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Dokumentenidentifikation DE68927344T2 20.02.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0394538
Titel Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces
Anmelder Rhein Biotech Gesellschaft für neue biotechnologische Prozesse und Produkte mbH, 40595 Düsseldorf, DE
Erfinder Hollenberg, Cornelius P., Prof. Dr., D-4000 Düsseldorf, DE;
Strasser, Alexander, Dr., D-4000 Düsseldorf, DE
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, Anwaltssozietät, 80538 München
DE-Aktenzeichen 68927344
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 28.04.1989
EP-Aktenzeichen 891077802
EP-Offenlegungsdatum 31.10.1990
EP date of grant 16.10.1996
Veröffentlichungstag der Übersetzung europäischer Ansprüche 11.04.1991
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.02.1997
IPC-Hauptklasse C12N 1/19
IPC-Nebenklasse C12P 21/02   C12N 15/81   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Hefezellen der Gattung Schwanniomyces und ein Verfahren für die Erzeugung von Polypeptiden.

Für die Expression eukaryontischer Proteine mit biotechnologischer Relevanz gibt es eine Vielzahl von Wirtssystemen, die den speziellen Erfordernissen entsprechend ausgewählt werden. Der am häufigsten verwendete Wirtsorganismus ist Escherichia coli, der der am besten bekannte Vertreter prokaryontischer Wirtsorganismen ist; Saccharomyces cerevisiae und tierische Gewebekulturen werden als eukaryontische Wirtszellen verwendet. Für bestimmte Zwecke, z.B., wo die Expression eines Glykoproteines erwünscht ist, ist die Expression in E. coli oder anderen prokaryontischen Organismen nicht geeignet, da in diesen die Fähigkeit zur Glykosylierung fehlt. Andererseits ist die Massenproduktion von Protein in Gewebekulturen immer noch mühsam und kostspielig; daher ist der Organismus der Wahl in vielen Fällen Hefe der gut charakterisierten Gattung Saccharomyces. S. cerevisiae kann effizient kleine Proteine sezernieren, z.B. Polypeptide wie MG1 (Kurjan und Herskowitz, 1982), β-Endorphin oder α-Interferon (Bitter et al., 1984), jedoch werden Proteine mit einem höheren Molekulargewicht im periplasmatischen Raum (Emr et al., 1981) oder dem Cytoplasma festgehalten und verursachen so verringerte Wachstumsraten oder sogar den Zelltod.

Daher ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes eukaryontisches Expressionssystem zur Verfügung zu stellen, das gegebenenfalls Proteine, die von einer fremden DNA kodiert werden, in das Kulturmedium sezernieren kann.

Diese Aufgabe wird durch eine Hefezelle der Gattung Schwanniomyces gelöst, wobei diese Hefezelle mindestens eine Expressionkassette enthält, umfassend:

a) eine erste DNA-Sequenz, die als Regulon dient,

b) gegebenenfalls eine zweite DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert,

c) eine dritte DNA-Sequenz, die für ein Fremdprotein kodiert, und

d) gegebenenfalls eine vierte DNA-Sequenz, die als ein Terminator dient,

wobei die erste, zweite und vierte DNA-Sequenz von Hefe abgeleitet sind.

Die Erfindung, die weitere Gegenstände umfaßt, wird nun ausführlich durch die folgende Beschreibung, die Beispiele und die Abbildungen beschrieben.

Kurze Beschreibung der Abbildungen Abbildung 1

A: Restriktionskarte des AMY1-Genes, das für α-Amylase kodiert, und seiner 5'- und 3'- nichtkodierenden Bereiche

B: Nukleotidsequenz des AMY1-Genes und seiner flankierenden Bereiche. Im 5'-Bereich ist die Transkriptionsinitiationsstelle durch eine unterbrochene Linie über der Sequenz angezeigt. Innerhalb des Strukturgenes sind die mutmaßlichen Signalpeptidase-Spaltstellen durch Sternsymbole gezeigt. Die beiden möglichen Glykosylierungsstellen, die Cysteinreste, die vermutlich vier Disulfidbindungen bilden (Annahme aufgrund der Homologie mit dem A. oryzae-Enzym) sind unterstrichen. Innerhalb des Bereiches am 3'-Ende wird auf das Transkriptionsterminationssignal TAG...TATGT...TTT durch eine durchgezogene Linie hingewiesen.

Abbildung 2

A: Restriktionskarte des GAM1-Genes, das für Glucoamylase kodiert, und seiner 5'- und 3'- nichtkodierenden Bereiche

B: Nukleotidsequenz des GAM1-Genes und seines flankierenden Bereiches. Im 5'-Bereich ist die Transkriptionsinitiationsstelle durch eine unterbrochene Linie angegeben. Innerhalb des Strukturgenes werden die mutmaßlichen Signalpeptidase-Spaltstellen durch Sternsymbole angezeigt.

Abbildung 3

M13 XhoI. Das EcoRI-ScaI-Fragment, das ein 1,8 kb Promotorfragment und ein ungefähr 0,4 kb Strukturgenfragment des α-Amylasegenes enthält, wurde im zuvor mit EcoRI und SmaI abgebauten M13mp8 subkloniert. Mittels einer stellengerichteten Mutagenese wurde eine XhoI-Stelle unmittelbar vor dem ATG-Codon eingesetzt:

Die Positionen, an denen Basen durch stellengerichtete Mutagenese ausgetauscht worden sind, sind durch Sternchen angezeigt.

Abbildung 4

pMaGAM-B/S. Das BglII-Fragment, das das Glucoamylasegen und seine flankierenden 5'- und 3'-Bereiche enthält, wurde in die BamHI-Stelle des Vektors pMAC5-8 (Kramer et al., 1984) subkloniert. Durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung des "gapped duplex DNA"-Verfahrens (Kramer et al., 1984) wurden eine BamHI-Stelle und eine SalI-Stelle unmittelbar vor dem Translationsinitiationscodon ATG insertiert:

Die von einer stellengerichteten Mutagenese betroffenen Positionen sind durch Sternchen angegeben.

Abbildung 5

YRp7αGAM. Das GAM-Gen wurde aus pMaGAM-B/S als ein SalI-Fragment isoliert und in die XhoI-Stelle von M13αXho ligiert (Abb. 3). Das BglII-Fragment, das die Fusion aus α-Amylase- Promotor und GAM-Gen beherbergt, wurde in die einzelne BamHI-Stelle des S. cerevisiae-Vektors YRp7 ligiert, was zum Plasmid YRp7αGAM führte.

Abbildung 6

Konstruktion von S. occidentalis-Vektoren für die Expression von Fremdgenen unter Verwendung des Promotors und der Signalsequenz des Glucoamylasegenes.

a: Insertion des 4,0 kb EcoRI-PvuII-Fragmentes aus pBRSwARSGAM, das den vollständigen GAM-Promotor und die ersten 208 bp der für GAM kodierenden Sequenzen enthält, in pBR322, gespalten mit EcoRI/PvuII, was zum Vektor pBRGAM führt.

b: Insertion des 3,4 kb PvuII-Fragmentes aus dem Plasmid pCT603, das das für Cellulase kodierende Strukturgen von Basenpaar Position +112 an enthält, in die PvuII-Stelle vom Plasmid pBRGAM, was zum Vektor pBRGC1 führt.

c: Insertion des 5,5 kb BglII-PstI-Fragmentes aus Plasmid pBRGC1 in BamHI/PstI geschnittenen pCJD5-1. Das resultierende Plasmid, pMPGC1-1, enthält 321 bp des nichtkodierenden 5'-Bereiches von GAM und die ersten 208 bp des kodierenden GAM-Bereiches, fusioniert mit Position +112 des celD-Genes.

d: Insertion des 6,5 kb BamHI-PstI-Fragmentes aus Plasmid pBRGC1 in BamHI/PstI geschnittenen pCJD5-1. Das resultierende Plasmid, pMPGC1-2, enthält 1,3 kb des nichtkodierenden 5'-Bereiches von GAM und die ersten 208 bp des kodierenden GAM-Bereiches, fusioniert mit Position +112 von celD.

