PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69217614T2 10.07.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0541753
Titel HYBRIDE, LÖSLICHE UND NICHT GESPALTENE GP160-VARIANTE
Anmelder Transgene S.A., Straßburg/Strasbourg, FR
Erfinder KIENY, Marie-Paule, F-67000 Strasbourg, FR
Vertreter Türk, Gille, Hrabal, Leifert, 40593 Düsseldorf
DE-Aktenzeichen 69217614
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, MC, NL, SE
Sprache des Dokument Fr
EP-Anmeldetag 30.04.1992
EP-Aktenzeichen 929108819
WO-Anmeldetag 30.04.1992
PCT-Aktenzeichen FR9200394
WO-Veröffentlichungsnummer 9219742
WO-Veröffentlichungsdatum 12.11.1992
EP-Offenlegungsdatum 19.05.1993
EP date of grant 26.02.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.07.1997
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse C12N 15/62   C12N 15/86   C12N 5/10   A61K 39/21   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mitteln, die für die Produktion von neuen Molekülen erforderlich sind, mit denen eine Immuno-Schutz-Antwort gegenüber einem für das erworbene Immundefekt-Syndrom (AIDS) verantwortlichen Virus eingeleitet werden kann.

Bei einem Individuum entwickelt sich diese Krakheit als Folge einer Infektion der T-Helfer-Lymphozyten durch ein HIV-(Human-Immundefizit-Virus)- Retrovirus. Bisher werden diese Retroviren in zwei große Typen unterteilt: den Typ HIV-1, der im wesentlichen in Europa und in Nordamerika grassiert, und den Typ HIV-2, der für afrikanische Infektionen charakteristisch ist. Im Innern eines jeden Typs weisen die HIV-Retroviren untereinander einen bestimmten Grad von Variabilität auf, der sich beispielsweise äußert in einem unterschiedlichen zellulären Trophismus oder in viralen Proteinen, die leicht voneinander verschieden sind. Deshalb verwendet man dann, wenn man sich auf ein spezielles HIV-Retrovirus beziehen will, vorzugsweise den Ausdruck "Virus- Stamm".

Allgemein haben die HIV-Retroviren die folgende Struktur: das Genom- RNA-Molekül und verschiedene damit assoziierte Proteine sind in einem Kapsid vom Protein-Typ (Nucleocapsid) eingekapselt. Das Ganze ist durch eine Zellmembran geschützt, der das Hüllenprotein viralen Ursprungs einverleibt worden ist.

Dieses Hüllenprotein wird in seinen verschiedenen Formen heute als ein potentielles therapeutisches Element für einen Impfstoff gegen AIDS angesehen.

Unter den natürlichen Bedingungen wird das Hüllenprotein (env) anfänglich in Form eines Vorläufers synthetisiert, der an seinem N-terminalen Ende eine Signal-Sequenz aufweist, welche die Überführung des Vorläufers in das Endoplasma-Reticulum (auf dem Wege der Sekretion) initiiert. Dieses Signal-Peptid wird anschließend durch proteolytische Spaltung eliminiert. Das Piodukt dieser Spaltung ist ein als gp160 bezeichnetes Protein, das anschließend selbst aufgespalten wird in eine kleine Untereinheit gp40 und in eine gioße Untereinheit gp120. Das N-terminale Ende von gp120 entspricht dem N- terminalen Ende von gp160, während das C-terminale Ende von gp40 dem C- terminalen Ende von gp160 entspricht.

Jede der Untereinheiten wird in das Innere der infizierten Zelle sekretiert. Das gp40 bleibt jedoch über seine Transmembran-Domäne in der Zellmembran verankert. Sein C-terminaler Abschnitt (die Intracytoplasma- Domäne) bleibt im Kontakt mit dem Cytoplasma, während sein N-terminaler Abschnitt (die Extracytoplasma-Domäne) sich an der Oberfläche der Zelle befindet. Die Untereinheit gp120 wird aus der Zelle ausgesalzen, wo sie mit der extrazellulären Domäne der Untereinheit gp40 in Wechselwirkung tritt. Die beiden Untereinheiten des Hüllenproteins bleiben somit in Form eines Komplexes miteinander kombiniert.

Die Sequenz der Aminosäuren der Vorläufer der Proteine env verschiedener Virenstämme sind jetzt bekannt. Beispielsweise ist in der Fig. 1 die Sequenz der Vorläufer der gp160 der Virenstämme HIV-1 Bru, HIV-1 MN, HIV-1 ELI, HIV-1 RF, HIV-1 SF2C und HIV-1 SC angegeben. Desgleichen ist in der Fig. 2 die Sequenz des Vorläufers von gp160 des Viren-Stammes HIV-2 Rod angegeben.

Nachstehend und zur Erleichterung des Verständnisses werden die Sequenzen der gp160, die von dem gp160 des Stammes HIV-1 Bru verschieden sind, unter Bezugnahme auf die Sequenz von gp160 des Stammes HIV-1 Bru (nachstehend als gp160-Bru bezeichnet) wie folgt beschrieben;

a) Das gp160-Bru weist 831 Aminosäuren auf, die mit 1 bis 831 numeriert sind. Außerdem entspricht das gp120-Bru der Sequenz der 486 ersten Aminosäuren von gp160-Bru, während das gp40-Bru der Sequenz entspricht, die mit der Aminosaure in der Position 487 beginnt und mit der Aminosäure in der Position 831 endet.

