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Dokumentenidentifikation DE69124696T2 05.06.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0541595
Titel Extraktion von Astaxanthin aus Pflanzen der Spezies Adonis aestivalis
Anmelder Quest International B.V., Naarden, NL
Erfinder MAWSON, Rodney Fairlawn, Thrapston Northants NN14 4NG, GB
Vertreter Hagemann, Kehl und Kollegen, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69124696
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 17.07.1991
EP-Aktenzeichen 919130526
WO-Anmeldetag 17.07.1991
PCT-Aktenzeichen GB9101182
WO-Veröffentlichungsnummer 9201754
WO-Veröffentlichungsdatum 06.02.1992
EP-Offenlegungsdatum 19.05.1993
EP date of grant 12.02.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.06.1997
IPC-Hauptklasse C09B 61/00
IPC-Nebenklasse A23L 1/27   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft aus natürlichen Quellen extrahierbare Carotinoidpigmente.

Es besteht eine Notwendigkeit für eine rentable natürliche Quelle für Astaxanthin, das das Carotinoidpigment ist, das dem Fleisch von wildem Lachs seine charakteristische rosa oder rote Farbe verleiht. Lachsfische werden heutzutage häufig gezüchtet, und es besteht eine kommerzielle Notwendigkeit dafür, solchen Fisch zu produzieren, der eine naturidentische Fleischfarbe besitzt.

Astaxanthin kommt in verschiedenen Meerestieren vor, wie z.B. in Schalentieren; die Extraktion aus solchen Quellen ist jedoch unökonomisch. Es ist auch möglich, Astaxanthin zu synthetisieren, jedoch ist dies teuer, und darüber hinaus vermittelt die Verwendung eines solchen synthetischen Pigments nicht die Assoziation "natürlich", die viele als wünschenswert betrachten. Ein allgemeines Verfahren zur Extraktion von Astaxanthin aus pflanzlichen oder tierischen Quellen ist in der WO 90/05765 beschrieben.

Astaxanthin kommt in bestimmten Pflanzen, insbesondere in gewissen zur Gattung Adonis gehörenden Spezies, vor. Aus B. Renstrom et al., Biochem. System. and Ecology 9, 249 (1981) und aus T. W. Goodwin, Nature 184, 1714 (1959) ist bekannt, daß Astaxanthin aus den Blütenblättern von Adonis annua erhalten werden kann. Eine weitere Spezies, in der Astaxanthin vorkommt, ist Adonis aestivalis, in der es bevorzugt in den Blütenblättern der leuchtend roten Blüten vorliegt. Jedoch besitzen die gemeldeten wilden Stämme von Adonis aestivalis nur Blütenköpfe mit sehr wenigen Blütenblättern, und das Verhältnis von Astaxanthinpigment relativ zur Gesamtmasse der Pflanze ist zu gering, um sie in einem vernünftigen kommerziellen Ausmaß zu kultivieren und extrahieren.

Wir haben einen neuen, reinrassig vermehrbaren Stamm von Adonis aestivalis gefunden, der wesentlich schwerere Blütenköpfe hat, und insbesondere eine wesentlich größere Anzahl von Blütenblättern besitzt. Der Astaxanthinpigmentanteil in dieser Pflanze ist ausreichend hoch, um die Kultivierung der Pflanze mit dem Zweck der Extraktion des Pigments kommerziell attraktiv zu machen.

Beschrieben sind Pflanzen der Gattung Adonis, die Astaxanthin enthaltende Blütenblätter haben, wobei die durchschnittliche Anzahl von Blütenblättern pro Blütenkopf mindestens 10 beträgt, insbesondere mindestens 16.

Die Blütenblätter enthalten Astaxanthin, wobei die Menge an Astaxanthin pro Blütenkopf mindestens 100 µg betragt, insbesondere mindestens 150 µg, und ganz besonders bevorzugt mindestens 200 µg.

Beschrieben wird die Kultivierung solcher Pflanzen mit dem Zweck, Astaxanthin zu erhalten, die Extraktion von Astaxanthin aus solchen Pflanzen und das so erhaltene Astaxanthin.

Die Extraktion von Astaxanthin wird vorzugsweise unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels durchgeführt, und besonders bevorzugt unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs, das ein wassermischbares organisches Lösungsmittel (wie z.B. Ethanol) und ein nicht wassermischbares organisches Lösungsmittel (wie z.B. Hexan) umfaßt.

Vorzugsweise wird das geerntete Pflanzenmaterial anfangs mit Wasser oder wäßrigen Medien extrahiert, um wasserlösliche Verbindungen, wie z.B. Glykoside, zu extrahieren.