Abbildung 7

Promotoruntersuchungen unter Verwendung des qualitativen Endoglucanase D-Aktivitätstests (Kongorot-Färbung) mit verschiedenen Transformanten:

NGA58: pMPAGC, NGA58: pMPPGC, NGA58: pMPGC1-1, NGA58: pMPGC1-2

a: Wachstum auf 2% Maltose

b: Wachstum auf 4% Glukose

Abbildung 8 Konstruktion eines S. occidentalis-Vektors für die Expression von Fremdgenen unter Kontrolle des ADH1-Promoters.

a: Insertion des 1,45 kb BamHI-SalI ADH1-Promotorfragmentes aus Plasmid pFM2-1 in pCJDS-1, zuvor geschnitten mit BamHI/SalI, resultierend in Plasmid pMPADH1.

b: Insertion des 3,2 kb SalI-Fragmentes von pJDcg-15 in die SalI-Stelle von pMPADH1, resultierend in pMPAG.

c: Austausch des GAM-Promotors in Plasmid pMPGC1-2 (Abb. 6d) durch den ADH1-Promotor aus Plasmid pMPAG durch in vivo Rekombination, resultierend in Plasmid pMPAGC.

Abbildung 9 Konstruktion eines S. occidentalis-Vektors für die Expression von Fremdgenen unter Kontrolle des PDC-Promotors.

a: Insertion des 6,0 kb SphI-AvaI-Fragmentes aus Plasmid pJDcg-15, enthaltend den PDC-Promotor, der mit dem GAM-Gen fusioniert ist, in YRpJD2, zuvor geschnitten mit SphI-AvaI, resultierend in Plasmid pMPPG.

b: Austausch des GAM-Promotors in Plasmid pMPGC1-2 (Abb. 6d) durch den PDC-Promotor aus Plasmid pMPPG durch in vivo-Rekombination, resultierend in Plasmid pMPPGC.

Abbildung 10

Konstruktion eines autonom replizierenden Vektors (enthaltend SwARS2) für die Transformation von S. occidentalis.

Das 3,2 kb TRP5-BamHI-Fragment aus Plasmid YRpJD2 wurde mit dem 5,5 kb BamHI-BglII-Fragment des Plasmides pBRSwARSGAM ligiert (Abb. 6a) was zu pMPTS2-A und pMPTS2-B führt.

Abkürzungen, die in dieser Anmeldung vervendet werden Restriktionsendonukleasen:

Aa - AatII

A - Asp718

B - BamHI

Bg - BglII

C - ClaI

E - EcoRI

EV - EcoRV

H - HindIII

P - PvuII

Ps - PstI

S - SalI

Sc - ScaI

Sm - SmaI

Sp - SphI

X - XhoI

In dieser Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen durch Erwähnung des ersten Autors und des Jahres der Publikation (in Klammern) Bezug genommen. Die vollständigen Zitate der Literaturstellen können am Ende der Beschreibung als ein Anhang gefunden werden, wo sie im Einklang mit ihrer alphabethischen Reihenfolge unmittelbar im Anschluß an die Beschreibung aufgeführt sind. Die Offenbarung dieser Publikationen werden in ihrer Gesamtheit durch Bezug in dieser Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, wie er dem Fachmann am Tage der hier beschriebenen und beanspruchten Erfindung bekannt war, genauer zu beschreiben.

Die erfindungsgemäße Hefezelle ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Expressionskassette enthält, die wiederum aus drei bis vier verschiedenen Bestandteilen zusammengesetzt ist, die in funktioneller Verbindung angeordnet sind, um eine effiziente Expression eines gewünschten Polypeptides sicherzustellen, gegebenenfalls gefolgt von dessen Sektretion. Diese Bestandteile sind als die folgenden definiert:

a) eine erste, als Regulon dienende DNA-Sequenz. Der Ausdruck "ein Regulon", wie er durch die Anmeldung hindurch verwendet wird, umfaßt jede cis-wirkende DNA-Sequenz, die in die Regulation der Expression eines gegebenen Strukturgenes involviert ist. Der Ausdruck umfaßt daher Sequenzen, die einer gegebenen kodierenden Sequenz vorangehen, beispielsweise einem Promotor und Sequenzen, die von Transkriptionsfaktoren oder anderen Proteinen, die in die Transkriptionsregulation involviert sind, erkannt werden. Die "erste DNA-Sequenz" ist daher nicht auf Sequenzen beschränkt, die bekannten Promotoren entsprechen. Ebenfalls umfaßt sind DNA-Sequenzen, die natürlich auftretenden Regulons entsprechen, die Insertions-, Deletions- oder Substitutionsereignissen unterlegen haben, aber immer noch ihre Aktivität als Regulon beibehalten. Der Ausdruck "Regulon" umfaßt weiterhin DNA-Sequenzen, die in die Transkriptionsregulation involviert sind, die chemisch synthetisiert worden sind oder durch gentechnologische Verfahren erhalten worden sind;

b) gegebenenfalls eine zweite DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert. Die Bedeutung dieser zweiten DNA-Squenz umfaßt verschiedene DNA-Sequenzen, die die Sekretion irgendeines Polypeptides steuern, das das so kodierte Peptid an seinem N-terminalen Ende enthält;

c) Eine dritte DNA-Sequenz, die für ein Fremdgen kodiert. Diese kodierende Sequenz kodiert für das Signalpeptid, um ein korrektes Leseraster für die dritte DNA-Sequenz beizubehalten. Die Fusion erfodert daher die Anwendung von Verfahren oder rekombinanter DNA-Technologie, die jedem Fachmann bekannt sind. Für Verfahren, die das Entwerfen korrekter Fusionen ermöglichen, wird allgemein auf Maniatis et al. (1982) verwiesen, worin geeignete Verfahren, z.B. verschiedene Wege, Restriktionsfragmentenden zu behandeln, das Klonieren von Linkermolekülen und ähnliche Verfahren im Detail beschrieben werden.

Das Fremdprotein, für das die dritten DNA-Sequenzen kodieren, kann jedes Protein sein, für dessen Expression ein Bedarf besteht. Da das Sekretionssystem nicht nur kleine Moleküle sezernieren kann, sondern ebenso große Proteine, sollte die Expression jedes gewünschten Proteines möglich sein. Für Beispiele wird auf die folgende Diskussion verwiesen.

d) Gegebenenfalls eine vierte DNA-Sequenz, die als ein Terminator dient. Als Terminator kann jede Sequenz verwendet werden, die die Transkription in dem jeweiligen Wirtsorganismus wirksam beendet. Terminatoren können beispielsweise Sequenzen sein, die leicht Haarnadelstrukturen und/oder Polyadenylierungsstellen bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Terminator vom gleichen Gen abgeleitet, von dem die zweite DNA-Sequenz, d.h., das Regulon, abgeleitet ist.

Die vier Bestandteile werden miteinander unter Verwendung bekannter Verfahren verbunden. Gegebenenfalls wird die korrekte Fusion beispielsweise durch Sequenzieren der Schnittstellen verifiziert.

Die erfindungsgemäße Hefezelle enthält mindestens eine Expressionskassette, die einige oder alle der obenerwähnten DNA-Sequenzen umfaßt. Sie stellt ein bequemes Werkzeug für die industrielle Expression jedes gewünschten Proteines zur verfügung.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erste und/oder zweite und/oder vierte DNA-Sequenz von einem Gen abgeleitet, das für ein amylolytisches Enzym kodiert, beispielsweise α-Amylase oder Glucoamylase, Enzyme, die in den meisten Organismen nach Kontakt mit Stärke induziert werden. Die DNA-Sequenzen können von einer der Gattungen Debariomyces, Saccharomyces, Lipomyces, Pichia oder Saccharomyces angehörenden Hefe abgeleitet sein, aber Hefen der Gattung Schwanniomyces sind bevorzugt.

Hefearten der Gattung Schwanniomyces haben einen effizienten Expressions- und Sekretionsapparat, was sie dazu befähigt, auf Stärke als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Stärke wird durch zwei amylolytische Enzyme, die in den Überstand ausgeschieden werden, zu Glukose hydrolysiert, nämlich α-Amylase (α-1,4-Glucan-4-glucanohydrolase, E.C.3.2.1.1) und Glucoamylase (Syn. Amyloglucosidase) (α-1,4-Glucanglucohydrolase, E.C.3.2.1.3; mit verzweigungsabbauender Aktivität E.C.3.2.1.9). Die amylolytischen Enzyme von Schwanniomyces occidentalis, früher auch Schwanniomyces castellii und Schwanniomyces alluvius genannt (Price et al., 1978), sind gut dokumentiert (Oteng-Gyang et al., 1981; Silis et al., 1982, 1984a, 1984b; Wilson et al., 1982).

