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Dokumentenidentifikation DE69023615T2 13.06.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0430065
Titel Barbiturattestkompositionen und Verfahren.
Anmelder Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill., US
Erfinder Grote, Jonathan, Grayslake, Illinois 60030, US;
Hu, Hsiang, Libertyville, Illinois 60048, US
Vertreter Schieber und Kollegen, 80469 München
DE-Aktenzeichen 69023615
Vertragsstaaten DE, ES, FR, IT
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 22.11.1990
EP-Aktenzeichen 901222984
EP-Offenlegungsdatum 05.06.1991
EP date of grant 15.11.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.06.1996
IPC-Hauptklasse G01N 33/94
IPC-Nebenklasse G01N 33/542   G01N 33/532   G01N 33/531   G01N 33/533   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft Immunoassays und insbesondere neue Verbindungen und Antiseren zum Einsatz in Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays für Barbiturate, neue Verfahren zur Verwendung der Verbindungen und Antiseren, und neue Intermediate, um die Verbindungen und Antiseren herzustellen.

Die Erfindung betrifft auch eine Verbesserung in Immunoassays für Analyte in Serumproben.

Hintergrund der Erfindung.

Die Babiturate sind eine Klasse von synthetischen Wirkstoffen, die im allgemeinen als Sedative, Hypnotika, und Anticonvulsiva verschrieben werden. Diese Wirkstoffe erzeugen eine Unterdrückung des zentralen Nervensystems, die von milder Sedation bis hin zum Koma reicht. Das Ausmaß der Unterdrückung hängt von dem Babiturattyp ab, der eingenommenen Menge, dem Verfahren der Verabreichung des Babiturats, und dem Erregbarkeitszustand des nervösen Systems der Person, die den Wirkstoff einnimmmt. Übermäßiger Gebrauch von Babituraten kann zu Gewöhnung oder Abhängigkeit führen. Überdosierung oder abrupter Entzug von Babituraten kann Koma oder sogar Tod zur Folge haben.

Obwohl die legale Verfügbarkeit von Babituraten abgenommen hat, geht der Verbrauch und manchmal der Mißbrauch von Babituraten weiter.

Der Nachweis von Babituraten im Körper einer Person hilft, eine Diagnose von Babituratgebrauch oder -überdosis zu bestätigen, und er hilft bei der Auswahl einer angemessenen Behandlung.

Die Sorten von biologischen Proben, die zum Nachweis von Babituraten eingesetzt werden, schließen Urin, Serum, Plasma und Gewebe ein. Babiturate werden mit einer Reihe von Verfahren nachgewiesen, einschließlich der Dünnschichtchromatographie (TLC, "thin layer chromatography"), Gaschromatographie (GC), und der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, "high performance liquid chromatography"). Diese Verfahren umfassen im allgemeinen chemische Extraktionen der Wirkstoffe und sind komplizierte arbeitsintensive Vorgänge, die hoch trainiertes Personal und lange Assayzeiten erfordern. Zusätzlich mangelt es der TLC an Empfindlichkeit, und die GC erfordert oft das Herstellen von Derivaten des Wirkstoffs vor dem Assay. Bei der Untersuchung von biologischen Proben auf Babiturate haben sich im allgemeinen konkurrierende Immunoassays als vorzuziehende Alternative gegenüber Verfahren wie TLC, GC und HPLC erwiesen. Unter diesen Immunoassays mit konkurrierender Bindung befindet sich das Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay.

Konkurrenzimmunoassays (manchmal als "Konkurrenzbindungsimmunoassays" bezeichnet) werden üblicherweise verwendet, um das Vorhandensein oder die Konzentration eines Ligandenanalyten in einer Testprobe zu messen. Der Ligandenanalyt konkurriert mit einem markierten Reagenz, welches ein Analogon des Analyten darstellt und manchmal als "Tracer" bezeichnet wird, um eine beschränkte Anzahl von Rezeptorstellen auf Antikörpern, die spezifisch für den Analyten und das Analogon sind. Bei einem konkurrierenden Immunoassay, das mit einer Probe durchgeführt wird, bestimmt die Konzentration des Ligandenanalyten in einer Probe die Menge des Analogons (Tracer), welche an den Antikörper bindet. Genauer gesagt, ist die Menge von Analogon, die an den Antikörper bindet, umgekehrt proportional zur Menge an Analyt in der untersuchten Probe, weil Analyt und Analogon beide im Verhältnis ihrer jeweiligen Konzentration an den Antikörper binden.

Bei einem homogenen konkurrierenden Bindungsassay wie dem Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay liegen der Antikörper zusammen mit dem Analyt (dem Liganden, dessen Anwesenheit oder Konzentration mit dem Assay festgestellt werden soll) und dem Ligandenanalogon (einem Analogon des Analyten, welches wie der Analyt in der Lage ist, an den Antikörper mit ungefähr der gleichen Affinität wie der Analyt zu binden) alle in Lösung vor (homogene Phase) . Im Gegensatz dazu ist der Antikörper bei einem heterogenen konkurrierenden Bindungsassay typischerweise an eine feste Phase gebunden, während der Analyt und das Analytanalogon in einer Lösung vorhanden sind, die in Kontakt mit der festen Phase steht.

Die Fluoreszenzpolarisation liefert ein Mittel zur Messung der Menge von Tracer-Antikörper-Konjugat, die bei einem homogenen Assay mit konkurrierender Bindung entstanden ist. Die Fluoreszenspolarisationsverfahren basieren auf dem Prinzip, daß ein fluoreszierend markierter Tracer, wenn er durch planar polarisiertes Licht angeregt wird, Fluoreszenz aussendet, die ein Polarisationsausmaß aufweist, das in umgekehrter Beziehung zur Rotationsgeschwindigkeit des Tracers steht. Hieraus folgt, daß wenn ein Tracer-Antikörper-Konjugat, das einen fluoreszierenden Marker als Teil des Tracers aufweist, insbesondere wenn der Tracer ein viel kleineres Molekulargewicht als der Antikörper aufweist, mit planar polarisiertem Licht angeregt wird, das aufgrund der Fluoreszenzemission ausgesendete Licht hoch polarisiert verbleibt, weil das Fluorophor, das an den relativ massiven und langsam rotierenden Antikörper gebunden ist, daran gehindert wird, zwischen dem Zeitpunkt, an dem Licht absorbiert wird und dem, an der die Emission von Fluoreszenz auftritt, sehr stark zu rotieren. Andererseits folgt, daß wenn ein ungebundenes Tracermolekühl von planar polarisiertem Licht angeregt wird, seine Rotation viel schneller ist als die des entsprechenden Tracer-Antikörper-Konjugats, so daß die Orientierungen einer Population angeregter ungebundener Tracer die Zufallsverteilung viel schneller erreichen als die Orientierungen einer Population von Antikörper-gebundenen Tracern, und demzufolge ist die Fluoreszenzemission der ungebundenen Tracer näher an der vollständigen Depolarisation als die von Antikörper-gebundenen Tracern. Daraus folgt, daß bei Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays von einer Reihe Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen an Analyt, aber einer konstanten Konzentration an Antikörpern und Tracern, die beobachtete Polarisation der Fluoreszenz mit steigender Konzentration an Analyt abnehmen wird.

Bei einem Fluoreszenspolarisations-Immunoassay ("FPIA"), das ein homogenes Assay ist, werden die Endpolarisationswerte aus einer Lösung abgelesen, in der sowohl freier Tracer wie auch Antikörper-gebundener Tracer enthalten sind. Dadurch wird die Notwendigkeit, freien von gebundenem Tracer zu trennen, eine Notwendigkeit, die bei vielen anderen Immunoassayverfahren vorhanden ist, beim FPIA vorteilhaft überflüssig gemacht.

Indem Standardpräparate (konstante Mengen an Antikörper und Tracer, konstantes Volumen der Lösung, konstanter pH, Ionenstärke, Temperatur und dergleichen) sowohl für die Mehrzahl von Proben mit bekannten und unterschiedlichen Konsentrationen an Analyt ("Eichlösungen") und für die Proben mit unbekannten Mengen an Analyt verwendet werden, bietet das FPIA ein Mittel, um die Menge an Tracer-Antikörper-Komplex quantitativ zu messen, die bei einem homogenen auf konkurrierender Bindung beruhenden Immunoassay unter Verwendung einer Testprobe (z.B. einer unbekannten) gebildet wurde. Dieses Verfahren wird zur Zeit in der Technik verwendet z.B. mit dem TDx Therapeutic Drug Monitoring System, welches kommerziell von Abbott Laboratories, Inc. (Irving, Texas, USA) vertrieben wird. Das TDx-System ist beispielsweise in den U.S.-Patenten mit den Nummern 4,420,568 und 4,269,511 beschrieben, die hiermit in die Anmeldung aufgenommen wereden.

In einem FPIA-System, das Standardpräparate als Eichlösungen und Testproben verwendet, ist das FPIA auch ein Mittel zur quantitativen Messung der Konzentration des Analyten in der Testprobe, wenn der in den Eichlösungen verwendete Analyt chemisch derselbe ist, wie in den (unbekannten ) Testproben, die untersucht werden, oder wenn die Affinitäten des Antikörpers für den Analyten in den Eichlösungen und für den Analyten in der untersuchten Testprobe bekannt sind. Wenn der Analyt in einer Testprobe eine komplexe Mischung aus chemisch verwandten Bestandteilen ist, und, wenn (wie es normalerweise der Fall sein wird> der Analyt in den Eichlösungen ein einziger, gut definierter Bestandteil ist, kann das FPIA verwendet werden, um zwischen einer Testprobe, die den Analyten (mehr als eine gewisse Mindestmenge (Empfindlichkeit)) enthält, und einer Testprobe, die den Analyten nicht enthält (überhalb des Empfindlichkeitspegels) zu unterscheiden; aber das FPIA kann bestenfalls nur eine qualitative Messung der Konzentrations des Analyten in einer Testprobe liefern.

Ein genaues und zuverlässiges Immunoassay für Babiturate erfordert, daß die Kreuzreaktivität des Antikörpers mit Komponenten, die nicht der gewünschte Analyt sind, minimiert ist. Wirkstoffe, die strukturell dem Babituraten ähnlich sind, wie Phenytoin, P-Hydroxyphenytoin, Glutethimid und Primidon sind üblicherweise anerkannte Interferenzfaktoren (unerwünschte Kreuzreagenzien) bei konkurrierenden Barbituratassays. Der Einsatz von Antiseren und Tracern, die Kreuzreaktionen mit solchen Interferenzen minimieren würden, in einem FPIA für Babiturate wäre vorteilhaft.

Weiterhin wäre es wünschenswert, Tracer zum Einsatz in FPIAs für Babiturate herzustellen, gemäß Verfahren, die keine Zusammensetzungen verwenden, die als "der Kontrolle unterliegenden Substanzen" im Sinne von Verordnungen der U. S.- Drug Enforcement Agency (DEA) gelten. Die Vermeidung des Einsatzes solcher Verbindungen wiirde verhindern, daß viel Zeit, Anstrengung und Ausgaben aufgebracht werden müssen, um den Verordnungen der DEA bezüglich den der Kontrolle unterliegenden Substanzen zu genügen.

Schließlich wäre ein Verfahren für Barbituratassays, welches keine Vorbehandlung der Proben vor ihrer Analyse erfordert wünschenswert, da es schneller und weniger fehlerempfindlich wäre, als Verfahren, die eine solche Vorbehandlung erfordern.

Für den Stand der Technik bezüglich dem Nachweis von Barbituraten in biologischen Proben, siehe U. S. Patent Nr. 4,244,939 (Tracer für Barbitursäure und deren Herstellung), U.S. Patent Nr. 4,107,157 (Barbitursäure-Antigene und dagegen spezifische Antikörper), U.S. Patent Nr. 3,766,162 (Barbitursäure-Antigene und dagegen spezifische Antikörper), U.S. Patent Nr. 3,905,871 (Lactamkonjugate zu Enzymen), U.S. Patent Nr. 3,875,011 (Enzymimmunoassays mit Glukose-6-phosphatdehydrogenase), Clinical Chemistry 1987, 33, 1921 (Polarisationsfluoroimmunoassays für mißbrauchte Drogen) Clinical Chemistry 1984, 30, 1765 (Polarisationsfluoroimmunoassay für Barbiturate), Cinical Chemistry 1984, 30, 307 (Phenobarbitalbestimmung in Serum durch Polarisationsfluoroimmunoassay), und Therapeutic Drug Monitoring 1982, 4, 397 (Bestimmung von Phenobarbital in Serum durch Polarisationsfluoroimmunoassay). Siehe auch EP-A-0 373 508.

Fluoresceinanaloga, die mit primären oder sekundären Aminogruppen derivatisiert sind, wodurch diese Analoga verwendet werden können, um Analytanaloga herzustellen, die als Tracer in FPIAs nützlich sind, sind bekannt. Darunter befinden sich Fluoresceinamin I (5-Aminofluorescein), Fluoresceinamin II (6- Aminofluorescein), 4'-Aminomethylfluorescein, und 4'- (substituiertes Amino-)methylfluoresceine. Im Hinblick darauf, siehe Anal. Biochem. (1987) 162, 89 (1987) und U. S. Patent Nr. 4,614,823 und 4,510,251, die hiermit in die Anmeldung aufgenommen werden.

Zusammenfassung der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung liefert Zusammensetzungen und Verfahren für Immunoassays von Barbituraten in biologischen Proben, wie Proben von Serum, Urin und Plasma, und generell für Immunoassays in Serum.

Mit Bezug auf Barbiturate liefert die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins und der ungefähren Menge einer breiten Auswahl von Barbituraten, alleine oder in Kombination, in biologischen Proben unter Verwendung von FPIA.

Das durch die Erfindung gelieferte FPIA-Verfahren besteht in seiner bevorzugten Anwendung zur Analyse menschlicher Serumproben aus der Inkubation einer Probe menschlichen Serums, welche auf Barbiturate getestet werden soll, mit (1) einem Aliquot eines neuen Antiserums gemäß der Erfindung, das mit einem neuen Immunogen gemäß der Erfindung hergestellt wird, und das überaschenderweise signifikante Kreuzreaktivität mit einer breiten Auswahl an Babituraten zeigt, aber nur geringe Kreuzreaktivität mit vielen üblichen interferierenden Stoffen in Barbituratassays und (2) mit einem neuen fluoreszierenden Tracer gemäß dieser Erfindung.

Die Immunogene und Tracer der Erfindung können nach synthetischen Verfahren hergestellt werden, welche den Einsatz von Substanzen vermeiden, die durch die U. S. DEA überwacht werden. Die Erfindung erleichtert ebenfalls solche synthetischen Verfahren, indem neue Barbituratderivate zur Verfügung gestellt werden, die vorteilhaft als Zwischenstufen bei der Synthese von Tracern und Immunogenen der Erfindung verwendet werden.

Ein Barbiturat-FPIA gemäß der Erfindung erfordert keine Vorbehandlung der Probe und ist demzufolge schneller und genauer als andere Barbituratassayerfahren.

Vorteilhafter- und unerwarteterweise werden bei einem Barbiturat-FPIA gemäß der Erfindung Interferenzen durch Verbindungen, die andere Barbituratassays gestört haben, bis auf ein nicht-signigikantes Ausmaß reduziert. Beispielsweise sind Phenytoin und Primidon geläufig verschriebene Antikonvulsiva und P-Hydroxyphenytoin ist ein Hauptmetabolit von Phenytoin. Glutethimid ist ein Sedativ/Hypnotikum. Aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Strukturen mit denjenigen von Barbituraten kann selbst ein kleine Menge jede dieser Verbindungen zu einem falsch positiven Ergebnis für Barbiturate führen, wenn der Antikörper (z. B. der polyklonale Antikörper in einem Antiserum), der in einem Immunoassay für Barbiturate verwendet wird, nicht ausreichend unkreuzreaktiv gegenüber den interferierenden Substanzen ist. Daher erfordert ein genaues und zuverlässiges Immunoassay für Barbiturate, daß die Antikörper-Kreuzreaktivität gegenüber Phenytoin, p-Hydroxyphenytoin, Glutethimid und Primidon minimiert ist. Unerwarteterweise wurde entdeckt, daß die Kombination des neuen Antiserums und der Tracer, die gemäß der vorliegenden Erfindung bei FPIAs eingesetzt werden, die Selektivität für Barbiturate in Abgrenzung zu Phenytoin, p- Hydroxyphenytom, Glutethimid und Primidon signifikant erhöht, insofern als daß die Kreuzreaktivität gegenüber Phenytoin und p- Hydroxyphenytom jeweils bei ca. 0,5 und 1.0% gehalten wird, und für die anderen interferierenden Substanzen unterhalb der Assayempfindlichkeit liegt.

