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Dokumentenidentifikation DE68927089T2 03.04.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0371119
Titel RETROVIRALER VEKTOR
Anmelder Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, N.Y., US
Erfinder GILBOA, Eli, Scarsdale, NY 10853, US
Vertreter Feiler und Kollegen, 81675 München
DE-Aktenzeichen 68927089
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 17.05.1989
EP-Aktenzeichen 899065742
WO-Anmeldetag 17.05.1989
PCT-Aktenzeichen US8902138
WO-Veröffentlichungsnummer 8911539
WO-Veröffentlichungsdatum 30.11.1989
EP-Offenlegungsdatum 06.06.1990
EP date of grant 04.09.1996
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.04.1997
IPC-Hauptklasse C12P 21/00
IPC-Nebenklasse C12N 15/79   C12N 7/01   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika unter der Bewilligungsnummer CA-33050-06 vom National Cancer Institute, U.S. Department of Health and Human Services, gemacht. Die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika besitzt bestimmte Rechte an dieser Erfindung.

Hintergrund der Erfindung

Das Verständnis der Genexpression wurde durch die Fähigkeit zur Übertragung klonierter Gene in Zellen und zur Untersuchung des Mechanismus ihrer Regulierung deutlich verbessert. Während der letzten Jahre wurde erkannt, daß Retroviren gute Kandidaten für Träger oder Vektoren zur Einführung von Genen in eukariontische Zellen sind. Von Retroviren abgeleitete Vektoren nutzen die für diese Virusgruppe einzigartigen biochemischen Verfahren zur in vitro- und in vivo-Übertragung von Genen in eine breite Vielzahl von Zelltypen mit hoher Effizienz aus. Durch Verwendung von von Retroviren abgeleiteten Vektoren können die Wirkungen von neu eingeführten Genen und der Mechanismus der Genexpression in Zelltypen, die sich bisher anderen Verfahren einer Genübertragung widersetzten, untersucht werden. Die speziellen Merkmale dieser neuen Genübertragungstechnologie lieferten zum ersten Mal die Möglichkeit der Einführung von Genen in somatische Zellen lebender Tiere. Obwohl gegenwärtig die Genübertragungstechnologie hauptsächlich auf den Gentransfer in hämopoetische Zellen beschränkt ist, beginnt man das Potential dieses Gentransfers in allgemeinen Untersuchungen und Anwendungen bei Therapien an Menschen zu erkennen.

Wie bei zahlreichen neu sich entwickelnden Technologien führte das Potential des Retrovirusgentransfers zu hohen Erwartungen. Es wurde schnell erkannt, daß ein Retrovirusgentransfer keine einfache für eine Anpassung leicht zugängliche Technik ist, so daß die anfängliche Euphorie offenkundigem Pessimismus wich. Der jüngste Fortschritt auf diesem Gebiet ist ermutigend, so daß es vielleicht Gründe für einen vorsichtigen Optimismus gibt, daß einige der durch diese neue Gentransfertechnik entstandenen Erwartungen erfüllt werden können.

Prinzipien des Retrovirusgentransfers

Retroviren sind RNA-Viren, in denen die Virusgene durch ein einzelsträngiges RNA-Molekül codiert sind. Nach Eindringen in die Zelle wird die Virus-RNA in einem als reverse Transkription bezeichneten Prozeß in ein doppelsträngiges DNA-Molekül umgewandelt. Die DNA tritt in den Kern ein und baut sich in das Zellchromosom ein, wodurch sie von einem beliebigen anderen Zellgen ununterscheidbar wird. Die eingebaute Virus-DNA- Form, die als Provirus bezeichnet wird, ist die Matrize für die Expression der Virusgene und die Synthese der nachkommenden Virion-RNA. Die Virusgenprodukte und die Nachkommen-RNA kommen zu einem Virion zusammen, das durch Knospung durch die äußere Zellmembran die Zelle verläßt.

Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß die Integration des Virusgenoms in das Zellchromosom ein notwendiger Teil des Virusreplikationsverfahrens ist und durch Viral codierte Enzyme vermittelt wird. Mit einigen Ausnahmen besitzen die Anwesenheit des Virusgenoms in der Zelle, die Expression der Gene hiervon und die Bildung eines Nachkommen-Virus keine augenscheinlichen Wirkungen auf die Lebensfähigkeit der infizierten Zelle. Die Zelle ist chronisch infiziert, ansonsten jedoch gesund und sezerniert kontinuierlich Virus in das Medium (vgl. Varmus und Swanstrom, 1985 (19) für einen Übersichtsartikel).

Für die Zwecke der Einführung funktioneller Gene in Zellen in einer Zahl von einer Kopie pro Zelle ohne Beeinträchtigung der Proliferationskapazität der Empfängerzelle wird ein Retrovirusgentransfer bzw. eine Retrovirusgenübertragung verwendet. Die Eignung der Retroviren für eine Genübertragung rührt von ihrem Replikationsmodus her. Durch "einfaches" Ersetzen der Virusgene durch ein interessierendes Gen und Ausnutzen des effizienten Virusinfektionsverfahrens wird das Gen in die Targetzelle, gleich als ob es ein Virusgen wäre, übertragen. Figur 1 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, wie dieses Verfahren arbeitet. Zuerst werden unter Verwendung rekombinanter Standard-DNA-Techniken Teile der Virus-DNA mit dem interessierenden Gen kombiniert. Wie in Figur 1 dargestellt, können die meisten der internen Virussequenzen durch das fremde Gen ersetzt werden. Die restliche Retrovirus-DNA wird als Vektor bezeichnet und umfaßt immer die beiden Enden des Virusgenoms, die terminal redudant sind und als long terminal repeats (LTRs) bezeichnet werden. Dieser und unmittelbar benachbarte Bereiche des Virusgenoms enthalten wichtige, für die Replikation des Virus notwendige cis-Funktionen, beispielsweise das in Figur 1 dargestellte Virusverpackungssignal. Die deletierten Sequenzen, die durch das Fremdgen oder die Fremdgene ersetzt sein können, codieren für Virusproteine, die für die Bildung infektiöser Virionen erforderlich sind. Diese Proteine können, auch wenn sie für die Replikation des Virus notwendig sind, mittels Transeffekt (in trans) ergänzt werden, wenn die Zelle weitere Viren enthält, die die Genprodukte, die in dem Vektor fehlen, exprimieren. In der zweiten Stufe wird die Hybrid-DNA mittels standardisierten (und ineffizienten) DNA-Transfektionsprozessen in speziell konstruierte Zellen eingeführt. Diese als Verpackungszellen bezeichneten Zellen beherbergen ein Retrovirus, das bezüglich der cis-Funktion einen Defekt aufweist. Die RNA derartiger Zellen kann sich nicht zu einem Virion einkapsidieren, sie exprimiert jedoch alle Virusproteine und kann folglich dieselben, in der hereinkommenden Vektor-DNA fehlenden Funktionen ergänzen. Die Vektor-DNA wird nun in die entsprechende RNA transkripiert, die in ein Retrovirusvirion eingekapselt und anschließend in das Medium sezerniert wird. Der tatsächliche Gentransfer erfolgt zu diesem Zeitpunkt: Das im Medium gesammelte Virus wird zur Infektion der Targetzellen verwendet, wobei das fremde Gen durch den wirksamen Virusinfektionsprozeß in das Zellchromosom insertiert wird, als ob es ein Virusgen wäre (für weitere Ausführungen vgl. Coffin, 1985 (4); Temin, 1986 (18) und Gilboa, 1986 (7)).

Die Genübertragung auf Retrovirusbasis ist aus zwei prinzipiellen Gründen eine vielversprechende Technik. Der erste Grund ist die hohe Effizienz. Gegenwärtig ist eine Genübertragung auf Retrovirusbasis das einzige zur Verwendung in Fällen, in denen es notwendig ist, das interessierende Gen in einen großen Anteil der Targetzellen einzuführen, verfügbare System. Dies steht im deutlichen Gegensatz zu anderen Genübertragungssystemen, wie der DNA-Transfektion, der Protoplastenfusion und der Elektroporation. Zweitens besitzen Retrovirusvektoren einen breiten Wirtbereich, der es ermöglicht, daß Gene nicht nur in in Form einer Monoschicht gezüchtete Zellen, wie NIH 3T3-Zellen oder L-Zellen, sondern auch in zahlreiche, in Suspension gezüchtete Lymphoidzellen und Myeloidzellen und die in der Knochenmarkpopulation vorhandenen hämatopoetischen Stammzellen eingeführt werden (vgl. Gilboa, 1986 (7) bezüglich eines Übersichtartikels).

Die grundlegende Beschränkung der Verwendung von Retrovirusvektoren, verglichen mit anderen Typen von Genübertragungstechniken, besteht darin, daß in diesem Fall Extramanipulationen erforderlich sind und somit dieses Verfahren zeitraubender ist. Bei der Durchführung einer DNA-Transfektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion wird das das interessierende Gen tragende DNA-Fragment direkt in die Targetzellen eingeführt, während bei der Verwendung von Retrovirusvektoren das interessierende Gen zuerst in einen Retrovirusvektor insertiert und anschließend der Retrovirusvektor in ein Virion umgewandelt wird, bevor die tatsächliche Genübertragung stattfindet (Fig. 1). Mit zahlreichen Verfeinerungen ist es nun ziemlich einfach, ein Gen in einen Retrovirusvektor zu insertieren, ein rekombinantes Virus zu erhalten, Targetzellen zu infizieren und das fremde Gen zu exprimieren. Was jedoch gegenwärtig schwieriger und schwerer zu fassen ist, ist, wie die Effizienz des Prozesses maximiert werden kann. Drei Parameter bestimmen die Effizienz der Retrovirusgenübertragung. Der erste Parameter ist die Stabilität des das interessierende Gen tragenden rekombinanten Virus vor dem Hintergrund der Beobachtung, daß einige Inserte im Kontext eines Retrovirusvektors instabil sind. Der zweite Parameter ist die Fähigkeit, einen großen Anteil an Targetzellen zu infizieren. Diese Eigenschaft ist eine Funktion des Titers des rekombinanten Virus, der in dem in Fig. 1 beschriebenen Verfahren produziert werden kann. Der Titel der Retrovirusvektoren ist ein wichtiger und begrenzender Parameter dieser Technologie. Der dritte und kritische Parameter dieser Technologie ist die Fähigkeit, das transduzierte Gen in den infizierten Zellen zu exprimieren. Dies ist wahrscheinlich der problematischste Aspekt dieser Technologie.