Die Gene für α-Amylase und Glucoamylase aus einer Hefe der Gattung Schwanniomyces sind von den Erfindern in EP-A-0260404 offenbart worden. Jedoch sind zu diesem Zeitpunkt die DNA- oder Peptidsequenzen, die die Sekretion steuern, nicht identifiziert worden. Weiterhin ist ihre Verwendung zum Etablieren eines effizienten Expressions- und Sekretionssystemes in Hefe damals nicht bekannt gewesen.

Es ist bevorzugt, als eine erste DNA-Sequenz das gesamte 1,8 kb BglII-XhoI-Fragment oder einen Teil davon zu verwenden, das dem Strukturgen vorangeht, das für die Schwanniomyces-α- Amylase kodiert, oder das gesamte 1,3 kb BamHI-PvuII-Fragment oder einen Teil davon, das dem für Schwanniomyces occidentalis-Glucoamylase kodierenden Strukturgen vorangeht. Weiter, wenn nur kleinere Fragmente verwendet werden sollen, ist es bevorzugt, eine DNA-Sequenz zu verwenden, die einen Teil oder die gesamte DNA-Sequenz umfaßt, die den Basen -1 bis -540 des Bereiches entspricht, der dem für α-Amylase kodierenden Strukturgen vorangeht, oder einen Teil oder das Ganze der DNA-Sequenz, die den Basen -1 bis -320 des Bereiches entspricht, der dem für Glucoamylase kodierenden Strukturgen vorangeht. Die entsprechenden DNA-Fragmente sind als Promotoren voll aktiv, induzierbar durch Stärke, Dextrin und Maltose.

Es ist naheliegend, daß das Ersetzen von Basen oder Basenpaaren, die in die Transkriptionsregulation nicht involviert sind, noch im Bereich der vorliegenden Erfindung liegt. Natürliche Mutation oder synthetische Äquivalente sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfaßt.

In Hefezellen der Gattung Schwanniomyces ist es ebenfalls möglich, Promotoren zu verwenden, die von Hefegenen abgeleitet sind, die aus vielen anderen Hefegattungen erhalten sind. Bevorzugt sind Regulons, die in die Expression von ADH1, ADH2, PDC1, GAL 1/10, PGK und GAPDH involviert sind, oder LAC4, die aus Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis oder Schwanniomyces occidentalis erhalten wurden.

Weiterhin ist es mglich, virale Regulons und/oder Terminatoren zu verwenden, beispielsweise Regulons und Terminatoren, die aus den E.coli T-Phagen erhalten sind. Diese Phagen besitzen außergewöhnlich starke funktionelle Sequenzen zum Durchführen ihrer lytischen Funktionen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Sequenzen des Phagen T7 verwendet, die durch die Expression der T7 RNA-Polymerase reguliert werden.

Um den Gesamtexpressionsspiegel zu erhöhen und weiterhin, um die Reinigung der erzeugten Polypeptide zu erleichtern, ist es höchst wünschenswert, daß die Polypeptide in das Kulturmedium ausgeschieden werden. Die vorliegende Erfindung stellt Signalsequenzen zur Verfügung, die den unschätzbaren Vorteil haben, von Genen von amylolytischen und daher induzierbaren Enzymen abgeleitet zu sein, die nach der Induktion sehr effizient ausgeschieden werden müssen. Ein weiterer Vorteil ist, daß die Induktion von amylolytischen Enzymen keine komplizierten Medien erfordert, denen beispielsweise eine spezielle Aminosäure oder Phosphat fehlt, sondern nur erfordert, daß die Kultur auf ein stärkehaltiges Medium übertragen wird. Signalsequenzen, die für die Sekretion von großen Proteinen bevorzugt verwendet werden, umfassen einen Teil oder alles von mindestens einem der folgenden Peptide:

In einer weiteren Ausführungsform werden die obenerwähnten Peptide von DNA-sequenzen kodiert, die der Gesamtheit oder einem Teil der folgenden DNA-Sequenzen entsprechen:

Es ist verständlich, daß das Ersetzen von Aminosäuren durch Reste, die vergleichbare Eigenschaften haben, und die Verwendung von alternativen Codons in Übereinstimmung mit den durch die genetischen Code bereitgestellten Möglichkeiten keinen Einfluß auf die erfindungsgemäße Hefezelle haben.

Das Polypeptid, das in der erfindungsgemäßen Hefezelle exprimiert werden soll, wird von einer dritten DNA-Sequenz kodiert. Diese dritte DNA-Sequenz kann natürliche oder synthetische DNA umfassen, sogar DNA, die intervenierende Sequenzen enthält.

Beispiele für Proteine, die von der erfindungsgemäßen Hefezelle exprimiert werden, umfassen Proteine von enormer Bedeutung für wissenschaftliche oder medizinische Zwecke, beispielsweise Cellulase, Interleukin, Interferon, insulinähnlichen Wachstumsfaktor, Lymphokin, menschlichen Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, Aprotinin, Insulin, Hirudin, Hormone, Blutgerinnungsfaktoren, Hepatitis-B-Oberflächen- oder -Kernantigene, virale oder bakterielle Impfstoffe oder humanen Granulocyten/Makrophagen Kolonie-stimmulierenden Faktor.

Die erfindungsgemäße Hefezelle kann gegebenenfalls einen Terminator als Bestandteil der Expressionskassette umfassen. Bevorzugte Terminatoren sind von Genen einer der folgenden Gattungen abgeleitet:

Saccharomyces, Pichia, Hansenula, bevorzugt jedoch Schwanniomyces. Beispiele bevorzugter Terminatoren sind die von Schwanniomyces-α-Amylasegen oder Schwanniomyces- Glucoamylasegen abgeleiteten, die ganz oder teilweise verwendet werden können. Solche Terminatoren sind von den Nukleotiden 1537 bis 1740 des Schwanniomyces-α-Amylasegenes oder den Nukleotiden 2875 bis 3320 des Schwanniomyces- Glucoamylasegenes umfaßt.

Es ist naheliegend, daß im Fall jeder der erwähnten DNA-Sequenzen Modifikationen, die die biologische Funktion des entsprechenden DNA-Fragmentes nicht verschlechtern, von der vorliegenden Erfindung immer noch umfaßt sind. Es gibt unzählige Möglichkeiten, die obenerwähnten DNA-Sequenzen leicht zu verändern, ohne die biologische Funktion des Genfragmentes zu beeinträchtigten.

Die erfindungsgemäße Hefezelle, die eine Expressionskassette trägt, die aus den oben diskutierten Bestandteilen zusammengesetzt ist, kann von einem zirkulären oder linearen Vektor getragen werden, der gegebenenfalls ein oder mehrere selektive Markergene umfaßt. Die Erfinder haben gezeigt, daß eine Vielzahl von bisher für die Transformation von Saccharomyces verwendeten Markergenen, beispielsweise TRP5, LEU2, ADE1, ADE2, HIS3, HIS4, URA3, LYS2, die aus Saccharomyces, Hansenula, Pichia oder Schwanniomyces erhalten werden können, in Schwanniomyces occidentalis funktionieren. Weiterhin ist es ebenfalls mglich, die amylolytischen Eigenschaften von α-Amylase oder Glucoamylase zu verwenden, um die transformierten Organismen zu selektionieren. Die korrespondierenden Gene sind isoliert und charakterisiert worden. AMY1 und GAM1 werden bevorzugt aus Schwanniomyces erhalten.

Die erfindungsgemäße Hefezelle kann die Expressionskassette als ein Insert in einem der endogenen Hefechromosomen enthalten. Weiterhin besteht jedoch die Möglichkeit, daß eine DNA-Sequenz, die die autonome Replikation steuern kann und ebenso die stabile Beibehaltung des Vektors in dem Wirtsorganismus, in die Hefezelle eingeführt wird. Diese DNA-Sequenzen sind die sogenannten ARS-Sequenzen, die die autonome Replikation und die stabile Beibehaltung in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern können. Diese DNA-Sequenzen sind bevorzugt von Saccharomyces, Pichia, Hansenula oder Kluyveromyces abgeleitet, besonders bevorzugt von Schwanniomyces.

Um eine wirksame Replikation in dem vorgesehenen Wirtsorganismus sicherzustellen, ist es bevorzugt, eine ARS zu verwenden, die von dem entsprechenden Wirtsorganismus abgeleitet ist.

