PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69123252T2 13.03.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0542895
Titel KREUZREAKTIVE IMMUNISIERUNG GEGEN INFLUENZA
Anmelder University of Massachusetts Medical Center, Worcester, Mass., US
Erfinder ENNIS, Francis, A., Shrewsbury, MA 01545, US
Vertreter Müller, Schupfner & Gauger, 21244 Buchholz
DE-Aktenzeichen 69123252
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 07.08.1991
EP-Aktenzeichen 919157982
WO-Anmeldetag 07.08.1991
PCT-Aktenzeichen US9105623
WO-Veröffentlichungsnummer 9202250
WO-Veröffentlichungsdatum 20.02.1992
EP-Offenlegungsdatum 26.05.1993
EP date of grant 20.11.1996
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.03.1997
IPC-Hauptklasse A61K 39/145

Beschreibung[de]
Grundlagen der Erfindung

Das Influenza A Virus ist ein großes RNS enthaltendes tierisches Virus. Das Protein-Capsid des Virus wird ferner in einer auf einer Lipiddoppeischicht basierenden Hülle, die virale Glycoproteine als herausstehende Spikes besitzt, umschlossen. Drei Influenza A Serotypen (H1, H2 und H3) sind identifiziert worden; die Klassifizierung basiert auf Unterschieden in den viralen Glycoproteinen.

In EP-A-O 366 238 und EP-A-O 176 493 werden Fusionsproteine offengelegt, die für das Auslösen einer schützenden Immunantwort gegen ein Epitop der HA2 Untereinheit des Hämagglutinin- Proteins zweckdienlich sind. Ein Fragment der immunogenen Determinante der HA2 Untereinheit wird als ein Teil des Fusionsproteins verwendet. Der andere Teil des Fusionsproteins kann NS1 oder ein Fragment von NS1 sein.

Kingsman, Genetic Engineering 1988, Blackwell Scientific Publications, Kapitel 12, Seiten 417 bis 426 zeigte, daß rekombinante Vaccinia Viren bekannte Vektoren für den Transport rekombinanter Proteine sind, von denen bekannt ist, daß sie immunogen sind.

Nach einer Influenza A Virus Infektion produziert der Körper Antikörper gegen die variablen Regionen der Oberflächen-Glycoproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Diese Antwort führt zur Produktion Virus spezifischer Antikörper, die die erste Abwehr des Immunsystems darstellen. Diese Antikörper liefern den immunologischen Druck, der zu einer Antigendrift innerhalb der viralen Subtypen und auch zu Antigenshifts zwischen den viralen Subtypen führt. Diese relativ hohe Mutageneserate kann Impfstoffe unwirksam machen, weil die Antigen-Determinanten der mutierten viralen Proteine sich signifikant von dem Protein, das als Immunogen verwendet wird, unterscheiden können, was dazu führt, daß der Körper die Infektion nicht mehr wirksam bekämpfen kann.

Zwei Hauptkomponenten des Immunsystems sind die B- Zellen und T-Zellen, wobei beide Lymphocyten sind. Die Lymphocyten-Linie divergiert während des Prälymphocyten- Stadiums in distinkte Sublinien. B-Zellen produzieren und sezernieren Antikörper-Moleküle; ein allgemein als humorale Antwort bezeichneter Prozeß. Die T-Zellen sind für eine Reihe zellulärer Antworten, die allgemein als Zellvermittelte Immunantworten bezeichnet werden, verantwortlich.

B-Zellen entwickeln eine Antigen-Spezifität sogar bei Fehlen einer Antigen-Stimulierung. Es ist beispielsweise geschätzt worden, daß das Präimmunrepertoir einer Maus mehrere Millionen unterschiedlicher Antikörper- Moleküle umfaßt. Dieses Präimmunrepertoir ist offensichtlich groß genug, um eine B-Zell-Spezif ität für nahezu jede potentielle Antigen-Determinante zu sichern.

Zur Zeit liefern Impfstoffe aus inaktivierten vollständigen oder Untereinheiten von Influenzaviren eine B- Zell-vermittelte (humorale) Immunität, weil sie Antikörper induzieren, die gegen die Antigen-Determinanten der Oberflächen-Glycoproteine des Virus gerichtet sind. Die erste Präsentation eines Influenza-Antigens einer für dieses Antigen spezifischen B-Zelle (z. B. zum Zeitpunkt der Immunisierung), führt zur Reifung der B-Zelle zu einer Plasmazelle, die für eine Antikörperproduktion hoch spezialisiert ist. Ein zweites Zusammentreffen mit dem gleichen Antigen führt zu einer schnellen und gesteigerten Sekundärantwort. Das Fremdantigen wird von dem spezifischen Antikörper gebunden, und anschließend wird das gebundene Antigen aus dem Blutstrom entfernt.