Retrovirusvektorausgestaltung

Die Natur des Retrovirusvektors bestimmt derartige Parameter in großem Ausmaß. Der Grund, warum die Entwicklung eines supereffizienten Retrovirusvektors für alle Zwecke schwierig ist, liegt in dem Fehlen des Verständnisses bezüglich einiger der subtileren Details der Struktur und Biologie von Retroviren sowie derjenigen von Säugetiergenen. Schwierigkeiten treten häufig auf, wenn das Hybridvirus durch Ersetzen von Virusgenen durch ein Fremdgen konstruiert wird (Fig. 1). Die Entfernung von Virussequenzen und das Ersetzen durch Fremd-DNA kann eine merkliche Verringerung des Titers der erzeugten Viren und ferner eine Verringerung der Effizienz, mit der das transduzierte Gen exprimiert wird, bewirken. Eine signifikantere, mit der Verwendung von Retrovirusvektoren verbundene Einschränkung ist die Unfähigkeit, das transduzierte Gen zu exprimieren. Diese Einschränkung wohnt der Ausgestaltung der meisten Retrovirusvektoren inhärent inne. Das neue, in der vorliegenden Erfindung beschriebene Vektorsystem ist jedoch hauptsächlich so ausgestaltet, daß dieses Problem umgangen oder gelindert wird.

Verschiedene Strategien der Retrovirusvektorausgestaltung sind in Fig. 2 dargestellt, um die Vorteile und Einschränkungen eines jeden Ansatzes herauszustellen. Es sei darauf hingewiesen, daß diese Vektoren nicht eines sondern zwei Gene beherbergen. Ein Gen ist das interessierende Gen, das zweite Gen ist ein selektierbares Gen. Ein selektierbares Gen ist nicht absolut erforderlich, seine Anwesenheit erleichtert jedoch die Verwendung von Retrovirusvektoren unter Gewährleistung der Identifizierung und Isolierung der produktiv infizierten Zellen in starkem Maße. In einigen Fällen kann die Anwesenheit eines selektierbaren Gens negative Effekte aufweisen, wobei die Verwendung von Vektoren ohne selektierbare Gene - wenn es auch mühsamer ist - von Vorteil sein kann.

Figur 2A zeigt die Struktur eines von Cepko und Mitarbeitern, 1984 (3) beschriebenen, einen Prototyp darstellenden, eine doppelte Expression (DE) aufweisenden Vektors (DE- Vektors). Wie in Fig. 2A (oben) dargestellt, werden die drei Virusgene aus zwei RNA-Spezies exprimiert. Das gag- und pol- Gen werden aus einer nichtgespleißten RNA-Form, die mit dem Virusgenom colinear ist, exprimiert. Das env-Gen wird aus einer gespleißten RNA-Form, die aus einer nichtgespleißten RNA-Spezies durch Entfernen eines langen Introns erzeugt wurde, exprimiert. Die Entfernung des Virusintrons wird in diesem System genau reguliert, da beide RNA-Spezies, die gespleißte Form und ihr Vorläufer, die nichtgespleißte Form, sich im Cytoplasma anhäufen. DE-Vektoren (Fig. 2A, unten) enthalten zwei Fremdgene. Ein Gen, das das gag/pol-Segment ersetzt, wird aus der nichtgespleißten RNA-Form exprimiert. Das zweite Gen, das das Virus-env-Gen ersetzt, wird aus der gespleißten RNA-Form exprimiert. Das unterscheidende Merkmal dieses Vektortyps besteht darin, daß der Vektor nicht nur die für die Transmission der Fremdgene in die Targetzellen erforderlichen cis-Funktionen, sondern auch die cis-Funktionen für ihre Expression, d.h. einen Enhancer, einen Promotor und die 5'-Spleißstelle in der 5' LTR-Sequenz und den stromabgelegenen Sequenzen, ein Poly A-Signal in der 3' LTR- Sequenz und eine 3'-Spleißstelle, die in einem dritten DNA- Fragment codiert ist, bereitstellt. DE-Vektoren sind von der effizienten Bildung der Virus-RNA-Spezies abhängig. Dies hängt seinerseits von dem geeignet regulierten Spleißprozeß ab, wobei die zugrunde liegende Annahme bei der Ausgestaltung dieser Vektoren die war, daß eine Entfernung des Virusintrons durch die unmittelbar die Spleißverbindungen umgebenden Sequenzen reguliert wird. Es gibt nun wachsende Hinweise darauf, daß diese Annahme nicht richtig ist. Vielmehr wurde festgestellt, daß über das gesamte Virusintron verteilte Sequenzen eine essentielle Rolle beim Modulieren der Gehalte an gespleißten und nichtgespleißten RNA-Formen, die sich im Cytoplasma ansammeln, spielen (9, 15). Somit kann das Fehlen von Intron enthaltenden Sequenzen in DE-Vektoren ein Grund für ihre schlechte Leistungsfähigkeit sein. Eine zweite und bedeutendere Einschränkung für die Verwendung von DE-Vektoren ist in der Struktur dieser Vektoren begründet. In DE-Vektoren wird die Expression des interessierenden Gens von dem in der LTR- Sequenz codierten Promotor gesteuert, so daß die Eignung dieser Vektoren auf Zellen begrenzt ist, in denen der Viruspromotor ausreichend aktiv ist.

Figur 2B zeigt die Struktur eines weiteren Typs von retroviralem Vektor, worin das transduzierte Gen von einem internen Promotor exprimiert wird. Daher haben diese Vektoren auch den Namen Vektoren mit internen Promotoren (VIP). In diesen Vektoren ist das selektierbare Gen mit den linken Ende der Virus-DNA verbunden und wird von dem Viruspromotor exprimiert. Ein vollständiges Gen oder ein Minigen gemäß der Darstellung in Fig. 2B wird stromab des selektierbaren Gens insertiert (14). Das für den Promotor codierende DNA-Fragment, das für die Expression des transduzierten Gens verantwortlich ist, kann aus einem beliebigen Gen stammen, so daß man bei der Verwendung dieses Vektortyps die Möglichkeit der Auswahl der Promotoren zur Expression des transduzierten Gens in einer für eine spezielle experimentelle Ausgestaltung geeignetsten Weise besitzt.

Der Hauptnachteil dieser Strategie der Vektorausgestaltung besteht darin, daß ein interner Promotor in die Retrovirustranskriptionseinheit eingebracht wird, die ihrerseits die Aktivität des internen Promotors beeinträchtigt, wodurch es zu variablen und häufig niedrigen Expressionsmengen des transduzierten Gens kommt. Dies entspricht den Erwartungen, da wiederholt gezeigt wurde, daß die Aktivität der Promotoren verringert wird, wenn sie stromab zu einem anderen aktiven Promotor vorhanden sind (5, 10). Die Störung der Promotoraktivität tritt auch auf, wenn zwei Transkriptionseinheiten einander gegenüberstehen (18).

Figur 2B (unten) zeigt die Struktur eines als N2 bezeichneten VIP-Vektors (1). Das einzigartige Merkmal dieses Vektors ist die Erzeugung signifikant höherer Virustiter, verglichen mit anderen Vektoren auf Retrovirusbasis. Wie in Fig. 2B (unten) dargestellt, erstreckt sich im N2-Vektor der Bereich stromab der 5' LTR-Sequenz über das gag-AUG-Initiationscodon hinaus und umfaßt 418 Basenpaare der gag-Codiersequenzen, woran das bakterielle Neo-Gen fusioniert ist. Scheinbar ist dieser Extrabereich, der in N2 vorhanden ist, für die Produktion 10- bis 50-facher höherer Virustiter, verglichen mit ähnlichen Vektoren, denen diese Sequenzen fehlen, verantwortlich (1, 2). Aus diesem Grund gewinnen Vektoren auf N2-Basis in vielen Laboratorien, insbesondere zur Einführung von Genen in kultivierte hämopoetische Zellinien und frische Knochenmarkzellen, steigende Popularität.

Obwohl Vektoren auf N2-Basis hohe Virustiter hervorbringen, ist die Expression der transduzierten Gene infolge der Anwesenheit einer aktiven Retrovirustranskriptionseinheit häufig enttäuschend gering. Um diesem Problem zu begegnen, wurde ein anderer Typ eines Retrovirusvektors, der als SIN-Vektor bezeichnet wird, entwickelt (23), wobei ähnliche auf demselben Prinzip basierende Vektoren später durch andere Laboratorien eingeführt wurden (6, 8, 22). Selbst inaktivierende (SIN)-Vektoren sind in Fig. 2C dargestellt und besitzen sehr interessante Eigenschaften. Die LTR-Sequenzen an den beiden Enden des Retrovirusgenoms codieren für Enhancer- und Promotorelemente, die für die Bildung der Virustranskriptionseinheit, die zur Hemmung der Genexpression der VIP-Vektoren gemäß der obigen Beschreibung führt, verantwortlich sind. Der Retrovirus- Enhancer kann ferner nach Einbau in das Zellchromosom benachbarte Oncogene aktivieren. Dies ist selbstverständlich ein ärgerlicher Aspekt, wenn retrovirale Vektoren bei der Therapierung von Menschen verwendet werden sollen. Wie sein vollständiger Name impliziert, rührt die spezielle Eigenschaft des SIN-Vektors von der Tatsache her, daß er sich nach Einbau in das Chromosom der Targetzellen selbst inaktiviert, da ein kleiner Teil der Virus-DNA, die die Enhancer- und Promotorsequenzen umfaßt, in beiden LTR-Sequenzen fehlt. Folglich wird die provirale DNA in den infizierten Zellen im Hinblick auf eine Transkription inaktiv, wodurch die nicht gehemmte Expression des Fremdgens ermöglicht wird. Darüber hinaus vermindert die Abwesenheit der viralen Enhancer die Möglichkeit einer Aktivierung zellulärer Oncogene. Figur 2C veranschaulicht wie dies abläuft. SIN-Vektoren enthalten eine kleine Deletion in der 3' LTR-Sequenz, die die Promotor- und Enhancersequenzen umfaßt, die die genaue und effiziente Transkription des Virusgenoms steuern. Diese Sequenzen sind für die virale Genexpression erforderlich, wenn sie in der 5' LTR-Sequenz vorhanden sind, jedoch nicht, wenn sie in der 3' LTR-Sequenz vorhanden sind, so daß ihre Entfernung aus DNA- Konstrukten gemäß der Darstellung in Fig. 2C die Virusfunktionen nicht beeinträchtigt. Da ein diese Deletion umfassender Bereich in der 3' LTR-Sequenz mit der Bezeichnung U3-Bereich die Matrize für die Synthese der U3-Bereiche sowohl in der 5' LTR-Sequenz als auch in der 3' LTR-Sequenz in der nächsten Generation ist, wird die den Virusenhancer und - promotor umfassende Deletion auf beide LTR-Sequenzen in den Targetzellen übertragen (23).

Obwohl gezeigt wurde, daß SIN-Vektoren sich in der Targetzelle selbst inaktivieren, waren die durch diesen Vektortyp erzeugten Virustiter enttäuschend gering (10³ - 10&sup4; cfu/ml) und sind wahrscheinlich für eine Verwendung bei einer einen in vivo-Gentransfer umfassenden Anwendung nicht ausreichend. Systematische Anstrengungen über einen Zeitraum von zwei Jahren mit dem Ziel der Verbesserung des Titers von SIN- Vektoren waren nicht erfolgreich (Yu und Gilboa, nicht veröffentlichte Ergebnisse).