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue SwARS-Sequenz zur Verfügung. Die DNA-Sequenz SwARS2 kann die autonome Replikation und stabile Beibehaltung des Vektors in einer Schwanniomyces-Hefezelle steuern. Die genaue Sequenz von SwARS2 ist bis jetzt nicht bestimmt worden. SwARS2 ist im Schwanniomyces-Genom im 3'-Bereich des Glucoamylasegenes angeordnet, wie beispielsweise in Abb. 10 gezeigt. SwARS2 ist leicht zu identifizieren und erlaubt effizient die autonome Replikation jedes Plasmides, das diese Sequenz aufweist. Die bisher bekannten autonom replizierenden Schwanniomyces- Sequenzen, SwARS1 und SwARS2, sind auf einem ClaI-BamHI-Fragment (SwARS1) enthalten, das dem in Abb. 2a gezeigten EcoRI-Fragment benachbart ist (siehe Abb. 10) und/oder auf einem EcoRI-BglII-Fragment, das in dem in Abb. 2a gezeigten EcoRI-Fragment enthalten ist (SwARS2).

Im Fall der SwARS-Sequenzen ist es ebenfalls nicht notwendig, in jedem Fall die Sequenzen so zu verwenden, wie sie natürlich auftreten. DNA-Sequenzen, die durch irgendeine Art einer modifizierten Behandlung erhalten worden sind, beispielsweise mittels Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide oder Basenpaare, liegen immer noch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, vorausgesetzt, die Modifikationen behalten die biologische Funktion der erfindungsgemäßen Hefezelle bei oder verbessern sie.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße Hefezelle eine DNA-Sequenz, die einer genomischen Schanniomyces-DNA homolog ist. Das Bereitstellen von Strukturen homologer DNA befähigt das DNA-Fragment, das von solchen homologen Sequenzen flankiert ist, durch homologe Rekombination insertiert zu werden. Es ist daher bevorzugt, homologe Sequenzen zu haben, die kein essentielles Gen der genomischen Schwanniomyces-DNA darstellen, sondern eher irgendein Gen, dessen Expressionsprodukt durch Zusätze zum entsprechenden Medium supplementiert werden kann oder wo das Fehlen des entsprechenden Expressionsproduktes keine ernsthafte Auswirkung auf die zuvor erwähnte Hefezelle hat.

Wenn keine SwARS-Sequenz oder eine andere äquivalente Sequenz, beispielsweise eine aus anderen Hefearten stammende Sequenz, verfügbar ist, kann die Expressionskassette ohne ein autonom replizierendes Mittel verwendet werden. In diesem Fall neigt die Expressionskassette dazu, in das Genom zu integrieren, beispielsweise über homologe Rekombination. Bevorzugt werden mehrere Kopien in ein oder mehrere Chromosomen insertiert.

In diesem Fall ist es bevorzugt, multiple Kopien der Expressionskassette insertiert zu haben, um die gleichzeitige Transkription und Translation an mehreren Kopien sicherzustellen.

Wenn die erfindungsgemäße Hefezelle von einer Hefe der Gattung Schwanniomyces abgeleitet ist, weisen die nach der Expression des entsprechenden Fremdgenes in diesen Hefezellen beobachteten Polypeptidprodukte Glykosylierungsmuster auf, die denen des gewünschten eukaryontischen Proteines entweder sehr ähnlich sind oder mit diesen sogar identisch sind. Hefezellen der Gattung Schwanniomyces sind daher für die Expression eukaryontischer Proteine bevorzugt.

Die oben diskutierte, erfindungsgemäße Hefezelle kann in einem Verfahren für die Erzeugung eines Polypeptides verwendet werden, in dem ein Hefewirtsorganismus unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird und das Polypeptid auf an sich bekannte Weise gewonnen wird. Die Kultivierungsbedingungen hängen von dem jeweils verwendeten Wirtsorganismus ab. Beispiele für Kultivierungsbedingungen für Hefe der Gattung Schwanniomyces werden in den Beispielen unten gegeben. Das von der erfindungsgemäßen Hefe erzeugte Polypeptid wird durch übliche Reinigungsverfahren zurückgewonnen, die von den Eigenschaften des exprimierten Proteins abhängen, der Verfügbarkeit des spezifischen Absorptionsmittels usw.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hefezellen der Art Schwanniomyces occidentalis als ein Wirtsorganismus verwendet und auf Stärke, Dextrin, Maltose und/oder Pflanzenbiomasse als entsprechender Kohlenstoffquelle kultiviert. Wie allgemein bekannt ist, sind diese Kohlenstoffquellen zu einem geringen Preis verfügbar.

Weiter gibt es die Möglichkeit, Hefezellen der Gattung Schwanniomyces für die Erzeugung von Einzelzellprotein zu verwenden. Das Einzelzellprotein kann dann je nach Bedarf einer weiteren Verwendung unterworfen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in einem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Protein ein amyloytisches Enzym, beispielsweise eine α-Amylase oder Glucoamylase. Diese Enzyme werden kommerziell verwendet, um Verzweigungen in Stärke zu entfernen oder Stärke abzubauen, die daran anschließend weiter verarbeitet werden kann, beispielsweise in Brauerei- oder Backverfahren. Es gibt einen hohen Bedarf für die Bereitstellung von stärkeabbauenden Enzymen.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Erzeugung eines Polypeptides durch Bereitstellen von Expressionskassetten erreicht werden, wie oben diskutiert, die eine Hefe-α-Amylase- oder Glucoamylase-Signalsequenz enthalten, und Einbauen der entsprechenden Expressionskassette in eine Hefe eine der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia oder Schizosaccharomyces. Die Erzeugung und Sekretion von fremden Proteinen in den jeweiligen Wirtsorganismus wird durch Anwenden der geeigneten induktiven Maßnahme erhalten, woran anschließend das erzeugte Protein in Folge der Gegenwart einer Hefe-α-Amylase- oder Glucoamylase-Signalsequenz ausgeschieden wird. Da es aus Experimenten des Erfinders bekannt ist, daß diese Signalsequenzen in beinahe jeder Hefegattung erkannt werden, können die α-Amylase- oder Glucoamylase-Signalsequenzen in vielen verschiedenen Hefen erfolgreich angewendet werden. Auch in diesem Fall ist es bevorzugt, die α-Amylase- oder Glucoamylase-Signalsequenzen zu verwenden, die von den entsprechenden Genen von Schwanniomyces occidentalis abgeleitet sind.

Zusammengefaßt sind die erfindungsgemäßen Hefezellen für die Transformation und Expression jedes gewünschten Fremdgenes gut geeignet. Wie bereits oben ausgeführt ist, ist die Expression von prokaryontischen sowie von eukaryontischen Genen möglich. Für die Expression von eukaryontischen Proteinen sind Hefezellen der Gattung Schwanniomyces, die einige oder alle der obenerwähnten DNA-Sequenzen enthalten, die am stärksten bevorzugten Hefezellen.

Charakterisierung der α-Amylase- und Glucoamylase- Genexpreasion in verschiedenen Hefegattungen:

Die N-Termini der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des α-Amylasegenes (Abb. 1B) und des Glucoamylasegenes (Abb. 2B) weisen die Eigenschaften typischer "Leader"-Sequenzen von sekretorischen Proteinen auf (Von Heijne, 1983, Perlman und Halvorsson, 1983). Die N-terminalen Aminosäuren von reifer α-Amylase, die von S. occidentalis ausgeschieden wird, wurden mit AspValSer bestimmt. Dies weist auf eine Prozessierung zwischen Arg33 und Asp 31 hin, die ungewöhnlich ist und nicht im Einklang mit dem Modell einer Stellenspezifität für die Signalpeptidasespaltung von Von Heijne steht. Diese mutmaßliche Spaltstelle wurde ebenfalls für in S. cerevisiae, Pichia stipidis, K. lactis, S. pombe und H. polymorpha exprimierte α-Amylase bestätigt. Jedoch wurde in diesen Hefearten eine Prozessierung auch zwischen Ala25 und Gln26 gefunden, was zu der N-terminalen Sequenz GlnProIle führt.

Aus einer Kultur von S. occidentalis isolierte α-Amylase wandert als eine einzelne Bande von 55 kDa auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel: nach Endoglucosidase-H-Behandlung und anschließender Gelelektrophorese wird eine einzelne Bande von 54 kDa beobachtet, was darauf hinweist, daß nur eine von zwei möglichen N-Glykosylierungsstellen des Proteines für die Glykosylierung verwendet wird. Es ist bemerkenswert, daß eine Glykosylierung mit viel Mannose, wie sie sehr oft in von S. cerevisiae ausgeschiedenen Proteinen gefunden wird, eine Sekretion in S. occidentalis nicht begleitet.