Die Erfindung liefert weiterhin Testkits, die zur Bestimmung von Barbituraten in einem FPIA nützlich sind, einschließlich einem Ein-Schritt-FPIA-Assay-System, wie dem zuvor erwähnten Abbott Laboratories TDx System. Die Kits umfassen einen neuen Tracer gemäß der Erfindung oder ein wässerige Lösung oder ein Salz dieses und ein neues Antiserum gemäß der Erfindung, welches sowohl die Barbiturate als auch den Tracer erkennt.

Im Hinblick auf Immunoassays von Serum im allgemeinen, bei denen ein Transfermittel (auch als Dispensationsmittel bezeichnet), wie ein Pipette oder ein ähnliches Gerät verwendet wird, um eine Vielzahl unterschiedlicher Serumproben in ein Reagenzglas oder ein System zu übertragen, in dem das Immunoassay durchgeführt wird, liefert die Erfindung eine Verbesserung. Die Verbesserung besteht darin, daß das Transfermittel zwischen den Übertragungen der Probe mit einer Lösung von Dimethylsulfoxid (innerhalb einer engen Konzentrationsbandbreite) und einem Alkalihalogenid (ebenfalls innerhalb einer engen Konzentrationsbandbreite) in Wasser gewaschen wird. Ein solches Waschen ist verblüffend wirksam bei der Minimierung der Verschleppung des untersuchten Analyten von einer Probe zur anderen als Folge des Anhaftens von Analyt an dem Dispensationsmittel. Automatisierte Immunoassaysysteme einschlieplich FPIA-Systemen wie dem Abbott Laboratories TDx System, sind Beispiele für Systeme, in denen ein Dispensationsmittel (z. B. ein automatische Pipette aus rostfreiem Stahl oder aus Teflon -beschichtetem rostfreien Stahl) verwendet wird, um eine Vielzahl von Proben in das System zu überführen.

Kits gemäß der Erfindung zur Durchführung von FPIAs für Barbiturate können ein solche Waschlösung beinhalten, wie auch Puffer, Verdünnungsmittel, antimikrobielle Stoffe wie Natriumazid, Stabilisatoren wie Rinderserumalburmin oder Rindergammaglobulin, Substanzen wie Kupfersulfat, um den Hintergrund zu reduzieren und dergleichen, wie es dem Stand der Technik bei FPIAs entspricht.

Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden besser verständlich nach dem Studium der folgenden detaillierten Beschreibung, einschließlich der Beispiele.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Unter einem ihrer Gesichtspunkte, beinhaltet die Erfindung eine Verbindung nach Formel I

wobei X&sub1; gleich Sauerstoff oder Schwefel ist; wobei Q&sub1; gleich (a) einer aktivierenden Gruppe für den nukleophilen Austausch von Q&sub1; durch eine Aminogruppe, (b) einem immunogenen Polypeptid, das über eine N-terminale oder über eine sich in einer Seitenkette befindende Aminogruppe des Polypeptids an die Carbonylgruppe gebunden ist, oder (c) einer funktionellen Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinamin I, Fluoresceinamin II und einem Fluorescein besteht, das in der 4'- Position mit einer Gruppe nach Formel X substituiert ist:

-CH&sub2;-(NH)R&sub1;&sub0;,

wobei R&sub1;&sub0; gleich Wasserstoff, Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Glycyl ist, wobei die funktionelle Gruppe über die Aminogruppe der funktionellen Gruppe an diejenige Carbonylgruppe gebunden ist, an die Q&sub1; in der Verbindung nach Formel I gebunden ist; wobei R&sub1; gleich Alkylen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylen mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenylen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkenylen mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; und wobei R&sub2; gleich Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkenyl mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, oder Phenyl ist, unter der Voraussetzung, daß (i) R&sub1; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom, das nicht dasjenige ist, welches an den Sauerstoff der Carbonatgruppe gebunden ist, mit Chlor oder Brom substituiert ist, daß (ii) R&sub2; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom mit Chlor oder Brom substituiert ist, und daß (iii) R&sub1; von Ethylen verschieden ist, wenn R&sub2; gleich Phenyl ist.

Die Nennung einer Verbindung der Erfindung, z. B. einer Verbindung nach Formel I, umfaßt die zahlreichen tautomeren und ionischen Formen, die die Verbindung in wässerigen Lösungen bei einem pH zwischen ungefähr 3 und ungefähr 9 annehmen kann, und die verschiedenen Stereoisomeren, die von der Verbindung existieren können, einschließlich denjenigen mit beiden Kontigurationen am asymmetrischen Kohlenstoffatom in Position 5 am Barbituratring.

Die Nennung von "Alkyl", "Alkylen", "Alkenyl" oder "Alkenylen" in den Definitionen von R&sub1; und R&sub2; in den Verbindungen nach der Erfindung umfaßt sowohl geradkettige wie auch verzweigte Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl- und Alkenylengruppen. Die Nennung von "Cycloalkyl," "Cycloalken," "Cycloalkenyl" oder "Cycloalkenylen" in den Definitionen von R&sub1; und R&sub2; in den Verbindungen der Erfindung umfaßt nicht nur cyclische Gruppen, sondern auch cyclische Gruppen, in denen eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit einer Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl- oder Alkenylengruppe substituiert sein kann, vorausgesetzt, daß bei Cycloalkyl- und Cycloalkylengruppen mindestens 3 Kohlenstoffatome dem Ring selbst angehören, und, bei Cycloalkenyl und Cycloalkenylengruppen mindesten 5 Kohlenstoffatome dem Ring selbst angehören.

Unter einem weiteren ihrer Aspekte umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-Barbiturat-Antiserums, das (a) die Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einer Verbindung nach Formel II umfaßt:

wobei R&sub1;, R&sub2; und X&sub1; die für die Verbindung nach Formel I definierte Bedeutung haben, und wobei Q&sub2; ein Polypeptid ist, das in dem Säugetier immunogen wirkt, und das an die Carbonylgruppe durch eine N-terminale oder über eine sich in einer Seitenkette des Polypeptids befindende Aminogruppe gebunden ist; und (b) das Gewinnen von Serum des immunisierten Säugetiers.

Unter noch einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe auf die Anwesenheit eines Barbiturats, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) das Zusammengeben in einer wässerigen Lösung von (i) der Probe, (ii) einem aliquoten Anteil eines Anti-Barbiturat- Antiserums, hergestellt nach dem Verfahren, das folgendes umfaßt: (A) das Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einer Verbindung nach Formel II:

wobei R&sub1;, R&sub2; und X&sub1; die fur die Verbindung nach Formel I definierte Bedeutung haben, und wobei Q&sub2; ein Polypeptid ist, das in dem Säugetier immunogen ist, und das an die Carbonylgruppe über eine N-terminale oder über eine sich in einer Seitenkette des Polypeptids befindende Aminogruppe gebunden ist; und (B) das Gewinnen von Serum des immunisierten Säugetiers; und (iii) einer Verbindung nach Formel I, worin Q&sub1; eine funktionelle Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinamin I, Fluoresceinamin II, und einem Fluorescein besteht, das in der 4'-Position mit einer Gruppe nach Formel X substituiert ist:

-CH&sub2;-(NH)R&sub1;&sub0;,

wobei R&sub1;&sub0; gleich Wasserstoff, Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Glycyl ist, wobei die funktionelle Gruppe über die Aminogruppe der funktionellen Gruppe an diejenige Carbonylgruppe gebunden ist, an die Q&sub1; in der Verbindung nach Formel I gebunden ist; wobei die wässerige Lösung einen pH aufweist, bei dem die Fluoresceingruppe fluoresziert;

(b) das Hindurchtretenlassen von planar polarisiertem Licht durch die resultierende Lösung nach Schritt (a);

(c) das Messen der Polarisation der Fluoreszenz der mit planar polarisiertem Licht beleuchteten Probe nach Schritt (b); und

(d) das Ermitteln, ob eines oder mehrere Barbiturate in der Probe vorhanden sind, indem die Polarisation der Fluoreszenz, die in Schritt (c) gemessen wird, mit der Polarisation der Fluoreszenz verglichen wird, die mit einem Aliquot des Antiserums der Erfindung, das bei Schritt (a) verwendet wird, und der fluoreszierenden Verbindung nach der Erfindung, die bei Schritt (a) verwendet wird, bestimmt wurde, für eine Vielzahl von Eichproben, die jeweils eine bekannte und unterschiedliche Konzentration eines Barbiturats enthalten.

Unter noch einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung eine Verbesserung in einem System zur Durchführung eines Immunoassays in bezug auf einen Analyten in Säugetierserum, wobei die Überführung einer Vielzahl von Serumproben in das System durch den wiederholten Gebrauch eines Transfermittels durchgeführt wird. Die Verbesserung umfaßt das Waschen des Transfermittels zwischen den Überführungsschritten von Serumproben in das System, mit einer Lösung, die im wesentlichen aus 0,8 bis 1,2 Teilen Dimethylsulfoxid, vermischt mit 1 Teil einer Lösung besteht, welche ihrerseits im wesentlichen aus einem Salz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NaCl, KCl, NaBr und KBr bei einer Konzentration von 0,14 molar bis 0,16 molar in Wasser besteht.

Die Erfindung umfaßt weiterhin Kits, die Reagenzien umfassen, die zur Bestimmung von Barbituraten in einem FPIA- System nützlich sind, wie etwa ein System zur Durchführung des oben beschriebenen FPIA-Verfahrens gemäß der Erfindung, einschließlich dem TDx System, das kommerziell von Abbott Laboratories, Inc erhältlich ist. Die Kits umfassen einen Tracer nach der Erfindung, z. B. eine Verbindung nach Formel I, worin Q&sub1; ein mit einer Aminogruppe derivatisiertes Flüorescein oder ein Salz davon ist, und ein Antiserum gemäß der Erfindung, z. B. ein Antiserum, das nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt wird, bei dem als Immunogen eine Verbindung nach Formel II verwendet wird, welche sowohl Barbiturate als auch den Tracer erkennt. Kits in Übereinstimmung mit der Erfindung zur Durchführung von FPIAs für Barbiturate können auch eine Waschlösung in Übereinstimmung mit der Erfindung beinhalten, z.B. eine Lösung, die im wesentlichen aus 0,8 bis 1,2 Teilen Dimethylsulfoxid, vermischt mit 1 Teil einer Lösung besteht, welche ihrerseits im wesentlichen aus einem Salz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NaCl, KCl, NaBr und KBr bei einer Konzentration von 0,14 molar bis 0,16 molar in Wasser besteht, wie auch Puffer, Verdünnungsmittel antimikrobielle Substanzen, Stabilisatoren, Substanzen zur Reduktion des Hintergrunds und dergleichen, wie sie dem Stand der Technik bei FPIAs entsprechen.

Eine Verbindung nach Formel 1, worin Q&sub1; eine aktivierende Gruppe für den nucleophilen Austausch der Carbonylgruppe ist, ist eine Zwischenstufe für die Synthese von Verbindungen nach Formel I, worin Q&sub1; ein immunogenes Polypeptid oder ein Aminoderivat von Fluorescein ist. Wie unten beschrieben, wird eine Verbindung nach Formel I, worin Q&sub1; eine aktivierende Gruppe für den nucleophilen Austausch ist, vorzugsweise und leicht nach Verfahren synthetisiert, die von einem Dialkylrest von Malonsäure ausgehen und über das Analogon der Verbindung fortschreiten, bei dem -(C=O)Q&sub1; durch Wasserstoff ersetzt ist, was nicht den Einsatz oder die Herstellung von Verbindungen umfaßt, die gemäß der Rechtsauslegung der U. S. DEA "kontrollierte Substanzen" sind.

Die Rechtsauslegung der DEA erstreckt sich auf kontrollierte Substanzen an sich, wie auch auf Substanzen, die wenn auch selbst nicht "kontrolliert", unter Verwendung einer "kontrollierten" Substanz hergestellt werden. Daher vermeiden die Verbindungen der Erfindung, weil die Verbindungen gemäß Formel I, einschließlich derer, worin Q&sub1; eine aktivierende Gruppe für nukleophile Angriffe ist, keine "kontrollierten" Substanzen sind, vorteilhafterweise die Rechtsauslegung der DEA und die damit verbundenen Schwierigkeiten und Ausgaben, wenn die bevorzugten synthetischen Verfahren eingesetzt werden, um die Verbindungen nach Formel I herzustellen.

Es sind zahlreiche Gruppen sind bekannt, die aktivierende Gruppen für den Austausch einer Carbonatcarbonylgruppe mittels nudeophilem Angriff durch einen Aminstickstoff sind, und welche demzufolge von Q&sub1; nach Formel I umfaßt werden. Diese umfassen Chlor, Brom, Fluor, Alkoxy (z. B. Methoxy, Ethoxy), substituiertes Alkoxy (z. B. 2,2,2-Trifluorethoxy) Alkenyloxy (z.B. Isopropenyloxy), Phenoxy, substituiertes Phenoxy ( z. B. p-Nitrophenoxy, Pentafluorphenoxy, 3,4-Dichlorphenoxy), N- Succinimidyloxy, N-Phthalimidyloxy, Imidazolyl, Benzotriazolyloxy, oder jede andere ähnliche Austrittsgruppe, die in der organischen Chemie gut bekannt ist. Die Chlorgruppe wird am meisten bevorzugt.

Eine Verbindung nach Formel I, worin Q&sub1; ein immunogenes Polypeptid ist, ist ein Immunogen gemäß der Erfindung. Das immunogene Polypeptid in einem Immunogen gemäß der Erfindung ist jedes Polypeptid oder jede Polyaminosäure, das/die als Trägerprotein geeignet ist, um eine Immunantwort (d.h. die Produktion von Antikörpern) gegen eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (d.h. einem Hapten) wie etwa einem Barbiturat- Derivat gemäß Formel I zu induzieren, worin Q&sub1; eine aktivierende Gruppe für den nucleophilen Angriff, wie oben definiert, ist, wenn ein Konjugat aus dem Hapten und dem Trägerprotein einem Säugetier auf eine Art und Weise verabreicht wird, die Fachleuten auf dem Gebiet der Immunologie geläufig ist, um in dem Säugetier eine Immunantwort auf das Konjugat zu induzieren. Die immunogenen Polypeptide umfassen sowohl synthetische als auch natürlich vorkommende Polypeptide, die zumindest ein freie Aminogruppe aufweisen, die eine Amidbindung mit dem Carbonatcarboxyl eines Barbiturathaptens bilden kann, in Übereinstimmung mit der Erfindung (mit einer Verbindung nach Formel I, in der Q&sub1; ein aktivierende Gruppe für einen nucleophilen Angriff, wie oben definiert, ist). Immunogene Polypeptide umfassen unter anderem Polylysine, Hämocyanine, sowie Napfschnecken-Hämocyanin ("keyhole limpet hemocyanin"); Ovalbumine von Vögeln, wie Hühnerei-Ovalbumin, Immunglobuline und Gammaglobuline von Säugetieren; Serumalbumine von Säugetieren und Thyroglobuline von Säugern. Die bevorzugten immunogenen Polypeptide (Trägerproteine) zum Einbau in eine Verbindung nach Formel I (oder Formel II) der Erfindung sind Rinderserumalbumin (abgekürzt "BSA", bovine serum albumin) und Rinderthyroglobulin (abgekürzt "BThy", bovine thyroglobulin); das am meisten bevorzugte ist BSA. Viele üblicherweise verwendete Trägerproteine, einschließlich BSA und BThy, können in geeigneter Form zur Verwendung als Trägerprotein in Übereinstimmung mit der Erfindung geliefert werden (typischerweise mindestens ca. zu 95% rein) von einer Anzahl von Bezugsquellen, wie der Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA. Es ist offensichtlich, daß bei einem Immunogenmolekül gemäß Formel II nach der Erfindung, es für mehr als ein Haptenmolekül möglich ist, mit einem einzelnen Trägerprotein konjugiert zu sein; tatsächlich ist es zu bevorzugen, daß durchschnittlich mindestens 10 Haptenmoleküle mit jedem einzelnen Trägerproteinmolekül konjugiert sind.

Eine Verbindung nach Formel 1, worin Q&sub1; ein Aminoderivat von Fluorescein ist, ist ein Tracer in Übereinstimmung mit der Erfindung.

