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Dokumentenidentifikation DE69026569T2 05.09.1996
EP-Veröffentlichungsnummer 0424519
Titel ANTIGENE EINES TRANSMEMBRANEN HÜLLENGLYCOPROTEINS EINES MENSCHLICHEN RETROVIRUS DES TYPS HIV-2 UND IMMUNOLOGISCH VERWANDTE ANTIGENE
Anmelder Institut Pasteur, Paris, FR
Erfinder HOVANESSIAN, Ara, F-93100 Montreuil, FR;
REY, Marie-Anne, F-75004 Paris, FR;
LAURENT, Anne, F-75007 Paris, FR;
KRUST, Bernard, F-75012 Paris, FR;
MONTAGNIER, Luc, F-92350 Plessis-Robinson, FR
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Wuesthoff & Wuesthoff, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69026569
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument Fr
EP-Anmeldetag 11.05.1990
EP-Aktenzeichen 909082406
WO-Anmeldetag 11.05.1990
PCT-Aktenzeichen FR9000336
WO-Veröffentlichungsnummer 9013314
WO-Veröffentlichungsdatum 15.11.1990
EP-Offenlegungsdatum 02.05.1991
EP date of grant 17.04.1996
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.09.1996
IPC-Hauptklasse A61K 39/21

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Antigene des Transmembranglykoproteins der Hülle eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2, Antigene, die ein immunologisches Verwandtschaftsverhältnis zu diesen aufweisen, und genauer Antigene, die ausschließlich während bestimmter Phasen der Entwicklung einer Infektion aufgrund eines humanen Retrovirus HIV-2 in vivo vorliegen. Diese Antigene sind für den Verlauf von Bildung und Reifung des Transmembranglykoproteins der Hülle dieses Retrovirus charakteristisch und stehen dementsprechend in Zusammenhang mit der Entwicklung und der Proliferation des Retrovirus HIV-2 und folglich mit der Ausbreitung der Infektion.

Die Erfindung betrifft gleichfalls Antikörper, die diese Antigene erkennen, sowie immunogene Zusammensetzungen, die diese Antikörper enthalten.

Die Erfindung betrifft überdies die Herstellung der vorstehend aufgeführten Antigene sowie deren Verwendung für die Diagnose einer Infektion aufgrund eines humanen Retrovirus HIV-2.

Ätiologische Mittel, die für die Entwicklung von Lymphadenopathiesyndromen (deren englische Abkürzung LAS ist) verantwortlich oder an der Entwicklung dieser Syndrome beteiligt oder für die Entwicklung von Syndromen erworbener Immundefizienz (AIDS) verantwortlich sind, wurden isoliert, identifiziert und charakterisiert.

Man hat durch HIV (englische Abkürzung von "Human Immunodeficiency Virus") mehrere humane Retroviren bezeichnet, die unter bestimmten Bedingungen beim Menschen ein LAS hervorrufen können, das gegebenenfalls von einem AIDS abgelöst wird.

So wurde ein erstes, als LAV-1 oder HIV-1 bezeichnetes Virus isoliert und in der Patentanmeldung EP 84401 834 vom 14.09.1984 (veröffentlicht unter der Nummer EP-A- 0 138 667) beschrieben. Dieses Virus wurde gleichfalls von F. Barre Sinoussi et al. (1) beschrieben.

Varianten dieses HIV-1-Virus, die als LAV ELI und LAV MAL bezeichnet wurden, wurden gleichfalls isoliert, charakterisiert und in der Patentanmeldung EP 84 401 834 beschrieben.

Die Isolierung und die Charakterisierung eines Retrovirus, das aus einer unterschiedlichen Klasse stammt und lediglich eine geringere immunologische Verwandtschaft zu den vorstehend Aufgeführten aufweist, wurden in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 87 400 151.4, veröffentlicht unter der Nr.239 425, beschrieben. Diese Retroviren, die unter der Bezeichnung HIV-2 zusammengefaßt wurden, wurden von mehreren erkrankten Afrikanem, die Symptome einer Lymphadenopathie oder eines AIDS zeigten, isoliert.

Die Untersuchung dieser HIV-Retroviren, die Isolierung und die Analyse von deren Nukleotidsequenzen sowie die Charakterisierung von deren antigenen Proteinen hat es ermöglicht, Vergleichsversuche zwischen den unterschiedlichen erhaltenen Stämmen vorzunehmen auf Ebene von deren Verwandtschaft oder im Gegensatz dazu auf der Ebene von deren Spezifität, sowohl struktureller als auch funktioneller Art.

Diese HIV-1- und HIV-2-Retroviren sind gleichfalls im Vergleich zu einem Retrovirus von Affenursprung (bezeichnet durch die Abkürzung SIV oder STLV-III) untersucht worden und diese Untersuchung hat es ermöglicht, eine gewisse Verwandtschaft zwischen den Proteinen und Glykoproteinen des HIV-2-Retrovirus und dessen Varianten und jenen des SIV- Retrovirus zu zeigen.

Eine Verwandtschaft ist insbesondere auf der Ebene des Hüllproteins von jedem dieser Viren bemerkenswert. Man hat in der Tat immunologische Kreuzreaktionen zwischen dem Glykoprotein der Hülle des SIV-Retrovirus und gegen das Glykoprotein der Hülle des HIV-2- Retrovirus gerichteten Antikörpern nachgewiesen, während diese immunologische Kreuzreaktion nicht zwischen dem SIV-Retrovirus und dem HIV-1-Retrovirus wie auch nicht zwischen den Retroviren HIV-1 und HIV-2 auftritt.

Ergebnisse, die das Glykoprotein der Hülle des HIV-2-Retrovirus betreffen, für das das Gen env des Genoms dieses Retrovirus kodiert, wurden in der bereits zitierten Europäischen Patentanmeldung Nr.87 400 151.4 (veröffentlicht unter der Nr. EP-A-0 239 425) aufgeführt. In dieser Europäischen Patentanmeldung wurde dieses Glykoprotein durch die Abkürzung gp140 unter Bezugnahme auf sein Molekulargewicht von ungefähr 140000 Da bezeichnet. Es war gleichwohl angegeben worden, daß die Berechnung des Molekulargewichts mit ± 10 %- iger Genauigkeit vorgenommen worden war. In einer zeitlich früheren französischen Patentanmeldung (Nr.86/03881, veröffentlicht unter der Nr.2.596.063) war gleichfalls ein Vorläufer des gp140, bezeichnet als gp160 (Molekulargewicht von 160 kDa ± 10%) beschrieben worden.

Untersuchungen, die mehr auf das Glykoprotein der Hülle des Retrovirus HIV-2 zugeschnitten waren, wurden ausgeführt und haben es den Erfindern ermöglicht, andere Messungen der bis dahin angegebenen Molekulargewichte auszuführen und folglich die Ergebnisse zu verfeinern ausgehend von den Molekulargewichtsbereichen, die vorstehend beschrieben worden sind. Das äußere Glykoprotein der Hülle weist in den Viruspartikeln von HIV-2 - unter den Untersuchungsbedingungen der vorliegenden Erfindung - ein Molekulargewicht von ungefähr 125000 Da auf (es wird als gp125 bezeichnet). Unter denselben Untersuchungsbedingungen hat der bereits nachgewiesene und in der Patentanmeldung FR-86/03881 durch gp160 bezeichnete Vorläufer gemäß den letzten erhaltenen Ergebnissen ein Molekulargewicht von ungefähr 140000 Da. Er wird demzufolge in der vorliegenden Patentanmeldung als "gp140" bezeichnet.

Bis zum heutigen Tage ist die Existenz mehrerer Entwicklungsphasen, die zum Entstehen von Glykoproteinen der Hülle in reifer Form führen, wobei diese reifen Glykoproteine der Hülle ein äußeres Glykoprotein der Hülle gp125 und ein Transmembranglykoprotein der Hülle gp36 umfassen, nachgewiesen und es sind verschiedene Stadien während des Ablaufs des viralen Replikationszyklus, der auftritt, wenn sich pathogene Störungen in Folge einer Infektion durch ein humanes HIV-2-Retrovirus entwickeln, diesbezüglich identifiziert worden.

Es wurden erste Ergebnisse betreffend die Existenz und die Charakterisierung eines Vorläufers des äußeren Glykoproteins der Hülle gp300 von HIV-2 erhalten. Dieses Glykoprotein wurde in einer Veröffentlichung (13) beschrieben. Für die Zwecke der Beschreibung wird in der Folge auf dieses Glykoprotein, das als gp 300 bezeichnet wird, Bezug genommen werden. Die Erfinder haben dann ein neues, in den viralen Zyklus von HIV-2 eingreifendes Glykoprotein nachgewiesen und charakterisiert.

Parallel hierzu haben sie ähnliche Untersuchungen an den viralen Zyklen der Retroviren HIV-1 und SIV vorgenommen. Diese letztgenannten Untersuchungen haben es erlaubt, neue, sehr spezifische Eigenschaften nachzuweisen, die die Retroviren HIV-2 und SIV gemeinsam haben und die im Gegensatz dazu offenbar während des viralen Replikationszyklus von HIV-1 nicht vorkommen.

Die Erfindung betrifft demnach neue Mittel zum Nachweisen einer Infektion aufgrund eines humanen HIV-2-Retrovirus oder aufgrund eines verwandten Virus wie auch zum Charakterisieren der Zugehörigkeit eines Retrovirus zum Typ der humanen HIV-2-Retroviren.

Im Hinblick auf die erhaltenen Ergebnisse erscheint der für die HIV-2 und SIV- Retroviren charakteristische virale Zyklus als komplexer Ablauf von Kettenreaktionen, deren Zusammenwirken allein zu der Bildung der Glykoproteine der Hülle des Retrovirus HIV-2 in deren endgültiger Form führen könnte. Während dieses Ablaufs konnten neue antigene Proteine oder Glykoproteine erkannt, isoliert und identifiziert werden.

Die Erfindung betrifft demnach antigene Glykoproteine, die in Folge einer Infektion durch ein humanes HIV-2-Retrovirus gebildet werden, die ein Peptidrückgrat aufweisen, das sie mit dem Transmembranglykoprotein gp36 gemeinsam haben, und die während des Ablaufs des viralen Zyklus in zwei Transmembranglykoproteine gp36 dissoziieren können.

Ein solches Glykoprotein könnte in dimerer Form der optimalen Form und der optimalen Konformation entsprechen und die Fusion der Virusmembran mit der Zellmembran ermöglichen..

Die Erfindung betrifft demnach ein Glykoprotein, das durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:

- es wird aus einem Dimer eines Transmembranglykoproteins der Hülle eines HIV- oder SIV-Retrovirus gebildet,

- es ist in der Lage, einen immunologischen Komplex vom Antigen-Antikörper-Typ zu bilden mit Antikörpern, die gegen ein antigenes Glykoprotein gp80 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 80 kDa gerichtet sind, das von polyklonalen, gegen das Glykoprotein gp300 eines humanen Retrovirus HIV-2 gerichteten Antikörpern erkannt wird und das in Assoziation in dimerer Form zwei Einheiten des Transmembranglykoproteins der Hülle gp36 enthält, für das das Genom eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2, das ein LAS oder ein AIDS beim Menschen hervorrufen kann, kodiert,

- es hat ein Molekulargewicht derselben Größenordnung wie jenes des obengenannten gp80 von HIV-2.

Gemäß einer Ausführungsvariante betrifft die Erfindung ein antigenes Glykoprotein gp80, das durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:

- es hat ein Molekulargewicht (MG) von ungefähr 80 kDa,

- es wird von polyklonalen, gegen das Glykoprotein gp300 eines humanen Retrovirus HIV-2 gerichteten Antikörpern erkannt,

- es umfaßt in Assoziation in dimerer Form zwei Einheiten des Transmembranglykoproteins der Hülle gp36, für das das Genom eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2, das ein LAS oder ein AIDS beim Menschen hervorrufen kann, kodiert.