Identifizierung der Transkriptionsinitiationsstellen und Promotorfunktion dem α-Amylase- und Glucoamylasegenes

Durch S1-Kartierung einer PolyA-mRNA (Sharp et al., 1980) konnte die Transkriptionsinitiationsstelle des α-Amylasegenes als im Bereich von -42 bis -30 liegend lokalisiert werden (angezeigt durch eine unterbrochene Linie über der entsprechenden Sequenz in Abb. 1B) und die Transkriptionsinitiationsstelle des Glucoamylasegenes wurde als im Bereich -7 bis -10 liegend bestimmt (unterstrichen in Abb. 2B).

Konstruktion eines α-Amylase-Glucoamylase-Hybridgenes

Um die Verwendung des α-Amylase-Promotors und Glucoamylase- Strukturgenes bei weiteren Konstruktionen zu erleichtern, wurden zusätzliche Restriktionsstellen vor den Translationsinitiationscodons beider Gene insertiert, wobei Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese nach der Beschreibung im AMERSHAM Protokoll verwendet wurde. Die korrekte Mutagenese wurde durch Sequenzierung gemäß Sanger (1977) bestätigt. Die Grenzen zwischen den ursprünglichen Schwanniomyces-Genen und dem insertierten Polylinker sind unten gezeigt:

α-Amylase:
Glucoamylase:

Die Manipulationen führten zu den Plasmiden M13αXho (Abb. 3) und pMaGAM-B/S (Abb. 4).

Daher können sowohl der α-Amylase-Promotor als auch das Glucoamylasestrukturgen aus dem Plasmid M13αXho und pMaGAM-B/S als geeignete DNA-Fragmente isoliert werden. Das GAM-Gen wurde aus pMaGam-B/S als ein 3,2 kb SalI-Fragment isoliert und in die XhoI-Stelle von M13αXho ligiert. Das BglII-Fragment, das die α-Amylase-Promotor/GAM-Genfusion beherbergt, wurde in die einzelne BamHI-Stelle des S. cerevisiae-Vektors YRp7 ligiert (Struhl et al., 1979), was zum Plasmid YRp7αGAM führte (Abb. 5). S. cerevisiae-Stamm YNN27 wurde mit diesem Plasmid transformiert, indem auf TRP-Prototrophie selektioniert wurde. Die Transformanten schieden aktive Glucoamylase in den Kulturüberstand (50 mU/ml) aus, was anzeigt, daß das α-Amylase- Promotorfragment die Expression und Sekretion von Fremdproteinen steuern kann.

Sekretion von α-Amylase und Glucoamylase in verschiedenen Hefen unter Verwendung geeigneter Promotoren

Die Expression des α-Amylase- und Glucoamylasegenes und die Sekretion der Genprodukte kann in K. lactis unter Kontrolle des Promotors des β-Galactosidase(LAC4)-Genes (Breunig et al., 1984) nachgewiesen werden. Die Expression des α-Amylase- und Glucoamylasegenes und die Sekretion der beiden Proteine kann auch in S. pombe unter Kontrolle des ADH1-Promotors (Russel et al., 1983) oder des GAL1/10-Promotors (Johnston and Davis, 1984) nachgewiesen werden.

Nach Fusion mit dem GAL1/10-Promotor (Johnston and Davis, 1984), DHAS-Promotor (Janowicz et al., 1985), MOX-Promotor (Ledeboer et al., 1985) oder FMDH-Promotor (EP 87 110 417.0) kann der Expression des α-Amylase- und Glucoamylasegenes und die Sekretion beider Proteine in Hansenula polymorpha nachgewiesen werden.

Expressions- und Sekretionsuntersuchungen in S. occidentalis unter Verwendung der Cellulase Endoglucanase D (EGD) aus Clostridium thermocellum als Modell für die Fremdgenexpression

Als erstes Beispiel für die Expression eines fremden Genes in S. occidentalis wurde das celD-Gen aus C. thermocellum (Millet et al., 1985, Joliff et al., 1986b), das für eine thermostabile Cellulase kodiert, nämlich Endoglucanase (EGD), verwendet. Die Vorteile der Benutzung dieses Systemes sind:

- spezifische Reaktion von EGD, die leicht beobachtet werden kann;

- ein schneller qualitativer Test auf Kolonien mit EGD-Aktivität (siehe Material und Methoden)

- Verfügbarkeit von Antikörpern gegen EGD für den spezifischen Nachweis von Translationsprodukten.

Charakterisierung des Glucoamylasepromotors nach Fusion mit der celD-Gen

Es wurden Plasmide konstruiert, die ein Replicon aus S. occidentalis (SwARS1) (EP 87110370.1), das TRP5-Gen aus S. cerevisiae (Zalkin und Yanowski, 1982) als einen selektiven Marker und zustzlich eine GAM/celD-Genfusion unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren enthielten. Im ersten Schritt wurde das 4,0 kb EcoRI-PvuII-Fragment aus Plasmid pBRSwARSGAM (Abb. 6a) isoliert und in das 2296 bp EcoRI-PvuII- Fragment des pBR322 insertiert, das das amp-Gen und den bakteriellen Replikationsursprung enthält, was zum Plasmid pBRPGAM führt (Abb. 6a). Zusätzlich zur pBR322-Sequenz trägt dieses Plasmid 3,6 kb aus dem 5'-nichtkodierenden Bereich des GAM-Genes und die ersten 208 bp, die für den N-terminalen Teil (einschließlich der Signalsequenz) der Glucoamylase kodieren. Ein 3,4 kb PvuII-Fragment aus dem Plasmid pCT603 (Joliff et al., 1986), das den kodierenden Bereich des celD-Genes enthält und dem im 5'-Bereich 111 bp fehlen, wurde in die einzelne PvuII-Stelle von pBRPGAM insertiert, was zu pBRGC1 führte (Abb. 6b). Mit diesem Plasmid transformierte E. coli zeigen eine schwache Carboxymethylcellulase (CMCase)-Aktivität, die mittels Kongorot-Färbung (siehe Material und Methoden) analysiert wurde, was darauf hinweist, daß der Glucoamylasepromotor in E. coli leicht exprimiert wird. Für die Konstruktion eines S. occidentalis-Expressionsvektors wurde das Plasmid pCJD5-1 (EP 87110370.1) mit BamHI/PstI gespalten und mit dem 5,5 kb BglII-PstI-Fragment oder einem 6,5 kb BamHI-PstI-Fragment aus pBRGC1 ligiert, was zu pMPGC1-1 (Abb. 6c) und pMPGC1-2 (Abb. 6d) führte. Beiden Plasmiden ist eine Fusion von GAM/celD im Leseraster gemeinsam, aber sie unterscheiden sich in der Länge des 5'-stromaufwärtsgelegenen Bereiches des GAM-Genes. S. occidentalis-Stamm NGA58 (trp5 ade), isoliert nach UV-Mutagenese des Stammes NGA23, wurde mit diesen Plasmiden transformiert und die Transformanten nach Tryptophanprototrophie ausgewählt und mittels eines Kongorot- Testes auf Cellulaseaktivität analysiert. Die Transformanten erzeugten aktives EGD, wenn sie unter induzierenden Bedingungen in 2% Maltose wachsen gelassen wurden (Abb. 7a). Unter reprimierten Bedingungen in 4% Glukose konnte bei einer Analyse mittels des Kongorot-Testes keine Aktivität nachgewiesen werden (Abb. 7b). NGA58:pMPGC1-1- und NGA58: pMPGC1-2-Transformanten scheiden aktives EDG in den Kulturüberstand aus, wenn sie in Maltose unter induzierten Bedingungen wachsen gelassen werden. Der intakte oder vollständige Glucoamylasepromotor liegt auf dem Plasmid pMPGC1-2, wie durch eine 20-fach höhere Aktivität im Vergleich mit dem kürzeren Promotorfragment bei der Genfusion von pMPGC1-1 (Tabelle 1) gezeigt wurde. Das 0,3 kb Promotorfragment beherbergt jedoch immer noch regulatorische Einheiten, die zur Katabolitrepression durch Glukose führen (Abb. 7b). Der Vergleich der N-terminalen GAM-Sequenz mit der Signalpeptidasespaltstelle verschiedener anderer sekretorischer Proteine (Von Heijne, 1983) zeigt drei mögliche Signalpeptidasespaltstellen nach den Aminosäureresten Ala 19, Ala 25 und Ala 34. Für die Bestimmung der N-terminalen Aminosäure der reifen Glucoamylase wurde das Protein zur N-terminalen Aminosäuresequenzierung isoliert. Der N-Terminus ist jedoch blockiert und konnte daher nicht sequenziert werden. Um die korrekte der Spaltstelle der GAM-Signalsequenz in S. occidentalis zu bestätigen, wurden die Bereiche zwischen den möglichen Signalpeptidasespaltstellen und der PvuII-Genfunsionsstelle in der GAM/celD-Fusion durch in vitro Mutagenese deletiert, um den Einfluß auf die Sekretion von aktivem EGD zu untersuchen.