Im Fall von Influenza A sorgt jedoch die Produktion von Virus neutralisierenden Antikörpern für einen immunologischen Druck, der zu einer Antigendrift innerhalb der viralen Subtypen und auch zu Antigenshifts zwischen viralen Subtypen führt. Impfstoffe, die gegen antigene Bereiche gerichtet sind, lösen keine weitreichende kreuzreaktive (daß heißt, Schutz gegen sämtliche Influenza A Virus Subtypen) B-Zellantwort aus. Ferner können die Mutationen, die sich aus diesem immunologischen Druck ergeben, heutige Impfstoffe unwirksam machen.

T-Zellen umfassen eine Klasse von Zellen, die, obwohl sie keine zirkulierenden Antikörper produzieren, eine zentrale Rolle im Immunsystem spielen. Die T-Zellklasse umfaßt T-Helferzellen, cytotoxische T-Zellen und T-Suppressorzellen. Die T-Helferzellen haben zum Teil die Aufgabe, die Antwort anderer Lymphocyten zu verstärken. Beispielsweise stimulieren, zusätzlich zur Stimulierung der B-Zell-Aktivierung, die T-Helferzellen aktivierte T- Lymphocyten durch Sekretion von Interleukinen und anderen löslichen Faktoren. Die cytotoxischen T-Zellen (auch als T-Killerzellen bezeichnet) andererseits zerstören mit einem bestimmten Antigen (z. B. von einem Virus infizierte Zellen) markierte Zellen.

T-Zellen werden durch Erkennen eines T-Zellepitops in Verbindung mit einem Klasse I oder Klasse II Haupthistokompatibilitäts (MHC) Antigen auf der Oberfläche einer Antigen präsentierenden Zelle stimuliert. Makrophagen gehören zu der Klasse der Antigen präsentierenden Zellen. Makrophagen sind Phagocyten, die fremde Partikel im Körper aufnehmen. Diese Zellen sind in der Lage, selbst große Mikroorganismen, wie beispielsweise Protozoen, aufzunehmen. Nach der Aufnahme verdaut die Antigen präsentierende Zelle den Fremdpartikel und Fragmente des Fremdpartikels werden auf der Zelloberfläche präsentiert.

T-Zellepitope unterscheiden sich wesentlich von B- Zellepitopen. B-Zellepitope sind Antigen-Determinanten, die in dem nativen Antigen-Molekül gefunden werden und von dem denaturierten Antigen oder Antigen-Fragmenten nicht repräsentiert werden. Andererseits werden T-Zellepitope auf nicht gefalteten Molekülen oder deren Fragmenten gefunden. Des weiteren umfassen die T-Zellepitope T-Helferzellepitope und cytotoxische T-Zellepitope. Es wird vermutet, daß diese Epitope distinkte, wenn auch möglicherweise überlappend, Teile des Antigen-Moleküls aufweisen.

Die Influenza A Virusinfektion verursacht heute immer noch tödliche Epidemien und sehr hohe Erkrankungsraten in der ganzen Welt, obwohl der ethiologische Auslöser bekannt ist. Große Anstrengungen sind für die Entwicklung eines Impfstoffs unternommen worden. Es besteht ein Bedarf an einer wirksamen Influenza A Impfstrategie, die eine Subtyp Kreuzimmunität gegen virale Influenza- Infektionen liefern könnte.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Feststellung des Anmelders, daß T-Zellepitope des Influenza NS1 Proteins in der Lage sind, eine Influenzavirus Schutzantwort in einem Individuum zu stimulieren, die Subtyp kreuzprotektiv ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung von Influenza A Virus NS1 Protein geliefert (oder Homologe/Fragmente davon, in denen ohne wesentliche Abschwächung ihrer immunologischen Eigenschaften Aminosäuren deletiert, inseriert oder substituiert worden sind) oder eines dafür codierenden rekombinanten Virus für die Herstellung eines Medikaments zum Einsatz in einer Immuntherapie, wobei diese Immuntherapie die Schritte umfaßt;

(a) Verabreichung einer wirksamen Menge des NS1 Proteins oder eines dafür codierenden rekombinanten Virus an ein Individuum, wodurch

(b) eine NS1 spezifische T-Zellantwort stimuliert wird, die

(c) schützende Kreuzimmunität gegen Influenza A Virus Subtypen besagtem Individuum verschafft.

Die Erfindung kann bei einem Verfahren verwendet werden, das die Verabreichung einer wirksamen Menge an Influenza A Virus NS1 Protein in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger umfaßt, dadurch eine T- Zellantwort gegen ein NS1 Epitop in dem Individuum stimuliert, was zu einer Influenza A Virus Schutzantwort führt, die Subtyp kreuzprotektiv ist. Ein Homolog des NS1 Proteins, in dem ohne wesentliche Abschwächung seiner immunologischen Eigenschaften Aminosäuren deletiert, inseriert oder substituiert worden sind, ist ebenfalls für diesen Zweck verwendbar.