Das obengenannte Glykoprotein gp300 ist das in (13) beschriebene Glykoprotein, es hat ein Molekulargewicht von ungefähr 300 kDa und wird durch die Assoziation von zwei Einheiten eines Vorläufer-Glykoproteins gp140, insbesondere des Glykoproteins der Hülle gp125, für das das Gen env des Genoms eines humanen HIV-2-Retrovirus, das ein LAS oder ein AIDS hervorrufen kann, kodiert, gebildet.

Nach erfolgter Isolierung und Charakterisierung haben die Erfinder nachgewiesen, daß das Serum von hinsichtlich der HIV-2-Antigene positiven Kranken das Glykoprotein gp80 in Zellextrakten oder in viralen Extrakten erkennt. gp80 ist ein reifes Produkt des Transmembranglykoproteins, das einen notwendigen Schritt für die Bildung der infektiösen, ja sogar pathogenen Viruspartikel darstellt. Die Erfinder haben folglich festgestellt, daß, indem der normale virale Zyklus einer Bildung der Partikel vom Typ HIV-2 blockiert wird, insbesondere auf der Ebene der Bildung oder der Dissoziation des gp80, es möglich ist, in die Ausbreitung der Infektion einzugreifen. Eine solche Blockierung der Infektion könnte durch Verwendung von Castanospermin, das die Reifung des Glykoproteins gp80 hemmen kann, bewirkt werden.

Die Erfindung betrifft demnach ein Glykoprotein, das durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:

- es wird aus einem Dimer eines Transmembranglykoproteins der Hülle eines HIV- oder SIV-Retrovirus gebildet,

- es hat ein Molekulargewicht von ungefähr 80 kDa,

- es ist in der Lage, einen immunologischen Komplex vom Antigen-Antikörper-Typ zu bilden mit Antikörpern, die gegen ein antigenes Glykoprotein gp80 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 80 kDa gerichtet sind, das von polyklonalen, gegen das Glykoprotein gp300 eines humanen Retrovirus HIV-2 gerichteten Antikörpern erkannt wird und das in Assoziation in dimerer Form zwei Einheiten des Transmembranglykoproteins der Hülle gp36 enthält, für das das Genom eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2, das ein LAS oder ein AIDS beim Menschen hervorrufen kann, kodiert.

Ein nach der Erfindung bevorzugtes Glykoprotein gp80 wird weiter durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:

- es kann mit durch ein humanes Retrovirus des Typs HIV-2 infizierten Zellen und/oder Virionen und/oder Viren des Typs HIV-2 assoziiert sein,

- es ist in vitro in Gegenwart eines nichtionischen Detergens, wie 1 % Triton X-100, nicht dissoziiert und ist in vitro in Gegenwart eines ionischen Detergens, wie 1 % SDS, bei einem schwach sauren pH dissoziiert, um das Transmembranglykoprotein gp36 eines Retrovirus des Typs HIV-2 zu bilden,

- es kann über eine HIV-2-Serum-Sepharose -Immunaffinitätssäule gereinigt werden und erscheint (gemäß einer Analyse durch Polyacrylamidgelelektrophorese) 3 bis 4 h nach Beginn der Markierung der infizierten Zellen.

Gleichfalls in den Rahmen der Erfindung gehören Proteine, die von dem vorstehend definierten Glykoprotein gp80 abgeleitet und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie hinsichtlich des nicht glykosylierten Peptidrückgrats diesem Glykoprotein gp80 entsprechen.

Dieses Protein, befreit von den Glykosylgruppen des gp80, ist im Rahmen der Erfindung aufgrund der Eigenschaften, die es mit gp80 gemein hat, interessant.

Die Paralleluntersuchungen des viralen Zyklus des Affen-Retrovirus SIV und des Retrovirus HIV-1 haben gezeigt, daß der Zyklus von SIV einen Schritt einer Dimerisierung zu einer Form eines Glykoproteins gp65 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 65 kDa umfaßt, die zur Bildung zweier Transmembranglykoproteine der Hülle gp 32 führen kann.

Im Gegenzug wurde dieser Verlauf einer Dimerisierung des Transmembranglykoproteins der Hülle nicht in biologischen, durch HIV-1 infizierten Proben beobachtet.

Das Entstehen einer dimerisierten Form des Transmembranglykoproteins der Hülle könnte demnach mit einer spezifischen Infektion durch ein Retrovirus des Typs HIV-2 oder ein Retrovirus, das eine immunologische Verwandtschaft zu dem letzteren aufweist, in Verbindung stehen. Dieses Glykoprotein stellt demnach ein besonders geeignetes Mittel für einen Nachweis einer spezifischen Infektion aufgrund des Retrovirus HIV-2 oder eines verwandten Retrovirus dar.

Die Erfindung betrifft gleichfalls polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch einerseits gp300, gp140, gp125 und gp80, die in durch ein Retrovirus des Typs HIV-2 infizierten Zellen vorliegen, und andererseits gp125, gp80 und gp36, die in Extrakten eines Retrovirus des Typs HIV-2 enthalten sind, erkennen und nicht die Proteine oder Glykoproteine von gesunden Zellen oder von durch ein Retrovirus des Typs HIV-1 infizierten Zellen erkennen.

Gleichfalls im Rahmen der Erfindung befinden sich monoklonale Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie spezifisch mit dem Glykoprotein gp80 reagieren und daß sie nicht mit den Proteinen von durch ein Retrovirus des Typs HIV-1 infizierten Zellen oder mit Virusansammlungen von HIV-1 reagieren.

Ein anderer monoklonaler Antikörper gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß er darüberhinaus die Glykoproteine gp300, gp140 und gp36 von HIV-2 erkennt.

In besonders bevorzugter Weise entspricht ein dritter monoklonaler Antikörper den vorstehend aufgeführten Definitionen und ist dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop erkennt, das dem Glykoprotein gp80 und der folgenden Aminosäuresequenz des Peptids p39':

VTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH

gemein ist.

Die Erfindung umfaßt gleichfalls Antikörper, die gegen das von gp80 abgeleitete und von den Glykosylgruppen befreite Protein gerichtet sind.

Die obengenannten monoklonalen Antikörper können immunogene und neutralisierende Eigenschaften haben und, indem sie auf den Verlauf einer Bildung des gp80 einwirken, können sie die Proliferation des Retrovirus HIV-2 unterbrechen.

Mehrere Verfahren zur Herstellung der obengenannten Antikörper können im Rahmen der praktischen Durchführung der Erfindung als geeignet angesehen werden. Beispielsweise kann auf Asciteskulturen in Tieren, insbesondere Nagetieren, wie Mäusen, zurückgegriffen werden. Man kann gleichfalls die Antikörper auf Basis von gegebenenfalls immobilisierten oder eingeschlossenen oder ferner in Suspension befindlichen Zellkulturen herstellen. Man kann insbesondere das Verfahren von Hybridomen verwenden, die ausgehend von der Fusion von Lymphozyten eines Tiers erhalten worden sind, das man vorher mit dem Retrovirus HIV-2 animpfte. Lymphozyten des infizierten Tieres werden dann entnommen und mit ausgewählten Myelomzellen fusioniert, um Hybride zu bilden, die nachfolgend hinsichtlich ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, spezifische, gegen die weiter oben beschriebenen antigenen Proteine und Glykoproteine gerichtete Antikörper zu bilden.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper der Erfindung umfaßt die folgenden Schritte:

- Immunisierung von Mäusen vom Typ BALB-C, sofern erforderlich mehrfach, durch intraperitoneale Injektion des gereinigten Glykoproteins gp80,

- Fusion von Zellen immunisierter Mäuse, insbesondere von Milzzellen, mit Myelomzellen, beispielsweise Zellen vom Typ NS1, gemäß dem Verfahren von Köhler und Milstein (10),

- Selektion und Gewinnung der Hybridome, die die gesuchten monoklonalen Antikörper produzieren.

Das Screening der Hybridome in Hinblick auf die Selektionierung von denjenigen unter diesen, die eine Produktion der gewünschten monoklonalen Antikörper betreiben, kann unter Verwendung von RIPA-Tests oder Western-blot-Analysen erfolgen.

Monoklonale, spezifisch hinsichtlich der Ausführung der Erfindung adaptierte Antikörper werden durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten und deren Eigenschaften gegenüber gp80 oder einem analogen Protein, das den vorstehend angegebenen Definitionen entspricht, können durch Vergleich mit den Ergebnissen, die mit dem monoklonalen Antikörper 1H8 (Mab 1H8) beschrieben worden sind, untersucht werden.

Die Erfindung umfaßt gleichfalls Hybridome, die die vorstehend beschriebenen monoklonalen Antikörper produzieren.

Diese produzierten monoklonalen Antikörper werden beispielsweise verwendet, um die Proteine und/oder Glykoproteine zu inaktivieren, mit denen sie einen immunologischen Komplex bilden, oder ferner aufgrund ihrer Fähigkeit, den normalen Ablauf der Bildung der endgültigen Glykoproteine der Hülle von HIV-2 zu verhindern.

Eine weitere eventuelle Anwendung dieser Antikörper bestünde beispielsweise in dem Nachweis viraler Antigene in biologischen Präparationen oder ferner in der Reinigung von Proteinen und/oder Glykoproteinen beispielsweise über eine Affinitätssäule.

Nachdem die Existenz des gp80 nachgewiesen und es isoliert und charakterisiert worden ist, haben die Erfinder Mittel bereitgestellt, um die Diagnose einer Infektion aufgrund eines humanen Retrovirus vom Typ HIV-2 zu bewerkstelligen.

Zu diesem Zweck betrifft die Erfindung eine antigene Zusammensetzung für die spezifische in vitro-Diagnose einer Infektion aufgrund eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2 in einer biologischen Probe, die nach dieser Infektion gebildete Antikörper enthalten könnte, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens das auf den vorhergehenden Seiten definierte Glykoprotein gp80 enthält.

Die biologische Probe kann eine biologische Flüssigkeit, insbesondere das Blut oder das Serum, oder ferner ein biologischer Gewebeextrakt sein. Die obengenannten Zusammensetzungen sind für den Nachweis von Antikörpern in einer obengenannten biologischen Probe einsetzbar.

Die Erfindung umfaßt demzufolge gleichfalls ein Verfahren zur in vitro-Diagnose einer Infektion, die spezifisch auf ein Retrovirus des Typs HIV-2 zurückgeführt werden kann, das durch die Schritte gekennzeichnet ist:

- In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe, die nach einer Infektion durch ein Retrovirus des Typs HIV-2 gebildete Antikörper enthalten könnte, mit einem Glykoprotein gp80, das den oben angegebenen Definitionen entspricht, oder mit einer vorstehend beschriebenen antigenen Zusammensetzung unter geeigneten Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes vom Antigen-Antikörper-Typ erlauben, und

- Nachweis des gegebenenfalls gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.

Die Erfindung betrifft außerdem eine immunogene Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens das Glykoprotein gp80 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für die Herstellung von Impfstoffen enthält.

Diese Zusammensetzungen können für die Herstellung von Impfstoffen gegen ein Retrovirus des Typs HIV-2 verwendet werden.

Eine so gebildete immunogene Zusammensetzung enthält eine solche Dosierung an antigenen Proteinen und/oder Glykoproteinen, daß sie die Verabreichung einer Dosis von 10 bis 100 µg/kg ermöglicht.

Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein Verfahren einer Herstellung von gp80, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist,

- Lyse von durch ein humanes Retrovirus HIV-2 infizierten Zellen und Trennung des Überstands und der infizierten Zellen oder Lyse der durch Zentrifugation hergestellten, Viren enthaltenden Niederschläge,

- Inkubation des Zellextrakts und/oder des viralen Extrakts auf einer Immunaffinitätssäule, welche mit einem Immunadsorbens beschickt ist, das gereinigte Antikörper enthält, wie solche, die aus einem Serum eines durch das humane Retrovirus HIV-2 infizierten Kranken erhalten werden, wobei dieses Serum die Fähigkeit hat, stark mit den Hüllproteinen von HIV-2 zu reagieren, wobei diese Antikörper vorteilhafterweise an einen adäptierten Träger gekoppelt sind, in Anwesenheit eines Puffers und für eine ausreichend lange Zeitdauer, um die Bildung eines immunologischen Antigen-Antikörper-Komplexes zu erhalten,

- Waschen der Säule mit einem Puffer zum Entfernen der nicht auf dem Träger zurückgehaltenen Moleküle und

- Gewinnung der gewünschten antigenen Proteine.

Nach einer ersten Ausführungsweise dieses Herstellungsverfahrens wird die Gewinnung der Glykoproteine durch Elektrophorese und durch Elektroelution der Proteine vorgenommen.

Die infizierten Zellen können in vitro ausgehend von einer Kultur durch HIV-2 infizierter Zellen erhalten worden sein, insbesondere unter Verwendung von durch HIV-2 infizierten T-Lymphozyten. Solche Zellkulturen können aus Linien CEM hergestellt werden.

Nach einer weiteren Ausführungsweise dieses Herstellungsverfahrens wird die Gewinnung der Glykoproteine erhalten durch:

- Elution der auf der obengenannten Immunaffinitätssäule gebundenen Proteine und

- Reinigung der so eluierten Produkte über eine Chromatographiesäule, die auf dem Trennmaterialträger monoklonale Antikörper, die gp80 erkennen, gebunden enthält. In einer besonderen Ausführungsweise der Erfindung wird die Lyse der infizierten Zellen in einer Detergenslösung ausgeführt, sind die in dem Immunadsorbens enthaltenen Antikörper an Agarosekügelchen gebunden und arbeitet man in Gegenwart eines Puffers für die Anheftung (Bindungspuffer).

Im Rahmen der Erfindung liegt gleichfalls eine Zusammenstellung oder ein Kit zum Nachweis von Antikörpern im Serum oder in einer anderen biologischen Probe eines Patienten, der durch ein humanes Retrovirus HIV-2 infiziert sein könnte, die bzw. der dadurch gekennzeichnet ist, daß sie bzw. er enthält:

- mindestens ein antigenes Glykoprotein gp80 oder eine Zusammensetzung

- oder ferner eine Mischung dieser unterschiedlichen Bestandteile,

- Mittel, die die Bildungsreaktion des immunologischen Komplexes zwischen den Antigenen und den gegebenenfalls in der zu untersuchenden biologischen Probe anwesenden Antikörpern ermöglichen, insbesondere, sofern erforderlich, einen oder mehrere Inkubationspuffer,

- eine negative Kontrollprobe und

- Mittel zum Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.

Die Erfindung betrifft gleichfalls markierte Glykoproteine gp80 und gp65, die vorzugsweise mit radioaktiven Markern, enzymatischen Markern, Fluoreszenzmarkern, Chemolumineszenzmarkern oder Chromophoren markiert sind.

Die Erfindung stellt gleichfalls ein Verfahren zum Nachweis von durch das HIV-2-Virus infizierten Zellen bereit. Dieses Verfahren umfaßt die Behandlung einer biologischen Probe, die Zellen enthält, die durch HIV-2 infiziert sein könnten, auf eine Weise, daß die intrazellulären Proteine freigesetzt werden, und den Test zum Nachweis der freigesetzten intrazellulären Proteine, um das Vorliegen von gp80-Glykoproteinen von HIV-2 zu untersuchen. Der Nachweis der freigesetzten intrazellulären Proteine kann beispielsweise durch Elektrophorese oder durch einen immunologischen Test mit Antikörpern, die hinsichtlich des gp80 von HIV-2 immunologisch reaktiv sind, erfolgen. Solche Antikörper sind beispielsweise auf den vorhergehenden Seiten beschrieben worden.

Nach einer besonderen Ausführungsweise des Nachweises des Vorliegens von gp80- Antigen ist die biologische Probe eine Probe, die von zellulärem Debris befreit ist.

Die Erfindung stellt gleichfalls Mittel zum Nachweisen einer spezifischen Infektion durch HIV-2 und zum Unterscheiden von einer Infektion durch HIV-1 bereit ausgehend von Zellen, die Antigene von HIV-2 enthalten könnten. Dieses Verfahren umfaßt das In-Kontakt- Bringen einer biologischen Probe, die intrazelluläre Proteine enthält, die aus behandelten Zellen einer biologischen Probe erhalten wurden, die man untersuchen will, mit gegen gp80 gerichteten Antikörpern. Eine gegebenenfalls auftretende Reaktion vom Typ Antigen- Antikörper wird dann untersucht zum Nachweis der Existenz einer Infektion durch HIV-2.

Andere charakteristische Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden anhand der Beispiele und der Figuren erläutert.

ERLÄUTERUNG DER FIGUREN Figur 1:

Identifizierung eines spezifischen Proteins von 80 kDa in durch HIV-2 infizierten Zellen durch Western blot-Analyse unter Verwendung eines HIV-1-positiven Serums und dreier HIV-2-positiver Seren (A, B und C). Zellextrakte von CEM-Zellen (entsprechend Produkten aus 106-Zellen), die nicht infiziert waren (Linien 2), von durch HIV-1 infizierten Zellen (Linien 1) und von durch HIV-2 infizierten Zellen (Linien 3) wurden durch Elektrophorese in einem 7,5 %-igen Polyacrylamidgel vor der Western-blot-Untersuchung analysiert. In der Figur wird eine Autoradiographie gezeigt. Auf der linken Seite geben die Pfeile die Position des extrazellulären Glykoproteins von HIV-1 (gpl2o) und der Vorläufer von gag p55 und p40 an. Auf der rechten Seite wurde die Position der für HIV-2 spezifischen Glykoproteine gp300, gp140 und gp80 aufgetragen.

Figur 2: Synthese der mit HIV-2 in Verbindung stehenden Glykoproteine.

Die durch HIV-2 infizierten Zellen wurden mit [³H]-Glucosamin (200 µCi/ml; 4x10&sup6; Zellen/ml) während 2,3,4, 6 und 8 Stunden markiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Extrakte (Produkte von 10&sup7;-Zellen) hergestellt ausgehend von infizierten Zellen und ausgehend von Virusanhäufungen (Synonym für Viren enthaltende Niederschläge) (hergestellt durch Zentrifugation des Kulturmediums bei 100000 g). Aliquote dieser Extrakte (entsprechend 2 x 10&sup6; Zellen) wurden über HIV-2-Serum-Sepharose gereinigt und die markierten Proteine durch Polyacrylamidgelelektrophorese (12,5 %-iges Gel) analysiert. Es wird eine Fluorographie gezeigt. Auf der linken Seite wurde die Position der Molekulargewichtsproteinmarker aufgetragen: Myosin: 200000, Phosphorylase B: 97000, Rinderserumalbumin: 68000, Ovalbumin: 43000 und Carboanhydrase 30000.

Figur 3: Western blot-Analyse mit gegen gp 300 gerichteten, polyklonalen Antikörpern.

Auf der linken Seite sind Extrakte nicht infizierter CEM-Zellen (-) und durch HIV-1 oder HIV-2 infizierter Zellen gezeigt. Auf der rechten Seite sind Extiakte durch HIV-2 infizierter CEM- Zellen gezeigt: Zellextrakte (Linie C) und Virusansammlungen (Viren enthaltender Niederschlag) (Linie V). Die Proben wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese (7,5 %-iges Gel auf der linken Seite, 12,5 %-iges Gel auf der rechten Seite) vor der Western blot-Analyse unter Verwendung gegen das gereinigte Protein gp300 gerichteter polyklonaler Maus-Antikörper (anti-gp300) analysiert. Es wird das Autoradiogramm gezeigt, wobei jede Probe dem Produkt aus 10&sup6; Zeilen entspricht.

Figur 4: Es wird eine Western blot-Analyse unter Verwendung eines monoklonalen

Antikörpers mAb 1H8 gezeigt. Die Extrakte von durch HIV-1 oder HIV-2 infizierten Zellen (Linien C) und die Extrakte von Virusniederschlägen (Linien V) wurden durch Elektrophorese in einem 12,5 %-igen Polyacrylamidgel vor der Western blot-Analyse unter Verwendung des mAb 1H8-Antikörpers analysiert. Es wird die Autoradiographie gezeigt; der monoklonale Antikörper war gegen das Transmembranglykoprotein der Hülle von HIV-2ROD gerichtet.

Figur 5:

Das Peptid p39' blockiert die Bindung zwischen dem Antikörper mAb 1H8 und gp80. Extrakte von Virusniederschlägen von HIV-2 wurden durch Western blot analysiert unter Verwendung des Antikörpers 1H8 (Abschnitt mAb) oder polyklonaler Antikörper anti-gp300 (Abschnitt 5). Die Inkubation mit jedem dieser Antikörper wurde in Abwesenheit (Linien -) oder in Gegenwart (Linien +) von 1 µg/ml Peptid p39' vorenommen. Die Ergebnisse der Autoradiographie werden gezeigt.

Figur 6:

"Pulse chase"-Experimente (Markierung, gefolgt von einer Phase einer Beobachtung des Markers), die die Produktion von gp80 in durch HIV-2 infizierten Zellen zeigt, werden gezeigt. Die durch HIV-2 infizierten CEM-Zellen wurden mit [³&sup5;S]-Methionin (200 µCi/ml; 4 x 10&sup6; Zellen/ml) während 30 min markiert (Linien 0). Die radioaktive Markierung wurde im Kulturmedium, das 5 mM kaltes, d.h. nicht radioaktiv markiertes Methionin enthielt, während 2 und 4 h beobachtet (Linien 2 und 4). Das Kulturmedium wurde nach 4 h bei 100000 g zentrifugiert und die Niederschläge extrahiert. Sämtliche Proben wurden unter Verwendung von anti-gp300-Antikörpern oder von mAb 1H8-Antikörpern immunpräzipitiert. Die markierten Proteine der Immunkomplexpräparationen wurden in den Elektrophoresepuffer eluiert und durch Elektrophorese in einem 7,5 %-igen Polyacrylamidgel analysiert. Es wird eine Fluorographie gezeigt, in der C und V den Zellextrakten bzw. den viralen Extrakten entsprechen. Jede Probe stellt das Produkt aus 10&sup6; Zellen dar.

Figur 7: a) Einbau von markiertem Glucosamin und von Fucose in gp80.

Die durch HIV-2 infizierten CEM-Zellen, die mit [³HJ-Glucosamin (200 µCi/ml) oder mit [3H]- Fucose (200 µCi/ml) markiert worden waren, wurden durch Immunpräzipitation unter Verwendung polyklonaler anti-gp300-Antikörper (Linien 5) oder monoklonaler mAb 1H8-Antikörper (Linien M) untersucht. Sämtliche Proben wurden durch Elektrophorese in einem 12,5 %-igen Polyacrylamidgel analysiert. Es wird die Fluorographie gezeigt.

b) Wirkung von Castanospermin auf die Produktion von gp125 und gp80.