Wie oben erklärt und in der der Immunoassaytechnik gut bekannt, insbesondere in der FPIA-Technik, sind die Tracer gemäß der Erfindung Analytanaloga von Barbituraten. Die Analytanaloga als solche konkurrieren mit jedem Barbiturat, das in einer Probe vorhanden ist, die in einem FPIA gemäß der Erfindung untersucht wird, um die Bindung an Baribiturat-erkennende Antikörper in einem Antiserum gemäß der Erfindung. Der Tracer in einem Assay- System, sowohl der gebundene (an einen solchen Antikörper) wie auch der freie ist nachweisbar aufgrund der Fluoreszenz, die die Fluoresceinylgruppe emittiert; aber, wie oben erklärt, ist die Polarisation der Fluoreszenz des Antikörper-gebundenen Tracers signifikant höher als diejenige des freien Tracers (welche im wesentlich vollständig depolarisiert ist), so daß die Messung (durch zahlreiche gut bekannte Verfahren) der Polarisation der Fluoreszenz der Fluoresceinylgruppe in einer Probe ein Maß für die Konzentration von gebundenem Tracer ist, welche ihrerseits umgekehrt proportional zur Konzentration an Barbituraten ist, die, wie der Tracer, von dem Antikörper im Antiserum erkännt werden.

Die Fluoresceinylgruppe in einem Tracer gemäß der Erfindung kann, wie das Fluorescein selbst, wie in Figur IV unten dargestellt, in der sauren (oder "offenen") tautomeren Form oder in der tautomerem Lacton-(oder geschlossenen) Form vorliegen, wobei das Verhältnis der Konzentrationen der zwei Formen vom pH der Lösung abhängt. Figur IV zeigt ebenso die Numerierung der Fluoresceinylgruppe, die in dieser Beschreibung verwendet wird.

Figur IV
Saure Form Lactonform

Die saure Form ist fluoreszierend, wobei sie Licht mit einer Wellenlänge im blauen Bereich des sichtbaren Spektrums absorbiert und nach einer Fluoreszenz-Abklinghalbwertszeit von etwa 4 Nanosekunden Licht im grünen Bereich des sichtbaren Spektrums emittiert. Bei einem Assay gemäß der Erfindung wird der pH so eingestellt, daß vorzugsweise die Konzentration der sauren Form der Fluoresceinylgruppe gegenüber der Konzentration der Lactonform signifikant überwiegt. Daher ist ein pH einer solchen Lösung von 3 bis 12 arbeitsfähig, aber ein pH von 5 bis 10 ist vorzuziehen, und einer zwischen 6 und 8 wird am meisten bevorzugt.

Aminoderivate von Fluorescein werden verwendet, um die Tracer gemäß der Erfindung herzustellen, indem ein Amid aus der (primären oder sekundären) Aminogruppe des Fluoresceinderivates und der Carbonylgruppe des Carboxylates, das an die R&sub1;-Gruppe des Tracers gebunden ist, gebildet wird. Daher kann Q&sub1; in einem Tracer gemäß der Erfindung unter anderem Fluoresceinamin I (5- Aminofluorescein), Fluoresceinamin II (6-Aminofluorescein), oder ein Fluorescein sein, daß an der 4'-Position mit einer Gruppe nach Formel X substituiert ist,

-CH&sub2;-(NH)R&sub1;&sub0;,

wobei R&sub1;&sub0; gleich Wasserstoff, Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen, oder Glycyl (-(C=O)CH&sub2;NH&sub2;) ist. Am meisten bevorzugt sind Tracer, worin Q&sub1; gleich 4'-Aminomethylfluorescein (abgekürzt "AMF") ist.

Die Synthese der Vorläufer der Zwischenstufen gemäß der Erfindung, z. B. der Derivate von Verbindungen nach Formel I, worin Q&sub1;-(C=O)- durch Wasserstoff ersetzt ist, wird im Detail in den folgenden Beispielen erklärt, beginnend mit dem Dialkylester von Malonsäure, Diethylmalonat, als dem Ausgangsmaterial. (Dimethylmalonat könnte ebenso gut verwendet werden). Im allgemeinen wird das Dialkylmalonat zuerst mit einem Reagenz alkyliert, das ein geschütztes Hydroxyl enthält, das später demaskiert wird. Die Behandlung mit Harnstoff erzeugt eine 5- monosubstituierte Barbitursäure, die dann ein zweites Mal alkyliert wird, um eine weitere Gruppe in der 5-Position einzuführen. Die Behandlung mit Harnstoff könnte nach der zweiten Alkylierung durchgeführt werden. Das geschützte Hydroxyl wird dann demaskiert, um die Synthese der entsprechenden Zwischenstufe gemäß der Erfindung zu erlauben (d.h., der Verbindung gemäß Formel I, worin Q&sub1; eine aktivierende Gruppe für den nukleophilen Austausch ist). Die Beispiele lehren eine Reihe von Varianten dieses allgemeinen Ansatzes. Beispielsweise weiß der Spezialist, daß die Reihenfolge der Alkylierungen umgekehrt werden kann, so daß die Gruppe, die das geschützte Hydroxyl enthält, als zweite eingeführt wird, statt als erste. Die Vorläufer, bei denen X&sub1; gleich Schwefel ist, werden auf die gleiche Art hergestellt, wie jene, bei denen X&sub1; gleich Sauerstoff ist, außer daß bei der Bildung des Barbituratrings Thioharnstoff verwendet wird, anstatt Harnstoff (Sauerstoff wird vorgezogen für X&sub1;).

Die Zwischenstufen gemäß der Erfindung, d.h. die Verbindungen nach Formel I, worin Q&sub1; eine aktivierende Gruppe für den nukleophilen Austausch derselben von der Carbonylgruppe des Carbonats durch eine (primäre oder sekundäre) Arminogruppe ist, werden nach gut bekannten Verfahren hergestellt, indem, in einem geeigneten Lösungsmittel wie Benzol, Acetonitril, Tetrahydrofuran oder Dimethoxyethan der hydroxylische Vorläufer mit einem aktivierenden Reagenz, das einen reaktiven Ester an der Hydroxylgruppe bildet, umgesetzt wird. Unter diesen aktivierenden Reagentien sind Phosgen, Carbonyldibromid, Carbonyldifluorid, 2,2,2-Trifluorethylchlorkohlensäureester, Trichlormethylchlorkohlensäureester, Phenylcarbonat, substituiertes Phenylcarbonat, Methylcarbonat, Ethylcarbonat, Carbonyldiimidazol, Carbonyldibenzotriazol und, wie dem Fachmann in organischer Chemie gut bekannt, ähnliche Verbindungen, die den vielen aktivierenden Gruppen, die an das Carbonat in der Verbindung gemäß Formel I (siehe oben für Beispiele) gebunden werden können, entsprechen. Vorzugsweise wird der hydroxylische Vorläufer mit Phosgen in Benzol zur Reaktion gebracht, um das Intermediat gemäß Formel I, worin Q&sub1; gleich Chlor ist, zu bilden.

Ein Immunogen gemäß der Erfindung (d.h. eine Verbindung gemäß Formel II) wird aus einer Zwischenstufe gemäß der Erfindung hergestellt, in dem einfach das immunogene Polypeptid und das Intermediat (in einem großen molekularen Überschuß bezogen auf das Polypeptid) in einer wässerigen Lösung zusammengegeben werden, die auf einen pH zwischen 7 und 9 gepuffert ist, wobei die Konjugationsreaktion in Lösung bei Umgebungsbedingungen (d.h. Raumtemperatur (ca. 23 ºC) und etwa 1 Atmosphäre Druck) zwischen ungefähr einer und ungefähr fünf Stunden laufen gelassen wird, und wobei das entstandene Konjugat (und alles nicht umgesetzte Polypeptid) von der Zwischenstufe und anderen niedermolekularen Verbindungen mittels erschöpfender Dialyse gegen einen wässerigen Puffer oder mittels Siebchromatographie abgetrennt wird. Siehe diesbezüglich, siehe Beispiel 9 und 12 unten.

Die Tracer gemäß der Erfindung, d.h. die Verbindungen nach Formel I worin Q&sub1; ein Aminoderivat von Fluorescein ist, werden hergestellt, in dem einfach das Fluoresceinderivat und die Zwischenstufe nach der Erfindung, entsprechend der Verbindung nach Formel I, in ungefähr äquimolaren Mengen in einem geeigneten Lösungsmittel zusammen gegeben werden, wie Dimethylformamid, das ganze in Anwesenheit eines großen molaren Überschusses (z. B. zwei Äquivalenten) einer Base, wie Triethylamin oder eines anderen, bevorzugt flüchtigen Trialkylamins, wobei der nukleophile Austausch zwischen dem Fluoresceinderivat und der Zwischenstufe dann etwa 6 bis 24 Stunden bei Umgebungsbedingungen ablaufen gelassen wird, und wobei dann vorzugsweise nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum bei Umgebungsbedingungen, der Tracer chromatografisch gereinigt wird. Siehe diesbezüglich Beispiel 1 unten.

Die Immunogene gemäß der Erfindung werden zur Herstellung von Antibarbiturat-Antikörpern zur Verwendung in FPIAs gemäß der Erfindung eingesetzt. Der Antikörper, der mit den Immunogenen hergestellt wird, ist polyklonal. Der Antikörper kann durch in- vitro-Immunisierung von Säugetierzellen mit einem Immunogen gemäß der Erfindung hergestellt werden, in einer Zellkultur, die in der Lage ist, Antikörper herzustellen (z. B. Lymphozyten oder Splenozyten), unter Verwendung von Verfahren, die in der Immunologie zur Herstellung polyklonaler Antikörper durch solche in-vitro-Immunisierungsverfahren bekannt sind. Eher vorzuziehen ist es allerdings, daß der polyklonale Antikörper als Bestandteil eines anti-Barbiturat-Antiserums gemäß der Erfindung zur Verfügung steht.

Ein Antiserum gemäß der Erfindung wird nach einem Standardverfahren hergestellt, das ein Immunogen gemäß der Erfindung verwendet, um ein Säugetier zu immunisieren und um danach Serum von dem Säugetier zu gewinnen, nachdem es eine Immunantwort gegen das Immunogen ausgebildet hat. Zu den Säugetieren, die eingesetzt werden können, um Antiseren gemäß der Erfindung herzustellen, gehören unter anderem Schafe, Ziegen, Kaninchen, Mäuse und Ratten. Schafe werden bevorzugt. Weiterhin ist es vorzuziehen, daß das immunogene Polypeptid des Immunogens nach der Erfindung, das zur Herstellung eines Antiserums nach der Erfindung verwendet wird, ein Polypeptid ist, das der zur Herstellung von Antiserum verwendeten Säugetierspezies fremd ist. Rinderserumalbumin ist das bevorzugte immunogene Polypeptid bei Immunogenen gemäß der Erfindung. Die Einzelheiten der Herstellung eines Antiserums gemäß der Erfindung weichen, wie dem Fachmann in der Immunologie geläufig ist, in Abhängigkeit von der Spezies, dem Alter, dem Gewicht und anderen Merkmalen des verwendeten Säugetiers, dem angepeilten Anti-Barbiturat-Antikörper-Titer, der Zusammensetzung des verwendeten Inoculums (z. B. ob Adjuvans verwendet wird, und wenn dem so ist, welches Adjuvans und in welcher Konzentration; der Konzentration des Immunogens), und weiteren Faktoren in einem gewissen Ausmaß voneinander ab. Dennoch kann ein Fachmann mit gewöhnlichen Fähigkeiten leicht ein Antiserum gemäß der Erfindung unter Verwendung jeglicher Säugetierspezes herstellen. Typischerweise wird bei der Herstellung eines Antiserums gemäß der Erfindung ein Immunogen in Verbindung mit einem Adjuvans, wie Freund's vollständigem oder unvollständigem Adjuvans in einer physiologisch verträglichen wässerigen Lösung, wie einer physiologischen Kochsalzlösung, einem Säugetier durch mehrmalige subcutane oder intravenöse Injektionen innerhalb zwei Wochen bis drei Monaten verabreicht. Nach einem weiteren Zeitraum nach der letzten Injektion, der zwischen einer Woche und etwa drei Monaten beträgt, wird regelmäßig Blut von dem angeimpften Säugetier abgenommen, Serum wird nach einem Standardverfahren (das grundsätzlich aus dem Entfernen der Zellen aus dem Blut besteht) aus dem Blut hergestellt, und das Serum wird auf den Titer von Anti-Barbiturat-Antikörpern hin untersucht. Sobald ein Antikörper-Titer erreicht ist, der als akzeptabel eingeschätzt wird, wird dem Tier üblicherweise eine große Menge Blut abgenommen und das aus diesem Blut hergestellte Serum wird gelagert und nach Bedarf in Assays oder zur Herstellung von Testkits für Assays verwendet. Ein Säugetier, das Anti- Barbiturat-Antikörper mit einem akzeptablem Titer in seinem Serum bildet, als Resultat der Immunisierung mit einem Immunogen gemäß der Erfindung, wird üblicherweise solange wie möglich am Leben gehalten, um eine Antiserumquelle zu haben, die so einheitlich wie möglich in Hinsicht, auf die relevanten Eigenschaften ist. Außer, daß es mit Puffern, Stabilisatoren, antimikrobiellen Stoffen und Substanzen, die den Hintergrund reduzieren, und dergleichen, wie beispielsweise unten in Beispiel 13 beschrieben, vermischt wird, wird das Antiserum gemäß der Erfindung eingesetzt, wie nach Entfernung der Zellen aus dem Blut, das dem Säugetier entnommen wurde, welches das Antiserum liefert, erhalten.

In vielen Immunoassay Systemen, FPIAs und anderen, insbesondere in automatisierten Systemen, wird ein einzelnes Transfermittel wiederholt verwendet, um unterschiedliche Proben in das Analysesystem zu überführen. Dies führt zu einem "Carryover" (Verschleppungs)- Problem, da ein Analyt, der in einer Probe vorhanden ist, an dem Transfermittel hängen bleiben kann und in Proben eingetragen werden kann, die später überführt werden, was möglicherweise zu falsch positiven oder fälschlicherweise überhöhten Konzentrationen an Analyt in den später überführten Proben führt. Um dieses Carryover-Problem zu minimieren, muß das wiederholt eingesetzte Transfermittel zwischen den Übertragungen mit einer Waschlösung gewaschen werden. Im Verlaufe des Entstehens der vorliegenden Erfindung haben wir eine Waschlösung gefunden, die überraschend wirksam bei der Verminderung der Verschleppung bei Immunoassays von Serumproben ist. Diese Lösung weist als Hauptkomponenten (d.h. den Komponenten, aus denen sie im wesentlichen besteht) Wasser, Dimethylsulfoxid und ein Alkalihalogenid auf, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: NaCl, KCl, NaBr und KBr, wobei NaCl bevorzugt ist. (Mit der hier gemachten Angabe "besteht im wesentlichen aus" wird ausgesagt, daß andere als die genannten Bestandteile, in der Zusammensetzung nicht in signifikanten Mengen enthalten sind, obwohl kleinere und nicht signifikante Menge anderer Stoffe, (z. B. gelöste Luft, kleine und nicht signifikante Mengen anderer Bestandteile, einschließlich anderer Salze oder anderer Arten von Substanzen, die als Verunreinigungen vorliegen) vorhanden sein können.) Eine Waschlösung gemäß der Erfindung wird hergestellt, indem in einer Lösung üblicherweise bei Umgebungsbedingungen zwischen 0,8 und 1,2 Teile Dimethylsulfoxid mit einem Teil einer Lösung zusammengegeben werden, die im wesentlichen aus zwischen 0,14 molaren bis 0,16 molarem (vorzugsweise ungefähr 0,15 molarem) NaCl, KCl, NaBr oder KBr in Wasser besteht. Jedes Transfermittel, das verwendet wird, um Serumproben in ein Reagenzglas, eine Mikrotiterplattenvertiefung oder einen anderen Probenhalter, in dem ein Immunoassay oder ein Teil davon ausgeführt wird, zu überführen, kann vorteilhaft mit einer Waschlösung gemäß der Erfindung gewaschen werden. Üblicherweise ist das Transfermittel (oder "Verteilungsmittel", wie es manchmal genannt wird) eine Art Röhre, wie eine Pipette, die verwendet wird, um ein zuvor festgelegtes Volumen einer Flüssigkeit (z. B. Serumprobe) von einem Gefäß in ein anderes zu überführen, wie es in der Technik gut bekannt ist. Unter den Transfermitteln, die Pipetten sind, die vorteilhaft mit der Waschlösung verwendet werden können, befinden sich manuell bediente Pipetten, Eppendorff-Pipettten, und automatische Pipetten, die aus Glas, Kunstharz (incl. Neopren, Teflon oder ähnlichem) rostfreiem Stahl, Kunstharz-beschichtetem rostfreien Stahl, Teflon-beschichtetem rostfreiem Stahl oder Ähnlichem bestehen können. Die Waschlösung gemäß der Erfindung wird verwendet, indem das Transfermittel gründlich mindestens, und bevorzugt, ein Mal zwischen den Überführungen der Proben gespült wird, wobei jede Spülung mit einer frischen Portion Waschlösung erfolgt, wobei jede Portion Waschlösung nach Gebrauch bei der Spülung eines Transfermittels verworfen wird.