Ebenfalls wird ein Verfahren zur Immunisierung eines Individuums gegen eine Infektion mit Influenza A Virus Subtypen offengelegt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines rekombinanten Virus, das das Influenza A Virus NS1 Protein exprimiert, umfaßt. Diese Verfahren sind auf die Verabreichung eines rekombinanten Virus beschränkt, der das NS1 Protein oder ein T-Zellepitop davon exprimiert und dabei eine T-Zellantwort gegen ein T-Zellepitop stimuliert, was zu einer Influenza A Virus Schutzantwort, die Subtyp kreuzprotektiv ist, führt.

Die hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen liefern ein breites kreuzreaktives Impf schema, das gegen die Subtypen H1, H2 und H3 des Influenza A Virus schützt.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Wie schon zuvor erörtert, umfaßt das Influenza A Virus drei Subtypen, H1, H2 und H3. Die Erfindung des Anmelders bezieht sich auf Verfahren zur Immunisierung eines Individuums, vorzugsweise eines Menschen, gegen Infektionen durch jeden dieser Subtypen. Obwohl die hier beschriebenen Verfahren für die Immunisierung von Menschen besonders zweckdienlich sind, sind die Verfahren ebenfalls bei anderen Säugern anwendbar. Die Bezeichnung "kreuzprotektiv" wird in dieser Anmeldung verwendet, um eine Immunität gegen die Subtypen H1, H2 und H3 zu beschreiben.

Das Gen, das das Influenza A NS1 Protein codiert, ist isoliert, kloniert und in einem rekombinanten Vaccinia-System exprimiert worden (siehe z. B., Bennink et al., J. Virol. 61:1098-1102 (1987)). Mit Hilfe von biochemischen Standardtechniken (z. B. Säulenchromatographie) kann das NS1 Protein, das ein bekanntes Molekulargewicht besitzt, aus den Zellen, in denen es exprimiert wird, isoliert werden. Wenn es zur Erzielung der gewünschten Reinheit notwendig ist, kann ein Hybridom, das für NS1 spezifische monoklonale Antikörper produziert, hergestellt werden. Mit diesem Hybridom produzierte monoklonale Antikörper können dann in einem Affinitätschromatographie - Reinigungs system verwendet werden.

In WO-A-88/01875 wird NS1 zur Stimulierung einer immunmodulierenden Antwort verwendet. Hier wird die Verstärkung cytotoxischer Aktivitäten durch in vitro Induktion der Leukocyten-Interferonproduktion gezeigt. Die Induktion von Leukocyten-Interferon ist für eine prophylaktische Behandlung von malignen Neoplasmen und Organ-Metastasen, bestimmten bakteriellen, viralen und mykotischen Infektionen und zur Krebsbehandlung zweckdienlich.

Homologe des NS1 Proteins, in denen Aminosäuren ohne wesentliche Abschwächung ihrer immunologischen Eigenschaften deletiert, inseriert oder substituiert worden sind, können auf verschiedene Arten gebildet werden. Zum Beispiel können in vitro Mutagenesetechniken angewendet werden, um das das NS1 Protein codierende klonierte Gen zu modifizieren. Derartige Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um Nudeotide in dem Gen zu deletieren, zu inserieren oder zu substituieren, was zu einer Deletion, Insertion oder Substitution von Aminosäuren in dem codierten Produkt führt.

Die immunologischen Eigenschaften des mutagenisierten codierten Produkts können mit Hilfe von Verfahren, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben sind, untersucht werden.

Wirksame Dosierungen für die Stimulation einer Influenza A Virus Schutzantwort wurden mit anfänglichen Dosisbereichen, die auf älteren Daten für Peptidiprotein- Impfstoffzusammensetzungen beruhen, empirisch bestimmt. Die Bezeichnung Virus-Schutz, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Immunantwort in einem Individuum, was zu einer erfolgreichen Kontrolle oder Begrenzung einer Infektion durch Influenza A Virus Subtypen, die klinisch beobachtet wurden, führt.

Zum Beispiel können den Individuen NS1 Protein- Dosen verabreicht werden, die im Bereich von 0,5-500 Mikrogramm liegen. Ob eine spezielle Dosierung wirksam ist, kann mit Hilfe von allgemein bekannten T-Zellproliferations- und Cytotoxizitätstests bestimmt werden. Zum Beispiel wird unmittelbar nach der Verabreichung des Proteins an ein Individuum diesem Blut entnommen. Cytotoxische T-Zellen sind mit Hilfe von &sup5;¹Cr Freisetzungstests identifizierbar (siehe z. B. Kuwano et al., J. Virol. 140:1264-1268 (1988)). T-Helferzellen sind mittels T-Zellproliferationsstandardtests identifizierbar. (siehe z. B. Kurane et al., J. Clin. Invest. 83:506-513 (1989)). Die Ergebnisse aus diesen Untersuchungen werden mit Ergebnissen aus den gleichen Experimenten, die mit T-Zellen aus dem selben Individuum vor Verabreichung des Antigens durchgeführt wurden, verglichen. Durch Vergleich dieser Daten kann der wirksame Dosisbereich bestimmt werden.