Die Erfindung beschreibt insbesondere ein Verfahren zum Erhalt von Astaxanthin, wobei die Pflanzen der Spezies Adonis aestivalis mit einer Blütenblattanzahl von mindestens 16 pro durchschnittlichem Blütenkopf kultiviert und geerntet werden, und das Astaxanthin wird aus den geernteten Blütenköpfen oder deren Blütenblättern extrahiert.

Eine Saatprobe des neu entdeckten Stammes von Adonis aestivalis wurde am 18. Juli 1990 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, unter der Zugangsnummer NCIMB 40309 in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt. Pflanzen dieses hinterlegten Stammes haben üblicherweise im Durchschnitt 18 bis 22 Blütenblätter pro Blütenkopf, und die durchschnittliche Menge Astaxanthin pro Blütenkopf beträgt 200 bis 350 µg.

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Erhalt von Astaxanthin, wobei das Astaxanthin aus den Blütenblättern der Pflanzen extrahiert wird, die die wesentlichen Merkmale des hinterlegten Stammes besitzen.

Die Erfindung stellt insbesondere eine orale Zusammensetzung zum Verabreichen an Fische bereit, die so extrahiertes Astaxanthin umfaßt, und ein Verfahren zur Pigmentierung von Fischfleisch, insbesondere Lachsfisch, wobei den Fischen eine solche Zusammensetzung oral verabreicht wird.

Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung Astaxanthin in einer Mischung mit eßbarem Futtermaterial. Alternativ kann das Astaxanthin in eingekapselter Form vorliegen.

Alternativ kann eine Pigmentierung des Fischfleisches durch Verfüttern astaxanthinhaltiger Pflanzenteile an den Fisch erreicht werden. Vorzugsweise umfassen die Teile die Blütenblätter, und stark bevorzugt bestehen sie ausschließlich aus solchem Material. Falls gewünscht, kann das Pflanzenmaterial mit Wasser oder wäßrigen Medien extrahiert werden, um wasserlösliche Verbindungen, wie z.B. Glycoside, zu extrahieren, die für den Fisch oder andere Tiere toxisch sein können, ohne signifikante Mengen des gewünschten Astaxanthins zu entfernen.

Für die Pigmentierung von gezüchtetem Fisch kann das erfindungsgemäß erhaltene Astaxanthin den Fischen oral in jeder Weise analog den Techniken verabreicht werden, die bereits für Astaxanthin aus konventionellen Quellen verwendet werden. Üblicherweise ist das Pigment in einer Zusammensetzung enthalten, wie z.B. in einem zu Pellets geformten, zusammengesetzten Futtermittel, das die gesamte Nahrung oder Teile der Nahrung bildet, mit der die Fische großgezogen werden. Das Pigment ist öllöslich und kann in dieser Form dem Futter einverleibt werden, entweder als freies Öl oder als eingekapseltes Öl. Alternativ können die Blütenblätter oder anderes Pflanzenmaterial, das Astaxanthin enthält, (z.B. in getrockneter, gemahlener Form) mit konventionellen Fischfutterzutaten gemischt werden. Falls gewünscht, kann das Pflanzenmaterial teilweise mit wäßrigen Medien extrahiert werden (um wasserlösliche Verbindungen, wie z.B. Glycoside; zu entfernen), bevor es dem Futter zugesetzt wird. Als weitere Alternative kann das Pigment dem Futter in Form einer organischen Lösung zugesetzt werden, z.B. einer Lösung, die während der Extraktion des Astaxanthins aus dem Pflanzenmaterial erhalten wurde, wenn das verwendete organische Lösungsmittel für die Fische in keiner Menge, die die Fische wahrscheinlich über das zusammengesetzte Futtermaterial aufnehmen, toxisch ist.

Wenn das Astaxanthin Fischen über ihr Futtermaterial verabreicht wird, muß die Zusammensetzung des Futtermaterials nicht unkonventionell sein. Die Futterformulierung kann jede der normalen Fischfutterkomponenten enthalten, wie z.B. Fischmehl und/oder anderes Protein, Öl, wie z.B. Fischöl, Getreidearten, Vitamine, Mineralien, Konservierungsmittel und Medikamente, in den verschiedenen, üblicherweise verwendeten Mengen.

Das extrahierte Astaxanthin oder Astaxanthin enthaltende Pflanzenteile können auch als Färbematerial in Nahrungsmitteln für Menschen verwendet werden und auch als Geflügelfutter, um die Farbe des Eigelbs zu verbessern.

Spezifische Ausführungsformen der Erfindung werden nun nur durch Beispiele im Detail beschrieben.

Neue Stämme von Adonis aestivalis

Die wesentlichen Merkmale des neu entdeckten Stamms sind:

Chromosomenzahl 2n = 32

Aufrecht, einjährig, Blätter alternierend, fiederblättrig tief eingeschnitten in lineare oder fadenförmige Segmente. Die Blüten leuchtend rot, aktinomorph, hypogyn, zweigeschlechtlich, einzeln und endständig auf Stamm und Ästen.