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Eignung von eine doppelte Expression aufweisenden Vektoren (DE-Vektoren, Fig. 2A, unten) hauptsächlich aufgrund der Tatsache eingeschränkt ist, daß die Expression des transduzierten Gens auf die Virus- LTR-Sequenz eingeschränkt ist. Die Verwendung von Vektoren mit internen Promotoren (VIP-Vektoren, Fig. 2B) umgeht diese Einschränkung, wobei die in Fig. 2B dargestellte N2-Variante auch hohe Virustiter (ein kritischer Parameter dieser Technologie) erzeugt. Ein ernster Nachteil dieses Typs der Vektorausgestaltung ist jedoch die unvorhersagbare und häufig niedrige Expressionsmenge des transduzierten Gens infolge der Anwesenheit einer aktiven Readthrough-Retrovirustranskriptionseinheit. Die Enwicklung von sich selbst inaktivierenden Vektoren (SIN-Vektoren, Fig. 2C) war darauf ausgerichtet, diesem Problem zu begegnen. Unglücklicherweise liefert dieser Vektortyp, anders als Vektoren auf N2-Basis, niedrige Virustiter, die die Eignung dieser Vektoren insbesondere für einen Gentransfer in menschliche Knochenmarkzellen, stark einschränken. Wenn auch ein merklicher Fortschritt bei der Entwicklung retroviraler Vektoren gemacht wurde, besteht klar der Bedarf an effizienteren Vektoren, die höhere Virustiter liefern und ferner eine effiziente und ungehemmte Expression des transduzierten Gens gewährleisten.

Dieser Abschnitt über die Vektorgestaltung folgt teilweise den Darstellungen in einem ähnlichen Abschnitt, der von Gilboa, 1986 (7) dargestellt ist. (Für weitere Details über dieses Thema sei auch auf Coffin, 1985 (4) und Temin, 1986 (18) verwiesen.)

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen retroviralen Vektor zur Einführung von DNA mit Codierung für eine Transkriptionseinheit mit der Fähigkeit, in der eukaryontischen Zelle funktionell exprimiert zu werden, in eine eukaryontische Zelle, wobei der retrovirale Vektor eine erste DNA-Sequenz, bei der es sich um das reverse Transkript mindestens eines Teils eines Retrovirus, wobei der Teil sowohl die 5' LTR-Sequenz als auch die 3' LTR-Sequenz des Retrovirus umfaßt, handelt, und eine zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die ausschließlich in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz insertierte Transkriptionseinheit umfaßt.

Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Virions, das zur Einführung von DNA mit Codierung für eine DNA-Transkriptionseinheit in eine eukaryontische Zelle geeignet ist, durch Transfizieren einer eukaryontischen Zelle mit dem oben beschriebenen retroviralen Vektor in eine geeignete Verpackungszellinie unter derartigen Bedingungen, daß das Virion in der Verpackungszellinie gebildet und durch die Verpackungszellinie ausgeschleust wird.

Die vorliegende Erfindung liefert des weiteren ein Verfahren zur Einführung einer DNA-Sequenz mit Codierung für eine interessierende Transkriptionseinheit in eine eukaryontische Zelle durch Infizieren der Zelle mit dem oben beschriebenen Virion unter derartigen Bedingungen, daß die DNA-Sequenz mit Codierung für die interessierende Transkriptionseinheit in die chromosomale DNA der eukaryontischen Zelle eingebaut wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1: Verwendung retroviraler Vektoren zur Einführung von Genen in eukaryontische Zellen (bezüglich Details s. Text);

Figur 2: Strategien für eine Ausgestaltung retroviraler Vektoren (für Details 5. Text);

Figur 3: Die grundlegenden Strukturunterschiede zwischen einem DC-Vektor und den früher geschaffenen Vektoren;

Figur 4: Das Prinzip der double copy (DC)-Vektoren.

In einem DC-Vektor wird das interessierende Gen mittels standardisierten rekombinanten DNA-Techniken in den U3-Bereich der 3' gelegenen LTR-Sequenz insertiert. Das Gen kann in einer der beiden Transkriptionsorientierungen gemäß Angabe durch die beiden Pfeile insertiert werden. Ferner ist die Virus-RNA dargestellt, die an der Grenze des U3- und R-Bereichs der 5' LTR- Sequenz beginnt und an der Grenze des R- und US-Bereichs in der 3' LTR-Sequenz endet. Folglich befindet sich das in die 3' LTR-Sequenz insertierte Gen in der retroviralen Transkriptionseinheit. Das DNA-Konstrukt wird anschließend in ein Virus umgewandelt und in die Targetzelle gemäß Darstellung in Fig. 1 eingeführt. In der Targetzelle wird der U3-Bereich der 3' LTR- Sequenz einschließlich des insertierten Gens auf die 5' LTR- Sequenz gemäß Darstellung "übertragen", wobei zwei Kopien des insertierten Gens erzeugt werden. Als Ergebnis dieser Duplikation befindet sich das in der 5' LTR-Sequenz vorhandene Gen nun außerhalb der retroviralen Transkriptionseinheit.

Figur 5: Ein das ADA-Minigen enthaltender DC-Vektor.

Das ADA-Minigen besteht aus dem ADA-Promotor und der anfusionierten ADA-CDNA (20, 21), was stromab des Neo-Gens des N2-Vektors unter Erzeugung des AAX-Vektors (Fig. 5A) insertiert wurde. Zur Erzeugung des in Fig. 5B dargestellten DCA-Vektors wurde der N2-Vektor zuerst durch die Insertion einer Polylinkerklonierungsstelle in die in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz vorhandene Nhei-Stelle zwischen dem distalen Ende der LTR-Sequenz und dem Virusenhancer (als N2A bezeichnet) modifiziert. Das ADA-Minigen wurde anschließend in die in dem Polylinker vorhandene SnaBI-Stelle insertiert. Für weitere Details s. (1) und den folgenden Text.

Figur 6: DNA-Analyse von mit DCA-Virus infizierten NIH- 3T3-Zellen.

10³ infektiöse Einheiten des DCA-Virus aus 5 Producerlinien wurden zur Infektion von 2 x 10&sup5; NIH-3T3-Zellen verwendet. Infizierte Zellen wurden in G418 ausgewählt, ausgebreitet und zelluläre DNA isoliert. Die DNA wurde mit Bam HI verdaut, einer Elektrophorese in 1% Agarosegelen unterzogen und auf Nitrozellulosepapier geblottet. Vektorspezifische DNA wurde durch Hybridisieren mit einer Neo-spezifischen Sonde nachgewiesen. Molekulargewichtsmarker zeigen ein Gemisch aus drei DNA-Fragmenten bekannter Molekulargewichte von 6,2, 4,4 und 3,7 kb, die Neo-Sequenzen enthalten. N2A ist ein modifizierter N2-Vektor gemäß der Beschreibung in Fig. 5. Sowohl der Vektor N2 als auch N2A enthalten keine Bam HI- Stelle. DCA-3, 4, 6, 7 und 9 sind fünf unabhängig abgeleitete Virusüberstände, die durch Transfizieren von PA317-Zellen und Isolieren einzelner Kolonien erhalten wurden.

Figur 7: Expression vektorspezifischer RNA in mit DCA- und AAX-Virus infizierten NIH-3T3-Zellen.

Figur 7A zeigt die Struktur der AAX- und DCA-Proviren und der entsprechenden RNA-Transkripte (Pfeile). Im AAX-Vektor wurde das ADA-Minigen zwischen die beiden LTR-Sequenzen (stromab des Neo-Gens) kloniert, so daß die Struktur des Provirus der Vektor-DNA entspricht. Im DCA-Vektor wurde das ADA- Minigen in die 3' LTR-Sequenz insertiert, so daß das Provirus zwei Kopien des ADA-Minigens in jeder LTR-Sequenz enthält.

Drei RNA-Transkripte werden aus dem AAX-Provirus exprimiert, zwei durch die LTR-Sequenzen inituerte RNA-Formen, die nicht gespleißt und gespleißt sind, sowie ein drittes RNA-Transkript, das von dem intern angeordneten ADA-Promotor, der als die mRNA für die ADA-Synthese dient, exprimiert wurde. Das DCA-Provirus erzeugt ferner dieselben drei Transkripte mit der Ausnahme, daß beide ADA-Minigene als Matrizen für eine ADA- mRNA-Synthese dienen können. Die vorausgesagten (s. Text) und beobachteten (Fig. 7B) Mengen der RNA-Transkripte in den mit dem DCA-Virus infizierten Zellen sind durch die Dicke der Pfeile angegeben.

Figur 7B zeigt die RNA-Blotanalyse der die mit dem AAX- und DCA-Virus infizierten Zellen enthaltenden Überstände. Auf Formaldehyd-Agarose-Gelen fraktionierte und auf Nylonfilter geblottete, polyadenylierte RNA wurde zuerst an eine M-MuLV- U3-spezifische Sonde hybridisiert. Nach der Hybridisierung, Belichtung und Entwicklung des für Röntgenstrahlen empfindlichen Films wurde die Sonde entfernt und das Filter mit einer Human-ADA-spezifischen Sonde rehybridisiert. Um einen quantitativen Vergleich der in jeder Spur aufgetragenen RNA zu erhalten, wurde dasselbe Filter auch mit einer Humanglyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)-Sonde hybridisiert. AAX-11, DCA-18 und DCA-4 sind drei unabhängig hergestellte Viruspräparationen, die durch DNA-Blotten zur Erzeugung der vorausgesagten Proviren in den infizierten Zellen charakterisiert wurden. V und N sind die durch die LTR- Sequenzen inituerten Transkripte, die nichtgespleißte Virion- RNA (V) und die gespleißte neo-mRNA (N). ADA (die durch den ADA-Promotor inituerten RNA-Transkripte), R?, X, a und b sind weitere Transkripte, deren möglicher Ursprung im folgenden Text diskutiert wird.

Figur 7C zeigt die Ergebnisse eines weiteren Experiments gemäß Beschreibung in Fig. 7B (vgl. Text für weitere Details).

Figur 8: Human-ADA-Enzymaktivität in mit DCA- und AAX- Virus infizierten NIH-3T3-Zellen.

Die Anwesenheit des Human- und ADA-Mausisozyms in NIH- 3T3-Zellen wurde durch Cellogelelektrophorese von Zellextrakten und anschließende chemische in situ-Anfärbung bezüglich der enzymatischen ADA-Aktivität bestimmt (17, 31).

Figur 9: Schematische Diagramme einiger der Variationen auf den Sequenzen, die zwischen den beiden LTR-Sequenzen von DC-Vektoren vorhanden sein können (für eine ausführlichere, wenn auch nicht vollständige Liste vgl. Temin 1986 (18)).

Figur 10: Insertionsmodi in die 3' LTR-Sequenz.

Figur 11: DNA-Analyse der mit dem DCA-Virus infizierten NIH-3T3-Zellen.