Eine große Vielzahl an pharmazeutisch geeigneten Trägern sind zweckdienlich. Pharmazeutisch geeignete Träger umfassen beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ethanolpolyole (z. B. Glycerin oder die Verabreichung erfolgt typischerweise parenteral (das heißt, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder subkutan). Ein Adjuvans (z. B. Alaun) kann ebenfalls in der Impfstoffmischung enthalten sein.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Immunisierung eines Individuums gegen Infektionen mit Influenza A Subtypen durch Verabreichung einer Impfstoffzusammensetzung, die ein NS1 Protein/Homologe oder Fragmente davon, die mindestens ein T-Zellepitop des NS1 Proteins darstellen, in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger umfaßt. Aufgrund der genetischen Variabilität der Individuen könnte ein einziges Epitop keine Virus-Schutzantwort in allen Individuen, an die es verabreicht würde, stimulieren. Deshalb wird durch Kombination von zwei oder mehreren distinkten T-Zellepitopen der Impfstoff wesentlich wirksamer. Wie schon oben angedeutet, wird von T-Helferzellepitopen und cytotoxischen T-Zellepitopen angenommen, daß sie distinkte (wenn auch möglicherweise überlappend) Proteinregionen umfassen. Cytotoxische T-Zellepitope können von T-Helferzellepitopen experimentell mit Hilfe der oben beschriebenen Cytotoxizitäts- und Proliferationstests unterschieden werden (T-Helferzellen stimulieren die Proliferation, besitzen aber keine cytotoxische Aktivität).

Das T-Zellepitop wird als ein Oligopeptid verab reicht. Derartige Oligopeptide können nach der Identifizierung des Proteinteils, der das T-Zellepitop enthält, chemisch synthetisiert werden. Alternativ kann ein verkürzter Teil des Gens, das das NS1 Protein codiert, das ein T-Zellepitop enthält, in einer Zelle exprimiert werden, und das codierte Produkt kann mit Hilfe bekannter Verfahren (z. B. Säulenchromatographie, Gelelektrophorese etc.) isoliert werden. Zusätzlich kann das intakte NS1 Protein chemisch oder enzymatisch behandelt werden, um Fragmente zu bilden, die mindestens ein T-Zellepitop ent halten. Derartige Fragmente können, wie oben beschrieben, isoliert werden.

Der hier verwendete Begriff Oiigopeptid bedeutet eine beliebige Aminosäure-Sequenz, die mit einem Teil des NS1 Proteins identisch oder im wesentlichen homolog ist.

Der Ausdruck im wesentlichen homolog bezieht sich auf Oligopeptide, die eine Aminosäure-Sequenz eines NS1 T- Zellepitops, in dem ohne wesentlichen Abschwächung ihrer immunologischen Eigenschaften Aminosäuren deletiert, inseriert oder substituiert worden sind, besitzen. Diese Definition umfaßt Aminosäure-Sequenzen mit einer hinreichenden Länge, um als Polypeptide klassifiziert zu werden (diese Termini werden nicht übereinstimmend oder sehr exakt in der Literatur verwendet).

In einer bevorzugten Anwendung wird sowohl ein T- Helferzellepitop als auch ein cytotoxisches T-Zellepitop an das Individuum verabreicht. Die Stimulation cytotoxischer T-Zellen ist erwünscht, da diese Zellen vom Influenza A Virus infizierte Zellen abtöten. Die Stimulation der T-Helferzellen ist darin förderlich, weil sie lösliche Faktoren sezernieren, die einen stimulierenden Effekt auf andere T-Zellen ebenso wie auf B-Zellen besitzen. Wie oben aufgrund der genetischen Variabilität zwischen Individuen diskutiert, ist es vorzuziehen, daß zwei oder mehr cytotoxische Epitope und zwei oder mehr T- Helferzellepitope enthalten sind.

Verschiedene Verfahren sind in der Literatur beschrieben, die für die Identifikation von T-Zellepitopen zweckdienlich sind. Zum Beispiel haben DeLisi et al. vermutet, daß potentielle Epitopbereiche durch Identifizierung potentieller amphipathischer alpha helicaler Regionen in dem Molekül lokalisiert werden könnten. Delisi et al,. Proc Natl. Acad. Sci. USA 82:7048 (1987). Bixler et al. beschreiben eine Strategie zur Synthese überlappender synthetischer Peptide, die ein vollständiges Proteinmolekül zur Darstellung von T-Zellepitopen umfassen. Bixler et al., Immunol. Comm. 12:593 (1983); Bixler et al., J. Immunogenet. 11:339 (1984). Ein von Gysen (Ciba Foundation Symposium 119:130 (1986) beschriebenes Syntheseverfahren erlaubt die Synthese vieler verschiedener Peptide und dadurch ein Nachahmen einer Reihe potentieller Bindungsstellen, was dann wieder ein schnelles Abtasten des Moleküls erlaubt.