Durch HIV-2 infizierte Zellen wurden mit [³&sup5;5J-Methionin (200 µCi/ml; 4x10&sup6; Zellen/ml) in Abwesenheit (Linien -) oder in Gegenwart (Linien +) von Castanospermin (1 mM) markiert (16 h). Die Extrakte des Kulturmediums, das die Viruspartikel enthielt, wurden über eine Immunaffinitätssäule unter Verwendung von HIV-2-Serum-Sepharose gereinigt und die gereinigten Proteine durch Elektrophorese in einem 12,5 %-igen Polyacrylamidgel untersucht. Es wird die entsprechende Fluorographie gezeigt.

Figur 8: Dissoziation von gp80. Abschnitt C:

Extrakte von durch HIV-2 infizierten CEM-Zellen, die mit [³&sup5;S]-Methionin markiert und durch Immunpräzipitation unter Verwendung eines monoklonalen mAb 1H8-Antikörpers untersucht worden sind (Linie 1). Ein anderes Aliquot derselben Zubereitung von Zellextrakten wurde vorher in Gegenwart von 1 % SDS erwärmt (95ºC, 5 min). Dann wurde sie 10-fach in einem RIPA-Puffer vor der Immunpräzipitationsuntersuchung verdünnt (Linie 2). Die Immunkomplexpräparationen wurden durch Elektrophorese analysiert. Jede Probe entspricht dem Extrakt von 10&sup6; Zellen.

Abschnitt V:

Niederschläge von HIV-Viren, erhalten aus mit [³&sup5;S]-Methionin markierten Zellen (jeder entspricht dem Produkt aus 10&sup7; Zellen), wurden in unterschiedlichen Puffern suspendiert: (1) Tri ton enthaltender Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (Vol./Vol.) Triton X-100 und 100 Einheiten/ml Aprotinin); (2) SDS enthaltender Lysispuffer (danach erwärmt, wie unter in (1), enthält aber 1 % (Vol./Vol.) SDS anstelle von Triton X-100); (3) SDS enthaltender Lysispuffer, der danach 5 min auf 95ºC erwarmt wurde; (4) RIPA-Puffer (derselbe wie (1), jedoch modfiziert mit 0,1 % (Vol./Vol.) SDS und 0,2 % (Vol./Vol.) Desoxycholat). Sämtliche Proben wurden dann unter Verwendung eines mAb 1H8-Antikörpers immunpräzipitiert und die markierten Proteine wurden durch Elektrophorese auf einem 12,5 %-igen Polyacrylamidgel analysiert. Es wird die Fluorographie gezeigt.

Figur 9: Dissoziation von von gp36 gereinigtem gp80.

Durch HIV-2 infizierte CEM-Zellen wurden mit [³&sup5;S]-Methionin markiert (17 h) und die Viren enthaltenden Niederschläge wurden in einem Triton enthaltenden Lysispuffer suspendiert. Diese viralen Extrakte (Produkte entsprechend 2 x 10&sup7; Zellen) wurden unter Verwendung von mAb 1H8-Antikörpern immunprazipitiert und gp80 wurde durch präparative Gelelektrophorese gereinigt. Gleiche Anteile der gereinigten Präparation von gp80 wurden lyophilisiert und in 100 mM Acetat-Puffer von pH 6,8, 5,8 und 4,8, der 1 % (Vol./Vol.) SDS, 100 Einheiten/ml Aprotinin und 5 mM EGTA (zum Inhibieren der Calcium-abhängigen Proteolyse) enthielt, resuspendiert. Sämtliche Proben wurden bei 30ºC 60 min inkubiert vor der Verdünnung in einem zweifach konzentrierten Elektrophoresepuffer. Die Proben wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese (12,5 %-iges Gel) analysiert und es wird eine Fluorographie gezeigt.

Figur 10: Das Transmembranglykoprotein von SIV liegt in dimerer Form vor. Abschnitt Cell (Zelle):

Durch SIV-mac infizierte HUT-78-Zellen und durch HIV-2 infizierte CEM-Zellen wurden 16 h mit [³H]-Glucosamin (200 µCi/ml: 4 x 10&sup6; Zellen/ml) markiert. Die Extrakte (hergestellt in einem Triton enthaltenden Lysispuffer) der infizierten Zellen (Linien C) und der Viren enthaltenden Niederschläge (Linien V) wurden durch Immunpräzipitation unter Verwendung von mAb 1H8 gereinigt und die markierten Proteine durch Elektrophorese in einem 12,5 %-igen Polyacrylamidgel analysiert. Es wird die Fluorographie gezeigt.

BEISPIELE MATERIALIEN UND METHODEN MATERIALIEN

[³&sup5;S]-Methionin (spezifische Aktivität > 1000 µCi/mmol), L-[6-³H]-Fucose (spezifische Aktivität: 45-70 µCi/mmol), D-[6-³H]-Glucosamin (spezifische Aktivität: 20-40 µCi/ mmol) wurden von Amersham (Amersham, Vereinigtes Königreich) bezogen. Castanospermin und Tunicamycin wurden von Boehringer Mannheim (Mannheim, DE) bezogen. Poly(A)poly(U) stammte aus dem Institut Curie in Paris und wurde entsprechend dem von Hovanessian et al., 1982 (Journal Interferon Research, Band 2, S.209-216) beschriebenen Verfahren hergestellt.

VIREN UND ZELLEN

Das Isolat HIV-1BRU des humanen Immundefizienzvirus vom Typ 1 (12), das Isolat HIV-2ROD des humanen Immundefizienzvirus vom Typ 2 (4,5) und das Affen-Immundefizienzvirus, SIVmac&sub1;&sub4;&sub2; (6), wurden für diese Beispiele verwendet.

Die verschiedenen Zellinien und humanen Lymphozyten wurden in einem Suspensionsmedium RPMI-1640 (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise, Frankreich), das 10 % (Vol./Vol.) fetales Kälberserum enthielt, gezüchtet; 2 µg/ml Polybrene (Sigma) wurden zu den Kulturen von durch HIV infizierten Zellen zugesetzt. Die CEM Klon 13-Zellen stammen von der Linie humaner Lymphozyten CEM (ATCC-CCL119) ab und exprimieren das T4-Antigen in erhöhter Konzentration. Fünf Tage nach der Infektion mit den Isolaten HIV-1BRU oder HIV-2ROD produzieren ungefähr 80-90 % der Zellen Viruspartikel und können durch die cytopathogene Wirkung entsprechend der Vakuolenbildung in den Zellen und durch das Auftreten kleiner Synzytien identifiziert werden. Die Zellinie HUT-78 ist eine andere Zellinie humaner Lymphozyten, die hinsichtlich des T-Rezeptors positiv sind (Gazdal et al., 1980), wobei die Zellinie für die Replikation von SIVmac142 hochpermissiv ist (Daniel et al., 1985). Die gesunden Spenderlymphozyten aus peripherem Blut wurden 3 Tage lang mit 0,2 % (Gew./Vol.) P-Fraktion von Phytohaemagglutinin (Difco, Detroit, USA) in einem Medium RPMI-1640, komplettiert mit 10 % fetalem Kälberserum, stimuliert. Die Zellen wurden in einem Medium RPMI-1640, das 10 % (Vol./Vol.) T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF, Biotest) enthielt, in Kultur genommen. Nach einer Infektion mit HIV-2 wurden die Lymphozyten in Gegenwart von 10 % (Vol./Vol.) TCGF und 2 µg/ml Polybrene gezüchtet.

METABOLISCHE MARKIERUNG DER ZELLEN

Für die metabolische Markierung der Proteine wurden infizierte Zellen 16 h bei 37ºC in einem Minimalkulturmedium MEM (englische Abkürzung für "Minimal Essential Medium"), das kein L-Methionin und kein Serum enthielt, inkubiert, wobei das Medium gleichwohl mit 200 µCi/ml [³&sup5;S]-Methionin komplettiert war. Für die metabolische Markierung der Glykoproteine wurden die infizierten Zellen 16 h bei 37ºC in einem Kulturmedium MEM, das kein Serum und keine Glucose enthielt, aber mit 200 µCi/ml [³H]-Fucose oder 200 µCi/ml [³H]-Glucosamin komplettiert worden war, inkubiert.

ZELLEXTRAKTE UND VIRUSEXTRAKTE

Die 10&sup7; Zellen entsprechenden Zellniederschläge wurden resuspendiert in 100 µl Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 100 Einheiten/ml Aprotinin (Iniprol , Choay) vor einer Zugabe von 100 µl desselben Puffers, der 2 % (Vol./Vol.) Triton X- 100 enthielt.

Die Zellextrakte wurden 10 min bei 12000 g zentrifugiert und der Überstand wurde bei -80ºC bis zu seiner Verwendung aufbewahrt. Für die Herstellung der Virusextrakte wurden 100 µl loxlysis-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1,5 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 % (Vol./Vol.) Triton X-100, 100 Einheiten/ml Aprotinin) je ml geklärten Überstand der infizierten und wie vorstehend angegeben behandelten CEM-Zellen zugesetzt. Für die Herstellung von Extrakten aus Virusniederschlägen wurde ein Kulturmedium mit infizierten Zellen zunächst bei 12000 g 10 min vor einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 100000 g für 15 min (TL 100-Zentrifuge von Beckman ) zentrifugiert. Die Virusniederschläge (Produkt erhalten aus 10&sup7; Zellen) wurden dann in 200 µl Lysispuffer solubilisiert.

HERSTELLUNG EINES IMMUNADSORBENS MIT VON EINEM HINSICHTLICH HIV-2 SEROPOSITIVEN PATIENTEN ERHALTENEN ANTIKÖRPERN

Die Immunglobuline eines Serums eines hinsichtlich HIV-2 seropositiven Patienten wurden mit 50 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; präzipitiert, in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) gelöst und danach über eine DEAE-Cellulose-Säule (DE 52, Whatman ) durch Elution mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) gereinigt. Die so gereinigten Immunglobuline wurden als zu 90% rein beurteilt. Die Antikörper wurden dann an eine Sepharose CL 4B-Säule, die mit BcRN entsprechend dem von Berg beschriebenen Verfahren (2) aktiviert worden war, gekoppelt. 2 mg IgG wurden je ml Sepharose CL 4B gekoppelt. In der Folge wird dieses Immunadsorbens als "HIV-2-Serum-Sepharose" bezeichnet.

HERSTELLUNG DER HIV-2-PROTEINE ÜBER DIE IMMUNAFFINITÄTSSÄULE

Die Zellextrakte der HIV-2 produzierenden CEM-Zellen wurden zunächst mit zwei Volumina Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6,50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 % (Vol./Vol.) Glycerol, 7 mM β-Mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF, 100 Einheiten/ml Aprotinin) vor einer Inkubation mit einem Volumen HIV-2-Serum-Sepharose verdünnt. Das extrazelluläre Virus wurde wie die Überstände der HIV-2 produzierenden Zellen mit 1/10 Volumen des 10-fach konzentijerten Bindungspuffers behandelt. Die Anheftungs- oder Bindungsbehandlung wurde über Nacht ausgeführt, dann wurde die Säule ausreichend mit Bindungspuffer gewaschen. Die an die Säule gebundenen Proteine wurden durch Aufkochen in einem Elektrophoresepuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1 % (Gew./Vol.) SDS, 2 M Harnstoff, 20 % Glycerol, 0,5 % β-Mercaptoethanol) eluiert. Die eluierten Proteine wurden durch Elektrophorese in 7,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgelen, die 6 M Harnstoff und 0,1% Bisacrylamid anstelle von 0,2% (Gew./Vol.) enthielten, wiedergewonnen.