Figur 11A zeigt die Struktur des DCA-Vektors (rekombinante DNA) und die vorausgesagte Struktur des entsprechenden Provirus in der infizierten (Target)-Zelle. Schwarze Kästchen bedeuten die viralen LTR-Sequenzen, dicke schwarze Linien bedeuten einmalige Virussequenzen und offene Kästchen bedeuten die in den retroviralen Vektor eingeführten Fremdgene, das Neo- und ADA-Minigen. Die bei dieser Analyse verwendeten Restriktionsstellen sind auch dargestellt:

N = NcoI; Bg = BglII; B = BamHI; S = StuI.

Die vorausgesagten, durch Verdauung der proviralen DNA mit einem jeden Restriktionsenzym erzeugten DNA-Fragmente sind dargestellt, wobei die Größe lediglich für die DNA-Fragmente, die mit der Neo-Sonde hybridisieren, in Kilobasenpaaren angegeben ist. Figur 11B zeigt die Ergebnisse einer DNA- Blotanalyse von mit den DCA-Virus enthaltenden Überständen infizierten NIH-3T3-Zellen.

Figur 11B zeigt, daß die Hybridisierung mit einer Neospezifischen Sonde erfolgte.

Spur 1: Nichtinfizierte NIH-3T3-Zellen;

Spuren 2 bis 5: Mit dem DCA-6-Virusüberstand infizierte Zellen, verdaut mit StuI (Spur 2), NcoI (Spur 3), BGlII (Spur 4 und BamHI (Spur 5)..

Spuren 6 bis 8: Mit BamHI verdaute zelluläre DNA aus mit drei weiteren, Virus enthaltenden Überständen infizierten NIH-3T3- Zellen; DCA-3 (Spur 6); DCA-4 (Spur 7); DCA-9 (Spur 8).

MW: Die Wanderung der durch HindIII-Verdauung in der λ-DNA erzeugten DNA-Fragmente ist in Kilobasenpaaren angegeben.

Figur 12: Mit AAX- und DCA-Virus infizierte HUT-78- und Raji-Zellen.

5 x 10&sup5; HUT-78- und Raji-Zellen wurden in 1 ml Kultur mit AAX- oder DCA-Virus infiziert und 48 h gezüchtet, bevor G418 in einer Konzentration von 0,75 mg/ml zugegeben wurde. Anschließend wurden die Zellen etwa zwei Wochen gezüchtet, bis Vergleichskulturen keine lebenden Zellen mehr enthielten. Eine M-MuLV-U3-spezifische Sonde wurde dazu verwendet, vektorspezifische RNA-Transkripte nachzuweisen. Das vermutliche ADA-Transkript, das in mit dem AAX-Virus infizierten Raji- Zellen vorhanden ist, kann bei längerem Belichten des Röntgenfilms (nicht dargestellt) gesehen werden. Eine etwa zu derselben Position wandernde Bande in mit dem AAX-Virus infizierten HUT-78-Zellen entspricht nicht dem ADA-Transkript.

Figur 13: Mit AAX- oder DCA-Virus infizierte NIH-3T3- Zellen.

Aus mit AAX- oder DCA-Virus infizierten NIH-3T3-Zellen hergestellte Zellextrakte wurden einer Elektrophorese in einer Cellogelmatrix unterzogen, wobei die Wanderung der Mäuse- und Human-ADA-Isozyme mittels eines histochemischen Färbeverfahrens bestimmt wurde (17, 31). DCA-4, DCA-18, AAX-10 und AAX-11 sind unabhängig voneinander erhaltene Viruspräparationen. Aus nichtinfizierten NIH-3T3-Zellen und Humanknochenmark (HEM)- Zellen hergestellte Extrakte wurden dazu verwendet, um zwischen dem endogenen Mausisozym bzw. dem vektortransduzierten Humanisozym zu unterscheiden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen retroviralen Vektor zur Einführung von DNA mit Codierung für eine Transkriptionseinheit mit der Fähigkeit, funktionell in der eukaryontischen Zellen exprimiert zu werden, in eine eukaryontische Zelle, wobei der retrovirale Vektor eine erste DNA-Sequenz, bei der es sich um das reverse Transkript mindestens eines Teils eines Retrovirus, wobei der Teil sowohl die 5' LTR-Sequenz als auch die 3' LTR-Sequenz des Retrovirus umfaßt, handelt, und eine zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die ausschließlich in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz insertierte Transkriptionseinheit umfaßt. Die Transkriptionseinheit kann praktisch jede beliebige DNA-Sequenz mit der Fähigkeit, in RNA transkribiert zu werden, sein, unabhängig davon, ob eine derartige RNA nachfolgend in ein Polypeptid transiatiert wird, beispielsweise eine Antisense-RNA-Sequenz, d.h. eine Sequenz, die zu dem gesamten oder einem Teil eines anderen in der Wirtzelle vorhandenen RNA-Moleküls komplementär ist.

Der Fachmann auf dem einschlagigen Fachgebiet erkennt ohne Schwierigkeiten, daß eine Reihe von Retroviren zur Konstruktion des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors verwendet werden kann. Zu derartigen Retroviren gehören die Affensarkomviren (AvSV), Mäusesarkomviren (MuSV) und Leukämieviren, wie die Mäuseleukämieviren, beispielsweise das Mäuse- Moloney-Leukämivirus (M-MuLV). Besonders geeignet als retroviraler Vektor bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung ist das Mäuse-Moloney-Leukämivirus (M-MuLV).

In einer Ausführungsform handelt es sich bei der ersten DNA-Sequenz um das reverse Transkript des gesamten Retrovirus. In einer anderen Ausführungsform ist die erste DNA-Sequenz das reverse Transkript eines Teils des Retrovirus, wobei der Teil sowohl die 5' LTR-Sequenz als auch die 3' LTR-Sequenz des Retrovirus umfaßt. Geeignet als die erste DNA-Sequenz bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung ist der retrovirale Vektor N2.

In einer weiteren Ausführungsform codiert die zweite DNA- Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für das Human-ADA-Minigen. In einer anderen Ausführungsform codiert die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für eine Bindungssequenz, die einem eukaryontischen Promotor für Polymerase 1, Polymerase II oder Polymerase III entspricht. Dem Fachmann auf dem einschlägigem Fachgebiet ist bekannt, daß die eukaryontische Polymerase I ribosomale Gene transkribiert, daß die eukaryontische Polymerase II für die Expression der für Proteine codierenden zellulären Gene verantwortlich ist und daß die eukaryontische Polymerase III die 5S- und t-RNA-Gene der Zelle transkribiert. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung codiert die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für eine einer prokaryontischen Polymerase entsprechende Bindungssequenz, beispielsweise T7-Polymerase.

Die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit kann ferner für eine RNA-Sequenz, beispielsweise eine Antisense-RNA oder mRNA, oder ein interessierendes Polypeptide codieren. Die Antisense-RNA kann eine RNA-Sequenz sein, die zu einer durch ein Pathogen, wie ein Bakterium, ein Parasit oder ein Virus, z.B. das Human-Immunodeficienz-Virus (HIV), codierten Nukleotidsequenz komplementär ist. Die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit kann ferner für eine RNA codieren, bei der es sich um die Erkennungssequenz für das DNA- oder RNA-Bindungsprotein handelt. Das durch die zweite DNA-Transkriptionseinheit codierte Polypeptid kann - ohne darauf begrenzt zu sein - für Säugetierpolypeptide oder -proteine, wie das Hämoglobinprotein, codieren. Die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit kann ferner für ein selektierbares oder identifizierbares phänotypisches Merkmal, beispielsweise eine Resistenz gegen Antibiotika, beispielsweise Ampicillin, Tetracyclin oder Neomycin, codieren oder sie kann ein nichtselektierbares Gen umfassen.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein retroviraler Vektor, der des weiteren eine nichtretrovirale DNA-Sequenz umfaßt, die zwischen der 5'- und 3' LTR-Sequenz des Retrovirusvektors vorhanden ist. Diese nichtretrovirale DNA-Sequenz kann für ein selektierbares oder identifizierbares phänotypisches Merkmal codieren. Ein derartiges Merkmal kann eine Resistenz gegenüber Antibiotika, wie Ampicillin, Tetracyclin oder Neomycin, sein. In einem anderen Aspekt kann diese weitere Sequenz ein nichtselektierbares Gen umfassen (bezüglich Beispiele hierfür vgl. Fig. 9 und Temin, 1986 (18)).

Gegenstand einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein retroviraler Vektor, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für eine Transkriptionseinheit ausschließlich in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz insertiert ist. Im Einklang mit der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung kann die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit in eine beliebige Stelle im U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz oder alternativ stromauf der Enhancer- und Promotorsequenzen im U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz insertiert werden. In einer weiteren Möglichkeit wird die zweite DNA-Sequenz beim U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz stromab der Enhancersequenz insertiert. In einer weiteren Ausführungsform wird die zweite DNA-Sequenz im U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz, insbesondere stromab der Promotorsequenz insertiert. Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein retroviraler Vektor gemäß der obigen Beschreibung, wobei der Enhancer und/oder Promotor des U3-Bereichs der 3' LTR-Sequenz beispielsweise durch Mutation deletiert oder mutiert sind.

Die zur Herstellung des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors verwendeten Verfahren sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt und im folgenden im Abschnitt experimentelle Details und Diskussion vollständiger beschrieben. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Virions mit Eignung zur Einführung von DNA mit Codierung für eine Transkriptionseinheit in eine eukaryontische Zelle durch Transfizieren des oben beschriebenen retroviralen Vektors in eine geeignete Verpackungszellinie unter derartigen Bedingungen, daß das Virion in der Verpackungszellinie gebildet und durch die Verpackungszellinie ausgeschleust wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein durch ein derartiges Verfahren hergestelltes Virion.

Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Virionen sind dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet auch bekannt. Sie werden später beispielhaft im Abschnitt experimentelle Details und Beschreibung veranschaulicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Einführung einer DNA-Transkriptionseinheit in eine eukaryontische Zelle durch Infizieren der Zelle mit einem nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Virion unter derartigen Bedingungen, daß die DNA-Transkriptionseinheit in die chromosomale DNA der eukaryontischen Zelle eingebaut wird. In einer Ausführungsform ist die eukaryontische Zelle eine Säugetierzelle, beispielsweise eine hämopoetische Stammzelle.

Infektionsverfahren und Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit der Produkte der Transkriptionseinheiten oder Gene, d.h. von DNA mit Codierung für ein interessierendes Polypeptid oder Protein, sind auch auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt (wie beispielhaft im nächsten Abschnitt veranschaulicht wird).

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Abschnitten "experimentelle Details" und "Diskussion" weiter veranschaulicht. Diese Abschnitte sollen das Verständnis der vorliegenden Erfindung verbessern, sie sollen jedoch die vorliegende Erfindung, wie sie durch die folgenden Patentansprüche definiert ist, in keinster Weise einschränken.