Herkömmlichere Verfahren, wie beispielsweise ein enzymatischer oder chemischer Verdau von Proteinen, he fern Peptidfragmente, die leicht auf T-Zellaktivität getestet werden können. Zum Beispiel Enzyme, wie Chymotrypsin, Elastase, Ficin, Papain, Pepsin oder Trypsin liefern durch Spaltung spezifischer Aminosäurebindungen begrenzte und vorhersagbare Fragmente; ähnlich bilden chemische Verbindungen, wie N-Chlorsuccinimid BPNS-Skatol, Bromcyan, Ameisensäure oder Hydroxylamin durch ihr Einwirken auf Proteine ebenfalls definierte Fragmente. Das Vorhandensein der gewünschten T-Zell-stimulierenden Aktivität in einem beliebigen gegebenen Fragment kann mit Hilfe eines T-Zellproliferationsstandardtests mit gereinigten Fragmenten oder durch Analyse ungereinigter Fragmente in einem Western Assay leicht bestimmt werden. Young et al., Immunol. 59:167 (1986).

In einer weiteren Anwendung kann das Gen, das das NS1 Protein oder einen Teil davon, der ein T-Zellepitop enthält, codiert, in einen rekombinanten Virus kloniert werden, das das NS1 Protein oder den T-Zellepitop enthaltenden Teil davon in dem zu immunisierenden Individuum exprimiert. Ein Beispiel eines derartigen rekombinanten Virussystems ist das von Paoletti et al. (U.S. Patent Nr. 4.603.112) beschriebene Vaccinia-System. Andere Viren sind in der Literatur beschrieben worden, die ein Genom besitzen, das der Insertion fremder DNS Platz bietet, so daß ein von der DNS codiertes Protein in vivo exprimiert wird. Jeder derartige rekombinante Virus ist für das Verfahren dieser Erfindung zweckdienlich.

Der Fachmann erkennt, daß die hier beschriebenen Zusammensetzungen mit den Komponenten von heute gebräuchlichen Influenza A Impf stoffen kombiniert werden können und dadurch ein verbesserter Impfstoff erhalten wird. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

BEISPIELE MATERIAL UND METHODEN Mäuse

Balb/c Mäuse (H-2d) wurden von den Charles River Breeding Laboratories (Stone Ridge, NY) erworben. Sie wurden im Alter von 5 bis 9 Wochen verwendet.

Influenza Viren

Influenza A Viren, A/PR/8 (H1N1), A/BZ (H1N1), A/JAP (H2N2) und A/PC (H3N2) oder B/HK wurden in 10 Tage alten befruchteten Hühnereiern gezüchtet. Infizierte Allantoidflüssigkeit wurde 2 Tage nach der Infektion geerntet, aliquotiert und bei -80ºC aufbewahrt (Kuwano, K. et al., J. Immunol. 140:1264-1268 (1988)).

Vaccinia-Viren

In recombinanten Vaccinia-Viren enthaltene Gene (HA, NP, NS1 und PB2) für A/PR/8 Virus wurden freundlicherweise von Dr. 13. Moss (Bethesda, MD) zur Verfügung gestellt. Sie wurden, wie zuvor beschrieben, konstruiert und vermehrt (Smith, G.L. et al., Virolocrv 160:336-345 (1987). Zusammengefaßt: HeLa-Zellen wurden mit dem Virus 3 Tage bei 37º infiziert. Infizierte Zellen wurden mittels Zentrifugation pelletiert und in 2% FCS haltigem MEM resuspendiert. Drei Gefrier- und Auftauzyklen wurden durchgeführt und die Suspensionen wurde vorsichtig in Wasser 1 min beschallt, anschließend 30 min bei 37º mit Trypsin behandelt. Nach 5 minütiger Zentrifugation bei 500 rpm wurde der überstand aliquotiert und bei -80º aufbewahrt.