Untersuchung der Verwendung von geeigneten S. cerevisiae-Promotoren bei der Expression von Fremdgenen in S. occidentalis

Der ADA1-Promotor (Hitzeman et al., 1981) wurde als ein 1,45 kb BamHI-SalI-Fragment aus dem Plasmid pFM2-1 (Müller et al., 1987) isoliert und in das Plasmid pCJD5-1 (EP 87110370.1) nach Spalten mit BamHI und SalI ligiert, was zu pMPADH1 führte (Abb. 8a). Das GAM-Gen wurde als ein SalI-Fragment aus pJDcg- 15 (siehe unten) ausgeschnitten und in die einzelne SalI- Stelle von pMPADH1 (Abb. 8b) insertiert, was zum Plasmid pMPAG (Abb. 8b) führte. Mittels in vivo-Rekombination (Ma et al., 1987) wurde der GAM-Promotor aus pMPGC1-2 (Abb. 6d) durch den ADH1-Promotor aus pMPAG besetzt, was zum Plasmid pMPAGC führte (Abb. 8c). Das Plasmid pMPGC1-2 wurde mit BamHI linearisiert; die einzelne BamHI-Stelle von pMPGC1-2 ist zwischen der für TRP5 kodierenden Sequenz und dem Glucoamylasepromotor angeordnet. Das 2,75 kb ClaI-Fragment aus pMPAG, das den ADH1-Promotor enthält, hat Homologien mit dem TRP5-Gen sowie mit dem für GAM kodierenden Bereich bis zur Position +208. Für die in vivo-Rekombination wurde NGA58 mit BamHI-linearisiertem pMPGC1-2 zusammen mit einem ungefähr 10-fachen Überschuß von ClaI-Fragment unter Verwendung des Transformationsprotokolls von Ito et al., 1983, transformiert.

Die Rekombinanten wurden auf ihre Fähigkeit durchmustert, CMC auf 4% Glukose zu hydrolysieren. Unter diesen Bedingungen ist die celD-Expression in Transformanten reprimiert, die rezirkularisiertes pMPGC1-2 beherbergen. Aus 146 Transformanten wurden 7 Kolonien isoliert, die Cellulase in Gegenwart von 4% Glukose exprimierten. NGA58, das das "in vivo" konstruierte Plasmid pMPAGC enthält, exprimiert konstitutiv aktives EGD (siehe Abb. 7). Dieses Ergebnis zeigt, daß das neu konstruierte Plasmid pMPADH1 als Vektor für die Fremdgenexpression dient.

In einem weiteren Experiment wurde ein rekombinantes Plasmid durch in vivo-Rekombination konstruiert, um die Expression der GAM/celD-Genfusion unter Kontrolle des PDC-Promotors (Das und Hollenberg, 1982) zu untersuchen. Daher wurde das 6,0 kb SphI- AvaI-Fragment aus Plasmid pJDcg-15 (EP 87110370.1), das das Glucoamylasegen an den PDC-Promotor fusioniert trägt, in die entsprechenden Restriktionsstellen von YRpJD2 (EP 87110370.1) subkloniert, was zum Plasmid pMPPG (Abb. 9a) führt.

Für die in vivo-Rekombination wurde pMPPG mit ClaI gespalten und zusammen mit BamHI-linearisiertem pMPGC1-2 für die Transformation von NGA58 verwendet. Homologe Rekombination führt zu Plasmid pMPPGC (Abb. 9b), das eine GAM-celD-Fusion unter Kontrolle des PDC-Promotors beherbergt. Diese Konstruktion führt zu einer Expression in Schwanniomyces occidentalis NGA58, die durch Glukose induzierbar und teilweise durch Maltose reprimierbar ist (Tabelle 1). Die Transformanten wurden auf Expression von aktivem EGD unter Verwendung des qualitativen Kongorot-Testes analysiert (Abb. 7). Die Ergebnisse zeigen, daß das 0,3 kb GAM-Promotorfragment zu einer regulierten Expression führt, jedoch weniger effizient als das 1,3 kb Fragment (zum Vergleich siehe Tabelle 1 und Abb. 2A). Expression unter der Kontrolle des ADH1-Promotors für zur effizienten konstitutiven Expression. Der Expressionsspiegel ist vergleichbar mit dem einer induzierten, vom 1,3 kb GAM-Promotor gesteuerten Expression.

Die Tatsache, daß Plasmide mittels in vivo-Rekombination konstruiert werden können, ist ein Beweis für die homologe Rekombination und eröffnet daher die Möglichkeit einer stabilen stellengerichteten Integration in das Genom von S. occidentalis als Voraussetzung für die industrielle Erzeugung von Fremdproteinen.

Die Expression des α-Amylasegenes und Glucoamylasegenes und die Sekretion beider Genprodukte in S. occidentalis könnte auch unter Kontrolle des Phosphoglyceratkinase(PGK)-Promotors (Dobson et al., 1982), des Glycerinaldehyd-3- Phosphatdehydrogenase(GAPDH)-Promotors (Holland und Holland, 1979), des Kupferchelatin(CUP1)-Promotors (Karin et al., 1984, Butt et al., 1984) und des Alkoholdehydrogenase 2(ADR2 oder ADH2)-Promotors (Russel et al., 1983, Beier et al., 1985) oder Galactokinase(GAL1/10)-Promotors (Johnston und Davis, 1984) erreicht werden.

Konstruktion von pJDcg-15:

Das GAM-Gen wurde als ein 3,2 kb BamHI-SalI-DNA-Fragment aus dem Plasmid pMaGAM B/S (Abb. 4) isoliert und in die entsprechenden Restriktionsstellen von Plasmid pBM272 (Johnston & Davis, 1984) insertiert. Der PDC-Promotor wurde aus dem Plasmid pCP202 (Kellermann & Hollenberg, 1988) als ein SalI- SphI-Fragment isoliert und in die entsprechenden, nur einmal vorhandenen Stellen des Vektors YRp7 (Struhl et al., 1979) ligiert. Um den PDC1-Promotor als BamHI-Fragment isolieren zu können, wurde das 3,2 kb SalI-Fragment von pMaGAM B/S, das das GAM-Gen enthält, mit dem PDC-Promotor über die einmal vorhandene Sall-Stelle fusioniert. Das resultierende BamHI-Fragment, das den PDC-Promotor enthält, wurde in die einzelne BamHI- Stelle von pBM272 ligiert, das das GAM-Gen enthielt. Das so entstandene Plasmid wird pJDcg-15 genannt (Abb. 8b).

Expression des humanen Granulocyten/Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktors (hGM-CSF)

Das für hGM-CSF kodierende Gen (Cantrell et al., 1985) wurde von British Biotechnology Ltd. als ein HindIII-EcoRI-Fragment erhalten. Die Position +52 des hGM-CSF-Genes wurde mit der Position +102 der GAM-Signalsequenz unter Kontrolle des ADH1- oder GAM-Promotors fusioniert. Diese Fusion führt zu einem Hybridprotein, in dem die Endopeptidasespaltstellen der GAM- Signalsequenz mit einem Met verbunden ist, das in dem synthetischen Gen enthalten ist, das vom British Biotechnology Ltd. angeboten wird, gefolgt von der ersten Aminosäure von reifem hGM-CSF (Ala 18). Diese Fusion wurde in einen S. occidentalis- Expressionsvektor insertiert und in NGA58 transformiert. Die Westernblotanalyse zeigte die Sekretion von hGM-CSF-Protein.