Prinzip der double copy (DC)-Retrovirusvektoren

Der folgende Abschnitt beschreibt die erfindungsgemäße Gestaltung retroviraler Vektoren mit Eignung zur Expression des transduzierten Gens durch Beseitigung der Störung durch das retrovirale Readthrough-Transkript, das von der retroviralen LTR-Sequenz herstammt. Diese Strategie unterscheidet sich von der der SIN-Vektoren und ist dieser überlegen.

DC-Vektoren benutzen das bei der Ausgestaltung von SIN- Vektoren verwendete gleiche Prinzip, d.h. daß Sequenzen in der 3' LTR-Sequenz eines Provirus (dem U3-Bereich) auf beide LTR- Sequenzen des nachkommenden Provirus "übertragen" werden (23). In SIN-Vektoren wurde dieses Prinzip durch Einführen einer Deletion in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz zur Eliminierung der Enhancer- und Promotorsequenzen unter Herbeiführung einer Inaktivierung der viralen Transkriptionseinheit ausgenutzt. Dieses Prinzip wurde ferner für die Transduktion eines prokaryontischen t-RNA-Suppressorgens in bezüglich Replikation kompetenten Retroviren zum Zwecke der Selektion in Bakterienzeilen und nicht zur Expression transduzierter Gene in eukaryontischen Zellen erforscht. Die Insertion des t-RNA-Gens in den U3-Bereich der LTR-Sequenz erfolgte, um das Aufbrechen der essentiellen retroviralen Gene zu vermeiden und nicht um den mit diesem Verfahren verbundenen Duplikationsvorgang zu erforschen (12, 16).

In SIN-Vektoren, Vektoren vom VIP-Typ und in der Tat in allen bisher konstruierten retroviralen Vektoren befindet sich das transduzierte Gen, d.h. das Gen, dessen Expression in der eukaryontischen Zellen angestrebt wird, in allen Fällen zwischen den beiden LTR-Sequenzen, so daß sich die Position des Gens in der infizierten Zelle, bezogen auf die beiden LTR-Sequenzen, nicht verändert. Das einzigartige Merkmal der DC-Vektorengemäß Darstellung in Fig. 3 ist, daß sich das transduzierte Gen im U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz befindet. Figur 4 zeigt, daß in einer infizierten Zelle das Gen ferner auf die 5' LTR-Sequenz übertragen wird, wodurch zwei Kopien des transduzierten Gens hergestellt werden (daher der Name double-copy-Vektor). Das wichtige Ergebnis ist, daß das Gen in seiner neuen Position in der 5' LTR-Sequenz physikalisch außerhalb der retroviralen Transkriptionseinheit angeordnet ist, wodurch die negativen Wirkungen der retroviralen Transkriptionseinheit beseitigt oder zumindest verringert werden (Fig. 4).

DC-Vektoren auf N2-Basis zur Transduktion von Minigenen

Dieser Abschnitt beschreibt einen speziellen DC-Vektor, um das erfindungsgemäße Vektorgestaltungsprinzip zu veranschaulichen. Dieser spezielle Vektor basiert auf dem einen hohen Titer liefernden N2-Vektor und enthält das menschliche ADA-Minigen. Das 2082 Basenpaare (bp) lange ADA-Minigen besteht aus dem ADA-Promotor, der sich über 730 bp stromauf der RNA-Startstelle erstreckt, und den ADA-Codiersequenzen, aus denen die Polyadenylierungssignalsequenz AAUAAA entfernt wurde (20, 21). Das ADA-Minigen wurde in die 3' LTR-Sequenz des N2- Vektors in einer Transkriptionsrichtung, die parallel zu der Virustranskriptionseinheit ist, insertiert. Die Charakterisierung dieses im folgenden beschriebenen Vektors zeigt, daß DC- Vektoren gemäß der Vorhersage arbeiten. Ferner zeigt sie die weiteren Vorteile dieser speziellen Version der DC-Vektorausgestaltung.

Minigene tragende VIP-Vektoren werden häufig in Untersuchungen über einen retroviralen Gentransfer verwendet. Diese Strategie wurde zur Transduktion des Human-ADA-Gens verwendet (1, 11). Wie in Fig 5A dargestellt, wurde in diesen Untersuchungen der einen hohen Titer liefernde N2-Vektor verwendet, wobei das ADA-Minigen stromab des Neo-Gens zwischen die beiden LTR-Sequenzen insertiert wurde.

In einem Konstrukt wurde der Early-SV40-Promotor an die Human-ADA-CDNA fusioniert (SAX). Dieser Vektor wurde zur Expression des ADA-Gens in Mäusefibroblastzellen (1), geschaffenem Humanlymphoidzellen (11) und Knochenmarkzellen von Patienten mit ADA-Mangel (Bordignon und Mitarbeiter, PNAS, im Druck) verwendet. Jüngst wurde ein neuer Vektor konstruiert und in Untersuchungen von Bordignon und Mitarbeitern (PNAS, im Druck) verwendet. In diesen Untersuchungen war die ADA-cDNA an ihren eigenen Promotor (AAX), der in gleicher Weise aktiv, dem SAX- Vektor jedoch nicht überlegen ist, fusioniert (vgl. auch die Darstellung in Fig. 5A). Figur 5A zeigt ferner die Struktur der SAX- und AAX-Vektoren und der entsprechenden RNA-Transkripte, die in den mit den Vektoren infizierten Zellen vorhanden sind. Es sei darauf hingewiesen, daß die Struktur der Vektor-DNA gemäß in vitro-Konstruktion der Struktur der Provirus-DNA in der infizierten Zelle entspricht. Die beiden langen Transkripte, die von SAX oder AAX erzeugt wurden, haben ihren Anfang in der 5' LTR-Sequenz vom retroviralen Promotor und enden in der 3' LTR-Sequenz, die das Polyadenylierungssignal enthält. Die nichtgespleißte RNA- Spezies ist die Virion-RNA und die gespleißte Form dient als die mRNA für die Expression des Neo-Gens. Das kürzere Transkript, die mRNA für das ADA-Gen, hat ihren Anfang im internen Promotor, SV40 oder ADA, wobei die Transkripte aufgrund des Fehlens eines Polyadenylierungssignals im Minigen in der viralen 3' LTR-Sequenz an derselben Stelle enden, die durch die von der LTR-Sequenz herstammenden Transkripte verwendet wird. Die interne ADA-mRNA wird durch eine gestrichelte Linie dargestellt, um zu veranschaulichen, daß das Expressionsniveau der durch internen Promotor hervorgebrachten Transkripte unvorhersagbar und häufig niedrig ist (bezüglich weiterer Details vgl. Armentano und Mitarbeiter, 1987 (1)).

Die Struktur eines DC-Vektors, der das ADA-Minigen trägt (als DCA bezeichnet), ist in Fig. 5B dargestellt. Dieser spezielle Vektor basiert auf dem N2-Vektor und dem menschlichen ADA-Minigen, das in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz stromauf des viralen Enhancers insertiert wurde. Zur Konstruktion des DCA-Vektors wurde der N2-Vektor zuerst durch Insertion einer 52 bp langen Polylinkersequenz in eine in der 3' LTR-Sequenz vorhandene NheI-Stelle 30 Basenpaare stromab vom 5'-Ende der 3' LTR-Sequenz modifiziert. Die Polylinkersequenz enthält fünf Restriktionsstellen, die im N2-Plasmid einzig sind: ApaO, BglII, SnaBI, SacII und MluI. Da die Insertion der Polylinkersequenz in die NheI-Stelle die Virusintegration stören kann, wurde die Polylinkersequenz so ausgestaltet, daß sie weitere 16 Basenpaare der viralen Sequenz stromab der NheI- Stelle regeneriert. Somit enthält der durch den Polylinker modifizierte N2-Vektor mit der Bezeichnung N2A insgesamt 50 Basenpaare viraler Sequenz stromab des 5'-Endes der LTR-Sequenz, bevor er mit der fremden Sequenz zusammentrifft. Das ADA-Minigen wurde in die einzelne, in dem Polylinker vorhandene SnaBI- Stelle insertiert.

Wie bei AAX nutzen die ADA-Transkripte, da dem ADA-Minigen ein Polyadenylierungssignal fehlt, auch das virale Polyadenylierungssignal und enden an derselben Stelle, wie sie durch die LTR-Transkripte verwendet wird. Dieses Merkmal, das Fehlen eines Polyadenylierungssignals in dem transduzierten Gen und die damit einhergehende Verwendung des retroviralen Signals, stattet diese Untergruppe von DC-Vektoren mit weiteren geeigneten Eigenschaften (wie im folgenden beschrieben wird) aus.

Figur 5B zeigt, daß in der infizierten Zelle, d.h. der Targetzelle, das ADA-Minigen auch auf die 5' LTR-Sequenz übertragen wird, was zu dem unmittelbaren Ergebnis der Duplizierung des transduzierten Gens in der infizierten Zelle führt (vgl. auch Fig. 4). Die wichtigste Konsequenz dieser Duplizierung basierend auf der Ausgestaltung des DC-Vektors ist die, daß die Kopie das ADA-Minigens in der 5' LTR-Sequenz außerhalb der retroviralen Transkriptionseinheit vorhanden ist und folglich ihre Aktivität durch eine retrovirale Readthrough-Transkriptionseinheit weniger beeinträchtigt wird.

Wie in Fig. 5B dargestellt, enthält dieser spezielle DC- Vektor ein Minigen, das das virale Polyadenylierungssignal nutzt. Dies gilt nicht nur für das in der 3' LTR-Sequenz gelegene Minigen, sondern auch für das in der 5' LTR-Sequenz enthaltende Minigen in der infizierten Zelle, die das in der 5' LTR-Sequenz codierte Polyadenylierungssignal ausnutzt. Figur 5B veranschaulicht ferner die Tatsache, daß eine Initiation der RNA-Transkription gemäß Definition durch die Grenze zwischen dem U3- und R-Bereich in der LTR-Sequenz der Polyadenylierungsstelle gemäß Definition durch die Grenze zwischen dem R- und U5-Bereich vorangeht. Folglich überlappt das ADA- Gentranskript in der 5' LTR-Sequenz teilweise mit der retroviralen Transkriptionseinheit durch den Bereich R hindurch. Mit anderen Worten, sollte mit dem Transfer der ADA-Transkriptionseinheit in die 5' LTR-Sequenz die retrovirale Transkriptionseinheit und ihre Expression gehemmt werden. Dies wird in Fig. 5B dargestellt, wo die viralen Transkripte durch gestrichelte Linien dargestellt werden. Wenn dies so ist, ist vernünftigerweise davon auszugehen, daß der Hemmeffekt der retroviralen Transkriptionseinheit auf das in der 3' LTR-Sequenz gelegene ADA-Transkript auch gelindert wird, wie dies durch die Tatsache angezeigt wird, daß das 3' gelegene ADA-Minigen nun in der infizierten Stelle durch eine fette Linie dargestellt wird. Dies ist, wie in Fig. 7 dargestellt, in der Tat der Fall. Vermutlich die bedeutendste Konsequenz der Beseitigung oder Verringerung der Aktivität der viralen Transkriptionseinheit ist die parallele Verringerung des Auftretens von Rekombinationsvorgängen, wodurch es zur Bildung von bezüglich Replikation kompetenten Retroviren kommt (ein mit der Verwendung von Retroviren für die Humantherapie verbundenes Hauptanliegen).