Ein Kit gemäß der Erfindung zur Ausführung von FPIAs Barbiturate mit Serumproben, wie bei der Verwendung des Abbott Laboratories Tdx-Systems benutzt wird, kann günstigerweise eine Waschlösung gemäß der Erfindung umfassen, in einer Ampulle oder einem anderen Typ von Behältnis, das getrennt von den Ampulle(n), Behältnis(sen) oder dergleichen ist, die das Antiserum gemäß der Erfindung und den Tracer gemäß der Erfindung enthalten.

Die Antiseren und Tracer gemäß der Erfindung werden in FPIAs für Barbiturate in biologischen Proben gemäß der Erfindung verwendet, Proben von menschlichem Urin oder Serum sind bevorzugt, wobei menschliche Serumproben am meisten bevorzugt werden.

Das FPIA-Barbituratassay gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Mischen des Antibarbiturat-Antiserums gemäß der Erfindung und des Barbiturat-analogen Tracers mit einer Probe, die auf das Vorhandensein eines oder mehrerer Barbiturate hin untersucht wird. Die Konzentration des Antikörpers, der spezifisch gegen Barbiturate und Barbiturat-analoge (fluoreszierende) Tracer ist, ist sehr viel geringer als diejenige des Tracers und wahrscheinlich auch geringer als jene der Barbiturate (sofern in der Probe vorhanden). Die Barbiturate (falls vorhanden) und der Tracer konkurrieren um die begrenzten Antikörperbindungsstellen, was zur Bildung von Komplexen aus Antikörper und fluoreszierendem Analytanalogon und, falls Barbituratanalyt vorhanden ist, auch von Komplexen aus Antikörper und Analyt führt. Durch das Einhalten einer konstanten Konzentration von Tracern und Antikörper (aus Proben desselben Antiserums) für eine Reihe von Assays unterschiedlicher Proben, einschließlich Eichproben ("Kalibratoren") von bekannter Barbituratkonzentration, ist das Verhältnis von Barbiturat-Antikörperkomplex zu Tracer- Antikörperkomplex, das während der Inkubation ausgebildet wird, direkt proportional zur Menge von Barbituraten in den Proben und umgekehrt proportional zu der Nettopolarisation der Fluoreszenz, die bei den Proben beobachtet wird. Daher kann man durch Vergleich der Fluoreszenzpolarisation einer Testprobe (z.B. einer Probe, die auf das Vorhandensein von Barbituraten getestet wird) mit der Fluoreszenzpolarisation als einer Funktion der Barbituratkonzentration gemäß Eichproben, bei denen alle Polarisationsmessungen in Systemen durchgeführt werden, die den gleichen Tracer, die gleiche Tracerkonzentration, das gleiche Antiserum und die gleiche Konzentration an anti-Barbiturat- Antikörpern in dem Antiserum aufweisen, zumindest qualitativ die Nenge von Barbituraten, die in der Probe enthalten sind, bestimmen.

Ein FPIA gemäß der Erfindung kann jede Art von FPIA sein, ein manuelles oder ein automatisches. Es ist jedoch vorzuziehen, daß ein FPIA gemäß der Erfindung in einem automatisierten Ein-Schritt-System durchgeführt wird, wie dem TDx-System welches kommerziell von Abbott Laboratories, Inc. (Irving, Texas, USA) vertrieben wird.

Jede Kombination von Antiserum gemäß der Erfindung und von Tracer gemäß der Erfindung kann in einem FPIA gemäß der Erfindung verwendet werden. Es ist akzeptabel, aber nicht vorzuziehen, Antiseren in Kombination zu verwenden, die mit mehr als einem Immunogen gemäß der Erfindung hergestellt wurden, oder Antiseren in Kombination mit mehr als einen Tracer gemäß der Erfindung in einem FPIA gemäß der Erfindung zu verwenden. Es wird bevorzugt, daß Antiserum, das mit einem einzigen Immunogen gemäß der Erfindung erhalten wurde und ein einziger Tracer gemäß der Erfindung in einem FPIA gemäß der Erfindung verwendet werden, und daß bei einem solchen FPIA die Gruppe R&sub1; im Tracer von der Gruppe R&sub1; in dem Immunogen, das verwendet wurde, um das Antiserum herzustellen, abweicht, und daß die Gruppe R&sub2; im Tracer von der Gruppe R&sub2; in dem Immunogen, daß verwendet wurde, um das Antiserum herzustellen, abweicht. Diese Unterschiede in den R&sub1;- und R&sub2;-Gruppen erleichtern vorteilhaft die Konkurrenz des Barbituratanalyten gegenüber dem Tracer beim FPIA-Verfahren um die Bindung an Antikörper des Antiserums. Die bevorzugteste Kombination von Antiserum und Tracer bei einem FPIA gemäß der Erfindung ist die von Schafantiserum, das mit dem Immunogen nach Figur 21 hergestellt wurde (siehe Beispiel 9), mit Tracer gemäß Figur 1 (siehe Beispiel 1).

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß es viele und breite Variationen hinsichtlich der genauen Bedingungen gibt, die erfolgreich angewendet werden können, um ein FPIA durchzuführen, einschließlich einem FPIA gemäß der Erfindung für Barbiturate, das menschliches Urin oder Serum umfaßt. Eine detaillierte Vorschrift zur Durchführung eines FPIAs gemäß der Erfindung ist in den Beispielen angegeben. Diese Vorschrift soll nicht einschränkend sein, sondern sie dient eher der Veranschaulichung eines funktionierenden FPIA-Systems und als Leifaden bei der Erstellung von Vorschriften zur Durchführung von FPIAs gemäß der Erfindung.

Die überraschende und vorteilhafterweise breite Bandbreite von Barbituraten, die in empfindlicher Weise mit einem FPIA gemäß der Erfindung nachgewiesen werden können, und die überraschende und vorteilhafte Unempfindlichkeit eines FPIA gemäß der Erfindung für geläufige interferierende Stoffe in Assays für Barbiturate sind in den Beispielen 14 und 15 unten dargestellt. Wie aus diesen Beispielen ersichtlich, umfassen die Analyte, die gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können die Barbiturate Amobarbital, Aprobarbital, Brallobarbital, Butabarbital, Butalbital, Pentobarbital, Phenobarbital, Secobarbital und Talbutal unter anderem.

Tatsächlich ist es so, das vor der vorliegenden Erfindung ein durchführbares System für Assays für Barbiturate mit einer großen Bandbreite in menschlichem Serum nicht verfügbar war.

Die Durchführung eines FPIA gemäß der Erfindung wird durch ein Testkit gemäß der Erfindung, wie hier zuvor beschrieben, erleichtert. Bei einem Kit gemäß der Erfindung, befindet sich Antiserum gemäß der Erfindung (üblicherweise in einem geeigneten Puffer verdünnt, der auf einen geeigneten pH eingestellt ist und Stabisilatoren wie Ethylenglycol und Rinderserumalbumin, antimikrobielle Stoffe wie Natriumazid und dergleichen enthält, siehe Beispiel 13) in einem Behältnis, Tracer gemäß der Erfindung (üblicherweise in einem wässerigen Puffer gelöst, welcher ebenfalls Stabilisatoren und ähnliche Stoffe enthalten kann, siehe Beispiel 13) befindet sich in einem getrennten Behältnis, und andere Lösungen, die in dem Kit enthalten sein können, einschließlich einer Waschlösung gemäß der Erfindung, einer "Vorbehandlungs"-Lösung, und einer Eichlösung und einem Verdünnungsuffer oder dergleichen, befinden sich in noch weiteren Behältnissen (siehe wieder Beispiel 13). Jede Art von Behältnis, von denen dem Fachmann eine große Zahl gut bekannt sind, und welche geeignet ist, solche Lösungen zu transportieren und zu enthalten, kann verwendet werden, einschließlich beispielsweise Glas- oder Kunstharzampullen, die vorzugsweise mit Schraubdeckeln verschlossen sind.

Repräsentative Puffer, die in den Lösungen, die verwendet werden, um ein FPIA gemäß der Erfindung durchzuführen, schließen unter anderem folgende ein: Borat, Phosphat, Carbonat, Tris und dergleichen. Der besondere Puffer, der verwendet wird, ist nicht kritisch bei der vorliegenden Erfindung, aber Phosphatpuffer wird bevorzugt.

Das in Beispiel 13 unten beschriebene bevorzugte Verfahren für ein FPIA gemäß der Erfindung kann nicht nur zusammen mit dem Abbott Laboratories TDx Clinical Analyzer sondern auch mit den Abbott Laboratories automated abused drug systems, wie dem ADX oder Imx , vorteilhaft angewendet werden, welche alle von Abbott Laboratories, Irving, Texas kommerziell erwerblich sind. Es ist offensichtlich, daß wenn diese Systeme eingesetzt werden, das Assay voll automatisch abläuft, vom Beginn bis zur abschließenden Ablesung. Trotzdem kann ein manuelles Assay durchgeführt werden. Bei automatischen und manuellen Assays wird die Hälfte der Probe mit der Hälfte der "Vorbehandlungs"-Lösung und der Hälfte des Verdünnungspuffers vermischt und ein Hintergrundwert wird abgelesen. Dann wird die andere Hälfte der Probe zusammen mit verdünntem Antiserum und Tracerlösung sowie mit der anderen Hälfte der Vorbehandlungslösung und der anderen Hälfte des Verdünnungspuffers zusammengegeben. Siehe dazu die letzten beiden Sätze von Schritt 1 und Schritt 2 der Vorschrift, die in Beispiel 13 angegeben ist. Dann wird, nach der Inkubation, die Fluoreszenzpolarisation abgelesen und verarbeitet, um Informationen zu liefern, ob Barbiturate in der Testlösung vorhanden sind.

Die folgenden Beispiele beschreiben und veranschaulichen die vorliegende Erfindung eingehender. Ein großes C in den Beispielen, das alleine steht, steht für "Grad Celsius".

BEISPIEL 1

In diesem Beispiel wird die Synthese des am meisten bevorzugten Tracers gemäß der Erfindung, d.h. 5-{3-[(4'- Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]cyclopent-1-yl}-5- propylbarbitursäure, wie in Fig. 1 gezeigt, beschrieben.

Figur 1

Cyclopentendiol

- Zu einer mechanisch gerüffrten Suspension von 76g (0,34 Mol) 35%iger Peressigsäure (zuvor mit 2g Natriumacetat behandelt) und 91,4g (0,86 Mol) gepulvertem Natriumcarbonat in 500ml wasserfreiem Dichlormetan wurde tropfenweise 45,548g (0,69 Mol) frisch depolymerisiertes Cyclopentadien während 45 Min. hinzugefügt, bei periodischer Kühlung in einem Eisbad. Nach einstündigem Rühren wurde die Reaktion filtriert, und der Filterkuchen wurde mit 200ml Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten wurden im Verlaufe einer Stunde zu 250ml Wasser hinzugefügt, das auf 0-5 C gekühlt war. Die Mischung wurde weitere 10 Stunden lang gerührt. Die Dichlormethanphase wurde abgetrennt und 2 mal mit 50ml Wasser extrahiert. Das Wasser wurde am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wurde bei 0,3mm Hg destilliert, und man erhielt 14,169g eines klaren farblosen Öls, Kp 82-85 C.

4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-cyclopent-2-en-1-ol

Zu 1,592g (15,9mmol) des Öls, hergestellt wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben, wurden nacheinander 20ml Dimethylformamid, 1,51g (22,3mmol) Imidazol, und 2,39g (15,9mmol) t-Butyldimethylsilylchlorid hinzugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde 12 Stunden lang gerührt, mit 100ml Diethylether verdünnt, und 6 x (d.h. 6 mal) extrahiert, jeweils mit 2ml Wasser. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtirert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 2 x 18 cm Säule gepackt mit Hexan und eluiert mit 100 ml von jeweils 2%, 4%, 6%, 10%, 15% und 20% Ethylacetat/Hexan lieferten 683mg klaren farblosen Öl in den 12ml-Fraktionen 26-38.

4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-1-iodocyclopent-2-en

Eine Lösung von 1,25g (4,79mmol)Triphenylphosphin in 4,5ml Diethylether wurde zu einer Lösung von 325mg (4,79mmol) Imidazol in 1,5ml Acetonitril hinzugefügt, und die sich ergebende Mischung wurde auf 0 C gekühlt und danach mit 1,13g (4,47mmol) Iod (in Portionen) gefolgt von dem Öl, das hergestellt worden war, wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben. Nachdem eine Stunde lang bei Umgebungsbedingungen gerührt worden war, wurde das Reaktionsgemisch zu einem öligen Schlamm aufkonzentriert. Dieser Schlamm wurde in einer minimalen Menge an Dichlormethan gelöst und durch eine 2 x 10cm Säule von Silica-Gel filtriert, die mit 20%ig Diethylether/Hexan gepackt worden war, unter Einsatz von 80ml 20%ig Diethylether/Hexan als Laufmittel. Aufkonzentrieren lieferte 1,427g eines gelb- orangenen Öls, das sofort in der folgenden Reaktion verwendet wurde.

Diethyl-1-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclopent-2-enyl]-malonat

Das Iodid des vorhergehenden Absatzes wurde als Lösung in 2ml Tetrahydrofuran zu einer Lösung von 105mg (3,51mmol, 80%ige ölige Dispersion) Natriumhydrid hinzugefügt, das zuvor 3 mal gewaschen worden war, jeweils mit 5ml Pentan, und 0,53ml (3,51mmol) Diethylmalonat in 2ml Dimethylformamid, das zuvor eine Stunde lang bei Umgebungsbedingungen gerührt wurde. Die orange Farbe verschwand schnell; und nach 30 Minuten, wurde die Reaktionsmischung 12 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Die Mixtur wurde dann gekühlt, mit 1N HCl auf einen pH von 3 angesäuert, und 3 mal extrahiert, jeweils mit 15ml Ethylacetat. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Eine Chromatographie an einer 2 x 18cm Silicagel-Säule, gepackt mit Hexan und eluiert mit 50ml von jeweils 2%, 4%, 6%, 8% und 100ml 10%igen Ethylacetat/Hexan lieferte 697mg klares farbloses Öl in den 12ml-Fraktionen 13-17.

Diethyl-1-[4-(t-Butylidimethylsilyloxy)Cyxlopent-2-enyl]allylmalonat

Das Öl, das wie oben beschrieben hergstellt worden war, wurde in 1,5ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung zu einer Suspension von 32mg (1,08mmol, 80%ige Öldispersion) Natriumhydrid hinzugefügt, welche 3 x jeweils mit 5ml Pentan in 0,5ml Dimethylformamid und 0,5ml Tetrahydrofuran gewaschen worden war. Nach einstündigem Rühren bildete sich eine klare leicht braune Lösung, und 110 µl (1,27mmol) Allylbromid wurden hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Umgebungsbedingungen 12 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde in Ethylacetat verdünnt und mit 0,5ml Wasser gelöscht. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert, und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 1 x 18cm Silicagel-Säule, gepackt mit Hexan und eluiert mit 50ml 4%igem und 50ml 8%igem Ethylacetat/Hexan lieferte 169mg eines klaren farblosen Öls in der 6ml-Fraktion 5, und zusätzliche 184mg in den Fraktionen 6-9.

Diethyl-1-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclopentyl]propylmalonat

Die 169mg (0,43mmol) dialkenyliertes Malonat aus Fraktion 5 des chromatographischen Verfahrens, das am Ende des vorhergehenden Absatzes beschrieben ist, wurden in 10ml absolutem Ethanol gelöst und mit 17mg 10%igen Palladium auf Kohle vereinigt. Die Mischung wurde mit Wasserstoff gespült und bei 47-51 psi zwei Stunden lang hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat aufkonzentriert, was 158mg eines klaren farblosen Öls ergab.

5-{1-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclopentyl]}-5- propylbarbitursäure

Zu einer Lösung von 35mg (1,50mmol) Natrium und 35mg (0,57mmol) Harnstoff in 3ml absolutem Ethanol wurde das Öl, das nach dem Verfahren, das im vorhergehenden Absatz beschrieben ist, hergestellt worden war, hinzugefügt. Das Ethanol wurde durch Destillation entfernt und der verbleibende Sirup auf 80 C 6 Stunden lang erwärmt, abkühlen lassen, und dann wurde 12 weitere Stunden gerührt. Der Sirup wurde dann in Ethylacetat verdünnt und auf einen pH von 4 mit 1N HCl angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 1 x 12cm Silicagel-Säule, gepackt mit Chloroform und eluiert mit 50ml 3%igen Methanol/Chloroform und 50ml 6%igem Methanol/Chloroform lieferte 28mg eines klaren farblosen Öls in der 7ml-Fraktion 3 und zusätzlich 68mg in den Fraktionen 4-7.