Expression von Interleukin-2

Das für IL-2 kodierende Gen (Taniguchi et al., 1983) wurde von British Biotechnology Ltd. als ein EcoRI-HindIII-Fragment erhalten. Position +61 des IL-2-Genes wurde mit Position +102 der GAM-Signalsequenz unter Kontrolle des ADH1- oder GAM-Promotors fusioniert. Diese Fusion führt zu einem Hybridprotein, in dem die Endopeptidasespaltstelle der GAM-Signalsequenz mit einem Met verbunden ist, das in dem von British Biotechnology Ltd. angebotenen synthetischen Gen enthalten ist, gefolgt von der ersten Aminosäure des reifen IL-2 (Ala 21). Diese Fusion wurde in einen S. occidentalis-Expressionsvektor insertiert und in NGA58 transformiert. Die Westernblotanalyse zeigte die Sekretion von IL-2-Protein.

Isolierung eines zusätzlichen SwARS-Elementes und eines neuen selektierbaren Markers

Eine neue, stromabwärts vom kodierenden Bereich des GAM-Gens angeordnete SwARS-Sequenz (SwARS2) konnte identifiziert werden. Um die Funktion von SwARS2 zu analysieren, wurde ein Vektor konstruiert, der das Trp5-Gen und SwARS2 in pBR322 enthält, was zu pMPTS2-A und PMPTS2-B führt (Abb. 10). Für die Konstruktion von pMPTS2-A und pMPTS2-B wurde das 5,5 kb BamHI- BglII-Fragment von pBRSwARSGAM, konstruiert durch Insertion des in Abb. 2a gezeigten EcoRI-Fragmentes in die einzelne EcoRI-Stelle des Plasmides pBRSwARS1 (offenbart in EP 87110370.1), isoliert und mit den 3,2 kb BamHI TRP5-Fragment ligiert, das aus YRpJD2 erhalten worden war. Unter Verwendung dieses Plasmides wird eine Transformation von S. occidentalis mit hoher Frequenz erhalten.

Als ein weiterer selektierbarer Marker wurde das LEU2-Gen von S. occidentalis isoliert. Das LEU2-Gen, das für die Isopropylmalatdehydrogenase kodiert, wurde durch funktionelle Komplementation der Mutante AH22 (his4leu2) (Hinnen et al., 1978) von S. cerevisiae durch Transformation mit einer genomischen Cosmidbank von S. occidentalis kloniert.

Es wurde festgestellt, daß das LEU2-Gen auf einem 9 kb EcoRI-Fragment der genomischen Schwanniomyces-DNA lag; seine Funktion konnte durch Insertion des TRP5-Genes des S. cerevisiae beseitigt werden. Das unterbrochene LEU2-Gen wurde durch homologe Rekombination in das Genom von NGA58 integriert, was zu dem neuen Stamm NGA581 (TRP5, LEU2 und ADE) führte. Ein analoges Experiment mit dem klonierten HI54-Gen von S. occidentalis (EP 87110370.1) führte zu einem Stamm NGA58h (TRP5, HIS4, ADE).

Verbesserte Expression von heterologen Genen unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase und des T7-Promotors und -Terminators für die Expression von Fremdgenen in S. occidentalis

T7-RNA-Polymerase (Fürst et al., 1986) kann in S. occidentalis nach Fusion des Strukturgenes (Dunn und Studier, 1984) unter Verwendung der BamHI-Restriktionsstelle nahe dem Translationsinitiationscodon mit geeigneten Promotoren, wie beispielsweise α-Amylase, GAM (0,3 kb Fragment) oder PDC und homologer Integration in das Genom über irgendein homologes kloniertes Gen, z.B. HIS4, LEU2, AMY1 und GAM, exprimiert werden. Ein geeignetes Fragment, das die von homologen klonierten Sequenzen flankierte Fusion enthält, kann isoliert und zusammen mit pCJD5-1 (Abb. 6c) für die Co-Transformation von NGA58 verwendet werden, indem auf YNB, enthaltend 0,5% Casaminoacids, selektiert wird. Kolonien, die das integrierte T7-RNA-Polymerasegen enthalten, können mittels Southern-Analyse nach der Isolierung von Transformanten, die im Zielgen mutiert sind, identifiziert werden.

Für die Expression von Fremdgenen wurde ein S. occidentalis- Expressionsvektor konstruiert, der SwARS2, den ColE-Replikationsursprung aus E. coli, einen geeigneten selektiven Marker für S. occidentalis (z.B. TRP5, HIS4, LEU2) und eine Kassette, enthaltend den T7-Polymerasepromotor und Terminatorsequenzen, die aus dem Plasmid pAR2529 (Fürst et al., 1986) isoliert worden waren, getrennt durch die Polylinkersequenz von M13mp19, enthielt. Um die Wirksamkeit des T7-Systemes zu untersuchen, wurde eine GAM/celD-Fusion (GAM-Signalsequenz und celD-Strukturgen, als ein BamHI-Asp718-Fragment aus pMPGC1-2 erhalten) unter Kontrolle des T7-Promotors durch Insertion in die BamHI- Asp718-Stelle der Polylinkersequenz exprimiert. Unter Verwendung dieses Systemes wird aktive Cellulase in das Kulturmedium ausgeschieden.

Material und Methoden

1. Die verwendeten Mikroorganismen sind die folgenden:

Schwanniomyces occidentalis NGA23 : (DSM 3792)

Schwanniomyces occidentalis NGA58

Kluyveromyces lactis SD11 : (DSM 3795)

Schizosaccharomyces pombe Leu1-32, HIS5-303 (DSM 3796)

Saccaromyces cerevisiae YNN27 (URA3-52, TRP1-298, GAL2)

Der verwendete Escherichia coli-Stamm ist der folgende:

E. coli HB101 F-. hsd S20 (rB- mB -), recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Smr), xyl-5, mtl-1, supE44)

2. Kulturmedien:

Schwanniomyces occidentalis-Stamm NGA58 (isoliert mittels UV-Mutagenese von Stamm NGA23) wurde bei 30ºC in YNB (0,67% Hefe-Stickstoffgrundlage ohne Aminosäuren) wachsengelassen, supplementiert mit entsprechenden Aminosäuren und mit 2% löslicher Stärke, wo angegeben.

S. cerevisiae-Stamm YNN27 (URA3-52, TRP1-289, GAL2) (Stinchomb et al., 1980); K. lactis-Stamm SD11 TRP1 (Das und Hollenberg, 1982); S. pombe-Stämme LEU1-32, HIS5-303 (erhalten von W.D. Heyer): Diese Stämme wurden unter den oben für Schwanniomyces occidentalis beschriebenen Bedingungen wachsen gelassen, wobei 2% lösliche Stärke durch 2% Glukose ersetzt wurden, wo angegeben.

Die Kulturmedien für S. occidentalis und Hansenula polymorpha wurden mit 0,2 M NaPO&sub4; Puffer pH 6,2 gepuffert; diejenigen für S. cerevisiae und K. lactis wurden mit 0,1 M Citratpuffer pH 6 und die für S. pombe mit 0,05 M Acetatpuffer pH 6 gepuffert.

Das pH-Optimum für die Cellulase (Joliff et al., 1986a), α-Amylase und Glucoamylase (Wilson und Ingledew, 1982) ist ungefähr pH 6.

E. coli HB101 (Bolivar et al., 1977) wurde in LB-Medium (Maniatis et al., 1982) mit Penicillin G (150 µg/ml) wachsengelassen.

3. Verschiedene Methoden

Plasmid-DNA wurde entweder mittels CsCl-Gradienten-Zentrifugation (Maniatis et al., 1982) oder durch eine alkalische Schnellextraktion von Plasmid-DNA, beschrieben von Birnboim und Doly (1979), isoliert.

Heferohextrakte wurden mittels des Verfahrens von Schatz (1979) hergestellt. Hefeminilysate wurden nach dem Verfahren von Sherman et al. (1983), hergestellt.

DNA-Fragmente wurden aus niedrigschmelzender Agarose mit dem von Gafner et al. (1983) beschriebenen Verfahren isoliert. Die Southern-Hybridisierung wurde durchgeführt, wie von Southern (1975) beschrieben.

Hefetransformationen wurden nach Klebe et al. (1983) oder Ito et al. (1983) durchgeführt. Die Transformanten oder Integranten wurden auf Expression und Sekretion der Cellulase unter Verwendung entweder des qualitativen Kongorot-Ttests (Teather and Wood, 1982: Hofbildung auf Carboxymethylcellulose-Agarplatten) oder einem quantitativen Cellulasetest gemäß Joliff et al. (1986a) getestet. Eine Einheit (E) ist als die Menge Enzym definiert, die 1 µMol para-Nitrophenol pro min bei 60ºC freisetzt. Die Western-Analyse wurde durchgeführt, wie von Towbin et al. (1979) beschrieben.