PRÄPARATIVE ELEKTROPHORESE

Die Wiedergewinnung der von der Affinitätssäule eluierten HIV-2-Glykoproteine (gp300 oder gp80) wurde durch Pol yacrylamidgelelektrophorese, wie vorstehend beschrieben, vorgenommen und die Gelbereiche, die die viralen Glykoproteine enthielten, wurden unter Bezugnahme auf die Position der vorgefertigen Molekulargewichtsproteinmarker (BRL) ausgeschnitten.

Das Glykoprotein gp300 wurde durch 16-stündige Inkubation bei 4ºC in einem Elutionspuffer (0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5 mM EDTA, 0,05 % (Gew./Vol.) SDS, 0,2 mM PMSF) eluiert. Die so erhaltenen Fraktionen von Glykoproteinen wurden lyophilisiert und im Kühlschrank bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt. gp80 wurde in einen Puffer, der 4 mM Tris-HCl, pH 7,6, 2 mM Natriumacetat und 2 mM EDTA enthielt, elektroeluiert.

HERSTELLUNG VON POLYKLONALEN, GEGEN GP300 GERICHTETEN MAUS- ANTIKÖRPERN

Das Glykoprotein der Hülle von HIV-2 gp300 wurde aus Extakten infizierter CEM- Zellen (3x10&sup8; Zellen) durch Immunaffinitätschromatographie über HIV-2-Serum-Sepharose , gefolgt von einer präparativen Gelelektrophorese gereinigt (13). Die gereinigte Präparation von gp300 wurde in 10 ml 150 mM NaCl, das 0,5 M Harnstoff und 1 mg/ml Mäuseserumproteine enthielt, gelöst und dann 24 h in Kontakt mit einer Lösung, die 150 mM NaCl und 0,5 M Harnstoff enthielt, dialysiert. Das Dialyseprodukt wurde dann zentrifugiert und Anteile von 2 ml bei -80ºC aufbewahrt. Fünf Mäuse (Alter 8 Wochen) erhielten eine in Abständen von 12 Tagen fünffach wiederholte intraperitoneale Injektion von 350 µl der gp300-Präparation (ungefähr 1 µg gp300). Ein Poly(A)poly(U)-Adjuvans (200 µg; 1 mg/ml in 150 mM NaCl) wurde intravenös während jeder Immunisierung verabreicht (17). Fünf Tage nach der letzten Injektion erhielten die Mäuse mittels intraperitonealer Injektion eine Suspension von 10&sup6; 180/TG- Sarcomzellen zur Herstellung einer hyperimmunen Aszitesflüssigkeit (8). Acht Tage nach der Injektion wurden die Mäuse geopfert und die Aszitesflüssigkeiten gesammelt. Die Asziteszellen wurden durch Zentrifugation (200 g, 5 min) entfernt und die Peritonealflüssigkeit gesammelt.

HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER mAb 1H8

Die HIV-2-Virionen wurden in CEM-Zellen gezüchtet und aus aufkonzentrierten Kulturüberständen unter Bildung von Banden in Sucrosegradienten gereinigt. Das gereinigte Virus wurde aufgebrochen (solubilisiert) in 0,5% Triton X-100, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 % Aprotinin (Sigma ) und durch Ultrazentrifugation geklärt. Der Virusextrakt wurde dann über eine Lentil-Lectin-Sepharose 48 (Pharmacia )-Affinitätssäule gegeben, die Säule gewaschen und die gebundenen Glykoproteine mit 0,5 M Methyl-α-D-mannopyranosid (Sigma ) eluiert und über Nacht in Kontakt mit einem salzhaltigem Phosphat-Puffer dialysiert.

BALB/c-Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion von 0,3 ml gereinigte, nochmals an Lentil-Lectin-Sepharose 4B (50-100 µl) gebundene Glykoproteine (2-5 µg) immunisiert. Die Mäuse erhielten eine Auffrischung alle 4-6 Wochen für 24 h mit demselben Immunogen. Diese Mäuse wurden beobachtet, um die Produktion von Antikörpern qualitativ durch eine RIPA-Untersuchung von Extrakten von mit [³&sup5;S]-Methionin markierten HIV-2- Virionen und quantitativ durch die EIA-Untersuchung an aufgebrochenen (solubilisierten) Virionen (Genetic System ) nachzuweisen.

Drei Tage nach der letzten Injektion wurden Milzzellen mit NS1-Myelomzellen entsprechend dem Verfahren von Köhler und Milstein (10) fusioniert. Fusionsplatten mit je 96 Vertiefungen wurden durch Screening untersucht, um das Vorliegen von Hybridomen, die anti-HIV- 2-Antikörper sezernieren, unter Verwendung des EIA-Tests an aufgebrochenen (solubilisierten) Virionen von Genetic System nachzuweisen. Verfahren für die Vermehrung und die Stabilisierung der klonierten Hybridome und zur Herstellung von Aszites sind bereits beschrieben worden (7). Die Kulturüberstände der Hybridome wurden durch RIPA-Analysen und Western blot- Analysen einem Screening unterzogen. Ein monoklonaler Antikörper (mAb)1H8, der mit dem Glykoprotein reagiert, wurde dann mit der Sequenz der Aminosäuren 579-604 des entsprechenden Transmembranglykoproteins von HIV-2 unter Verwendung eines EIA-Tests auf Basis eines synthetischen Peptids (16) charakterisiert. Die Sequenz der Aminosäuren 579-604 ist in sämtlichen sequenzierten HIV-2- und SIV-Isolaten hochkonserviert; der monoklonale Antikörper 1H8 ruft eine Kreuzreaktion bei sämtlichen so untersuchten HIV-2 und SIV-Isolaten hervor. Das verwendete synthetische Peptid p39' wurde nach der aus der Nukleotidsequenz für die Hülle von HIV-2ROD abgeleiteten Sequenz der Aminosäuren 579-604 synthetisiert. Die Aminosäuresequenz des synthetischen Peptids p39' ist die folgende:

VTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH

RADIOIMMUNPRÄZIPITATIONS (RIPA)-UNTERSUCHUNG

Die Zellextrakte oder Virusextrakte (20 µl) (Produkt entsprechend 10&sup6; infizierten Zellen) wurden zunächst in zwei Volumina RIPA-Puffer [10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (Vol./Vol.) Triton X-100, 0,2 % (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat, 0,1 % (Gew./Vol.) SDS, 7 mM 2-β-Mercaptocthanol, 0,2 mM PMSF und 100 µ/ml Aprotinin (Iniprol , Choay) und 20 % (Vol./Vol.) Glycerol] verdünnt. Die verdünnten Extrakte wurden dann mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern (25 µl) ihkubiert (45 min, 4ºC). Dann wurde die Protein A-Sepharose zugesetzt und die Proben 3 h bei 4ºC inkubiert. Diese Proben wurden dann in PIPA-Puffer gewaschen. Die durch Immunprazipitation gewonnenen Proteine wurden unter Erwärmen (95ºC, 5 min) in Elektrophoresepuffer [125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1 % (Gew./Vol.) SDS, 20 % (Vol./Vol.) Glycerol, 0,5 % 2-β-Mercaptocthanol] eluiert. Die eluierten Proteine wurden durch Elektrophorese in 7,5 oder 12,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgelen, die 0,1 % (Gew./Vol.) Bisacrylamid anstelle von 0,2 % enthielten, wiedergewonnen.

IMMUNOBLOT-ANALYSE NACH ELEKTROPHOREFISCHEM TPANSFER: WESTERN BLOT

Die Proteine wurden einer Analyse durch Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen, bevor sie elektrophoretisch auf Nitrocelluloseblätter (0,45 µm; Schleicher und Schüll, Dassel, DE) in einem Elektrodenpuffer (20 mM Tris-Base, 150 mM Glycin, 20 % (Vol./Vol.) Methanol) transferiert wurden, wie in (3) beschrieben. Die durch die Elektrophorese erzeugten Bandenmuster wurden mit 5 % (Gew./Vol.) Magermilchpulver in PBS gesättigt (9). Sie wurden dann in einem verschweißten Beutel entweder mit HIV-1-positiven Seren oder mit HIV-2- positiven Seren (in einer Verdünnung von 1:100) oder mit polyklonalen oder monoklonalen Mäuse-Antikörpern (in einer Verdünnung von 1:200) in PBS, das 10 % fetales Kälberserum enthielt, inkubiert (über Nacht bei 4ºC). Die Blätter wurden dann in PBS gewaschen, wobei das PBS 5 % Nonidet P-40 enthielt, dann erneut mit Magermilchpulver (5 %) enthaltendem PBS gesättigt. Die gewaschenen Blätter wurden dann in einem verschweißten Beutel entweder mit einer Präparation von mit I¹²&sup5;(Amersham , > 30 mCi/mg) markiertem Protein A zum Sichtbarmachen der polyklonalenhumanen Antikörper in den HIV-1- oder HIV-2-Seren oder mit einer Präparation von mit I¹²&sup5;(Amersham , 2-10 µCi/µg) markierten Ziege-anti-Maus-Immunglobulinen inkubiert (2 h bei Raumtemperatur). Die Blätter wurden aus den Beuteln genommen und erneut gewaschen, getrocknet und dann 24-48 h einer Autoradiographie unterworfen (Kodak RP Royal, X-Ray Films).

ERGEBNISSE NACHWEIS DES 80 kDa-GLYKOPROTEINS IN DURCH HIV-2 INFIZIERTEN ZELLEN UND IM VIRION

Es wurde bereits gezeigt (13), daß der Vorläufer der Glykoproteine der Hülle von HIV- 2 ein Protein von 140 kDa (gp 140) ist, das die Bildung eines homologen Dimeren im Verlauf seiner Transformation zu reifen Produkten, nämlich dem extrazellularen Glykoprotein (gp125) und dem Transmembranglykoprotein (gp36), erfordert. Es wurde dann nachgewiesen, daß das Transmembranglykoprotein in Form eines Homodimeren mit einer elektrophoretischen Mobilität in Polyacrylamidgelen zu einer Position, die einem 80 kDa-Protein entspricht, existiert (Figuren 1 bis 6). Dieses Protein ist glykosyliert und wird aus Bequemlichkeitsgründen durch den Ausdruck gp80 bezeichnet.

Rohextrakte von durch HIV-1BRU oder HIV-2ROD) infizierten CEM-Zellen oder ferner von nicht infizierten Zellen dieses Typs wurden durch Immunoblot-Analysen nach einem elektrophoretischen Transfer (Western blot) unter Verwendung eines HIV-1-positiven Serums und dreier unterschiedlicher HIV-2-positiver Seren, die von an AIDS erkrankten Patienten gewonnen worden waren, analysiert (Figur 1). Die für HIV-2 spezifischen Seren erkannten die Vorläufer der Hüllproteine (gp140 und gp300) und erkannten darüberhinaus stark das Glykoprotein von 80 kDa (gp80). Diese Seren waren spezifisch für HIV-2-Proteine, da sie die folgenden HIV-1-Proteine nicht erkannten, die unter Verwendung eines für HIV-1 spezifischen Serums nachweisbar waren: der Vorläufer des Glykoproteins der Hülle gp120 von HIV-1 und die Vorläufer des gag-Proteins (p55 und p40 für HIV-1). Die Verbindung von gp80 mit der HIV- 2-Infektion wurde durch mehrere Ergebnisse nachgewiesen, in denen gp80 weder durch HIV- 1-positive Seren erkannt noch in durch HIV-1 infizierten Zellen identifiziert wurde.

Eine Western blot-Analyse der durch Zentrifugation (100000 g für 30 min) eines infizierten Kulturmediums hergestellten Virusniederschläge hat gezeigt, däß gp80 gleichfalls in HIV-2-Partikeln gleichzeitig wie das extrazelluläre Glykoprotein gp125 nachgewiesen werden kann.