5-[1-(4-Hydroxycyclopentyl]-5-propylbarbitursäure

Die 28mg, die aus Fraktion 3 nach dem Verfahren des vorhergehenden Absatzes erhalten worden waren, wurden in 0,5ml Acetonitril gelöst. Die Lösung wurde auf 0 C gekühlt und mit einem Tropfen 48%iger wässeriger Fluorwasserstoffsäure behandelt. Nach 35-minütigem Rühren wurde die Reaktionsmischung aufkonzentriert, der Rückstand wurde in Methanol gelöst, und die resultierende Lösung wurde auf eine 0,25mm x 20cm x 20cm Silicagel-Platte gestrichen und mit 6%ig Methanol/Chloroform eluiert. Die Elution der Hauptbande mit 80%ig Methanol/Chloroform und das Aufkonzentrieren lieferten 12,5mg eines weißen Feststoffes. Die erneute Chromatographie an einer weiteren Platte wie eben beschrieben lieferte 2mg und 10mg weiße Feststoffe als separate Banden.

5-[3-[(4'Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]cyclopent-1-yl}-5- propylbarbitursäure

Zu einer Lösung von 2,5mg-(9,8µmol) Portion des Hauptproduktes (10mg), das zuvor oben beschrieben wurde in 0,2ml Tetrahydrofuran wurden 0,3ml einer 12%igen Lösung von Phosgen in Bentol dazugegeben. Nach einstündigem Rühren wurde die Lösung unter einem trockenen Stickstoffstrom eingeengt, in 50µl Dimethylformamid erneut aufgelöst und mit einer Lösung von 3,9mg (9,8µmol) Aminomethylfluoresceinhydrochlorid (d.h., 4'- [Aminomethyl]fluoresceinhydrochlorid) und 2, 8µl (19,6µmol) Triethylamin in 50µl Dimethylformamid behandelt. Nachdem das Reaktionsgemisch 12 Stunden lang bei Umgebungsbedingungen gerührt worden war, wurden wurden die Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand wurde in Methanol erneut aufgelöst und auf eine 0,25mm x 20cm x 20cm Silicagel-Platte aufgestrichen. Die Entwicklung mit 10%ig Methanol/Chloroform, die Elution der Hauptbande mit 80%ig Methanol/Chloroform und das Aufkonzentrieren lieferten 5,1mg des Tracers als orangenen Feststoff. Eine weitere Reinigung des Tracers mit Hilfe einer Umkehrphasen-Chromatographie an einer C18 Platte, unter Elution mit 50%igem Acetonitril/Wasser erzielt werden.

BEISPIEL 2 5-{1-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]-pent-4-yl}-5- allylbarbitursäure

Der in der Überschrift genannte Tracer dieses Beispiels ist in Figur 3 dargestellt:

Figur 3

4-Brom-1-pentanol

Zu einer Lösung von 1,00g (4,78mmol) von Ethyl-4- brompentanoat in loml Tetrahydrofuran wurden 167mg (7,66mmol) Lithiumborhydrid zugegeben. Nach 12-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung in Diethylether verdünnt, auf 0 C gekühlt, und mit gleichen Anteilen Wasser und gesättigter NH&sub4;Cl-Lösung gelöscht, bis kein Wasserstoff mehr entwickelt wurde. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert zu 1,063g eines farblosen, leicht trüben viskosen Öls.

1-(2-Ethoxy)ethoxy-4-brompentan

Das trübe Öl, das oben hergestellt worden war, wurde in 2ml Ethylvinylether gelöst und auf 0 C gekühlt. Es wurden einige Kristalle an p-Toluolsulfonsäuremonohydrat zugesetzt, und die Reaktion wurde auf Raumtemperatur aufwärmen lassen und 1 Stunde lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann aufkonzentriert und direkt an einer 2 x 18cm Silicagel-Säule, die mit Hexan gepackt worden war, chromatographiert und mit 100ml 5%ig und mit 100ml 10%ig Diethylether/Hexan eluiert. Die Aufkonzentrierung der 10ml-Fraktionen 7-17 lieferte 872mg eines klaren farblosen Öls.

Diethyl[1-(2-ethoxy)ethoxypent-4-yl]malonat

Natrium (83mg, 3.63mmol) wurde in 1.5ml absolutem Ethanol gelöst. Diethylmalonat (0.55ml, 3.63mmol) wurde dann zugesetzt, gefolgt von dem Öl, das wie in dem Abschnitt oben beschrieben hergestellt worden war, und von 180mg (1.21mmol) Natriumiodid. Die Mischung wurde 12 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, gekühlt, mit Wasser gelöscht und 3 x extrahiert, jedes Mal mit 20ml Ethylacetat. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 2 x 18cm Silicagel-Säule bei Elution mit 100ml 5%ig, 100ml 10%ig, und 100ml 50%ig Ethylacetat/Hexan lieferte 861mg eines klaren farblosen Öls in den 12ml-Fraktionen 21-24.

Diethyl-[1-(2-ethoxy)ethoxypent-4-yl]allylmalonat

341mg (2.98mmol) Kaliumhydrid (35%ige Suspension in Mineralöl) wurde 3 x gewaschen, jedes mal mit 5ml Hexan und in 2.0ml Dimethylformamid suspendiert. Eine Lösung des Manolates in 1.0ml Tetrahydrofuran wurde hergestellt, wie im vorhergehenden Abschnitt oben beschrieben und zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt, was eine schwach braune Lösung ergab. Allylbromid (0.28ml, 3.25mmol) wurde dann zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und dann 3 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt, mit Wasser gelöscht und 4 x extrahiert, jedes Mal mit 15ml Ethylacetat. Die organischen Phasen wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert, was ein Öl ergab. Das Öl wurde an einer 2 x 18cm Silicagel-Säule chromatographiert, die mit Hexan gepackt worden war und mit 100ml 5%ig, 100ml 8%ig, 100ml 10%ig Ethylacetat/Hexan eluiert wurde. Einengen der 12ml-Fraktionen 8- 14 lieferte 614mg eines klaren farblosen Öls.

5-[1-(2-Ethoxy)ethoxypent-4-yl]-5-allylbarbitursäure

Natrium (133mg, 5.76mmol) wurde in 2ml absolutem Ethanol gelöst und 131mg (1.92mmol) Harnstoff wurden zugesetzt. Eine Lösung von 599mg des Malonats, das wie im unmittelbar vorhergehenden Anbschnitt beschrieben hergestellt worden war, in 0.5ml Ethanol wurde zugesetzt, und die Lösung wurde 12 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Das meiste Ethanol wurde am Rotavapor entfernt und die Reaktion wurde mit Wasser gelöscht und 4 x extrahiert, jedes Mal mit 10ml Ethylacetat. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Chromatographie an einer 1 x 18cm Säule, die mit Chloroform gepackt worden war und mit 30ml Chloroform, 50ml 3%ig und 50ml 6%ig Methanol/Chloroform eluiert wurde, lieferte 299mg Produkt über Aufkonzentration der 6ml-Fraktionen 6-12.

5-(1-Hydroxypent-4-yl)-5-allylbarbitursäure

104mg (0,32mmol) des Produkts, das wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben hergestellt worden war, wurden in 3ml Ethanol aufgelöst und mit 0,2ml 5%iger Schwefelsäure unter Rückfluß 10 Minuten lang behandelt, wobei zu diesem Zeitpunkt die TLC (Dünnschichtchromatographie, "thin layer Chromatography") kein Startmaterial mehr zeigte. Die Lösung wurde durch eine 1 x 12cm Silicagel-Säule filtriert, gepackt und mit 10%igem Methanol/Chloroform eluiert, und das Eluat auf 61mg eines weißen Feststoffes aufkonzentriert. Der Feststoff wurde in Methanol aufgelöst, und auf eine 0,5mm x 20cm x 20cm Platte gestrichen. Die Entwicklung mit 10%igem Methanol/Chloroform und die Elution der Hauptbande mit 80%igem Methanol/Chloroform lieferte 39mg eines weißen Feststoffes.

5-{1-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]pent-4-yl}-5- allylbarbitursäure

3,0mg (9,4µmol) des weißen Feststoffes, der wie im obigen Absatz beschrieben hergestellt worden war, wurden in die oben genannte Tracerverbindung nach dem selben Verfahren überführt, das im Endabsatz von Beispiel 1 beschrieben ist, und das zur Herstellung des Tracers nach Beispiel 1 angewendet worden war.

BEISPIEL 3 5-{1-[4-(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]pent-4-yl}-5- propylbarbitursäure

Der oben genannte Tracer dieses Beispiels ist in Figur 2 gezeigt:

Figur 2

Diethyl-[1-(2-ethoxy)ethoxypent-4-yl]propylmalonat

57mg (0,17mmol) an Diethyl-2-[1-(2-ethoxy)ethoxypent-4- yl]-2-allylmalonat, das wie oben hergestellt worden war, wurde in 10ml absolutem Ethanol aufgelöst und mit 6mg (56µmol) 10%ig Palladium auf Kohle zusammengegeben. Die Mischung wurde mit Wasserstoff gespült und 4 Stunden bei 44 psi hydriert. Die Entfernung des Katalysators mittels Filtration durch Celite Brand Diatomite und die Aufkonzentration lieferten 53mg eines farbloses Öls.

5-[4-(1-Hydroxypentyl)]-5-propylbarbitursäure

81mg (0,25mmol) der Verbindung des unmittelbar vorhergehenden Absatzes wurden in 2ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 4 Tropfen einer 1N HCl-Lösung für 2 Stunden zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde aufkonzentriert und auf 2 0,5mm x 20cm x 10cm (Hochformat) Platten gestrichen. Die Entwicklung mit 15%ig Methanol/Chloroform und die Elution der Hauptbande mit 50%ig Methanol/Chloroform lieferte 40mg eines weißen Halbfeststoffes.

5-{1-[4-(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]pent-4-yl}-5- propylbarbitursäure

Dieser Aminomethylfluoresceintracer wurde hergestellt, wie in dem letzten Absatz von Beispiel 1 beschrieben, und zwar aus 3mg 5-[4-(1-Hydroxypentyl)]-5-Propylbarbitursäure.

BEISPIEL 4 5-{4-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]cyclohex-1-yl}-5- allylbarbitursäure

Der obengenannte Tracer dieses Beispiels ist in Figur 5 gezeigt:

Figur 5

4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclohexan-1-ol

Ein Gramm 1,4-Cyclohexandiol wurde silyliert wie bei der Herstellung von 4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-cyclopent-2-en-1-ol in Beispiel 1 oben beschrieben.

4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-1-iodcyclohexan

Dieses Iodid wurde hergestellt, wie beschrieben für die Herstellung von 4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-1-iodcyclopent-2-en in Beispiel 1 oben.

Diethyl-1-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclohexyl]allyl-malonat

Die oben genannte Verbindung wurde hergestellt, wie beschrieben für die Herstellung von Diethyl-1-[4-(t- butyldimethylsilyloxy)cyclopent-2-enyl]malonat im Beispiel 1 oben.

Diethyl-1-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclohexyl]allylmalonat

Das dialkylierte Malonat wurde hergestellt, genau wie beschrieben für die Herstellung von Diethyl-1-[4-(t- butyldimethylsilyloxy)cyclopent-2-enyl]allylmalonat des Beispiels 1 oben.

5-{1-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclohexyl]}-5- allylbarbitursäure

Das Barbitursäurederivat wurde hergestellt, genau wie beschrieben für 5-{1-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)cyclopentyl]}5-propylbarbitursäure des Beispiel 1 oben.

5-{1-[4-Hydroxycyclohexyl]}-5-allylbarbitursäure

Der Ether wurde entschützt, wie beschrieben für die Herstellung von 5-[1-(4-Hydroxycyclopentyl]-5-propylbarbitursäure im Beispiel 1 oben.

5-{4-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]cyclohex-1-yl}-5- allylbarbitursäure

Dieser Tracer wurde hergestellt aus dem 4'- Hydroxycyclohexylanalogon, genau wie im letzten Abschnitt von Beispiel 1 für 5-{3-[4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]cyclopent-1-yl}-5-propylbarbitursäure, dem Tracer des Beispiels 1, beschrieben.

BEISPIEL 5 5-{3E-4-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]-3-methyl-2- butenyl}-5-allylbarbitursäure

Der oben genannte Tracer dieses Beispiels ist in Figur 6 veranschaulicht:

Figur 6

Diethyl-3,3-Dimethylallylmalonat

422mg (14,1mmol), 80%ige Mineralöldispersion) Natriumhydrid wurden 3 x gewaschen, jeweils mit 5ml Pentan, und in einer Mischung von 10ml Tetrahydrofuran und 5ml Dimethylformamid suspendiert. 2,04g (13,4mmol) Diethylmalonat wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde 40 Minuten lang gerührt, unter Ausbildung einer leicht braunen Lösung. Prenylbromid (2,00g, 13,4mmol) wurde dann hinzugefügt, und die Lösung 1 Stunde lang refluxiert. Die Reaktion wurde mit Wasser gelöscht, auf einen pH von 2 mit 1N HCl angesäuert, und 2 x extrahiert, jeweils mit 10ml Diethylether. Die organischen Phasen wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 2 x 18 cm Säule, gepackt mit Hexan und eluiert mit 50ml von jeweils 2%, 4%, 7%, 10%, und 15% Diethylether/Hexan, lieferte 2,734g eines klaren farblosen Öls in den 12ml-Fraktionen 4-16.

(3.3-bimethylallyl)barbitursäure

Zu einer Lösung von 70mg (3,03mmol) von Natrium in 1ml absolutem Ethanol wurden 61mg (1,01mmol) Harnstoff hinzugefügt, gefolgt von einer Lösung von 200mg (0,88mmol) des Malonats, hergestellt, wie im vorhergehenden Absatz, und 1ml absolutem Ethanol. Ein ml Ethanol wurde mittels Destillation entfernt, und die verbleibende Lösung über Nacht refluxiert. Die Lösung wurde auf einen pH von 3 mit 1N HCL angesäuert und 2 x extrahiert, jeweils mit 10ml Ethylacetat. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtiert und konzentriert und ergaben 214mg eines weißen Feststoffes.

5-(3,3-Dimethylallyl)-5-allylbarbitursäure

Zu einer Lösung des oben genannten Feststoffes in 0,5ml Tetrahydrofuran und 1,0 ml Dimethylformamid wurden 33mg (1,09mmol) Natriumhydrid (80%ige Mineralöldispersion) hinzugefügt. Die Lösung wurde 1 Stunde lang gerührt, 0,11ml Allylbromid wurden hinzugefügt, und die sich ergebende Lösung wurde weitere 48 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit 1N HCl auf einen pH von 3 gelöscht und 3 x extrahiert, jeweils mit 10ml Ethylacetat. Die organischen Phasen wurden über MgSO&sub4; getrocknet, futriert und konzentriert. Die Chromatographie an einer 1 x 18cm Silicagel-Säule, gepackt mit Hexan und eluiert mit 25ml jeweils von 20%igem und 30%igem Ethylacetat/Hexan, dann mit 50ml 50%igem Ethylacetat/Hexan, lieferte 100mg eines klaren farblosen Öls in den 7ml-Fraktionen 8-11.

5-(3E-4-Hydroxy-3-methyl-2-butenyl)-5-allylbarbitursäure

Zu einer Lösung von 100mg der dienischen Barbitursäure, die gemäß dem unmittelbar vorhergehenden Beispiel hergestellt worden war, in 1ml Dichlormethan wurden 9mg (84µmol) Selendioxid, 6mg (42µmol) Salicylsäure, und 0,29ml (1,09mmol) einer 3,8 molaren Lösung von t-Butylhydroperoxid in Benzol hinzugefügt. Die Lösung wurde 12 Stunden gut gerührt und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 1 x 14cm Säule, gepackt mit 30%ig Ethylacetat/Hexan und eluiert mit 25ml, jeweils 40%, 50%, 60%, und 70% Ethylacetat/Hexan, lieferte 21mg des erwünschten Produktes als ein klares farbloses Öl in den 7ml-Fraktionen 14-19, als auch eine Mischung von Ausgangsmaterial und ein unidentifiziertes Produkt in den Fraktionen 6-10.