Zellen

Die in dieser Untersuchung verwendeten Zellinien, P815 Zellen (H-2d, Mastocytoma) stammten von DBA/2 Mäusen, Klasse 1 MHC Moleküle, H-2Ld- oder H-2Dd-transfizierte Zellinie L929 und LM1 (Kk, Ld, Dk) oder DMI (Kk, Lk, Dd) entsprachen der Beschreibung von Weis, J.H. und J.G. Seidman (J. Immunol. 134:1999-2003 (1985)). Fusionsprotein D-Proteine wurden in E. coli, wie zuvor beschrieben, hergestellt (Yamada, A. et al., Escherichia coli. J. Exo. Med. 162:663-674 (1985); Kuwano, K. etal., J. Immunol. 140:1264-1268 (1988)). Zusammengefaßt: Plasmide, die zu der viralen RNS des A/PR/8 Virus komplementäre DNS-Fragmente enthalten, wurden manipuliert, um eine Expression der D-Proteine zu erreichen, die Hybride der ersten 81 Aminosäuren von NS1 sind, die an die 157 Amino säuren des C-terminalen Endes von HA2 über einen Glutamin- Isoleucin-Prolin-Linker fusioniert sind. Nach Lyse der Bakterien wurden zwei Extraktionen mit 0,1% Deoxycholat und eine Extraktion mit 1% Triton X-100R durchgeführt, um kontaminierende E. coli Proteine zu ent fernen, und das D-Protein wurde in 4 M Harnstoff bei 4º 30 min gelöst. Der Harnstoff wurde mittels Dialyse bei 4º entfernt. Die Proteine wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA gehalten. Das D-Protein wurde von J.F. Young (Smith, Kline und French Laboratories, Phila delphia, PA) zur Verfügung gestellt.

CTL-Klone

Die CTL-Klone wurden, wie zuvor beschrieben, etabliert (Kuwano, K. et al., J. Immunol. 140:1264-1268 (1988)). Zusammengefaßt: CTL Antwortzellen wurden wöchentlich mit A/PR/8 oder D-Protein-gepulsten normalen syngenen &sub7;-bestrahlten Milzzellen in Gegenwart von mit 10% Con A stimulierten Ratten-IL2 mehrere Wochen stimuliert. Eine Verdünnungsreihe wurde angesetzt, um CTL- Klone zu isolieren. Der 13-7 Klon wurde mittels D-Protein- Stimulierung etabliert. (Kuwano et al., J. Immunol. 140:1264-1268 (1988)). Der A-11 Klon wurde mit A/PR/8 Virus stimuliert und wuchs, mit einer Wachstumshäufigkeit in 2 von insgesamt 96 Vertiefungen, in einer Vertiefung, wo zwei Antwortzellen verbracht worden waren. Für die Routinepassage der Klone wurden 2 X 10&sup6; geklonte Zellen wöchentlich mit 30 X 10&sup6; A/PR/8 Virus oder mit D-Protein behandelten γ-bestrahlten Milzzellen in Gegenwart von 10% Ratten-IL2 und 5 X 10&supmin;&sup5; M 2-ME stimuliert.

CTL-Test

P815, LM1 oder DM1 Zellen (2 X 10&sup6;) wurden mit 0,5 ml Virus (10&sup7;-10&sup8; PFU) in Gegenwart von &sup5;¹Cr 60 min bei 37º inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die Zielzellen für eine weitere Stunde inkubiert. Dann wurden 1 X 1034 &sup5;¹Cr-markierte Zielzellen mit 1 X 10&sup4; Effektorzellen in 200 µl Gesamtvolumen in rundbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen 4 h bei 37º inkubiert. Die überstände wurden geerntet und die spezifische Lyse wurde als spezifische Lyse in Prozent = 100 X [(Freisetzung durch CTL - Spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung - spontane Freisetzung)] bestimmt.

Adodtiver Transfer des CTL-Klons

Zellen des CTL-Klons (3 X 10&sup6;) wurden in 0,5 ml RPMI 1640 suspendiert und Mäusen über deren Schwanzvene injiziert. Ein vorausgehendes Experiment zeigte, daß der Transfer von 1,0 X 10&sup6; Zellen zu signifikanten Reduktionen der durchschnittlichen Virustiter in den Lungen der Empfänger von Klon A-11 führte (0,6 -0,8 109&sub1;&sub0; PFU). Sechs Stunden nach adoptivem Transfer des CTL-Klons wurden die Mäuse intranasal mit 10³ PFU des Virus unter Ethernarkose infiziert. Die Lungen von vier Mäusen pro Gruppe wurden 3 Tage später zur Bestimmung des Virustiters entnommen.

Titrationen der Viren in der Lunge

Die Virustitrationen wurden mittels Plaque-Bildung mit Hilfe von MDCK Zellen, wie zuvor beschrieben, ausgeführt (Kuwano, K. et al., J. Immunol. 140:1264-1268 (1988)). Zusammengefaßt: von Empfängermäusen entnommene infizierte Lungen wurden per Hand in 115 ml 0,1% BSA haltigem PBS homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurden die überstände des Lungenhomogenisats in einer Verdünnungsreihe auf das 10fache in PBS verdünnt. Verdünnte Virus-Proben (100 µl) wurden zu konfluenten MDCK Zellen in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen gegeben und bei 37º 1 h inkubiert. In jede Vertiefung wurde dann 1% Agar gegeben, der wie zuvor beschrieben, hergestellt wurde (Kuwano, K. et al., J. Immunol. 140:1264-1268 (1988)). Nach zweitägiger Inkubation wurde der Agar in den Vertiefungen mit 1 ml 10% Neutralrot (GIBCO, Chagrin Falls, OH) in PBS überschichtet. Die Plaques wurden 8 h später gezählt. Die Ergebnisse wurden als durchschnittliche log&sub1;&sub0; PFU/ml der doppelt angesetzten Proben ausgedrückt.