Die Transformanten oder Integranten wurden auf Expression und Sekretion von α-Amylase unter Verwendung entweder eines standardisierten α-Amylase-Enzymtests von Merck, Westdeutschland, oder eines qualitativen Stärkeabbautests (Hofbildung auf Stärke-Agarplatten nach Färben mit Jod) wie folgt getestet: in diesen Test wird die Rate der Bildung von 2-Chlor-5-nitrophenol photometrisch bei 405 nm in 0,1 M Kaliumphosphat bei 37ºC bestimmt. Die Enzymeinheit (E) ist als die Menge Enzym definiert, die die Bildung von 1 µMol 2-Chlor-4-nitrophenol pro min bei 37ºC katalysiert.

Die Glucoamylaseaktivität wurde mittels eines Stopptestverfahrens bestimmt: Nach Inkubation der Probe in 10% löslicher Stärke in 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;-NaOH (pH 5,0) bei 50ºC wurde die Menge erzeugter Glukose mittels des Glukosedehydrogenaseverfahrens (System Glukose Merck) bestimmt. Die Menge des gebildeten NADH ist proportional zur Glukosekonzentration. Die Enzymeinheit (E) ist als die Menge Enzym definiert, die die Bildung von 1 µMol Glukose/min bei 50ºC katalysiert.

Tabelle 1

Die Transformanten wurden in YNB, 0,5% Casaminoacids, 2% Maltose, 20 mg/l Adenin und 0,2 M NaP Puffer pH 6,2 wachsen gelassen.

*: Werte für Transformanten, die in 4% Glukose wuchsen

Literaturliste

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Anspruch[de]

1. Hefezelle der Gattung Schwanniomyces, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezelle mindestens eine Expressionskassette enthält, umfassend:

a) eine erste DNA-Sequenz, die als Regulon dient,

b) gegebenenfalls eine zweite DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert,

c) eine dritte DNA-Sequenz, die für ein Fremdprotein kodiert, und

d) gegebenenfalls eine vierte DNA-Sequenz, die als ein Terminator dient,

wobei die erste, zweite und vierte DNA-Sequenz von Hefe abgeleitet sind.

2. Hefezelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und/oder zweite und/oder vierte DNA-Sequenz von einem für ein amylolytisches Enzym kodierenden Gen abgeleitet sind.

3. Hefezelle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das amylolytische Enzym eine α-Amylase oder Glucoamylase ist.

4. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und/oder zweiten und/oder vierten DNA- Sequenzen von einer Hefe eines Angehörigen der Gattungen Debariomyces, Saccharomycopses, Lipomyces, Pichia oder Saccharomyces, bevorzugt Schwanniomyces, abgeleitet sind.

5. Hefezelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe Schwanniamyces occidentalis ist.

6. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die erste DNA-Sequenz von einem 1,8 kb BglII- XhoI-Fragment umfaßt ist, wenn sie vom Schwanniomyces occidentalis-α-Amylasegen abgeleitet ist, oder von einem 1,3 kb Bam-HI-PvuII-Fragment, wenn sie van einem Schwanniomyces occidentalis-Glucoamylasegen abgeleitet ist.

7. Hefezelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die erste DNA-Sequenz van einem Teil oder der gesamten DNA-Sequenz umfaßt ist, die den Basen -1 bis -540 des Bereiches entspricht, der dem für α-Amylase kodierenden Strukturgen vorangeht, oder einem Teil oder der Gesamtheit der DNA-Sequenz, die den Basen -1 bis -320 des Bereiches entspricht, der dem für Glucoamylase kodierenden Strukturgen vorangeht.

8. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die erste DNA-Sequenz einem der Regulons entspricht, die die Expression regulieren von

a) ADH1, ADH2, PDC1, GAL1/10, PGK, GAPDH, wobei das Regulon bevorzugt von Saccharomyces cerevisiae erhalten ist,

b) LAC4, wobei das Regulon bevorzugt von Kluyveromyces lactis erhalten ist, oder

c) entsprechenden Regulons, bevorzugt aus Schwanniomyces erhalten.

9. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite DNA-Sequenz für die Gesamtheit oder einen Teil mindestens eines der folgenden Peptide kodiert:

10. Hefezelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptid kodierende DNA-Sequenz einem Teil oder der Gesamtheit einer der folgenden DNA-Sequenzen entspricht:

11. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte DNA-Sequenz, die für ein Fremdprotein kodiert, eine natürliche oder synthetische DNA-Sequenz ist, die für eine Zellulase, Interleukin, insulinähnlichen Wachstumsfaktor, Interferon, Lymphokin, menschlichen Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, Aprotinin, Insulin, Hirudin, Hormone, Blutgerinnungsfaktoren, Hepatitis-B-Oberflächen- oder -Kernantigene, virale oder bakterielle Impfstoffe oder humanen Granulocyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor kodiert.

12. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die vierte DNA-Sequenz von einer Hefe eines Angehörigen der Gattungen Saccharamyces, Pichia, Hansenula, bevorzugt Schwanniomyces, stammt.

13. Hefezelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die vierte DNA-Sequenz einem Teil oder der Gesamtheit des Terminators entspricht, der von den Nukleotiden 1537 bis 1740 des Schwanniomyces-α-Amylasegenes umfaßt ist, oder einem Teil oder der Gesamtheit des Terminators, der von den Nukleotiden 2875 bis 3320 des Schwanniomyces-Glucoamylasegenes umfaßt ist.

14. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und/oder zweite und/oder dritte und/oder vierte DNA-Sequenz durch Insertion oder Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide modifiziert worden ist, während die biologische Aktivität der DNA-Sequenz beibehalten oder verbessert wird.

15. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette von einem zirkulären oder linearen Vektor getragen wird, der gegebenenfalls ein oder mehrere selektive Markergene umfaßt.

16. Hefezelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor eines der folgenden selektiven Markergene umfaßt:

TRP5, LEU2, ADE1, ADE2, HIS3, HIS4, URA3, LYS2, bevorzugt erhalten von Saccharomyces, Hansenula, Pichia oder Schwanniomyces, AMY1 oder GAM1, bevorzugt erhalten von Schwanniomyces.

17. Hefezelle nach einem der Ansprüche 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor weiter eine DNA-Sequenz umfaßt, die die autonome Replikation und stabile Beibehaltung des Vektors in dem Wirtsorganismus steuern kann.

18. Hefezelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz von dem Genom eines Angehörigen der Gattungen Saccharomyces, Pichia, Hansenula oder Kluyveromyces abgeleitet ist, bevorzugt Schwanniomyces.

19. Hefezelle nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz aus den autonom replizierenden Sequenzen ARS, bevorzugt einer ARS, die von dem jeweiligen Wirtsorganismus abgeleitet ist, ausgewählt ist.

20. Hefezelle nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz SwARS1 oder SwARS2 ist, die die autonome Replikation und stabile Beibehaltung des Vektors in Schwanniomyces steuern können, wobei SwARS1 von einem ClaI-BamHI-Fragment umfaßt ist, das dem in Figur 2a gezeigten EcoRI-Fragment benachbart ist, und SwARS2 von einem EcoRI-BglII-Fragment umfaßt ist, das in dem in Figur 2a gezeigten EcoRI-Fragment enthalten ist.

21. Hefezelle nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide modifiziert worden ist, während ihre biologische Funktion beibehalten oder verbessert ist.

22. Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette in das Genom integriert wird, gegebenenfalls in mehreren Kopien, bevorzugt über homologe Rekombination.

23. Verfahren zum Erzeugen von Polypeptid, wobei ein Hefewirtsorganismus unter geeigneten Bedingungen kultiviert und das Polypeptid in an sich bekannter Weise gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Hefeorganismus eine Hefezelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Hefezellen der Art Schwanniomyces occidentalis als ein Wirtsorganismus verwendet werden und bevorzugt auf Stärke, Dextrin, Maltose und/oder Pflanzenbiomasse kultiviert werden.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß Hefezellen der Gattung Schwanniomyces für die Erzeugung von Einzelzellprotein verwendet werden.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Amylase oder Glycoamylase ist.

27. Verwendung einer Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Transformation und Expression von Fremdgenen.







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