5-{3E-4-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]-3-methyl-2- butenyl}-5-allylbarbitursäure

Dieser Tracer wurde hergestellt, wie beschrieben für 5- {3-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]cyclopent-1-yl}-5- propylbarbitursäure, der Tracer aus Beispiel 1 oben, wobei als Ausgangsmaterial 5mg 5-(3E-4-Hydroxy-3-methyl-2-butenyl)-5- allyl-barbitursäure verwendet wurden, wie sie oben gewonnen worden waren.

BEISPIEL 6 5-{3E-4-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]-3-methyl-2- butenyl}-5-(2-bromallyl)-Barbitursäure

Der obengenannte Tracer dieses Beispiels ist in Figur 7 gezeigt:

Figur 7

5-(3,3-Dimethylallyl)-5-(2-bromallyl)barbitursäure

Dieses disubstituierte Barbiturat wurde aus 229mg 5-(3,3- Dimethylallyl)barbitursäure wie im vorhergehenden Beispiel zur Herstellung von 5-(3,3-Dimethylallyl)-5-allylbarbitursäure beschrieben hergestellt.

5-(3E-4-Hydroxy-3-methyl-2-butenyl)-5-(2-bromallyl)barbitursäure

Zu einer Lösung von 50mg (0.16mmol) des Bromids, hergestellt wie im unmittelbar vorhergehenden Absatz beschrieben, wurden 18mg (0,16mmol) Selendioxid, 0.5ml absolutes Ethanol, und 50µL Wasser hinzugefügt. Die Lösung wurde 4 Stunden lang am Rückfluß gekocht&sub1; gekühlt und direkt an einer 0.50mm x 20cm x 20cm Platte chromatografiert, unter Einsatz von 6%igem Methanol/Chloroform zur Entwicklung. Die Hauptbande wurde abgekratzt und mit 80%ig Methanol/Chloroform eluiert, was 12mg eines weißen Schaums lieferte.

5-{3E-4-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]-3-methyl-2- butenyl}-5-(2-bromallyl)barbitursäure

Dieser Tracer wurde hergestellt, wie beschrieben für 5- {3-[(4'-Fluoresceinyl)metylaminocarbonyloxy]cyclopent-1-yl}-5- propylbarbitursäure, dem Tracer nach Beispiel 1 oben, aus 4.7mg des weißen Schaums, der wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben erhalten worden war.

BEISPIEL 7 5-< 4-{3-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]propyl} cyclopent-2-en-1-yl> -5-(2-methyl)allylbarbitursäure

Der oben genannte Tracer dieses Beispiels ist in Figur 8 gezeigt:

Figur 8

Diethylcyclopentenylmalonat

Zu 174g (2.63mol) frisch depolymerisiertem Cyclopentadien, welches gekühlt und auf -78 C gehalten wurde, wurden 87.5g(2.50mol) gasförmige HCl hinzugefügt. In der Zwischenzeit wurden 152ml (1.0mol) Diethylmalonat zu einer Lösung von 21.4g (0.93mol) Natrium in 400ml absolutem Ethanol hinzugefügt. Nach dem die Zugabe von HCl zum Cyclopentadien abgeschlossen war, wurde das rohe gelbe Chlorid, das bei -78 C gehalten wurde, in 1ml-Portionen der Malonatlösung hinzugefügt. Beim Hinzufügen jeder Portion von 1ml zu der Malonatlösung wurde beträchtliche Wärme erzeugt, die gelbe Farbe verschwand schnell und es bildete sich reichlich weißer Niederschlag. Nach Zugabe des gesamten Malonates wurde die Suspension 17 Stunden lang gerührt, danach wurde das meiste Ethanol am Rotarvapor entfernt, und die Reaktion wurde mit 200ml Wasser gelöscht und 5 x extrahiert, jedes Mal mit 100ml Diethylether. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und zu einem klaren gelben Öl aufkonzentriert. Die Destillation eines Anteils dieser Substanz unter 0.5mm Hg Druck ergab 19.091g eines klaren leicht grünen Öls mit einem Siedepunkt von 91-94 Cº.

Diethyl-1-(4-bromcyclopent-2-enyl)malonat

Zu einer Lösung von 1.0g (4.42mmol) des Cyclopentenylmalonats, das wie in dem unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben, hergestellt worden war in 9ml Tetrachlorkohlenstoff wurden 787mg (4.42mmol) N-Bromsuccinimid und 5mg Benzoylperoxid hinzugegeben. Die Lösung wurde zum Rückfluß erhitzt, um die Reaktion zu starten, und dann 5 Minuten lang gerührt. Sie wurde zusätzliche 30 Minuten am Rückfluß erhitzt, die Suspension wurde filtriert und der Filterkuchen wurde 2 x mit je 5ml Tetrachlorkohlenstoff gewaschen. Die Aufkonzentrierung lieferte das gewünschte Bromid als klares gelbes Öl.

Diethyl-4-{1-[3-(2-Ethoxy)ethoxypropyl]}cyclopent-2-en-1-ylmalonat

Zu einer gekühlten (-78 C) Lösung von 1.390g (6.63mmol) 3-(2-Ethoxy)ethoxy-1-brompropan in 3ml Diethylether wurde 7.8ml (13.3mmol) t-Butyllithium(1.7 molare Lösung in Pentan) zugesetzt. Nach 30-minütigem Rühren wurden 297mg (3.31mmol) Kupfer-(I)- Cyanid als Suspension in 1.0ml Diethylether über eine Kanüle hinzugegeben. Nach dem Rühren für zusätzliche 30 Minuten und dem Aufwärmen lassen auf -50 Cº und nach dem Einspritzen von 2ml Tetrahydrofuran, wurde das gelbe Öl, das wie in dem vorherigen Absatz beschrieben hergestellt worden war, als Lösung in 1ml Tetrahydrofuran zugesetzt, und die resultierende Lösung wurde über 1 Stunde hinweg auf 0 C aufgewärmt. Die Lösung wurde mit gesättigter NH&sub4;CL Lösung gelöscht und 4 x mit je 15ml Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 2 x 18cm Säule, die mit Hexan gepackt worden war und mit 50ml 8% und 50ml 15% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, lieferte 618mg eines klaren farblosen Öls in den 12ml-Fraktionen 8-12.

Diethyl-4-{1-[3-(2-ethoxy)ethoxypropyl]}cyclopent-2-en-1-yl-(2- methyl)allylmalonat

Zu einer gekühlten (0 C) Suspension von 18mg (0.59mmol) Natriumhydrid (80%ige Mineralöldispersion), die zuvor 3 x mit 5ml Pentan gewaschen worden war, in 0.2ml Tetrahydrofuran wurden lgomg (0.53mmol) des Malonates zugesetzt, das wie in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben zubereitet worden war, in 0.4ml Dimethylformamid. Die Lösung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt, wobei während 30 Minuten unter Ausbildung einer tief roten Lösung gerührt wurde. 73µL (0.74mmol) Methallylchlorid und 5mg Natriumiodid wurden dann zugesetzt und die resultierende Mischung wurde 48 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter NH&sub4;CL Lösung gelöscht, auf pH 4 angesäuert und 3 x mit je 10ml Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, futriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 1 x 18cm Säule, die mit Hexan gepackt worden war und mit 50ml 4%ig und 50ml 8%ig Ethylacetet/Hexan eluiert wurde, lieferte 55mg eines klaren farblosen Öls in den 6ml Fraktionen 6-9.

Diethyl 4-(3-Hydroxypropyl)cyclopent-2-en-1-yl-(2- methyl)allylmalonat

Eine Lösung von 109mg (0.27mmol) des Ethers, der wie in dem unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben hergestellt worden war, in 1.5ml Tetrahydrofuran wurde mit 2 Tropfen von 10%iger wässeriger Schwefelsäure behandelt. Nach dem Rühren für Minuten wurde die Reaktion unter einem Stickstoffstrom eingeengt und direkt an einer 1 x 16cm Säule, die mit Hexan gepackt worden war, und mit 25ml von je 10%ig, 25%ig und 40%ig Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, chromatographiert. Aus den 7ml- Fraktionen 10-12 wurden 79mg eines klaren farblosen Öles erhalten.

5-[4-(3-Hydroxypropyl)cyclopent-2-en-1-yl]-5-(2-methyl)allylbarbitursäure

Die dialkylierte Barbitursäure wurde hergestellt, wie dies oben für die Herstellung von (3,3-Dimethylallyl)barbitursäure aus dem entsprechenden Diethyl(3,3- dimethylallyl)malonat beschrieben ist, wobei als Ausgangssubstanz die 79mg des Diethyl-4-(3- hydroxypropyl)cyclopent-2-en-1-yl-(2-methyl)allylmalonat verwendet wurden, die wie im unmittelbar voranstehenden Beispiel beschrieben, erhalten worden waren.

5-< 4-{3-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]propyl}cyclopent-2-en-1-yl> -5(2-methyl)allylbarbitursäure

Dieser Tracer wurde hergestellt, wie dies oben für 5-{3- [(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]cyclopent-1-yl}-5- propylbarbitursäure beschrieben ist, der Tracer von Beispiel 1 oben, unter Verwendung der 5.4mg der im unmittelbar voranstehenden Abschnitt genannten Verbindung als Ausgangsmaterial.

BEISPIEL 8 5-{4-[(4'-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxy]pent-2-yl}-5- allylbarbitursäure

Der genannte Tracer dieses Beispiels wurde hergestellt, indem die basenkatalysierte Amidierung angewendet wurde, die in dem Endabschnitt von Beispiel 1 beschrieben ist, wobei 5-[2-(4- Chlorcarbonyloxy)pentyl]-5-allylbarbitursäure und 4'- Aminomethyfluorescein als Ausgangsmaterialien verwendet wurden. Die Herstellung von 5-[2-(4-Chlorcarbonyloxy)pentyl]-5- allylbarbitursäure, die das bevorzugte Hapten der Erfindung, 5- [2-(4-Carbonyloxy)pentyl]-5-allylbarbitursäure umfaßt, ist im Endabschnitt von Beispiel 9 beschrieben. Der in diesem Beispiel genannte Tracer ist in Figur 4 gezeigt:

Figur 4

BEISPIEL 9

Die Herstellung des am meisten bevorzugten Immunogens der Erfindung, d.h. von 5-[2-(4- Carbonyloxy)pentyl]allylbarbitursäure-Rinderserumalbuminimmunogen, wie in Figur 21 gezeigt, ist in diesem Beispiel beschrieben.

Figur 21

4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-2-hydroxypentan

Zu einer Lösung von 1.00g (9.60mmol) 2,4-Pentandiol in 9ml Dimethylformamid wurde 1.52g (10.1mmol) Butyldimethylsilylchlorid und 915mg (13.4mmol) Imidazol hinzugegeben. Die Lösung wurde 12 Stunden lang gerührt, in 100ml Ether verdünnt, und 5 x mit je 2mL Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Chromatographie an einer 2 x 18cm Säule, die mit Hexan gepackt war und mit 100ml von je 5%ig, 10%ig und 25%ig Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, lieferte 1.192g eines klaren farblosen Öls in den 10ml-Fraktionen 6-14.

4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-2-iodpentan

Zu einer Lösung von 1.192g des Alkohols, der wie direkt darüber beschrieben hergestellt worden war, 2.01g (7.65mmol) Triphenylphosphin und 521mg (7,65mmol) Imidazol in 5,5mL Ether und 1,5mL Acetonitril wurden 1,81g (7,11mmol) Jod in Portionen zugesetzt. Die resultierende gelbe Suspension wurde 3 Stunden lang gerührt und an einem Rotationsverdammpfer eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst, und durch eine 2 x 12cm Silicagel-Säule filtriert, die mit 100ml 20% Diethylether/Hexan gepackt worden war und mit dem gleichen Laufmittel eluiert wurde. Beim Einengen erhielt man 1.833g eines klaren farblosen Öls.

Diethyl-2-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)pentyl]malonat

Zu einer gekühlten (0 C) Suspension von 164mg (5.47mmol) Natriumhydrid, das zuvor 3 x mit je 5ml Pentan gewaschen worden war in 2ml Dimethylformamid wurden 0.84ml (5.47mmol) Diethylmalonat zugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren wurden 1.833g des rohen Iodids, das wie in unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben erhalten worden war, als Lösung in 2ml Tetrahydrofuran zugesetzt, und die Reaktion wurde 12 Stunden auf 60 C erwärmt. Die Reaktion wurde mit Wasser gelöscht, mit 1N HCl auf pH 4 angesäuert, und 3 x mit je 15ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 2 x 18cm Silicagel-Säule, die mit Hexan gepackt worden war und mit 50ml Hexan, 100ml 2%ig, 100ml 5%ig und 100ml 10%ig Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, ergab 1,612g eines klaren farblosen Öls aus den 10ml-Fraktionen 9-18.

Diethyl-2-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)pentyl]allylmalonat

Zu einer Suspension von 141mg (4.70mmol) Natriumhydrid (80%ige Mineralöldispersion), zuvor 3 x mit je 5ml Pentan gewaschen, in 5ml Dimethylformamid, wurde das Malonat zugesetzt, das hergestellt worden war, wie dies im unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist. Nach 1-stündigem Rühren wurde 0.46ml (5.37mmol) Allylbromid zugesetzt, und die Reaktion wurde 48 Stunden auf 60 C erwärmt. Die Reaktion wurde mit Wasser gelöscht und 3 x extrahiert, jeweils mit 15ml Ethylacetat. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 2 x 18cm Säule, die mit Hexan gepackt worden war und mit 50ml 1%ig und 100ml 5%ig Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, lieferte 1.635g eines klaren farblosen Öls in den 10ml-Fraktionen 8-12.

Diethyl 2-(4-Hydroxypentyl)allylmalonat

Zu einer Lösung in 0.5ml Tetrahydrofuran von 185mg (0.46mmol) des Malonats, das wie in den unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben hergestellt worden war, wurde 1.0ml 1.0M Tetrabutylammoniumfluorid in THF zugesetzt. Nach 8-stündigem Rühren wurde die Lösung aufkonzentriert und direkt an einer 1 x 18cm Säule chromatographiert, die mit Hexan gepackt worden war und mit 50ml von je 5%ig, 10%ig, 20%ig, 50%ig und 75%ig Ethylacetat/Hexan eluiert wurde. Aus den 6ml- Fraktionen 9-18 wurden 67mg eines klaren farblosen Öls erhalten.

5-[2-(4-Hydroxypentyl)]allylbarbitursäure

Zu einer Lösung von 35mg (1.52mmol) Natrium in absolutem Ethanol wurden - als Lösung in 0.5ml Ethanol - 33mg (0.55mmol) Harnstoff und 132mg (0.46mmol) des Diesters hinzugegeben, der wie in den unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben, hergestellt worden war. Nach dem Kochen am Rückfluß für 12 Stunden wurde die Reaktionsmischung aufkonzentriert, mit 1N Hcl auf pH 3 angesäuert und 3 x mit je 15ml Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, futriert und aufkonzentriert. Ein Anteil (49mg) dieser Substanz wurde auf eine 0.5mm x 20cm x 20cm Platte als methanolische Lösung aufgebracht. Die Platte wurde mit 10%ig Methanol/Chloroform entwickelt. Die Elution der Hauptbande mit 80%ig Methanol/Chloroform lieferte 37mg eines weißen kristallinen Feststoffes. Dieser Alkohol wurde zur Herstellung des Immunogens verwendet, wie dies in dem unmittelbar nachfolgenden Abschnitt beschrieben ist, wie auch für die Herstellung des Fluoresceinyltracers, wie in Beispiel 8 oben beschrieben.

5-[2-(4-Carbonyloxy)pentyl]allylbarbitursäure- Rinderserumalbuminimmunogen

Zu einer gekühlten (0 C) Lösung von 35mg (0.14mmol) des Alkohols aus dem unmittelbar vorhergehenden Pharagraphen in 1.0ml Tetrahydrofuran wurde 1.0ml einer 12%igen Lösung von Phosgen in Benzol zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde 3 Stunden lang gerührt, während derer sie sich auf Raumtemperatur aufwärmte. Einengen im trockenen Argonstrom lieferte 45mg eines dicken farbloses Öls. Dieses Material wurde in 0.77ml Tetrahydrofuran gelöst; 70µl dieser Lösung wurden zur Herstellung des Tracers nach Beispiel 8 (siehe Endabschnitt von Beispiel 8) verwendet, während die verbleibende Menge zur Herstellung des oben genannten Immunogens in diesem Abschnitt eingesetzt wurde. Daher wurde für das Immunogen die verbleibende Lösung zu einer Lösung von 400mg Rinderserumalbumin in 5.6ml 0.1M Natriumphosphatpuffer von pH 8 und 2.4ml Dimethylformamid zugesetzt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur 3 Stunden lang wurde die Reaktionsmischung 40 Stunden lang 4 x gegen je 6 Liter Wasser dialysiert. Die Immunogenlösung wurde bis zur Verwendung eingefroren.

