A und ApTRE-dis, wie sie in kontinuierlichen Kulturen bestimmt werden

Da die neutrale Trehalaseaktivität wahrscheinlich durch die Wachstumsrate der Zellen reguliert wird, wird die Wirkung der Zerstörung des neutralen Trehalasegens bei zwei verschiedenen Wachstumsraten bestimmt. Um den Elter und die zerstörte Mutante unter identischen Bedingungen zu vergleichen, wird die neutrale Trehalaseaktivität in Zellen in einer kontinuierlichen Kultur gemessen, die in einem gleichbleibenden Zustand wachsen.

Stamm A und Stamm ApTRE-dis werden in Batch für 24 Stunden in Applikonfermentern (Applikon Dependable Instruments, Schiedam, Niederlande) mit einem Arbeitsvolumen von 2 Litern angezogen. Das Medium und die Kulturbedingungen sind im wesentlichen dieselben wie sie von E. Postma, W.A. Scheffers, J.P. van Dijken (1989), Yeast 5, 159-165 beschrieben wurden.

Nach dem Beginn der Fütterung bei einer Verdünnungsrate von 0,06 h&supmin;¹ erreicht die Kultur den gleichbleibenden Zustand in 65 Stunden und verbleibt für einen Tag in diesem gleichbleibenden Zustand. Während diesem Tag werden die Proben entnommen. Dann wird die Fütterung auf eine Verdünnungsrate von 0,15 h&supmin;¹ erhöht. 48 Stunden später ist ein gleichbleibender Zustand erreicht und die Proben werden entnommen.

Die Aktivität der neutralen Trehalase ist deutlich von der Wachstumsrate abhängig, wie dies aus Tabelle 4 ersichtlich ist. Sowohl der Elter als auch die zerstörte Mutante zeigen höhere Aktivitäten bei D = 0,06 h&supmin;¹. Bei beiden Verdünnungsraten beträgt die Aktivität der neutralen Trehalase der zerstörten Mutante etwa die Hälfte der Aktivität des Elterstamms. Dies zeigt, daß unabhängig von der Wachstumsrate die Abnahme der Aktivität der neutralen Trehalase in etwa zur Genkopiezahl äquivalent ist.

Tabelle 4
Trehalaseaktivität A (E/g Trockengewicht) ApTRE-dis

Beispiel 6 Trehalosegehalte der in der Trehalase zerstörten Mutahten der Bäckerhefe

Um die Wirkung der Zerstörung einer Kopie des für die neutrale Trehalase kodierenden Gens auf die Trehalosegehalte der Zellen in der stationären Phase zu bestimmen, wird folgendes Experiment durchgeführt:

Die Stämme A G, ApTRE-dis und GpTRE-dis werden zweifach in 500 ml Schüttelkolben angezogen, die 100 ml YEP-Medium mit 5 % Glucose enthalten. Die Zellen werden in der stationären Phase geerntet, gewonnen und zum Zeitpunkt t = 0 min in 70 ml frischem YEP-Medium resuspendiert, das 0,5 % Glucose enthält. Die Proben werden alle 90 min bis zu einer Gesamtzeit von 7,5 Stunden entnommen.

Der Trehalosegehalt der Zellen wird folgendermaßen mit HPLC bestimmt: Die Fermentationsproben werden flitriert, gewaschen und anschließend gekocht. Nach der Zentrifugation zur Entfernung von großen Zellfragmenten wird der Überstand direkt auf eine Bio-Rad Aminex HPX 87-H Säule aufgespritzt. Die Säulentemperatur beträgt 65ºC und die Elution wird mit 0,01 N H&sub2;SO&sub4; durchgeführt. Der Trehalosegehalt wird mit Hilfe eines Refraktometers und eines Integrators bestimmt.

Zellfreie Extrakte werden hergestellt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die zellfreien Extrakte nicht dialysiert werden. Die Trehalasemengen in den zellfreien Extrakten werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.

Die Tabelle 5 zeigt bei allen Zeitpunkten klare Unterschiede zwischen den Trehalosemengen in Elterstämmen und zerstörten Stämmen. Der Stamm A weist initial einen höheren Trehalosegehalt auf, der unter den Bedingungen des Experiments weniger stabil ist als die initial niedrigere Trehalosemenge von Stamm G.

Die Aktivität der neutralen Trehalase in Stamm G ist deutlich niedriger, wenn man sie mit der Aktivität in Stamm A vergleicht (Tabelle 5). Darüberhinaus sind in den beiden Stämmen ApTRE-dis und GpTRE-dis die Trehalasemengen niedriger in Bezug auf die Elternstämme (Tabelle 5).