SYNTHESE VON gp80 IN DURCH HIV-2 INFIZIERTEN ZELLEN

Vorab durchgeführte Experimente haben gezeigt, daß sämtliche HIV-2-positive Seren gp80 wie auch die Vorläufer der Hüll proteine, gp140 und gp300, wie auch das extrazelluläre Glykoprotein gp125 immunpräzipitieren konnten. Zum Charakterisieren der Synthese von gp80 wurde ein HIV-2-positives Serum, das stark mit den Hüllproteinen reagierte, verwendet. Gereinigte Antikörper dieses Serums wurden an eine Säule von durch BrCN aktivierter Sepharose (HIV-2-Serum-Sepharose) gekoppelt, die als Immunaffinitätssäule zum Reinigen der Glykoproteine der Hülle verwendet wurde. Die durch HIV-2 infizierten Zellen wurden mit [³H]-Glucosamin markiert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten (2, 3, 4, 6 und 8 h) wurden Extrakte aus infizierten Zellen und aus Viren enthaltenden Niederschlägen hergestellt. Sämtliche Proben wurden über HIV-2-Serum-Sepharose gereinigt und die markierten Proteine durch Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert (Figur 2); nach 2 h sind gp140 und gp300 die einzigen markierten Proteine, die in den infizierten Zellen nachweisbar sind. gp125 und gp80 wurden nach 3 oder 4 h nach dem Beginn der Markierung nachweisbar und sie waren gleichfalls in den aus dem Kulturmedium hergestellten Virusansammlungen (-niederschlägen) nachweisbar. 6 oder 8 h nach dem Beginn der Markierung konnten gp125 und gp80 klar nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß gp80 mit den Viruspartikeln assoziiert ist, und die Ergebnisse legen nahe, daß dieses gp80 ein reifes Produkt eines Vorläufers sein muß, der eine Reifung erfordert.

In diesen Experimenten konnte gleichfalls ein durch [³H]-Glucosamin markiertes gp36 - allerdings nicht intrazellulär - nachgewiesen werden. Ein Protein von 200 kDa erscheint gleichfalls in der Figur 2 und entspricht wahrscheinlich einem zellulären Protein, da es nicht durch andere HIV-2-positive Seren immunpräzipitiert wurde.

Die Ergebnisse einer Kinetik betreffend die Synthese der Glykoproteine der Hülle von HIV-2 entsprechen den bereits erhaltenen Ergebnissen. In den durch HIV-2 infizierten Zellen ist gp140 das erste Produkt der Hülle, das 15 min nach der Markierung nachweisbar ist (pulse- labelling). Während der Zeitspanne der Beobachtung des Tracers (chase) konnte die dimere Form des Vorläufers der Hülle (gp300) nach 30 min nachgewiesen werden, wie dann das reife extrazelluläre Protein (gp125) 1h 30 min bis 3 h nach Beginn nachweisbar wurde (13).

IDENTIFIZIERUNG DES gp80 DURCH POLYKLONALE, GEGEN DEN VORLÄUFER DER HÜLLE VON HIV-2 GERICHTETE ANTIKÖRPER

Zum Charakterisieren der Glykoproteine der Hülle von HIV-2 wurden gegen den gereinigten dimeren Vorläufer gp300 gerichtete polyklonale Antikörper hergestellt. Zu diesem Zweck wurde gp300 vorab teilweise durch ein Immunadsorbens mit Antikörpern von einem HIV-2-seropositiven Patienten vor einer Reinigung durch präparative Elektrophorese gereinigt. Fünf Mäuse wurden mit 5 µg dieser gereinigten Präparation von gp300 immunisiert, die intraperitoneal 5 mal in Abständen von 10 Tagen verabreicht wurde. Poly(A)poly(U) (200 µg) wurde als Adjuvans verwendet, indem es als Mischung mit dem Antigen verabreicht wurde (siehe Materialien und Methoden). Sämtliche Mäuse entwickelten Antikörper gegen gp300. Diese Antikörper sind polyklonale Antikörper gegen gp300 (Antikörper anti-gp300). Die Figur 3 zeigt die Ergebnisse einer Western blot-Analyse, für die die Antikörper von einer der immunisierten Mäuse eingesetzt wurden. anti-gp300-Antikörper reagierten spezifisch mit gp300, aber gleichfalls mit gp140, gp125 und gp80, die in durch HIV-2 infizierten Zellen anwesend sind. Kein spezifisches Signal wurde bei durch HIV-1 infizierten CEM-Zellen oder bei nicht infizierten Zellen beobachtet. Die manchmal beobachtete Markierung eines Proteins von 60 kDa mit anti- gp300-Antikörpern war wahrscheinlich nicht spezifisch, da sie in den Zellextrakten unabhängig von einer viralen Infektion (Figur 3, Abschnitt Zellen: "CELLS") beobachtet wurde und in bestimmten Experimenten überhaupt nicht beobachtet wurde. Diese polyklonalen Antikörper wurden gleichfalls in einer ahnlichen Western blot-Untersuchung eingesetzt, für die Extrakte von durch HIV-2 infizierten Zellen sowie auch von Virusniederschlägen eingesetzt wurden. In den Zellextrakten erkannten die Antikörper gp300, gp140 und gp80 (Figur 3, Abschnit HIV-2, Linie C). In den viralen Extrakten erkannten sie gp125, gp80 und das Protein von 36 kDa, das wahrscheinlich das Transmembranglykoprotein gp36 ist (Figur 3, Abschnitt HIV-2, Linie V). Nach einer längeren Exposition war es möglich, ein der Position des gp36 entsprechendes Signal in den Zellextrakten nachzuweisen. Interessanterweise stellt man fest, daß die Menge von gp80 und gp36 in der Virusanhäufung (-niederschlag) sehr viel höher ist im Vergleich zu deren Menge in den Zellextrakten.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die gegen den Vorläufer des Glykoproteins der Hülle gerichteten polyklonalen Antikörper gp80 wie auch sämtliche Bestandteile der Hülle von HIV-2 erkennen. Dies ist der Grund, weshalb gp80 in Verbindung mit der Hülle von HIV-2 gebracht werden kann. Das Glykoprotein gp80 ist mit dem Virus assoziiert; es handelt sich wahrscheinlich um ein reifes Produkt.

IDENTIFIZIERUNG DES FÜR DAS TRANSMEMBRANGLYKOPROTEIN VON HIV-2 SPEZIFISCHEN gp80 DURCH MONOKLONALE 1H8-ANTIKÖRPER

Der monoklonale Antikörper mAb 1H8 wurde in einer Western blot-Untersuchung eingesetzt, um zu bestimmen, welche viralen Proteine identifiziert werden können. In den durch HIV-2 infizierten Zellen erkannte mAb 1H8 gp300, gp140 und gp80, während er in den HIV- 2-Partikeln hauptsächlich gp80 und nur schwach gp36 und gp300 erkannte (Figur 4). Das Vorliegen einer geringen Menge an gp300 im Viren enthaltenden Niederschlag war wahrscheinlich auf Kontaminationen zurückzuführen, die von lysierten Zellen stammen, da es sich um ein zelluläres Protein handelt (13). Das schwache Signal mit gp36 reflektiert wahrscheinlich die geringe Konzentration dieses Proteins. mAb 1H8 erkannte das extrazelluläre Glykoprotein gp125 nicht (Figur 4). Darüberhinaus wurde kein Protein der Extrakte von durch HIV-1 infizierten Zellen oder von Virusniederschlag erkannt. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Spezifität des mAb 1H8-Antikörpers für die Vorläufer der Hülle von HIV-2 (gp140 und gp300) und das Transmembranglykoprotein (gp36) vorliegt. Die Reaktivität von mAb 1H8 wurde an der Sequenz der Aminosäuren 579-604 des Transmembranglykoproteins von HIV-2 unter Verwendung eines synthetischen Peptids p39' lokalisiert.

Um die Spezifität der Reaktivität von mAb 1H8 gegenüber gp80 zu zeigen, wurde eine Western blot-Untersuchung unter Verwendung von Virusniederschlagsextrakten von HIV-2 ausgeführt. Nach dem Transfer der Proteine wurden Nitrocelluloseblätter mit mAb 1H8-Antikörpern oder gegen gp300 gerichteten polyklonalen Antikörpern in Abwesenheit oder in Gegenwart von p39'-Peptiden inkubiert (Figur 5). mAb 1H8 gab ein starkes Signal mit gp80. Darüberhinaus wurde ein Signal für gp36 beobachtet, aber ausschließlich nach einer längeren Exposition des Autoradiogramms. anti-gp300-Antikörper reagierten mit gp125, gp80 und gp36; das mit dem 60 kDa-Protein erhaltene Signal war nicht spezifisch (wie in Figur 3). Die Zugabe von p39'-Peptid beseitigte vollständig die mit mAb 1H8 erhaltenen Signale, nicht aber jene, die mit den anti-gp300-Antikörpern erhalten worden waren (Figur 5). Diese Beobachtungen bestätigen, daß die Reaktivität von mAb 1H8 für den Abschnitt von 26 Aminosäuren entsprechend der Sequenz von 579 bis 604 des Transmembranglykoproteins von HIV-2 spezifisch sein könnte. Folglich könnte eine der Sequenz des Peptids p39' entsprechende Sequenz in gp80 vorliegen. Die Reaktivität der anti-gp300-Antikörper wurde nicht durch das Peptid p39' beeinträchtigt. Dies ist darauf zurückzuführen, daß diese polyklonalen Antikörper mit anderen Epitopen als jenen, die dem Peptid p39' entsprechen, wechselwirken könnten.

IMMUNPRÄZIPITATION DES gp80 DURCH POLYKLONALE ANTI-gp300-ANTIKÖRPER UND mAb 1H8

Polyklonale Antikörper immunprazipitierten gp300, gp140 und gp125 sowie gp80, während mAb 1H8 gp 300, gp140 und gp80 immunpräzipitierte (Figur 6). Zugleich waren zwei zelluläre Proteine (60 und 45 kDa) mit den Immunkomplexpräparationen unter Verwendung der polyklonalen und monoklonalen Antikörper in gleicher Weise assoziiert (Figur 6, Linien 0 und 2h). Das Vorliegen von Proteinen von 60 und 45 kDa in der Immunkomplexpräparation war auf deren Bindung an die Protein A-Sepharose zurückzuführen; diese letztere wurde verwendet, um die mit den unterschiedlichen Antikörpern gebildeten Immunkomplexe wiederzugewinnen.

Durch HIV-2 infizierte Zellen wurden 30 min durch das "pulse"-Verfahren markiert und der Marker wurde während 2 und 4 h beobachtet (chase). Extrakte markierter Zellen (zum Zeitpunkt 0, 2 und 4 h) und nach 4 h Beobachtungsphase (chase-Phase) gewonnener Virusniederschlag wurden durch einen Immunpräzipitationstest unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen gp300 und des monoklonalen mAb 1H8-Antikörpers analysiert (Figur 6). Mit den polyklonalen und monoklonalen Antikörpern konnte gp80 während der Markierungsphase (pulse) nicht nachgewiesen werden. Es wird erst nach 2 h der Beobachtungsphase (chase-Phase) in den infizierten Zellen klar sichtbar. Wenn die Beobachtungsphase (chase-Phase) auf 4 h verlängert wird, war mit [³&sup5;S]-Methionin markiertes gp80 in den infizierten Zellen nicht mehr nachweisbar. Die Analyse von nach 4 h hergestelltem Virusniederschlag zeigte, daß gp80 wie das extrazelluläre Glykoprotein gp125 mit den Viruspartikeln assoziiert war (Figur 6). Man kann annehmen, daß gp80 ein Reifungsprodukt der Hülle von HIV-2 ist. Die Tatsache, daß gp80 durch für das Transmembranglykoprotein von HIV-2 spezifische monoklonale Antikörper erkannt wird, hat gezeigt, daß es der dimeren Form des gp36 entspricht (bestätigt durch die Ergebnisse, die in den Figuren 8 und 9 gezeigt sind). Der Nachweis von gp80 war nicht auf infizierte CEM-Zellen beschränkt, da es gleichfalls in durch HIV-2 infizierten T-Lymphozyten nachgewiesen wurde.