Transfer und Expression des ADA-Gens und Verwendung eines DCA- Vektors

Dieser Abschnitt liefert experimentelle Beweise für die Funktion und die charakteristischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen DC-Vektoren, die beispielhaft durch den in Fig. 5B dargestellten DCA-Vektor veranschaulicht sind.

Transfer des ADA-Minigens in die 5' LTR-Sequenz: Das Duplikationsverfahren

Die Konstruktion des DCA-Vektors und Herleitung des entsprechenden Virus erfolgten nach etablierten Verfahren. Kurz gesagt wurde die das ADA-Minigen tragende rekombinante DNA nach standardisierten rekombinanten DNA-Techniken erzeugt und gemäß dem folgenden Vorgehen in ein retrovirales Virion umgewandelt. PA317-Verpackungs-Zellen (13) wurden mit der DCA-DNA transfiziert und in einem 0,7 mg/ml G418 zur Selektion bezüglich das in dem DCA-Vektor enthaltende Neo-Gen exprimierender Zellen enthaltenden Medium gezüchtet, worauf G418-resistente Kolonien isoliert und zu Zellinien vermehrt wurden. Der Überstand einer jeden Zellinie wurde anschließend bezüglich der Anwesenheit von DCA-Viren getestet. Zuerst wurde der Virustiter durch Infizieren von NIH-3T3-Zellen mit seriellen Verdünnungen und durch Züchten der Zellen in Gegenwart von G418 bestimmt. Drei von 10 Zellinien erzeugten hohe Titer des Neo enthaltenden Virus (2 x 10&sup4; bis 1,0 x 10&sup5; Neo cfu/ml). In diesem Experiment lieferte ein als Vergleich verwendeter Titer-AAX-Virusüberstand (vgl. Fig. 5A) 2 x 10&sup4; cfu/ml. Daraus kann geschlossen werden, daß der DCA-Vektor hohe Virustiter liefert, die für Vektoren auf N2-Basis charakteristisch sind.

Als nächstes wurde bestimmt, ob das ADA-Minigen in den infizierten Zellen dupliziert wurde (vgl. Fig. 5B). Um dies zu tun, wurde der DNA-Gehalt der mit den einen hohen Titer aufweisenden DCA-Überständen infizierten NIH-3T3-Zellen durch DNA-Blotten analysiert. Chromosomale DNA wurde unter Verwendung eines Guanidiumisothiocyanatextraktionsvorgehens (24) hergestellt. Die DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, einer Elektrophorese in 1% Agarosegelen (10 µg pro Spur) unterzogen, auf ein Nylonfilter (Biotrans , ICN) unter Verwendung einer Elektroblotvorrichtung (Biorad ) übertragen, mit einer ³²P-markierten speziellen Sonde hybridisiert und auf einen für Röntgenstrahlen empfindlichen Film (Kodak XAR5) in Gegenwart von Verstärkungsschirmen (Dupont Cronex lighting plus) belichtet.

Die Figuren 6 und 11 zeigen die.DNA-Analyse der mit DCA- Virus infizierten NIH-3T3-Zellen. Die Figuren 5b und 11A zeigen, daß das DCA-DNA-Konstrukt in dem,in der 3' LTR-Sequenz vorhandenen ADA-Minigen eine BHI-Stelle enthält. Wenn das ADA- Minigen auf die 5' LTR-Sequenz übertragen wird, wird in den infizierten Zellen ein etwa 5,1 kb langes charakteristisches BHI-DNA-Fragment erzeugt. In der Tat wird in jedem Fall, wenn mit dem DCA-Virus infizierte NIH 3T3-Zell-DNA mit BHI verdaut wird, ein DNA-Fragment der erwarteten Größe erzeugt (vgl. Fig. 6 und 11B).

Wie oben ausgeführt, zeigt Fig. 11A, daß eine einzelne BamHI-Restriktionsstelle in der DCA-Vektor-DNA vorhanden ist, wobei, wenn die 2,7 kb große Hybrid-LTR-Sequenz am 5'-Ende der proviralen DNA dupliziert wird, in den infizierten Zellen ein charakteristisches, 5,1 kb langes DNA-Fragment, das mit der Neo-Sonde hybridisiert, erzeugt wird. Wie in Fig. 11B, Spuren 5-8 dargestellt, liefert eine Infektion von NIH-3T3-Zellen mit vier unabhängig abgeleiteten, DCA-Virus enthaltenden Überständen die vorausgesagte 5,1 kb DNA-Bande. Weitere in den Spuren 6 und 8 vorhandene Banden zeigen, daß die entsprechenden Viruspräparationen auch Virus enthalten, das Umlagerungen vermutlich während der Transfektion der PA317-Zellen mit der Vektor-DNA durchlaufen hat. Eine Restriktionsanalyse unter Verwendung der Restriktionsenzyme StuI, BglII und NcoI steht ferner im Einklang mit der akuraten Duplikation der Hybrid-3'- LTR-Sequenz in den infizierten Zellen (Fig. 11B, Spuren 2, 3, 4 und begleitendes Diagramm in Fig. 11A).

Expression des ADA-Minigens in mit DCA- und AAX-Virus infizierten NIH-3T3-Zellen

Eine Expression des ADA-Minigens in infizierten Zellen wurde durch Analysieren bezüglich

(a) der Anwesenheit vektorspezifischer RNA-Transkripte in der Zelle und

(b) des Auftretens enzymatischer Aktivität entsprechend dem Human-ADA-Genprodukt

bestimmt. Gesamtzell-RNA (sowohl nukleare als auch cytoplasmische) wurde unter Verwendung des Guanadiumisothiocyanatextraktionsvorgehens (24) hergestellt. Die Gesamtzell-RNA wurde auf Oligo (dt)-Cellulosesäulen fraktioniert, worauf die Poly-A&spplus;- RNA-Fraktion einer Elektrophorese in 1% Agaroseformaldehydgelen (25) unterzogen wurde. Die vektorspezifischen RNA-Spezies wurden nach Elektroblotten auf Nylonfilter, Hybridisieren mit ³²P-markierten Sonden und Belichten auf einen für Röntgenstrahlen empfindlichen Film in Gegenwart von Verstärkungsschirmen identifiziert. In diesen Experimenten wurde die Expression des ADA-Gens aus dem DCA-Vektor mit der aus AAX (einem herkömmlichen Vektor) verglichen (vgl. Fig. 7A sowie 5A und 5B).

AAX ähnelt dem DCA-Vektor, mit der Ausnahme, daß das ADA- Minigen an einer Stelle stromab des Neo-Gens 457 Basenpaare stromauf von der Klonierungsstelle im DCA-Vektor insertiert ist. Die Fig. 7A und 5 zeigen die Struktur der von AAX und DCA herrührenden Proviren und der vorausgesagten, von der viralen LTR-Sequenz und dem ADA-Promotor in den NIH-3T3-Zellen exprimierten RNA-Spezies. Vektoren auf N2-Basis erzeugen zwei von LTR-Sequenzen herrührende Transkripte, eine nichtgespleißte RNA-Spezies und eine gepleißte RNA-Form (Fig. 7A, Virion-RNA bzw. Neo-RNA). Eine dritte RNA-Spezies wird von dem internen ADA-Promotor exprimiert (1). Alle drei RNA- Transkripte enden an der Polyadenylierungsstelle, die in der viralen LTR-Sequenz (an der R/US-Verbindung) vorhanden ist. Die beiden durch LTR-Sequenzen inituerten Transkripte, die vom AAX- und DCA-Vektor erzeugt wurden, besitzen eine identische Größe, obwohl das durch den ADA-Promotor inituerte und von dem DCA-Vektor exprimierte Transkript 457 Nukleotide kürzer sein sollte als das entsprechende mit der AAX-Matrize synthetisierte Transkript. Figur 7A zeigt ferner, daß in dem DCA-Provirus in der 5' LTR-Sequenz eine zweite Kopie des ADA- Minigens vorhanden ist, so daß zwei ADA-Transkripte pro Provirus erzeugt werden. Wenn das durch die LTR-Sequenz inituerte Readthrough-Transkript die Aktivität der internen Promotoren hemmt, verstärkt die Anordnung des ADA-Minigens in der 5' LTR-Sequenz die Expression von ADA in das DCA-Provirus beherbergenden Zellen, verglichen mit das AAX-Provirus beherbergenden Zellen.

Figur 7B zeigt die spezielle in mit dem AAX- und DCA-Virus infizierten NIH-3T3-Zellen exprimierte RNA-Spezies. Mit dem DCA-Vektor infizierte Zellen exprimieren verglichen mit mit dem AAX-Vektor infizierten Zellen 10- bis 20fach höhere Mengen von durch den ADA-Promotor inituerten Transkripten. (Die relativen Mengen der RNA-Transkripte wurden durch Aufnehmen von Autoradiogrammen zu wechselnden Zeitpunkten und Korrigieren bezüglich der kleinen Schwankungen der in jeder Spur aufgetragenen RNA bestimmt.) Diese Differenz der RNA-Expression steht im Einklang mit der Voraussage, daß die Anordnung einer Kopie des ADA-Minigens außerhalb der viralen LTR-Sequenz die Hemmwirkung eines stromauf gelegenen Promotors auf die Aktivität eines stromab gelegenen Promotors verringert. (Es ist nicht möglich, experimentell zu bestimmen, ob eine oder beide Kopien des ADA-Minigens in dem DCA-Provirus gleichermaßen zur ADA-Expression ihren Beitrag leisten.) Aus dieser Analyse ist ferner ersichtlich, daß in mit dem DCA-Virus infizierten Zellen die Expression der durch die LTR-Sequenz inituerten Transkripte (Fig. 7B, V und N) verringert wird. (Die nichtgespleißte RNA-Form (V) wird 3- bis Sfach verringert, die gespleißte RNA-Form (N) wird 10- bis isfach verringert.) Dies steht auch im Einklang mit den Beobachtungen, daß Readthrough- Transkripte die Aktivität der internen Promotoren hemmen, da das durch den ADA-Promotor inituerte Transkript in der 5' LTR-Sequenz den Virusenhancer/Promotor-Bereich, der mit den durch die LTR-Sequenz inituerten Transkripten über einen kurzen Bereich hinweg überlappt, überkreuzt, bzw. ihm entgegenläuft. Obwohl eine experimentelle Untersuchung in diesem Fall nicht möglich ist, sollte eine verringerte Expression der durch die LTR-Sequenz inituerten Transkripte ebenfalls die Transkription von dem 3' gelegenen ADA-Minigen vermehren. (Dies wird durch die Dicke des entsprechenden Pfeils in Fig. 7A angegeben). Weitere RNA-Spezies können auch in den infizierten Zellen nachgewiesen werden (vgl. Fig. 7B). Eine langsam wandernde BNA-Spezies in mit DCA-Virus infizierten Zellen mit der Bezeichnung R? in Fig. 7B kann ein von dem 5'-gelegenen ADA-Promotor der in der 3' LTR-Sequenz des Provirus endet, inituertes Readthrough-Transkript darstellen. Zwei RNA-Spezies mit den Bezeichnugnen a und b, die lediglich mit der M-MuLV-U3-Sonde in mit einem DCA- Virusisolat infizierten Zellen nachgewiesen wurden, wandern gemeinsam mit den durch den N2-Elternvektor (N2 parenal vector) erzeugten Transkripten (nicht dargestellt). Höchstwahrscheinlich spiegeln diese beiden RNA-Spezies einen Rekombinationsvorgang wider, der zwischen den beiden LTR-Sequenzen des DCA-Vektors während der Transfektion der PA317-Zellen ablief. Eine Rekombination zwischen nicht identischen LTR-Sequenzen unter ähnlichen Umständen wurde früher bereits beobachtet (23). Die Natur der RNA-Spezies mit der Bezeichnung X in Fig. 7B, die in allen mit dem DCA-Virus infizierten Zellen auftritt, ist unklar.