Blütenblätter weniger als 15 mm lang, bis zweifache Länge der Kelchblätter. 5 bis 8 Kelchblätter. 18 bis 22 Blütenblätter.

Werte für diese Parameter und für den Astaxanthingehalt pro Blütenkopf können der Analyse der ersten vollständig geöffneten Blütenköpfe von 1000 Pflanzen entnommen werden.

Reife Achäne 3 bis 5 mm, Zahn auf Dorsaloberf läche weit entfernt vom Fortsatz. Die Achänen haben einen transversalen Grat, der um die Mitte der Achäne herumreicht. Die Achänen haben auch einen Dorsalhöcker in einiger Entfernung vom Fortsatz.

Kultivierung

Die Pflanze kann unter einem weiten Bereich von Temperaturbedingungen angebaut werden. Die Keimung erfordert ein gewisses Maß an wechselnden Temperaturen von 10 bis 20ºC. Reife blühende Pflanzen werden vier Monate nach dem Säen bei Felddichten von bis zu 150 Pflanzen/m² unter einer Vielzahl von Bodenbedingungen erhalten; Blüte in den Sommermonaten (gemäßigtes Klima). Die Pflanze bevorzugt trockene Bedingungen ohne Staunässe. Die Samen können mit Mähdrescher und die Blüten per Hand geerntet werden.

Pigmentextraktion

Das Pigment kann durch Lösungsmittelextraktion extrahiert werden, z.B. in Lösungsmittelgemische wie z.B. Ethanol/Hexan, und durch Trennen des Lösungsmittelgemischs mit Wasser und nachfolgende Säurenchromatographie weiter gereinigt werden. Der so gereinigte Endextrakt ist reich an Carotinoiden, vorherrschend Astaxanthin, das hauptsächlich als ein racemisches Gemisch in Form von Mono- und Diestern, üblicherweise der Palnitinsäure, vorliegt.

Übliches Ausgangsmaterial

Gefrorener Block aus Blütenköpf en, gelagert im Dunkeln bei -20ºC, oder getrocknete Blütenblätter/Blütenköpfe, fein gemahlen, ebenfalls bei tiefen Temperaturen im Dunkeln gelagert.

Primärextraktion

Man mischt mit 10 Volumina Hexan/Ethanol (50:50 Vol./Vol.), läßt dispergieren und homogenisiert 10 min. im Dunklen unter kalten Bedingungen unter Verwendung eines scherenden Mischers; oder man vermahlt in Ethanol mit einem scherenden Mischer und setzt dann aus Sicherheitsgründen Hexan zu.

Man läßt über Nacht im Dunkeln und unter kalten Bedingungen stehen.

Man filtriert durch einen Filter (z.B. Muslin) auf einem Schüttelsieb, und wäscht den Pfropfen mit 50:50 Ethanol:Hexan. Die ursprünglich filtrierte Flüssigkeit und die Waschlösungen werden als Primärextrakt aufgefangen. Dieser Primärextrakt enthält wasserlösliche, ethanollösliche und hexanlösliche Materialien, einschließlich Pigmente und Glycoside.

Zweite Extraktion

Man gibt 1 Teil Wasser zu 2,5 Teilen Primärextrakt, überführt in einen Phasenseparator und entfernt die untere, ethanolische Schicht. Die obere Hexan-Schicht wird mit einer 1:1 Ethanol/Wasser-Mischung gewaschen, nach Phasentrennung wird die untere Phase verworfen.

Man überführt in einen Vakuumverdampfer mit Dampfmantel (mit Zyklon) und entfernt das Hexan bei 45ºC in 15 bis 30 Min., bis ein schlammiger Rückstand erhalten wird. Es wird mit Ethanol gewaschen und eingedampft, mit Hexan gewaschen und zur Trocknung eingedampft (wiederum bei tiefen Temperaturen, unter Vakuum oder unter Stickstoff). Dies liefert ein erstes Konzentrat von etwa 5% Gesamtpigment (80% Astaxanthin) im Trockenmaterial.

Man nimmt in Hexan auf und trägt auf eine Silica-Säule (1:1 oder 2:1 Extrakt zu Silica) auf. Die Säule wird mit Hexan unter Lichtausschluß und kalten Bedingungen gewaschen und die Waschlösungen verworfen. Man eluiert mit 2,5% Ethanol in Hexan, bis eine rot-orange Bande auftritt. Die rot-orangen Eluate werden gesammelt, bis sich die Farbe nach orange-grün verändert.