So ist es durch die Verringerung der neutralen Trehalaseaktivität durch die Zerstörung des für die neutrale Trehalase kodierenden Strukturgens möglich, eine Hefe mit einem höheren Trehalosegehalt zu erhalten. Diese Hefe scheint für die industrielle Anwendung sehr brauchbar zu sein.

Tabelle 5
Stunden Trehalose (%, G/G) Trehalase (E/g Trockengewicht)

Die Daten sind Mittelwerte der zweifach ausgeführten Experimente.


Anspruch[de]

1. Transformierte Hefe, die zumindest ein Gen enthält, das für eine neutrale Trehalase kodiert, wobei das Gen durch Zerstörung des Wildtypgens modifiziert wurde, das für eine neutrale Trehalase kodiert, die Hefe als Ergebnis einen höheren Trehalosegehalt verglichen mit der untransformierten Elterhefe aufweist, und das Wildtypgen besteht aus

i) der DNA Insertion 16.1.1 in Plasmid pTRE16.1.1 (CBS 115.91, siehe Fig. 1),

ii) einer DNA, die zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit einer DNA von i) fähig ist oder

iii) einer DNA, die sich von den DNA's von i) und ii) in der Codonsequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet.

2. Transformierte Hefe nach Anspruch 1, worin die Expression des Gens, das die neutrale Trehalase kodiert, mit Hilfe eines induzierbaren Promotors modifiziert wurde.

3. Transformierte Hefe nach Anspruch 1, worin zumindest ein Gen, das für neutrale Trehalase kodiert, so modifiziert wurde, daß eine Phosphorylierungsstelle der Trehalase modifiziert ist.

4. Transformierte Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin zumindest ein Gen, das modifiziert wurde, beim Abbau der Trehalose während der Trehalosesynthese weniger aktiv ist, als das entsprechende Wildtypgen.

5. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin diese Hefe zur Gattung Saccharomyces gehört.

6. Cremige, gepreßte, gefrorene, aktive Trocken- oder Instanttrockenhefe, die eine Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.

7. Teig, der eine Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.

8. Verfahren zur Herstellung einer transformierten Hefe, die einen zur untransformierten Elterhefe unterschiedlichen Trehalosegehalt aufweist, wobei das Verfahren die Modifizierung zumindest eines für Trehalase kodierenden Gens durch Zerstörung des Wildtypgens umfaßt, das für neutrale Trehalase kodiert, und das Wildtypgen besteht aus

i) der DNA Insertion 16.1.1 in Plasmid pTRE16.1.1 (CBS 115.91, siehe Fig. 1),

ii) einer DNA, die zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit einer DNA von i) fähig ist oder

iii) einer DNA, die sich von den DNA's von i) und ii) in der Codonsequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet.

9. Verfahren nach Anspruch 9, worin diese Hefe zur Gattung Saccharomyces gehört.

10. Verfahren zur Herstellung eines Teigs, das die Verwendung der transformierten Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt.

11. Verfahren zur Herstellung von Trehalose, das die Verwendung einer Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt.

12. Für neutrale Trehalase kodierendes Gen, das besteht aus

i) der DNA Insertion 16.1.1 in Plasmid pTRE16.1.1 (CBS 115.91, siehe Fig. 1),

ii) einer DNA, die zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit einer DNA von i) fähig ist oder

iii) einer DNA, die sich von den DNA's von i) und ii) in der Codonsequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet,

wobei das Gen in gereinigter und isolierter Form vorliegt.

13. Rekombinantes Plasmid oder rekombinanter Vektor, welcher ein neutrales Trehalasegen umfaßt und worin das neutrale Trehalasegen durch Zerstörung des Wildtypgens modifiziert wurde, das die neutrale Trehalase kodiert, so daß dieses Gen für Trehalase mit einer Aktivität kodiert, die niedriger ist als die des entsprechenden Wildtypgens, wobei das Wildtypgen besteht aus

i) der DNA Insertion 16.1.1 in Plasmid pTRE16.1.1 (CBS 115.91, siehe Fig. 1),

ii) einer DNA, die zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit einer DNA von i) fähig ist oder

iii) einer DNA, die sich von den DNA's von i) und ii) in der Codonsequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet.

14. Hefe, die mit einem Vektor nach Anspruch 14 transformiert wurde.







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