Figur 7C ist ein weiteres Experiment, das wie die in Fig. 7B dargestellten Experimente zeigt, daß mit dem AAX-Virus infizierte Zellen die drei erwarteten Banden erzeugen (vgl. Fig. 5A und Armentano und Mitarbeiter, 1987 (1)). Die Banden a und b entsprechen den durch die LTR-Sequenzen inituerten Transkripten, der Virion-RNA und Neo-mRNA, und die Bande c enspricht dem durch den ADA-Promotor inituerten Transkript, der mRNA für das ADA-Genprodukt. Wie in Fig. 7C dargestellt und aus der Intensität der drei Banden beurteilt werden kann, ähneln sich die Gleichgewichtsmengen der drei aus dem AAX- Provirus exprimierten Transkripte. Mit dem DCA-Virus infizierte NIH-3T3-Zellen exprimieren auch verschiedene vektorspezifische RNA-Transkripte. In diesem Fall ist die vorwiegende RNA-Spezies (Bande c*) das kurze Transkript, das der durch den ADA-Promotor inituerten ADA-mRNA entspricht. Die in der 5' LTR-Sequenz inituerten Virustranskripte sind, wenn auch nachweisbar, in merklich geringeren Mengen vorhanden (die beiden Banden in den Spuren DCA-3 und DCA-6, die etwas langsamer wandern als die Banden a und b in der AAX-Spur).

Die Schlüsse aus diesen Experimenten sind:

(1) daß das durch den ADA-Promotor inituerte RNA-Transkript von dem DCA-Vektor exprimiert wird. Obwohl die Menge der in mit dem AAX-Vektor und DCA-Vektor infizierten Zellen gebildeten Transkripte bei diesem und anderen Experimenten nicht genau quantifiziert werden kann, scheint es, daß (1) mit dem DCA-Virus infizierte Zellen 10- bis 20fach höhere Mengen ADA-spezifische Transkripte und des entsprechenden Genprodukts (vgl. auch Fig. 8) exprimieren.

(2) Es wird die Voraussage des in Fig. 7C dargestellten Experiments bestätigt, daß der Transfer des ADA-Minigens in die 5' LTR-Sequenz die Synthese der durch die LTR-Sequenzen gesteuerten Transkripte unterdrückt.

Auftreten einer Human-ADA-Aktivität in mit dem DCA- und AAX- Virus infizierten NIH-3T3-Zellen

Um zu zeigen, daß eine Infektion der Zellen mit dem DCA- Virus zur Synthese eines biologisch aktiven Genprodukts führt, wurden die infizierten Zellen bezüglich der Anwesenheit einer enzymatischen ADA-Aktivität entsprechend dem Humanisozym analysiert. Dazu wurden die Zellextrakte einer Elektrophorese in einer Cellogelmatrix unter Bedingungen, die das endogene Maus-ADA-Enzym von dem Humanisozym trennen, unterzogen. Danach wurde das Cellogel bezüglich der Anwesenheit einer ADA-Aktivität "angefärbt". Die Figuren 8 und 13 zeigen, daß sowohl mit dem DCA-Virus als auch mit dem AXX-Virus infizierte Zellen, jedoch nicht nichtinfizierte Zellen, das Human-ADA-Isozym neben dem Mausenzym exprimieren und daß mit dem DCA-Virus infizierte Zellen höhere Niveaus einer enzymatischen Human-ADA- Aktivität enthalten (vgl. die Bandenintensität von Human-ADA in der DCA- und AAX-Spur relativ zu den Mäuse-ADA-Banden (Fig. 8 und 13)).

Es wurde beobachtet, daß das ADA-Transkript in mehreren Humanlymphoidzellinien, die mit dem AAX-Vektor transduziert wurden, wie in HUT-78- und Raji-Zellen, schlecht exprimiert wird (Yu und Gilboa, unveröffentlichte Ergebnisse). Folglich war es von beachtlichem Interesse zu sehen, ob eine DC-Vektorausgestaltung für eine Expression des ADA-Gens in diesen Zellinien besser geeignet ist. Wie in Fig. 12 dargestellt, sind in mit dem AAX-Vektor infizierten HUT-78- und Raji-Zellen die durch den internen ADA-Promotor gesteuerten Transkripte kaum nachweisbar. Andererseits sind merklich höhere Mengen an ADA-Transkripten in den DCA-Vektor beherbergenden Zellen vorhanden. Dies liefert weitere Anzeichen für die potentielle Eignung dieses Typs der Vektorausgestaltung.

Experimentelle Diskussion

Double copy- oder DC-Retrovirusvektoren wurden als Antwort auf die Probleme in Verbindung mit der Expression retroviral getragener Gene geschaffen. Das einzigartige Merkmal der DC-Vektoren ist, daß das Fremdgen in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz des Vektors insertiert ist. Dies führt zur Duplikation des Gens und der Transposition des Gens in die 5' LTR- Sequenz außerhalb der retroviralen Transkriptionseinheit. Die Eignung des DC-Vektordesigns wurde unter Verwendung eines 2,1 kb langen ADA-Minigens, das in die 3' LTR-Sequenz des das Neo- Gen enthaltenden retroviralen Vektors N2 insertiert wurde, getestet. Eine DNA-Analyse zeigte, daß die 2,7 kb lange chimäre LTR-Sequenz in den infizierten Zellen zuverlässig dupliziert wurde (Fig. 6 und 11). Mehrere Studien haben die Insertion kurzer DNA-Sequenzen in die 3' LTR-Sequenz von Retroviren, wodurch virale Funktionen nicht in widriger Weise beeinträchtigt werden, beschrieben (12, 16, 26). Was für Einschränkungen kann es bei der Insertion von fremden Sequenzen in den U3-Bereich der retroviralen LTR-Sequenz geben? Im Falle einer retroviralen Replikation umfaßt die Duplikation der LTR-Sequenz und die Transposition in das 5'-Ende eine Actinomycin D-empfindliche Stufe, in der sich die reverse Transkriptase einer doppelsträngigen DNA als Matrize bedient, um eine zweite Kopie der LTR-Sequenz zu erzeugen (19). Es gibt keine Hinweise für die Vermutung, daß diese Stufe durch die Insertion weiterer Sequenzen in die LTR-Sequenz signifikant beeinträchtigt wird. Man ist versucht zu spekulieren, daß - mit wahrscheinlichen Ausnahmen - eine Insertion von fremden Sequenzen in die LTR- Sequenz toleriert wird, vorausgesetzt, daß sie keine essentiellen Virusfunktionen beeinträchtigt. Wenn dies so ist, sind die Einschränkungen bezüglich Zusammensetzung und Länge der in die LTR-Sequenz insertierten Sequenzen dieselben Beschränkungen, die zu berücksichtigen sind, wenn fremde Gene in retrovirale Vektoren insertiert werden. Die Haupteinschränkung ist hierbei die Verpackungsfähigkeit der entsprechenden BNA in bzw. zu Virionen. Eine zweite mögliche Einschränkung kann die Stabilität der lange direkte Repeats enthaltenden Proviren sein (27). Beispielsweise sollte der in dieser Untersuchung verwendete, von M-MuLV herrührende DC-Vektor über 6 kp lange fremde Sequenzen in der LTR-Sequenz unterbringen können.

Die Hauptvorhersage bei der Ausgestaltung der DC-Vektoren war, daß die Transposition des Gens in die 5' LTR-Sequenz außerhalb der retroviralen Transkriptionseinheit deren Expression verstärkt. Die in den Fig. 7, 8, 12 und 13 zusammengefaß ten Experimente zeigen, daß die Expression des ADA-Gens von einem DC-Vektor in den drei getesteten Zellinien (NIH-3T3- Zellen, HUT-78-Zellen und Raji-Zellen) signifikant erhöht wird. Dies und die Verringerung der durch LTR-Sequenzen inituerten Transkripte (Fig. 7B) steht im Einklang mit vorherigen Beobachtungen, daß stromauf gelegene Promotoren eine Hemmwirkung auf stromab gelegene Promotoren ausüben (5, 11,28). Ferner können diese Ergebnisse einige der Probleme in Verbindung mit der Expression retroviral getragener Gene von internen Promotoren erklären (29, 30).

In früheren Studien wurde ein prokaryontisches t-RNA-Gen in die 3' LTR-Sequenz des bezüglich Replikation kompetenten Mäuseretrovirus M-MuLV insertiert (12, 16). In diesem Fall wurde das t-RNA-Gen in Bakterien exprimiert und als selektierbarer Marker während einer molekularen Klonierung in Bakterien verwendet. Da es seinen prokaryontischen Ursprung nicht verwendete, war eine Funktion in eukaryontischen Zellen nicht absehbar. Die hier beschriebene Untersuchung ist der erste Fall, in dem eine DNA-Sequenz in die 3' LTR-Sequenz eines von Retroviren herstammenden Vektors insertiert und in einer eukaryontischen Zelle exprimiert wird. Lediglich in eukaryontischen Zellen und nicht in Bakterien werden die einzigartigen Vorteile der Insertierung von Genen in die 3' LTR- Sequenz eines Retrovirus oder von von einem Retrovirus herstammenden Vektoren realisiert.