ERGEBNISSE Kreuzreaktivität von Klon A-11, der mit A/PR/8 Virus stimuliert wurde

Vier CTL-Klone wurden etabliert, die von A/PR/8 Virus-immunen Milzzellen von BALB/c Mäusen (H-2d), die mit A/PR/8 Virus (H1N1) stimuliert wurden, abstammten. Zwei der CTL-Klone zeigten eine H1 Subtyp spezifische Lyse der Virus-infizierten Zielzellen. Diese CTL-Klone waren spezifisch für PB2 Protein, wie mit Hilfe von Zielzellen bestimmt wurde, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das das Gen für PB2 von dem A/PR/8 Virus enthält, infiziert wurden. Klon 1E8, der für beide H1 Subtyp spezifische Klone repräsentativ ist, ist als negative Kontrolle in Tabelle 2 angeführt. Klon A-11, der für die anderen beiden CTL-Klone repräsentativ ist, zeigte eine kreuzreaktive Lyse der mit A/PR/8 (H1N1), A/BZ (H1N1), A/JAP (H2N2) oder A/PC (H3N2) Viren infizierten Zielzellen, versagte aber bei der Lyse von B/HK infizierten Zielzellen (Tabelle 1). Der 13-7 CTL-Klon (Kuwano, K. et al., J. Immunol. 140:1264-1268 (1988)) wurde als Kontrolle verwendet. 13-7 war mit einem Fusionsprotein, das einen Teil der HA2 Untereinheit des A/PR/8 Virus enthält, stimuliert worden und zeigte eine H1H2 Subtyp kreuzreaktive Lyse der Zielzellen, die mit A/PR/8 (H1), A/BZ (H1) oder A/JAP (H2) Viren infiziert worden waren. Die pHänotypen der Zelloberflächen-Antigene sowohl der A-11 als auch der 13-7 Klone waren Thy1+, Lyt-2+ und L3T4.

Tabelle 1 Virusspezifität von Klon A-11, der mit A/PR/8 Virus stimuliert wurde

aKlon A-11 exprimiert 94% Thy1.2, 86% Lyt-2 und 5% L3T4 Oberflächen-Ag.

bKlon 13-7 exprimiert 97% Thyl.2, 95% Lyt-2 und 0% L3T4 Oberflächen-Ag.

CTL-Klon A-11 ist für NS1 Protein spezifisch

Um das von Klon A-11 erkannte Influenza-Protein zu untersuchen, wurden die Zielzellen mit rekombinanten Vaccinia-Viren, die verschiedene Influenza-Gene des A/PR/8 Virus enthalten, infiziert und in CTL-Tests verwendet. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, lysierte Klon A- 11 NS1-VAC infizierte und A/PR/8 Virus-infizierte Zellen signifikant. P815 Zielzellen dienten als positive Kontrolle. Jedoch versagte Klon A-11 beim Erkennen von HA VAC, NP-VAC, PB2-VAC oder parental VAC infizierten P815 Zielzellen. Klon 13-7 als negative Kontrolle lysierte HA- VAC infizierte Zielzellen ebenso gut wie A/PR/8 Virusinfizierte Zielzellen, lysierte aber keine NP-VAC oder Vac infizierte Zielzellen. Der ebenfalls von A/PR/8 Virus-immunen Milzzellen, die durch wiederholte Stimulation mit A/PR/8 Virus, wie oben h3schrieben, erhalten wurden, abstammende Klon 1E8 erkannte PB2-VAC infizierte Zielzellen oder A/PR/8 Virus-infizierte Zielzellen, versagte aber beim Erkennen von NS1-VAC oder HA-VAC infizierten Zielzellen; er ist ebenfalls als Kontrolle angeführt. Diese Ergebnisse zeigen, daß CTL-Klon A-11 das NS1 Protein auf Influenza A Virus-infizierten Zellen erkennt.