Das Eluat wird wie oben getrocknet und in Hexan oder Öl (Fischöl, Pflanzenöl) aufgenommen. Dies liefert ein zweites Konzentrat mit etwa 20% Gesamtpigment, das ungefähr 80% Astaxanthin ehthält.

Typisches Lachsaufzuchtfutter

Pigmenteinverleibung

Das Astaxanthinpigment aus einem erfindungsgemäßen Adonis-Stamm kann in Bereichen von z.B. 1 bis 100 ppm zu dem obigen Futtertyp in verschiedenen Arten zugesetzt werden:

a) als extrahiertes Astaxanthin mit Fischöl als Hauptbestandteil, der fakultativ Antioxidantien enthält.

b) als extrahiertes Astaxanthin, als rieselfähiges Pulver in Weizenmehl oder jedem anderen feingemahlenen Futtermittel für Lachs.

c) wie bei (b), jedoch in Alginat, Gelatine oder Xanthangummi eingekapselt, z.B. unter Verwendung eines Granuliertellers oder durch Sprühkühlung.

d) als extrahiertes Astaxanthin in einem verkapselten Lipid, z.B. Casein-geschütztem Lipid.

Pigmentierung

Die obige übliche Lachs-Auf zuchtformulierung, die 50 bis 100 ppn aus dem hinterlegten, erfindungsgemäßen Adonis-Stamm extrahiertes Astaxanthin enthält und in einem der oben beschriebenen Produktformen enthalten ist, wird in Form von Pellets an Fische mit einem Lebendgewicht von 300 g und mehr für einen Minimalzeitraum von 3 Monaten verfüttert. Übliche Werte für die Pigmentierungseffizienz liegen im Vergleich zum käuflich erhältlichen synthetischen Astaxanthin mindestens bei etwa 80% des synthetischen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von Astaxanthin, wobei das Astaxanthin aus Pflanzen der Spezies Adonis aestivalis extrahiert wird, die im Durchschnitt mindestens 10 Blütenblätter pro Blütenkopf haben.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Pflanzen im Durchschnitt mindestens 16 Blütenblätter pro Blütenkopf haben.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Pflanzen in Durchschnitt 18 bis 22 Blütenblätter pro Blütenkopf haben.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Pflanzen mindestens 100 µg Astaxanthin pro Blütenkopf enthalten.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Pflanzen mindestens 150 µg Astaxanthin pro Blütenkopf enthalten.

6. Verfahren gemäß Anspruch 51 wobeidie Blütenköpfe mindestens 200 µg Astaxanthin enthalten.

7. Verfahren zur Herstellung von Astaxanthin, wobei das Astaxanthin aus Pflanzen des Stammes NCIMB 40309 extrahiert wird.

8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, wobei die Extraktion des Astaxanthins unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Extraktion unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs durchgeführt wird, das ein wassermischbares organisches Lösungsmittel und ein nicht wassermischbares organisches Lösungsmittel umfaßt.

10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 oder 9, wobei das geern tete Pflanzenmaterial anfänglich mit Wasser oder wäßrigen Medien extrahiert wird, um wasserlösliche Verbindungen, wie z.B. Glycoside, zu entfernen.

11. Zusammensetzung zur Verwendung zur Pigmentierung von Fisch, die Astaxanthin umfaßt, das durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellt wurde und mit eßbarem Futtermaterial gemischt ist.

12. Zusammensetzung zur Verwendung zur Pignentierung von Fisch, die Astaxanthin, das durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellt wurde, in eingekapselter Form um-

13. Verfahren zur Pignentierung von Fisch, das das orale Verabreichen einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12 betrifft.

. 14.Geerntete Blütenköpfe, oder Blütenblätter davon, der Spezies Adonis aestivalis, die im Durchschnitt mindestens 10 Blü tenblätter pro Blütenkopf haben.

15. Geerntete Blütenköpfe, oder Blütenblätter davon, gemäß Anspruch 14, die im Durchschnitt mindestens 16 Blütenblätter pro Blütenkopf haben.

16. Geerntete Blütenköpfe, oder Blütenblätter davon, gemäß Anspruch 15, die im Durchschnitt 18 bis 22 Blütenblätter pro Blütenkopf haben. 17. Geerntete Blütenköpfe, oder Blütenblätter davon, der Spezies Adonis aestivalis, die mindestens 100 µg Astaxanthin pro Blütenkopf haben.

18. Geerntete Blütenköpfe, oder Blütenblätter davon, gemäß Anspruch 17, die mindestens 150 µg Astaxanthin pro Blütenkopf haben.

19. Geerntete Blütenköpfe, oder Blütenblätter davon, gemäß An spruch 18, die mindestens 200 µg Astaxanthin pro Blütenkopf haben.

20. Fischfuttermittel, dem das geerntete Material gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19 einverleibt ist.







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