Der Vergleich der durch Western blot-Analysen und durch Immunpräzipitationsuntersuchungen erhaltenen Ergebnisse zeigt, daß die HIV-2-positiven humanen Seren, die polyklonalen Maus-Antikörper und mAb 1H8 die denaturierten Formen von gp80 und gp125 besser als die nativen Formen erkennen (Figur 1, 2, 3, 4 und 6). Die nativen Formen dieser reifen Glykoproteine haben wahrscheinlich Konformationen, die die Epitope maskieren, die durch die unterschiedlichen Antikörper erkannt werden.

EINBAU VON GLUCOSAMIN UND VON FUCOSE IN gp80

Extrakte von durch das Virus HIV-2 infizierten Zellen, die metabolisch mit [³H]-Glucosamin und [³H]-Fucose markiert worden waren, wurden unter Verwendung von mAb 1H8- Antikörpern und polyklonalen anti-gp300-Antikörpern immunpräzipitiert. In Übereinstimmung mit den vorstehend aufgeführten Ergebnissen (Figuren 3-6) immunpräzipitierten die anti- gp300-Antikörper mit den Zuckern markierte Glykoproteine, nämlich gp300, gp140, gp125 und gp80, während mAb 1H8 gp300, gp140 und gp80 immunpräzipitierte. Alle diese Proteine haben [³H]-Glucosamin eingebaut, während der Einbau von [³H]-Fucose meist bei gp125 und gp80 auftrat (Figur 7A). In diesen Experimenten wurde die Markierung von gp36 mit [³H]- Fucose schwach nach einer längeren Exposition des Autoradiogramms beobachtet. gp80 kann auch [³H]-Mannose auf dieselbe Weise wie gp300, gp140 und gp125 einbauen. Der Einbau dieser markierten Zucker in gp80 und in andere Glykoproteine wurde durch Tunicamycin (15), ein Antibiotikum, das die Glykosylierung der vereinigten Proteine an den Stickstoffatomen hemmt, vollständig blockiert.

Die Oligosaecharide von Glykoproteinen, die an Asparagin gebunden sind (die N- Acetylglucosamin, Mannose und Glucose enthalten) unterlaufen eine noch wichtigere Reifung nach deren Anheftung an native Proteine (11). Die Oligosaccharidketten werden an ihren Enden im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat vor der Übertragung der Fucose- und Sialinsäurereste zurechtgeschnitten Dies ist der Grund dafür, daß der Einbau der Fucosereste lange nach den Glykosylierungsschritten stattfindet. In den durch HIV-2 infizierten Zellen wird [³H]-Fucose hauptsächlich in gp125 und gp80 eingebaut (Figur 7), in zwei Proteine, die reifen Produkten von Vorläufern der Hülle von HIV-2 entsprechen (Figur 6). Um zu bestätigen, daß gp120 während der Reifung des Vorläufers der Hülle produziert wird, wurden mit HIV-2 infizierte Zellen mit [³&sup5;S]-Methionin in Abwesenheit oder in Gegenwart von einem Glucosidase-Inhibitor, Castanospermin, markiert (14). Die Kulturüberstände wurden dann durch Immunpräzipitation unter Verwendung eines Serums eines HIV-2-positiven Patienten, das mehrere virale Proteine erkannte, untersucht. In Gegenwart von Castanospermin wurde die Produktion von gp80 und gp125 merklich vertingert, wahrend die Produktion des Hauptproteins des Nucleocapsids (core) (p26) nicht signifikant beeinflußt wurde (Figur 7b).

DISSOZIATION VON gp80 ZU gp36

Es wurden Versuch vorgenommen, um die Bedingungen zu optimieren, unter denen die Dissoziation von gp80 stattfinden könnte, wobei diese Bedingungen einem stärker salzhaltigen Medium, einem sauren pH, einem ionischen Detergens, EDTA oder EGTA entsprechen. Wir haben das Verfahren ausprobiert, das in (13) beschrieben wurde und das es erlaubt, gp300 durch Inkubation in einem schwach sauren Puffer zu dissoziieren. Obwohl dieses Verfahren zur Dissoziation von gp80 geeignet sein könnte, wurde der größte Teil der gp80-Glykoproteine in einem Puffer mit einem pH unter 6 abgebaut. In sämtlichen Experimenten wurden Extrakte infizierter Zellen oder von Virusniederschlägen hergestellt, indem man einen Lysispuffer, der ein nicht ionisches Detergens, Triton X- 100, enthielt, einsetzte. Unter diesen Bedingungen sind gp300 und gp80 nicht dissoziiert, selbst nach Zugabe des ionischem Detergens SDS nicht. Die Wirkung von SDS wurde untersucht, wenn es für die Herstellung der Extrakte durch Triton ersetzt wurde. Die durch HIV infizierten Zellen wurden mit [³&sup5;S]-Methionin vor einer Herstellung der Extrakte durch Solubilisierung in einem Lysispuffer, der entweder 1 % Triton X-100 oder 1 % SDS enthielt, markiert. Diese Extrakte wurden dann 10-fach in einem Lysispuffer ohne Detergens verdünnt und unter Verwendung von mAb 1H8 immunprazipitiert. Die Immunkomplexpräparationen aus Triton -Extrakten haben das Vorliegen von mit [³&sup5;S]- Methionin markierten Banden, die gp300, gp140 und gp80 entsprachen, und von schwachen Banden von gp36 gezeigt (Figur 8, Abschnitt C, Linie 1). Andererseits waren, wenn die Extrakte mit SDS hergestellt worden waren, gp300 und gp80 praktisch nicht nachweisbar, während die Menge an gp140 und gp36 verstärkt war (Figur 8, Abschnitt C, Linie 2). Demnach waren in Gegenwart eines ionischen Detergens die dimeren Formen gp300 und g80 dissoziiert, wodurch Anlaß zur Produktion von gp140 bzw. von gp36 gegeben wurde. Die Dissoziation von gereinigtem, mit [³&sup5;S]-Methionin markiertem gp300 gab allein Anlaß zur Bildung von gp140 (13). gp36 existiert demnach erst nach der Dissoziation von gp80. Es wird festgestellt, daß der Abbau von Proteinen gleichfalls in Gegenwart von SDS stattfinden kann, demzufolge beide markierten Proteine gp300 und gp80 unter den dissoziierten Proteinen nicht wiedergewonnen wurden (Figur 8, Abschnitt C). Die Gegenwart von 200 Einheiten/ml Aprotinin und von 0,2 mM PMSF verhinderte nicht einen solchen Abbau während der Inkubation mit SDS. Es ist möglich, daß die dimeren Formen der Proteine eine Konformation aufweisen, sodaß sie der Proteolyse widerstehen. Die Dissoziation von gp300 und gp80 kann dann zu konformatorischen Modifikationen führen, die die proteolytisch angreifbaren Stellen wieder zugänglich machen.

Die Dissoziationsexperimente wurden gleichfalls mit Virusniederschlägen von HIV-2 vorgenommen. Die mit [³&sup5;S]-Methionin markierten viralen Proteine wurden in einem Lysispuffer, der 1 % Triton oder 1 % SDS in einem RIPA-Puffer, der 0,1 % SDS und 1 % Desoxycholat enthielt, solubilisiert. Die Extrakte im Lysispuffer, der 1 % SDS enthielt, wurden gleichfalls auf 95ºC erwärmt. Sämtliche Extrakte wurde dann mit mAb 1H8 immunpräzipitiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert (Figur 8, Abschnitt V).

In dem aus Triton -Extrakten hergestellten Immunkomplex waren gp80 und gp36 die hauptsächlichen, durch den 1H8-Antikörper immunpräzipitierten Proteine. Andererseits ist gp80 nicht mehr nachweisbar, während die Menge an gp36 empfindlich in den SDS-Extrakten erhöht wird. Das Ausmaß eines Abbaus der SDS-Extrakte war wahrscheinlich besonders bedeutend, da die Mehrzahl der markierten Bestandteile verschwand. Ein besseres Ergebnis wurde mit dem RIPA-Puffer erhalten, in dem der Großteil der gp80 dissoziiert war und ungefähr 30 % der Markierung in den gp36 wiedergefunden wurde (Figur 8, Abschnitt V). Um zu zeigen, daß gp80 ausschließlich aus gp36 aufgebaut ist, wurden Dissoziationsexperimente unter Verwendung des mit [³&sup5;S]-Methionin markierten gp80, das durch Immunpräzipitation mit den mAb 1H8-Antikörpern und durch präparative Gelelektrophorese gereinigt worden war, ausgeführt. Die lyophilisierten gp80-Präparationen wurden dann direkt in einem Acetatpuffer, der SDS enthielt, mit pH 6,8, 5,8 und 4,8 suspendiert. Bei pH 4,8 wurde sämtliches gp80 in gp36 umgewandelt (Figur 9).

CHARAKRERISIERUNG EINES TRANSMEMBRANGLYKOPROTEINS IN DIMERER FORM BEI SIV-mac

Es wurde untersucht, ob das Transmembranglykoprotein in dimerer Form in Proben von SIV nachweisbar war.

Durch SIV und HIV-2 infizierte Zellen wurden mit [³H]-Glucosamin markiert und es wurden Extrakte in einem Lysispuffer, der Triton enthielt, hergestellt und dann mit dem mAb 1H8-Antikörper immunpräzipitiert. Wie in Figur 7 gezeigt, präzipitierte der monoklonale Antikörper gp300, gp140 und gp80 der durch HIV-2 infizierten Zellen, während nur gp80 in den Viruspartikeln gefunden wurde (Figur 10). In den durch SIV infizierten Zellen präzipitierte der monoklonale Antikörper drei glykosylierte Proteine: den Vorläufer der Hülle gp140, den dimeren Vorläufer gp300 und ein Protein von 65 kDa (gp65), das wahrscheinlich dem Gegenstück von gp80 von HIV-2 entspricht. Wie gp80 ist gp65 offensichdich mit den Viruspartikeln von SIV assoziiert (Figur 10).

Man stellt fest, daß in diesen Experimenten die monomeren Formen des Transmembranglykoproteins von HIV-2ROD und von SIV-mac nicht nachweisbar sind. Die Sequenz der Aminosäuren 579-604 von HIV-2ROD entspricht der Sequenz der Aminosäuren 595-620 von SIV-mac (19,7). Diese zwei Sequenzen weisen eine hohe Homologie auf und der Antikörper mAb 1H8 zeigt eine Kreuzreaktion mit den Hüllproteinen von HIV-2ROD und SIV-mac in gleicher Weise.

Die Erfinder haben dementsprechend dann nachgewiesen, daß ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 65 kDa einer dimeren Form des gp32 des SIV-mac-Virus entspricht.

DISKUSSION

Die Dissoziation der dimeren Formen (gp300 und gp80) kann bei einem leicht sauren pH stattfinden. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis kann angenommen werden, daß die Dimerisierung von gp140 vom pH abhängig sein und in einem Kompartiment des endoplasmatischen Retikulums stattfinden kann, das die Fusion zweier Vorläufermoleküle gp140 begünstigt.