Die Effizienz des Gentransfers, der Anteil der mit dem retroviralen Vektor transduzierten Zellen, ist eine Funktion des Virustiters. Obwohl der wichtige Punkt der Virustiter in diesen Untersuchungen nicht vollständig behandelt wurde, waren die von dem DCA-Vektor erzeugten Virustiter (0,2 - 0,8 x 10&sup5; cfu/µl) lediglich etwas niedriger als die Virustiter, die von dem AAX-Vektor erzeugt wurden (1 - 2 x 10&sup5; cfu/µl) und deutlich höher als der Virustiter, der von den das ADA-Gen tragen den SIN-Vektoren erzeugt wurde (0,5 - 2 x 10&sup4; cfu/µl) (Yu und Gilboa, unveröffentlichte Ergebnisse). Sowohl DCA- als auch AAX-Vektoren basieren auf dem einen hohen Titer aufweisenden N2-Retrovirusvektor (1).

Der retrovirale Vektor N2, der auch für ein Neo-Gen codiert (1), stellt ein Beispiel eines retroviralen Vektors dar, der zur Konstruktion eines DC-Vektors verwendet werden kann. Andere weitere nichtretrovirale Sequenzen, die zwischen den beiden LTR-Sequenzen vorhanden sind (selektierbare und nichtselektierbare Gene, cDNAs) enthalten die Vektoren, können auch verwendet werden (vgl. Fig. 9 für verschiedene Beispiele und Temin, 1986 (18)).

Der spezielle, in dieser Untersuchung beschriebene DC- Vektor, der DCA-Vektor, stellt ein Beispiel verschiedener möglicher Konfigurationen von DC-Vektoren, die hergestellt werden können, dar. cDNAs, Minigene sowie ganze Gene konnen in jeder beliebigen Transkriptionsorientierung in den gesamten U3-Bereich insertiert werden, vorausgesetzt, daß die Insertion die Virusfunktionen nicht stört Darüber hinaus kann das Prinzip der SIN- und DC-Vektorausgestaltung durch Entfernen der Enhancer/Promotor-Sequenzen aus der chimären 3' LTR-Sequenz kombiniert werden. Jede Konfiguration kann einzigartige Vorteile und Einschränkungen aufweisen und für einen speziellen Zweck dienen (vgl. Fig. 10 bezüglich Beispielen).

Zusammenfassend wurde die Einsetzbarkeit von DC-Vektoren unter Verwendung des ADA-Minigens, das in die 3' LTR-Sequenz des N2-Retrovirusvektors auf M-MuLV-Basis insertiert wurde, gezeigt. Die allgemeine Eignung dieser Vektorgestaltung wird lediglich aus der kumulativen Erfahrung vieler Personen, die Gene in interessierende Zellen einführen oder in diesen exprimieren, festgelegt. Basierend auf den hier beschriebenen Untersuchungen und weiteren vorläufigen Erfahrungen aus dem Labor (vgl. Tabelle 1) hoffen wir, daß DC-Vektoren letztendlich die Fähigkeit zur Expression retroviral transduzierter Gene verbessern und zur Lösung der mit der Expression des transduzierten Gens in gezüchteten Zellen und insbesondere bei Einführung in lebende Tiere verbundenen Probleme beizutragen.

Die allgemeine Eignung dieses neuen Typs eines retroviralen Vektors wird durch die jüngsten, in Tabelle 1 zusammengefaßten Experimente, in denen eine breite Vielzahl von DNA-Inserten in den in dieser Anmeldung beschriebenen DC-Vektor eingeführt wurde, herausgestellt. Obwohl das Erfolgsniveau nicht immer wie im Falle des ADA-Vektors DCA charakterisiert wurde, ist das Erfolgsniveau, d.h. die Erreichung eines einen hohen Titer aufweisenden Virus und einer Genexpression in der Targetzelle, verglichen mit unseren früheren Experimenten, deutlich höher.

Tabelle I faßt die Verwendung von DC-Vektoren für einen Gentransfer zusammen.

TABELLE 1

Legende zu Tabelle I

A. TK: Herpes-virus-simplex-Thymidinkinasegenpromotor und SV: early 5V40-Promotor, anfusioniert an CDNA;

hIFN: Humangammainterferon;

mIFN: Mäusegammainterferon;

hIL-2: Humaninterleukin;

tax (HTLV-I): Taxgen des Human-T-Zellenleukämievirus I;

DHFR: Mäusedihydrofolatreduktase.

T7-HIV cap: Bakteriophagen-T7-Promotor, anfusioniert an einen Bereich des HIV-Genoms in einer Antisenseorientierung;

Chmäre t-RNA (3X): Drei chimäre t-RNA-Gene.

Alle obigen Konstrukte wurden in den DC-Vektor auf N2-Basis gemäß der Beschreibung bei DCA in einer Transkriptionsorientierung, die zu der retroviralen Transkriptionseinheit parallel ist, insertiert. SV-DHFR-poly A enthält ein Poly-A-Signal und ist in den DC-Vektor in entgegengesetzter Orientierung (angegeben durch den Pfeil) insertiert. ADA-poly-A besteht aus dem in dem DCA-Vektor beschriebenen ADA-Minigen und einem Polyadenylierungssignal (auch in entgegengesetzter Orientierung).

B. Der Virustiter ist ein wichtiges Merkmal des retroviralen Vektors, wobei er in vielen Fällen den begrenzenden Faktor für die Eignung des Vektors darstellt.

H: Hoher titer (10&sup5; - 10&sup6; cfu/µl);

M: Mittlerer Titer (10&sup4; - 10&sup5; cfu/µl).

Zum Vergleich beträgt der Titer des N2-Vektors etwa 2 x 10&sup6; cfu/µl; AAX: 5 x 10&sup5; cfu/µl; DCA: 8 x 10&sup4; cfu/µl und von SIN herstammender Vektor: 10² - 10³ cfu/ml.

C. Hauptmerkmal bei der Charakterisierung des Vektors auf DC-Basis in Targetzellen.

DNA: Die Struktur des Provirus, um zu zeigen, daß eine Duplikation erfolgt ist.

RNA: Expression des entsprechenden RNA-Proteins.

Protein: Expression des Genprodukts (wenn das Insert für ein Protein codiert).

Human- und Mäusegammainterferon und hIL-1 wurden mittels eines Bioassays bestimmt. DHFR wurde durch das Auftreten von MTX-resistenten Zellen bestimmt.

ND: Nicht durchgeführt.

NA: Nicht anwendbar.

Literaturstellen

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Anspruch[de]

1. Retroviraler Vektor zur Einführung von DNA mit Codierung für eine Transkriptionseinheit mit der Fähigkeit, in der eukaryontischen Zelle funktionell exprimiert zu werden, in eine eukaryontische Zelle, wobei der retrovirale Vektor eine erste DNA-Sequenz, bei der es sich um das reverse Transkript mindestens eines Teils eines Retrovirus, wobei der Teil sowohl die 5' LTR-Sequenz als auch die 3' LTR-Sequenz des Retrovirus umfaßt, handelt, und eine zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die ausschließlich in den U3-Bereich der 3' LTR- Sequenz insertierte Transkriptionseinheit umfaßt.

2. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz das reverse Transkript des gesamten Retrovirus ist.

3. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz ein reverses Transkript eines Teils des Retrovirus ist, wobei der Teil sowohl die 5' LTR-Sequenz als auch die 3' LTR-Sequenz des Retrovirus umfaßt.

4. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei das Retrovirus Mäuse-Moloney-Leukämie-Virus. (M-MuLV) ist.

5. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die erste DNA-Sequenz der retrovirale Vektor N2 ist.

6. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für das Humanadenosindeaminase (ADA)-Minigen codiert.

7. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für eine einem eukaryontischen Promotor, der unter Polymerase I, Polymerase II und Polymerase III ausgewählt ist, entsprechende bindende Sequenz codiert.

8. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite 10 DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für eine einem prokaryontischen Promotor entsprechende bindende Sequenz codiert.

9. Retroviraler Vektor nach Anspruch 8, wobei der prokaryontische Promotor T7 Polymerase ist.

10. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für ein BNA-Molekül codiert.

11. Retroviraler Vektor nach Anspruch 10, wobei die BNA ein Antisense-RNA-Molekül ist.

12. Retroviraler Vektor nach Anspruch 10, wobei die BNA für eine Erkennungssequenz für ein DNA- oder BNA-bindendes Protein codiert.

13. Retroviraler Vektor nach Anspruch 10, wobei die BNA ein mRNA-Molekül ist.

14. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für eine selektierbare oder identifizierbare phänotypische Anlage codiert.

15. Retroviraler Vektor nach Anspruch 14, wobei die selektierbare oder identifizierbare phänotypische Anlage eine Neomycin-Resistenz ist.

16. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für die Transkriptionseinheit für ein Polypeptid codiert.

17. Retroviraler Vektor nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid ein Säugetierpolypeptid ist.

18. Retroviraler Vektor nach Anspruch 17, wobei das Säugetierpolypeptid ein Hämoglobinprotein ist.

19. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für eine Transkriptionseinheit in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz stromauf der Enhancer- und Promotorsequenzen insertiert ist.

20. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für eine Transkriptionseinheit beim U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz stromab der Enhancersequenz insertiert ist.

21. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA-Sequenz mit Codierung für eine Transkriptionseinheit in den U3-Bereich der 3' LTR-Sequenz stromab der Promotorsequenz insertiert ist.

22. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die Enhancersequenzen des U3-Bereichs der 3' LTR-Sequenz deletiert oder modifiziert worden sind.

23. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die Promotorsequenzen des U3-Bereichs der 3' LTR-Sequenz deletiert oder modifiziert worden sind.

24. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die Enhancerund Promotorsequenzen des U3-Bereichs der 3' LTR-Sequenz deletiert oder modifiziert worden sind.

25. Retroviraler Vektor nach Anspruch 1, der des weiteren eine zwischen die 3'- und 5' LTR-Sequenz des retroviralen Vektors insertierte, nicht-retrovirale DNA-Sequenz umfaßt.

26. Retroviralervektor nach Anspruch 25, wobei die nichtretrovirale DNA-Sequenz für eine selektierbare oder identifizierbare phänotypische Anlage codiert.

27. Retroviraler Vektor nach Anspruch 26, wobei die selektierbare oder identifizierbare phänotypische Anlage eine Neomycinresistenz ist.

28. Verfahren zur Herstellung eines Virions, das zur Einführung von DNA mit Codierung für eine Transkriptionseinheit in eine eukaryontische Zelle geeignet ist, durch Transfizieren des retroviralen Vektors nach Anspruch 1 in eine geeignete Verpackungszellinie (suitable packaging cell line) unter derartigen Bedingungen, daß das Virion darin gebildet und durch die Verpackungszellinie ausgeschleust wird.

29. Nach dem Verfahren von Anspruch 28 hergestelltes Virion.

30. Verfahren zur Einführung einer DNA mit Codierung fur eine Transkriptionseinheit in eine eukaryontische Zelle durch Infizieren der Zelle mit einem Virion nach Anspruch 29 unter derartigen Bedingungen, daß die DNA mit Codierung für die Transkriptionseinheit in die chromosomale DNA der eukaryontischen Zelle eingebaut wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die eukaryontische Zelle eine Säugetierzelle ist.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Säugetierzelle eine hematopoietische Stammzelle ist.







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