BEISPIEL 10 5-[2-(4-Pentenyl)]-5-[1-(2-carbonyloxy)ethyl]barbitursäure- Rinderserumalbuminimmunogen

Die oben genannte Verbindung dieses Beispiels ist in Figur 17 gezeigt:

Figur 17

2-Jod-4-Penten

Dieses Jodid wurde aus 5g Hydroxy-1-penten gemäß dem in Beispiel 9 für 4-(t-Butyldimethylsilyloxy)-2-iodpentan beschriebenen Verfahren hergestellt.

Diethyl-2-(4-Pentenyl)malonat

Dieses monosubstituerte Malonat wurde hergestellt, wie dies für Diethyl-2-[4-(t-Butyldimethylsilyloxy)pentyl]malonat in Beispiel 9 beschrieben ist, ausgehend von den rohen Jodid, das erhalten wurde, wie im unmittelbaren vorhergehenden Abschnitt beschrieben.

Diethyl-2-(4-pentenyl)-1-(2-tetrahydropyranyloxy)ethylmalonat

Zu einer Suspension von 332mg (2.89mmol) Kaliumhydrid (35%ige Mineralöldispersion, die je 3 x mit 5ml Hexan gewaschen worden war) in 1ml Tetrahydrofuran und 2ml Dimethylformamid wurden 600mg (2.63mmol) des monosubstituierten Malonats aus dem unmittelbar vorhergehenden Abschnitt zugesetzt. Nach dem Rühren für 1 Stunde wurden 808mg (3.16mmol) an 2- (Tetrahydropyranyloxy)-1-iodethan hinzugegeben, und die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann 12 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Die Reaktion wurde mit wasser gelöscht, und die Mischung wurde 3 x mit je 10ml Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 1 x 18cm Silicagel-Säule, die mit Chloroform gepackt worden war und mit 2%ig Methanol/Chloroform eluiert wurde, lieferte 775mg eines klaren farblosen Öls in den 10ml-Fraktionen 5-8.

5-[2-(4-Pentenyl)]-5-[1-(2-Tetrahydropyranyloxy)ethyl]barbitursäure

Dieses Barbitursäurederivat wurde hergestellt, wie es für die Synthese von 5-[2-(4-Hydroxypentyl)]-allylbarbitursäure in Beispiel 9 beschrieben ist, unter Verwendung von 765mg des Malonats, das hergestellt wurde wie im unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben.

5-[2-(4-Pentenyl)]-5-[1-(2-hydroxyethyl)]barbitursäure

Zu einer Lösung von 140mg (0.43mmol) der Tetrahydropyranylbarbitursäure aus dem unmittelbar vorhergehenden Abschnitt in 2 ml Ethanol wurden 0.5ml 5%ige wässerige Schwelfelsäure zugegeben. Nach dem Kochen am Rückfluß für 20 Minuten wurde die Reaktionsmischung aufkonzentriert und direkt an einer 1 x 10cm Säule chromatographiert, die mit Chloroform gepackt worden war und mit 20ml 2%ig, 20ml 10%ig, und 20ml 15%ig Methanol/Chloroform eluiert wurde. Durch Einengen der 6ml-Fraktion 9-12 wurden 69mg eines weißen Feststoffes erhalten.

5-[2-(4-Pentenyl)]-5-[1-(2-Carbonyloxy)ethyl]barbitursäure- Rinderserumalbuminimmunogen

Die gesamte Menge des alkoholischen Vorläufers aus dem unmittelbar vorhergehenden Abschnitt wurde gemäß dem Vorgehen im Endabschnitt des Beispiels 9 in das Chlorcarbonyloxyderivat und dann in das oben genannte Immunogen dieses Beispiels überführt.

BEISPIEL 11 5-Cyclopentyl-5-[1-(2-Carbonyloxy)ethyl]barbituratsäure- Rinderserumalbuminimmunogen

Das in der Überschrift gennante Immunogen dieses Beispiels ist in Figur 18 gezeigt:

Figur 18

Diethylcyclopentylmalonat

Zu einer Lösung von 4,69 (0.2mol) Natrium in 80ml absolutem Ethanol wurden 30,4ml (0.2mol) Diethylmalonat zugegeben. Nach kurzem Rühren wurden 21,4ml (0.2mol) Cyclopentylbromid hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde 12 Stunden am Rückfluß gekocht. Der Hauptteil des Ethanols wurde dann am Rotationsverdampfer entfernt, und die Reaktion wurde mit 250ml Wasser gelöscht und 3 x je 100ml Ether extrahiert. Die Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Destilation durch eine 6"Vigreuxkolonne bei 6mm Hg lieferte 32,232g eines klaren farblosen Öls mit einem Siedepunkt von 122-125 C.

5-Cyclopentylbarbitursäure

Zu einer Lösung von 3.48g (151mmol) Natrium in 50ml absolutem Methanol wurden 3.02g (50.4mmol) Harnstoff und 10g (43.9mmol) des Malonats zugesetzt, das im unnmittelbar vorhergehenden Abschnitt hergestellt worden war. Die Lösung wurde über Nacht am Rückfluß gekocht, gekühlt und aufkonzentriert. Die Reaktion wurde mit Wasser gelöscht, mit 10ml konzentrierter Schwefelsäure angesäuert und der resultierende weiße Feststoff wurde durch Filtration der gekühlten Lösung erhalten. Umkristallisation des Feststoffes aus Wasser und dann aus 5%ig Ethanol/Wasser ergab 7,001g farbloser Plättchen mit einem Schmelzpunkt von 222-223 C.

5-Cyclopentyl-5-(2-tetrahydropyranyloxy)ethylbarbitursäure

Die in der Überschrift genannte Verbindung dieses Abschnittes wurde hergestellt, wie dies in Beispiel 10 für Diethyl-2-(4-pentenyl)-1-(2-tetrahydropyranyloxy)ethylmalonat beschrieben ist, unter Verwendung von 860mg der kristallinen Barbitursäure, die wie im unmittelbar vorhergehenden Abschnitt beschrieben hergestellt worden war.

5-Cyclopentyl-5-(2-hydroxy)ethylbarbitursäure

Dieses Barbitursäurederivat wurde aus 240mg des Produktes synthetisiert, das im unmittelbar vorhergehenden Abschnitt erhalten worden war, unter Anwendung des Verfahrens zur Herstellung von 5-[2-(4-Pentenyl)]-5-[1-(2-hydroxyethyl)] barbitursäure, wie in Beispiel 10 beschrieben.

5-Cyclopentyl-5-[1-(2-carbonyloxy)ethyl]barbitursäure- Rinderserumalbuminimmunogen

Nach den Verfahren, die im Endabschnitt von Beispiel 9 beschrieben sind, wurden 43mg des alkoholischen Vorläufers aus dem unmittelbar vorhergehenden Abschnitt in das Chlorcarbonyloxyderivat überführt, das seinerseits zur Konjugierung des Haptens an das Rinderserumalbumin verwendet wurde, um das Immunogen nach der Überschrift dieses Beispiels herzustellen.

BEISPIEL 12 5-[4-(1-Carbonyloxy)pentyl]-5-propylbarbitursäure- Rinderthyroglobulinimmunogen

20mg (78µmol) von 5-[4-(1-Hydroxypenty)1]-5-propylbarbitursäure, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt worden waren, wurden in 0.5ml Tetrahydrofuran gelöst und 0.5ml einer 12%igen Lösung in Benzol wurden zugesetzt. Nach 3- stündigem Rühren wurde die Lösung auf 28mg eines weißen Halbfeststoffes aufkonzentriert, der in 600µl Dimethylformamid gelöst wurde. 300µl dieser Lösung wurden zu einer Lösung von 205mg Rinderthyroglobulin in 10ml von 0.05M Natriumphosphatbuffer, pH 7.51 zur Konjugation gegeben. Die Konjugationsreaktionsmischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und 4 x 32 Stunden lang dialysiert, jedes Mal gegen 21 einer 0.05M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,5. Die Immunogenlösung wurde eingefroren bis zu ihrer Verwendung.

Das in der Überschrift dieses Beispiels genannte Immunogen ist in Figur 10 gezeigt:

Figur 10

BEISPIEL 13

Das FPIA-Verfahren wird diesem Beispiel beschrieben:

A. Reagenzien

1) Vorbehandlungslösung - eine Lösung, die 0,1M Tris, 1%iges 5-Sulfosalicylsäuredihydrat, 0,1% Kupfersulfatpentahydrat, und 0.1% Natriumazid (pH 7.5) umfaßt.

2) Tracer - Tracerverbindung, bei ungefähr 100 nM, in 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,0, welcher 20% (V/V) Dimethylsulfoxid, 0.01% Rindergammaglobulin, und 0.1% Natriumazid enthält. Der bevorzugte Tracer ist jener aus Beispiel 1(Figur 1).

3) Antikörper - Schafantiserum, gezüchtet gegen ein Immunogen gemäß der Erfindung (vorzugsweise das Immunogen nach Beispiel 9, Figur 21) in einem 0.1M Natriumphosphatpuffer pH 6,5, enthaltend 1% Rinderserumalbumin, 2.0%ig (V/V) Ethylenglykol und 0.1%ig Natriumazid. [Das Antiserum wird nach einem Standardverfahren erhalten, indem zelluläres Material aus dem Blut entfernt wird, welches einem Schafabgenommen wurde, das ein Immunantwort gegen das Immunogen errichtet hat, und indem dann das zellfreie Antiserum mit dem oben beschriebenen Puffer bis zu einer Verdünnung von etwa 1:140 (V/V) mit dem Puffer verdünnt wird, der weiter oben in diesem Absatz beschrieben ist(d.h. 7ml Serum, mit dem Puffer auf 11 verdünnt.

4) Waschlösung - eine Lösung, die 50% (V/V) Dimethylsulfoxid in 0.45% Natriumchlorid enthält, hergestellt durch Vermischen eines Teils von Dimethylsulfoxid mit einem Teil 0.15M NaCl in Wasser.

5) Eichlösungen - vereinigte normale (d.h. barbituratfreie) menschliche Seren die mit 0.1% Natriumazid konserviert sind, zu denen 0.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0 oder 40.0 µg/mL von Secobarbital hinzugefügt wurde.

6) Kontrollösungen - vereinigte normale menschliche Seren, die mit 0.1% Natriumazid konserviert sind, zu denen 3.0, 7.5, oder 30.0µg/mL Secobarbital hinzugefügt wurden.

7) Verdünnungspuffer - ein 0.1M Natriumphosphatpuffer pH 7,5, der 0.1% Natriumazid und 0.01% Rindergammaglobulin enthält.

Alle Messungen der polarisierten Fluoreszenz wurden mit Hilfe des kommerziell erwerblichen Abbott Laboratories TDx Clinical Analyzers durchgeführt.

B. Assayvorschrift.

1) 25µl einer unbekannten Probe oder Kontrollösung wird in den Vorverdünnungsbehälter pipettiert. Die Pipette wird dann mit Waschlösung gewaschen bevor eine andere Probe oder Kontrollösung überführt wird. Ein ausreichendes Volumen von Verdünnungspuffer wird zugegeben, um das Volumen in dem Vorverdünnungsbehälter auf 500µl. anzuheben. Eine 6µl Probe aus dem Vorverdünnungsbehälter und 12.5µl von Vorbehandlungslösung werden in die Küvette pipettiert. Ausreichend Verdünnungspuffer wird zugegeben, um das Volumen auf 1ml zu erhöhen. Eine Ablesung der Hintergrundintensität wurde vorgenommen.

2) 12.5µl der Vorbehandlungslösung, 25µl jeweils an Tracer- und Antikörperlösung und eine 6µl Probe aus dem Vorverdünnungsbehälter werden zu der Küvette hinzugefügt. Ausreichend Verdünnungsbuffer wird zugegeben, um das Endvolumen auf 2.0ml zu erhöhen.

3) Die Fluoreszenzpolarisation aufgrund von Tracerbindung an den Antikörper (Nettopolarisation) wird erhalten, indem die Fluoreszenzpolarisationsintensitäten des Hintergrundes von der Endfluoreszenzpolarisationsintensitäten der Mischung abgezogen werden.

4) Die erhaltenen Polarisationswerte sind zu der Barbituratkonzentration jeder Probe umgekehrt proportional.

5) Der Nettopolarisationswert für eine Probe wird mit einer Standardkurve verglichen, die unter Verwendung von Eichlösungen bekannten Secobarbitalgehaltes erhalten wurde.

Die oben ausgeführte Vorschrift ist für ein Barbituratassay von Serum unter Verwendung des TDx-Systems, von Schafantiserum, das mit dem Immunogen nach Formel 21 gezüchtet wurde, und von Tracer nach Formel 1 optimiert. Verschiedene Abwandlungen können auf die Vorschrift angewendet werden, wenn ein Assay-System verwendet wird, das von dem TDx-System verschieden ist, wenn ein anderes Antiserum oder ein anderer Tracer eingesetzt wird, oder wenn ein Probensatz analysiert wird, von dem im voraus bekannt ist, daß ein ungewöhnlich hoher oder ein ungewöhnlich niedriger Barbituratgehalt untersucht werden muß. Eine solche Abwandlung kann z.B. darin bestehen, daß sich das Volumen der verdünnten Probe ändert, die aus dem Vorverdünnungsbehälter entfernt wird, um in die Küvette gegeben zu werden. Solche Abwandlungen liegen offensichtlicherweise im Erfahrungsbereich des Fachmanns in der FPIA-Technik.

BEISPIEL 14

Das vorliegende Beispiel zeigt die Leistung der Antiseren (und daher, indirekt der Immunogene) und Tracer in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wenn sie in dem Abbott Laboratories TDx Analyzer in Übereinstimmung mit der Vorschrift, die im Beispiel 13 beschrieben ist, verwendet werden. Die Leistung kann als Ausdruck der maximalen Nettopolarisation (in Millipolarisationseinheiten, abgekürzt "mP"), werden, wobei 1000mP die vollständige Polarisation des einfallenden polarisierten Lichtes und 0mP die völlige Depolarisation bedeuten, oder als Ausdruck der Bereichsbreite (in mP) und der Nettofluoreszenzintensität, wenn eine festgelegte Versuchsvorschrift bei einer bestimmten Systemverdünnung und einer festgelegten Konzentration eines Tracers im System verwendet wird. Die maximale Nettopolarisation zeigt die Maximalpolarisation an, wenn eine maximale Menge des Tracers an den Antikörper gebunden ist (d.h. bei Verwendung eines Serums, das gänzlich frei vo Barbituraten ist) . Ein maximaler Nettopolarisationswert über 250mP ist außergewöhnlich gut, aber ein Wert, der größer als 230mP ist, ist ausgezeichnet und für die kommerzielle Anwendung verträglich. Die Bereichsbreite zeigt den Unterschied zwischen der Nettopolarisation bei maximaler Bindung von Tracer an den Antikörper (d.h., wenn kein Barbiturat vorhanden ist) und der Nettopolarisation bei minimaler Bindung von Tracer an den Antikörper (d.h., in der Sprache des vorliegenden Beispiels, bei Secobarbitalmengen um 40µg/ml in einer Serumprobe an). Eine größere Bereichsbreite erlaubt eine genauere quantitative Datenanalyse. Eine Bereichsbreite von wenigstens 170mP ist für die kommerzielle Anwendung bevorzugt. Die Nettofluoreszenzintensität ist ein Maß für die Amplitude des Fluoreszenz- Signals, die über die Hintergrundfluoreszenz hinausragt; eine höhere Nettomtensität ergibt eine genauere Messung. Die Nettofluoreszenzintensität ist die Summe der Intensität (über dem Hintergrund) der vertikal polarisierten Fluoreszenz plus 2 x der Intensität (überhalb des Hintergrundes) der horizontal polarisierten Fluoreszenz (Die Polarisation des planar polarisierten einfallenden Lichtes ist als "vertikal" definiert.). Für eine kommerziell verträgliche anti-Barbiturat- Antiserum/Tracer-Kombination muß die Fluoreszenzintensität in dem Assay-System bei der oben beschriebenen Tracer- und Antiserumverdünung wenigstens 3 oder 4 mal so groß wie die Hintergrundintensität sein, der wenigstens 8 bis 10fache Wert bezogen auf den Hintergrund wird aber bevorzugt. Die Werte bezüglich der Leistung von Antiseren (von Schafen) und Tracern sind in Tabelle 14 gezeigt.

TABELLE 14
Immunogen für Antiserum Nettopolarisation mP Bereichsbreite mP Nettointensität mP Verh.¹ NI/HI Tracer Figur ¹ "Verh." bedeutet Verhältnis, "NI/HI" bedeutet Nettointensität dividiert durch Hintergrundintensität.