Tabelle 2 Erkennung von NSL Protein von A/PR/8 Virus durch Klon A-11 % sdezlfische Lvse von P815 Zielzellen

Verminderung der Virustiter in der Lunae durch Transfer eines NS1 spezifischen CTL-Klons

Um zu untersuchen, ob ein adoptiver Transfer vom NS1 Protein-spezifischen CTL-Klon A-11 die Virustiter in den Lungen von Mäusen, die mit Influenzaviren infiziert waren, vermindern würde, wurden 3 X i06 Zellen von Klon A-11 in BALB/c Mäusen 6 h vor der Influenza-Infektion adoptiv transferriert. Drei Tage später wurden die Lungen für die Titration der Influenzaviren entfernt. Die Virus titrationen wurden mit Hilfe von Plaque-Bildungstests in MDCK Zellen durchgeführt. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei Experimenten mit einer durchschnittlichen Abnahme des Virustiters in der Lunge von ca. 1,0 log&sub1;&sub0; erhalten. Wie in Tabelle 3 gezeigt, verminderte der adoptive Transfer von CTL-Klon A-11 die Virustiter in den Lungen von Mausen signifikant, die mit A/PR/8, A/JAP oder A/PC Viren infiziert waren, verminderten aber nicht die Virustiter in den Lungen von Mäusen, die mit dem B/HK Virus infiziert waren. Diese Ergebnisse spiegeln die in Tabelle 1 gezeigte in vitro Kreuzreaktivität von CTL-Klon A-11 wider.

Tabelle 3 Verminderung des Virustiters in der Lunge durch adoptiven Transfer von Klon A-11

aZellen (3 X 10&sup6;) wurden 6 h vor Virusinfektion transferriert; +1 transferriert; -, Zellen nicht trans ferriert.

bLungen wurden entnommen und die Virustiter wurden mittels Plaque-Tests in MDCK Zellen 3 Tage nach Virusimfektion untersucht.

cp< 0,011, T-Test nach Student.

dp< 0,02, T-Test nach Student.

ep< 0,005, T-Test nach Student.

fp< 0,005, T-Test nach Student.

gp< 0,0005, T-Test nach Student.

hp< 0,005, T-Test nach Student.

MHC-Restriktion der Zielzellyse durch Klon A-11

Mit H-2Dd (DMI Zellen) und H-2Ld (LM1 Zellen) codierenden Genen transfizierte L929 Zellen (H-2k) wurden verwendet, um die MHC Restriktion der Zielzellyse durch CTL-Klon A-11 zu untersuchen. Wie in Tabelle 4 gezeigt, lysierte CTL-Klon A-11 A/PR/8 Virus-infizierte LM (H-2Ld) Zielzellen signifikant, versagte aber bei der Lyse von A/PR/8 Virus-infizierten DMI (H-2Dd) oder A/PR/8 Virusinfizierten DAP(H-2k) Zielzellen.

Als eine Kontrolle wurde von Stammkulturen der A/PR/8 Virus-immunen BALB/c (H-2d) Milzzellen, die mit A/PR/8 Virus in Gegenwart von IL2 mehrere Wochen stimuliert worden waren, stammende CTL ebenfalls in diesem Experiment verwendet. Diese Virus-stimulierten CTL lysierten mit A/PR/8 Virus-infizierten LM1 oder DM1 Zielzellen, töteten aber A/PR/8 Virus-infizierte DAP Zielzellen nicht ab. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß der CTL-Klon A-11 nicht in der Lage war, A/PR/8 Virus-infizierte peritoneale Exudatzellen aus C3H.OL Mäusen (H-2kd,Dk) zu erkennen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Erkennung durch den CTL-Klon A-11 von NS1 auf A/PR/8 Virus-infizierten Zielzellen durch das H-21d Allel eingeschränkt ist.

Tabelle 4 MHC-Restriktion der CTL Erkennung durch CTL-Klon A-11


Anspruch[de]

1. Verwendung von Influenza A Virus NS1 Protein (oder Homologelfragmente davon, in denen ohne wesentliche Abschwächung ihrer immunologischen Eigenschaften Aminosäuren deletiert, inseriert oder substituiert worden sind) oder eines rekombinanten Virus, das für besagtes NSL Protein oder Homolog/Fragment davon codiert, für die Herstellung eines Medikaments zum Einsatz in einer Immuntherapie, wobei diese Immuntherapie die Schritte umfaßt;

(a) Verabreichung einer wirksamen Menge des NS1 Proteins oder Homologs/Fragments oder eines dafür codierenden rekombinanten Virus an ein Individuum, wodurch

(b) eine NS1 spezifische T-Zellantwort stimuliert wird, die

(c) schützende Kreuzimmunität gegen Influenza A Virus Subtypen besagtem Individuum verschafft.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Virus ein Vaccinia-Virus ist.

3. Verwendung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, worin in Schritt (a) das NS1 Protein oder Homolog/Fragment oder dafür codierende rekombinante Virus als eine Impfstoff-Zusammensetzung verabreicht wird, die eine wirksame Menge des NS1 Proteins oder Homologs/Fragments oder dafür codierenden rekombinanten Virus in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger enthält oder daraus besteht.

4. Verwendung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die T-Zellantwort eine cytotoxische und/oder T-Helfer-Zellantwort ist.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com