Das Molekulargewicht der dimeren Form des Vorläufers der Hülle gp300 von HIV-2 wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen bestimmt (13). In einem 5 %-igen Polyacrylamidgel, das 0,1 % (Gew./Vol.) Bisacrylamid anstelle von 0,2 % enthielt, wanderte dieser dimere Vorläufer zu einer Position, die einem Protein von 280 kDa entsprach. Um das Molekulargewicht des Dimeren unter nativen Bedingungen zu bestätigen, wurden Gelfiltrationsexperimente unter Verwendung einer Sephacryl S-300-Säule und von Extrakten durch HIV-2 infizierter, mit [³&sup5;S]-Methionin markierter Zellen, die in einem Triton enthaltenden Lysispuffer hergestellt worden waren, ausgeführt. Unter diesen experimentellen Bedingungen wurde gp300 in Form eines zweiten Peak nach dem Peak der aggregierten Proteine eluiert. Das Dimer von Transmembranglykoproteinen entspricht einem Protein, das mit einem Molekulargewicht von 75-80 kDa nach dem Peak von gp125 und vor dem Peak des Rinderserumalbumins (68 kDa), das als Marker verwendet wird, eluiert. Diese Beobachtungen zeigen, daß die Molekulargewichtsbestimmungen der nativen und denaturierten Dimeren gp 300 und gp80 vergleichbar sind. In vitro findet die Dissoziation dieser dimeren Formen bei saurem pH und gleichfalls in Gegenwart eines ionischen Detergens SDS statt. Wenn die Extrakte in dem Triton enthaltenden Lysispuffer hergestellt worden sind, widerstanden die dimeren Formen gp300 und gp80 der Dissoziation durch SDS. Das nicht ionische Detergens Triton bewahrt demnach die nativen Formen der Dimeren der Hülle gp300 und gp80.

Die dimeren Formen des Vorläufers der Hülle gp300 und des Transmembranglykoproteins sind gleichfalls in den durch SIV infizierten Zellen, aber nicht in durch HIV-1 infizierten Zellen beobachtet worden. Insbesondere widerstehen die Transmembranproteindimeren von HIV-2 (gp80) und von SIV (gp65) der Dissoziation durch reduzierende Agentien. Dies ist der Grund dafür, daß die Dimerisierung des Transmembranglykoproteins der Hülle als eine spezifische Eigenschaft der Expression der Gene für die Hülle von HIV-2 und SIV angesehen werden kann. Diese Eigenschaft kann für die Charakterisierung neuer HIV-Isolate herangezogen werden als Marker, der geeignet ist, die Verwandtschaft des entdeckten Isolats zum Typ HIV-1 oder zum Typ HIV-2 darzustellen. Die Dimerisation des Vorläufers der Hülle könnte unabdingbar sein für seine Reifung zu dem Zweck, reife Glykoproteine der Hülle zu produzieren. Während die dimere Form des Transmembranglykoproteins für die optimale Bildung der Struktur des Virions und zugleich für seine Fähigkeit, mit den Zellmembranen zu fusionieren und infektiös zu sein, essentiell sein kann, führt die Dissoziation des Transmembranproteindimeren in vitro zu einem überaus bedeutenden Abbau. Dies kann auf die Fähigkeit der dimeren Form dieses Glykoproteins zurückzuführen sein, der Proteolyse dank seiner Konformation zu widerstehen.

Die nachstehend aufgeführte Tabelle und das Schema der Schritte zur Herstellung der Glykoproteine gp125 und gp80 von HIV-2 fassen bestimmte Gesichtspunkte der Erfindung, die in den Beispielen dargelegt worden sind, zusammen.

GLYKOPROTEINE DER HÜLLE VON HIV-1, HIV-2 UND SIV
GKLYKOPROTEIN DER HÜLLE Vorläufer Dimerer Vorläufer Extrazelluläres Protein Transmembranprotein Dimeres Transmembranprotein keiner keines
Mannosidase Glucosidasen Translation Fucose Sialinsäure Protease

LITERATURVERZEICHNIS

1 - Barré-Sinoussi, F. et al., 1983. Science 220.868-871.

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4 - Clavel F. et al. 1986a. Science 233, 343-346.

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7 - Gosting, L., et al. 1987. Journal of Clinical Microbiology, 25, 845-848.

8 - Hovanessian, A.G., et al. 1988. Immunology Today 9, 161-162.

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15 - Schwartz, R.T. et al. 1976. J. Virol. 19, 782-791.

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18 - Weiss R.A. 1988. Nature 331, 15.

19 - Chakrabarti, L. et al. 1987. Nature 328, 543.547.


Anspruch[de]

1. Glykoprotein,

gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

- es wird aus einem Dimer eines Transmembranglykoproteins der Hülle eines Retrovirus HIV oder SIV gebildet,

- es ist in der Lage, einen immunologischen Komplex vom Antigen-Antikörper-Typ zu bilden mit Antikörpern, die gegen ein antigenes Glykoprotein gp80 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 80 kDa gerichtet sind, das von polyklonalen, gegen das Glykoprotein gp300 eines humanen Retrovirus HIV-2 gerichteten Antikörpern erkannt wird und das in Assoziation in dimerer Form zwei Einheiten des Transmembranglykoproteins der Hülle gp36 enthält, für das das Genom eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2, das ein LAS oder ein AIDS beim Menschen hervorrufen kann, kodiert,

- es hat ein Molekulargewicht derselben Größenordnung wie jenes des obengenannten gp80 von HIV-2.

2. Antigenes Glykoprotein gp80 nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

- es hat ein Molekulargewicht (MG) von ungefähr 80 kDa,

- es wird von polyklonalen, gegen das Glykoprotein gp300 eines humanen Retrovirus HIV-2 gerichteten Antikörpern erkannt,

- es umfaßt in Assoziation in dimerer Form zwei Einheiten des Transmembranglykoproteins der Hülle gp36, für das das Genom eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2, das ein LAS oder ein AIDS beim Menschen hervorrufen kann, kodiert.

3. Glykoprotein gp80 nach Anspruch 2,

dadurch gekennzeichnet, daß

- es mit durch ein humanes Retrovirus des Typs HIV-2 infizierten Zellen und/oder Virionen und/oder Viren des Typs HIV-2 assoziiert sein kann,

- es in vitro in Gegenwart eines nichtionischen Detergens,

wie 1 % Triton X-100, nicht dissoziiert ist und es in vitro in Gegenwart eines ionischen Detergens, wie 1 % SDS, bei einem schwach sauren pH dissoziiert ist, um das Transmembranglykoprotein gp36 eines Retrovirus des Typs HIV-2 zu bilden.

4. Von einem Glykoprotein gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abgeleitetes Protein,

dadurch gekennzeichnet, daß es von Glykosylgruppen des gp80 befreit ist.

5. Polyklonaler Antikörper,

gekennzeichnet dadurch,

- daß er spezifisch einerseits gp300, gp140, gp125 und gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die in durch ein Retrovirus des Typs HIV-2 infizierten Zellen vorliegen, und andererseits gp125, gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und gp36, die in Extrakten eines Retrovirus des Typs HIV-2 vorliegen, erkennt und

- daß er die Proteine oder Glykoproteine von gesunden Zellen oder von durch ein Retrovirus des Typs HIV-1 infizierten Zellen nicht erkennt.

6. Monoklonaler Antikörper,

dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch mit dem Glykoprotein gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 4 reagiert, daß er nicht mit den Proteinen und Glykoproteinen von durch ein Retrovirus des Typs HIV-1 infizierten Zellen oder mit Niederschlägen von Viren von HIV-1 reagiert und daß er darüberhinaus die Glykoproteine gp300, gp140 und gp36 von HIV-2 erkennt.

7. Hybridom, das monoklonale Antikörper nach Anspruch 6 produziert.

8. Antigene Zusammensetzung für die spezifische in vitro- Diagnose einer Infektion aufgrund eines humanen Retrovirus des Typs HIV-2 in einer biologischen Probe, die nach dieser Infektion gebildete Antikörper enthalten könnte,

dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens das Glykoprotein gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

9. Immunogene Zusammensetzung,

dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens das Glykoprotein gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für die Herstellung von Impfstoffen enthält.

10. Verfahren zur in vitro-Diagnose einer Infektion, die spezifisch auf ein Retrovirus des Typs HIV-2 zurückgeführt werden kann, gekennzeichnet durch die Schritte:

- In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe, die nach einer Infektion durch ein Retrovirus des Typs HIV-2 gebildete Antikörper enthalten könnte, mit einem Glykoprotein gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder mit einer antigenen Zusammensetzung nach Anspruch 8 unter geeigneten Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes vom Antigen-Antikörper- Typ erlauben, und

- Nachweis des gegebenenfalls gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes.

11. Verfahren zur Herstellung eines antigenen Glykoproteins gp80 nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Lyse von durch ein humanes Retrovirus HIV-2 infizierten Zellen und Trennung des Überstandes und der infizierten Zellen oder Lyse der durch Zentrifugation hergestellten, Viren enthaltenden Niederschläge,

- Inkubation des Zellextrakts und/oder des viralen Extrakts auf einer Immunaffinitätssäule, welche mit einem Immunadsorbens beschickt ist, das gereinigte Antikörper enthält, wie solche, die aus einem Serum eines durch das humane Retrovirus HIV-2 infizierten Kranken erhalten werden, wobei dieses Serum die Fähigkeit hat, stark mit den Hüllproteinen von HIV-2 zu reagieren, wobei diese Antikörper vorteilhafterweise an einen adaptierten Träger gekoppelt sind, in Anwesenheit eines Puffers und für eine ausreichend lange Zeitdauer, um die Bildung eines immunologischen Antigen-Antikörper-Komplexes zu erhalten,

- Waschen der Säule mit einem Puffer zum Entfernen der nicht auf dem Träger zurückgehaltenen Moleküle und

- Gewinnung der gewünschten antigenen Proteine.

12. Verfahren nach Anspruch 11 zur Herstellung des Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4,

dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung der Glykoproteine bewerkstelligt wird durch Elektrophorese und durch Elektroelution.

13. Verfahren nach Anspruch 11 zur Herstellung des Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4,

dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung der Glykoproteine erhalten wird durch

- Elution der an die vorstehend bezeichnete Immunaffinitätssäule gebundenen Proteine und

- Reinigung der so eluierten Produkte über eine Chromatographiesäule, die an den Trennungsträger gekoppelt monoklonale Antikörper, die gp80 erkennen, enthält.

14. Zusammenstellung oder Kit zum Nachweis von Antikörpern im Serum oder in einer anderen biologischen Probe eines Patienten, der durch ein humanes Retrovirus HIV-2 infiziert sein könnte, gekennzeichnet dadurch, daß sie bzw. er enthält:

- mindestens ein antiqenes Protein und/oder Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4

- oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 8

- oder ferner eine Mischung dieser unterschiedlichen Bestandteile und

- Mittel, die die Bildungsreaktion des immunologischen Komplexes zwischen den vorstehend genannten Antigenen und den gegebenenfalls in der zu untersuchenden biologischen Probe anwesenden Antikörpern ermöglichen, insbesondere, sofern erforderlich, einen oder mehrere Inkubationspuffer,

- eine negative Kontrollprobe und

- Mittel zum Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes.

15. Verfahren zum Nachweis einer Infektion durch das Retrovirus HIV-2 in einer biologischen Probe,

gekennzeichnet durch die Schritte:

- Behandlung der biologischen Probe auf eine Weise, daß die intrazellulären Proteine freigesetzt werden und

- Nachweis der Anwesenheit des Glykoproteins nach Anspruch 1 unter den freigesetzten intrazellulären Proteinen, beispielsweise durch Elektrophorese oder durch einen immunologischen Test mittels immunologisch hinsichtlich gp80 reaktiver Antikörper.







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