BEISPIEL 15 Kreuzreaktivität

Däs Assay der vorliegenden Erfindung ist -ein besonders wünschenswertes Assay für die Barbiturate, weil es die Glieder dieser Wirkstoffklasse relativ gleichwertig nachweist und weil es andere Substanzen wie 1) andere narkotische Wirkstoffe 2) anregende Wirkstoffe und 3) für gewöhnlich mitverabreichte Wirkstoffe, die aufgrund ihrer Kreuzreaktivität gegenüber Babituraten für Immunoassays auf Barbiturate eine Schwierigkeit darstellten, und demgemäß mit dem Assay interferierten, was zu falsch positiven oder übertrieben positiven Ergebnissen führte, nicht nachweist. Die Kreuzreaktivität wurde für die Barbiturate und deren Metabolite getestet. Die Verbindungen wurden einem Assay unterzogen, indem eine bekannte Menge einer Testverbindung zu wirkstoffreiem normal- Humanserum zugesetzt wurde, und indem mit dem Barbituratassay der vorliegenden Erfindung auf dem Abott Laboratories TDx Clinical Analyzer (siehe Beispiel 13) unter Verwendung von Schafantiserum gegen das Immunogen nach Figur 21 und unter Verwendung des Tracers nach Figur 1 getestet wurde. Die Kreuzreaktivität wurde nach folgender Formel bestimmt:

%-Satz Kreuzreaktivität = 100 x Konzentration der Testverbindung, die in dem Assay gefunden wurde/Bekannte Konzentration der zugegebenen Testverbindung

Repräsentative Werte sind in der Tabelle 15-1 unten gezeigt.

TABELLE 15-1
Testverbindung zugesetzte Konz.(µg/ml) gefundene Konz.(µg/ml) % Kreuzreaktivität Allobarbital Alphenal Amobarbital Bralloboarbital Butabarbital Butalbital Butabarbital (Butethal) Cyclobarbital
TABELLE 15-1 (Fortsetzung)
Testverbindung zugesetzte Konz.(µg/ml) gefundene Konz.(µg/ml) % Kreuzreaktivität Cyclopentobarbital Pentobarbital Phenobarbital Secobarbital (Eichsubstanz) Talbutal Thiamylal Vinyl Barbital

Die Kreuzreaktivität wurde ebenfalls noch dem oben in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren geprüft, für Verbindungen, die den Barbituraten ähnelnde Strukturen aufweisen. Die Repräsentativen Werte sind in den Tabellen 15-2 und 15-3 aufgezeigt. Wie aus der Untersuchung der Werte in den Tabellen 15-2 und 15-3 hervorgeht, weist das Assay-System der vorliegenden Erfindung eine minimale Kreuzreaktivität gegenüber vielen barbituratartigen Verbindungen und anderen möglichen Störungsquellen in Immunoassays für Barbituraten auf.

TABELLE 15-2
Testverbindung zugesetzte Konz.(µg/ml) gefundene Konz.(µg/ml) % Kreuzreaktivität p-Hydroxyphenytoin Phenytoin

Die Verbindungen, die in Tabelle 15-3 gezeigt sind, ergaben Ergebnisse, die geringer als die Assayempfindlichkeit (0.7ug/mL) waren, wenn sie bis zu den gezeigten Konzentrationen hin getestet wurden.

TABELLE 15-3
Getestete Verbindung Getestete Konz. (µg/ml) Acetaminophen Alloxan Amitriptylin Amoxapin Amphetamin Coffein Chlorpromazin Cocain Desipramin Dextromethorphan Diazepam Dyphyllin Ethchlorvymol Ethosuximid Ethotoin Fentanyl Glutathimid Ibuprofen Mephenytoin Methaqualon Methylprylon Morphin Phencyclidin Phenylbutazon Primidon Promethazin Salicylat 11-Hor-Delta-8-tetrahydrocannabinol-9-carbonsäure Theophyllin

BEISPIEL 16 Verschleppung

Unter Verwendung der Waschlösung, die in Beispiel 13 beschrieben ist, zum Auspülen der in dem TDx-System zur Probenüberführung in das System verwendeten Pipette wurde die Verschleppung bestimmt in dem normales (d. h. barbituratfreies) Humanserum untersucht wurde, in das 200µg/ml Secobabital eingespritzt worden waren, gefolgt von barbituratfreiem Normalserum nach dem Auswaschen der Pipette. Das Assay wurde durchgeführt, indem das Schafantiserum gegen das Immunogen nach Figur 21 und der Tracer nach Figur 1 verwendet wurden, gemäß dem in Beispiel 13 beschriebenen Verfahren. Die Verschleppung wurde nach der folgenden Formel berechnet:

%-Verschleppung = Konzentration an Secobarbital, die im barbituratfreien Serum gefunden wurde/Konzentration an Secobarbital, die in Secobarbital enthaltenden Serum gefunden wurde.

Es wurde festgestellt, daß der Prozentsatz an Verschleppung gleich oder weniger als erstaunlich geringe 0.13% betrug.


Anspruch[de]

1. Verbindung nach Formel 1,

wobei X&sub1; gleich Sauerstoff oder Schwefel ist; wobei Q&sub1; gleich (a) einer aktivierenden Gruppe für den nukleophilen Austausch von Q&sub1; durch eine Aminogruppe, (b) einem immunogenen Polypeptid, das über eine N-terminale oder über eine sich in einer Seitenkette befindende Aminogruppe des Polypeptids an die Carbonylgruppe gebunden ist, oder (c) einer funktionellen Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinamin I, Fluoresceinamin II und einem Fluorescein besteht, das in der 4'- Postion mit einer Gruppe der Formel X

-CH&sub2;-(NH)R&sub1;&sub0;

substituiert ist, wobei R&sub1;&sub0; gleich Wasserstoff, Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Glycyl ist, wobei die funktionelle Gruppe über die Aminogruppe der funktionellen Gruppe an diejenige Carbonylgruppe gebunden ist, an die Q&sub1; in der Verbindung nach Formel I gebunden ist; wobei R&sub1; gleich Alkylen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylen mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenylen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cyloalkenylen mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; und wobei R&sub2; gleich Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkenyl mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Phenyl ist, unter der Voraussetzung, daß

(i) R&sub1; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom, das nicht dasjenige ist, welches an den Sauerstoff der Carbonatgruppe gebunden ist, mit Chlor oder Brom substituiert ist, daß (ii) R&sub2; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom mit Chlor oder Brom substituiert ist, und daß (iii) R&sub1; von Ethylen verschieden ist, wenn R&sub2; gleich Phenyl ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei X&sub1; gleich Sauerstoff ist; wobei R&sub1; aus der Gruppe, bestehend aus

gewählt ist, wobei R&sub2; gleich -CH&sub2;(CH=CH&sub2;) ist, wenn R&sub1; gleich - CH(CH&sub3;)CH&sub2;(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2; gleich Cyclopentyl ist, wenn R&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub2;- ist; wobei R&sub2; aus der Gruppe gewählt ist, die aus n-Propyl und Allyl besteht, wenn R&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub3;(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2; gleich n-Propyl ist, wenn R&sub1; gleich Cyclopentylen ist; wobei R&sub2; gleich, Allyl ist, wenn R&sub1; gleich Cyclohexylen ist; wobei R&sub2; aus der Gruppe bestehend aus Allyl und 2-Bromallyl gewählt ist, wenn R&sub1; gleich -CH&sub2;((CH&sub3;)C=CH)CH&sub2;- ist; wobei R&sub2; gleich 2- Methylallyl ist , wenn R&sub1; gleich Cyclopentenylen ist; und wobei R&sub2; gleich 2-Methylallyl ist, wenn R&sub1; gleich

ist.

3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei R&sub1; aus der Gruppe gewählt ist, die aus -CH(CH&sub3;)CH&sub2;(CH&sub3;)CH- und Cyclopentylen besteht, und wobei Q&sub1; aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinamin I, Fluoresceinamin II und aus einem Fluorescein besteht, das in der 4'-Position mit einer Gruppe nach Formel X substituiert ist.

4. Verbindung nach Anspruch 2, wobei Q&sub1; ein immunogenes Polypeptid ist.

5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid Rinderserumalbumin ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines anti- Barbituratantiserums, das folgendes umfaßt: (a) Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugers mit einer Verbindung nach Formel II

wobei X&sub1; gleich Sauerstoff oder Schwefel ist; wobei Q&sub2; ein Polypeptid ist, das in dem Säuger immunogen ist, und das über eine N-terminale oder über eine sich in einer Seitenkette des Polypeptids befindende Aminogruppe an die Carbonylgruppe gebunden ist; wobei R&sub1; gleich Alkylen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylen mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenylen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkenylen mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; und wobei R&sub2; gleich Alkyl von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkenyl von 5 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Phenyl ist, unter der Voraussetzung, daß (i) R&sub1; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom, das nicht dasjenige ist, welches an den Sauerstoff der Carbonatgruppe gebunden ist, mit Chlor oder Brom substituiert ist, daß (ii) R&sub2; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom mit Chlor oder Brom substituiert ist, und daß (iii) R&sub1; von Ethylen verschieden ist, wenn R&sub2; gleich Phenyl ist; und (b) Erhalten des Serums von dem immunisierten Säuger.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei in der Verbindung, die zur Immunisierung des Säugers verwendet wird, X&sub1; gleich Sauerstoff ist; und R&sub1; aus der Gruppe, bestehend aus

gewählt ist, wobei R&sub2; gleich -CH&sub2;(CH=CH&sub2;) ist, wenn R&sub1; gleich - CH(CH&sub3;)CH(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2; gleich Cyclopentyl ist, wenn R&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub2;- ist; wobei R&sub2; aus der Gruppe gewählt ist, die aus n-Propyl und Allyl besteht, wenn R&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub3;(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2; gleich n-Propyl ist, wenn R&sub1; gleich Cyclopentylen ist; wobei R&sub2; gleich Allyl ist, wenn R&sub1; gleich Cyclohexylen ist; wobei R&sub2; aus der Gruppe bestehend aus Allyl und 2-Bromallyl gewzhlt ist, wenn R&sub1; gleich -CH&sub2;((CH&sub3;)C=CH)CH&sub2;- ist; wobei R&sub2; gleich 2- Methylallyl ist , wenn R&sub1; gleich Cyclopentenylen ist; und wobei R&sub2; gleich 2-Methylallyl ist, wenn R&sub1; gleich

ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei in der Verbindung, die zur Immunisierung des Säugers verwendet wird, das immunogene Polypeptid aus der Gruppe gewählt ist, die aus dem Hämocyanin der Napfschnecke, einem Vogel-Ovalbumin, einem Polylysin und - von einer Säugerspezies, welche von der Spezies des immunisierten Säugers verschieden ist- aus einem Serumalbumin, einem Immunglobulin und einem Thyroglobulin gewählt ist.

9. Testkit zur Analyse einer biologischen Probe auf die Anwesenheit eines Barbiturats mittels Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay, wobei das Kit folgendes umfaßt: (1) ein anti-Baribituratantiserum, wobei das Serum durch ein Verfahren hergestellt worden ist, das folgendes umfaßt: (a) Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugers mit einer Verbindung nach Formel II

wobei X&sub1; gleich Sauerstoff oder Schwefel ist; wobei Q&sub2; ein Polypeptid ist, das in dem Säuger immunogen ist, und das über eine N-terminale oder über eine sich in einer Seitenkette des Polypeptids befindende Aminogruppe an die Carbonylgruppe gebunden ist; wobei R&sub1; gleich Alkylen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylen von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenylen von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkenylen von 5 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; und wobei R&sub2; gleich Alkyl von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkenyl von 5 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Phenyl ist, unter der Voraussetzung, daß (i) R&sub1; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom, das nicht dasjenige ist, welches an den Sauerstoff der Carbonatgruppe gebunden ist, mit Chlor oder Brom substituiert ist, daß (ii) R&sub2; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom mit Chlor oder Brom substituiert ist, und daß (iii) R&sub1; von Ethylen verschieden ist, wenn R&sub2; gleich Phenyl ist; und (ii) Erhalten des Serums von dem immunisierten Säuger; und (2) eine Verbindung nach Formel XXI

wobei X&sub2;&sub1; gleich Sauerstoff oder Schwefel ist; wobei Q&sub2;&sub1; gleich einer funktionellen Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinamin I, Fluoresceinamin II, und einem Fluorescein besteht, das in der 4'-Position mit einer Gruppe nach Formel X substituiert ist,

-CH&sub2;-(NH)R&sub1;&sub0;,

wobei R&sub1;&sub0; gleich Wasserstoff, Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Glycyl ist, wobei die funktionelle Gruppe über die Aminogruppe der funktionellen Gruppe an diejenige Carbonylgruppe gebunden ist, an die Q&sub2;&sub1; in der Verbindung nach Formel XXI gebunden ist; wobei R&sub2;&sub1; gleich Alkylen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkylen mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenylen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cyloalkenylen mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; und wobei R&sub2;&sub2; gleich Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Cycloalkenyl mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Phenyl ist, unter der Voraussetzung, daß (1) R&sub2;&sub1; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom, das nicht dasjenige ist, welches an den Sauerstoff der Carbonatgruppe gebunden ist, mit Chlor oder Brom substituiert ist, daß (ii) R&sub2;&sub2; an 0 oder an 1 Kohlenstoffatom mit Chlor oder Brom substituiert ist, und daß (iii) R&sub2;&sub1; von Ethylen verschieden ist, wenn R&sub2;&sub2; gleich Phenyl ist.

10. Kit nach Anspruch 9, wobei (1) das Antiserum durch ein Verfahren hergestellt wurde, bei dem ein Schaf, ein Kaninchen, eine Ziege, eine Maus oder eine Ratte mit einer Verbindung nach Formel II immunisiert wurde; wobei X&sub1; gleich Sauerstoff ist, wobei Q&sub2; aus der Gruppe gewählt ist, die aus Rinderserumalbumin und Rinderthyroglobulin besteht; wobei R&sub1; aus der Gruppe, bestehend aus

gewählt ist, wobei R&sub2; gleich -CH&sub2;(CH=CH&sub2;) ist, wenn R&sub1; gleich - CH(CH&sub3;)CH&sub2;(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2; gleich Cyclopentyl ist, wenn R&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub2;- ist; wobei R&sub2; aus der Gruppe gewählt ist, die aus n-Propyl und Allyl besteht, wenn R&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub3;(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2; gleich n-Propyl ist, wenn R&sub1; gleich Cyclopentylen ist; wobei R&sub2; gleich Allyl ist, wenn R&sub1; gleich Cyclohexylen ist; wobei R&sub2; aus der Gruppe bestehend aus Allyl und 2-Bromallyl gewählt ist, wenn R&sub1; gleich -CH&sub2;((CH&sub3;)C=CH)CH&sub2;- ist; wobei R&sub2; gleich 2- Methylallyl ist , wenn R&sub1; gleich Cyclopentenylen ist; und wobei R&sub2; gleich 2-Methylallyl ist, wenn R&sub1; gleich

ist; und wobei in der Verbindung nach Formel XXI, die bei dem Verfahren verwendet wird, X&sub2;&sub1; gleich Sauerstoff ist; wobei Q&sub2;&sub1; gleich 4'-Aminomethylfluorescein ist; wobei R&sub2;&sub1; aus der Gruppe, bestehend aus

gewählt ist, wobei R&sub2;&sub2; gleich -CH&sub2;(CH=CH&sub2;) ist&sub1; wenn R&sub2;&sub1; gleich - CH(CH&sub3;)CH&sub2;(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2;&sub2; gleich Cyclopentyl ist, wenn R&sub2;&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub2;-ist; wobei R&sub2;&sub2; aus der Gruppe gewählt ist, die aus n-Propyl und Allyl besteht, wenn R&sub2;&sub1; gleich -(CH&sub2;)&sub3;(CH&sub3;)CH- ist; wobei R&sub2;&sub2; gleich n-Propyl ist, wenn R&sub2;&sub1; gleich Cyclopentylen ist; wobei R&sub2;&sub2; gleich Allyl ist, wenn R&sub2;&sub1; gleich Cyclohexylen ist; wobei R&sub2;&sub2; aus der Gruppe bestehend aus Allyl und 2-Bromallyl gewählt ist, wenn R&sub2;&sub1; gleich -CH&sub2;((CH&sub3;)C=CH)CH&sub2;- ist; wobei R&sub2;&sub2; gleich 2-Methylallyl ist , wenn R&sub2;&sub1; gleich Cyclopentenylen ist; und wobei R&sub2;&sub2; gleich 2-Methylallyl ist, wenn R&sub2;&sub1; gleich

ist.







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