b) Die Sequenz eines beliebigen gp160 ist ausgerichtet auf die Sequenz von gp160-Bru, um ein Homologie-Maximum aufzuweisen. Zu diesem Zweck können freie Stellen (Plätze) entweder in die Sequenz von gp160-Bru oder in die Sequenz von gp160 eingeführt werden. Durch Definition wird die Position einer Aminosäure in dem beliebigen gp160 in identischer Weise bezeichnet durch die Position der homologen Aminosäure in gp160-Bru.

c) Infolgedessen gibt es keine Aminosäure in der Position x in der Sequenz von gp160, wenn eine freie Stelle (Platz) in die Sequenz des beliebigen gp160 gegenüber der Aminosäure in der Position x eingeführt wird. Man nimmt jedoch an, daß diese Aminosäure eine virtuelle Präsenz aufweist.

d) Wenn eine oder mehrere freie Stellen in die Sequenz von gp160-Bru zwischen der Aminosäure in der Position x und der Aminosäure in der Position x + 1 eingeführt wird (werden), nimmt man an, daß in dem beliebigen gp160 die Position mindestens zwei Unterpositionen xa, xb, ..., xn, abdeckt, von denen jede von einer Aminosäure besetzt ist. Laut Definition repräsentiert die stromabwärts gelegene Position xn die Position x.

e) Wenn man eine oder mehrere freie Stellen (Plätze) in die Sequenz von gp160-Bru stromaufwärts von der Aminosäure in der Position 1 einführt, nimmt man an, daß in dem beliebigen gp160 die Position 1 mindestens zwei Unterpositionen Ia, Ib, ..., In abdeckt, von denen jede von einer Aminosäure besetzt ist. Laut Definition stellt die stromaufwärts gelegene NH&sub2;-terminale Position In die Position I dar.

f) Wenn man eine oder mehrere Leerstellen in die Sequenz des beliebigen gp160 gegenüber der (den) NH&sub2;-terminalen Aminosäure(n) von gp160-Bru einführt, gibt man laut Definition an, daß die Aminosäure in der NH&sub2;-terminalen Position in dem beliebigen gp160 die Position 1 und ihre homologe Aminosäure-Position in sich vereinigt (zusammenfaßt).

g) Wenn man eine oder mehrere freie Stellen in die Sequenz des beliebigen gp160 gegenüber der (den) COOH-terminalen Aminosäure(n) in gp160- Bru einführt, gibt man laut Definition an, daß die Aminosäuren in der COOH- terminalen Position in dem beliebigen gp160 die Position 841 und ihre homologe Aminosäure-Position in sich vereinigt (zusammenfaßt).

Bis auf den heutigen Tag wird unter dem Gesichtspunkt eines Impfstoffes das Hüllenprotein als ein potentieller Kandidat angesehen, der vom therapeutischen Standpunkt aus betrachtet interessant ist. Seine Abstammung aus einer Mehrfachketten-Struktur stellt jedoch ein Handicap dar im Hinblick auf seine Verfügbarkeit. Deshalb schien es bisher bevorzugt, ein Einfachketten- Protein zu verwenden, das die Mehrzahl der Epitope von gp120 und derjenigen von gp40 beibehält. Dieser Protein-Typ wurde bereits in der Patentanmeldung WO 87/6260 vorgeschlagen. Es handelt sich dabei insbesondere um eine nicht-spaltbare (nicht-schneidbare) und lösliche gp160-Variante.

Alle gp160 der Viren-Stämme vom Typ HIV-1 weisen in den Positionen 483-486 eine Schnittstelle, eine sogenannte Hauptschnittstelle, auf, wie sie für ein proteolytisches Enzym oder für proteolytische Enzyme bekannt ist. Diese Schnittstelle ist die gleiche für alle gp160, die in der Fig. 1 angegeben sind, und sie entspricht der Sequenz Arg-Glu-Lys-Arg (REKR). Die proteolytischen Enzyme schneiden unmittelbar stromabwärts von dieser Schnittstelle, wobei sie eine gp120 und ein gp40 freisetzen.

Wenn die Schnittstelle nicht vorhanden ist, wurde festgestellt, daß die proteolytischen Enzyme mit einer jedoch etwas geringeren Wirksamkeit eine Schnittstelle erkennen, die als Nebenschnittstelle bezeichnet wird, und einen Schnitt durchführen unmittelbar stromabwärts von derselben. Auch hier ist diese Schnittstelle für alle gp160 gleich, wie sie in der Fig. 1 gezeigt sind. Sie entspricht der Sequenz Lys-Arg-Arg (KRR) in den Positionen 477-479 nach bestimmten Autoren oder sie entspricht der Sequenz Lys-Ala-Lys-Arg (KAKR) in den Positionen 475 - 478 nach anderen Autoren.

Außerdem ist angegeben, daß die gp160 der Virus-Stämme vom Typ HIV-2 nur eine Haupt-Schnittstelle in den Positionen 475 - 478 aufweisen, die der Sequenz Lys-Glu-Lys-Arg (KEKR) entspricht.

Eine nicht-schneidbare gp160-Variante ist ein künstliches Analogon zu einem nativen gp160. Seine Aminosäure-Sequenz entspricht derjenigen eines nativen gp160, in dem die Hauptschnittstelle und/oder die Nebenschnittstelle unterdrückt worden ist (sind).

Eine solche gp160-Variante kann dank der rekombinanten DNA- Verfahren synthetisiert werden. Es genügt, ein DNA-Fragment zu isolieren, das für ein natives gp160 codiert, und dann die Region zu modifizieren, die für die Hauptschnittstelle codiert, durch gerichtete Mutagenese, so daß man ein DNA-Fragment erhält, das für eine gp160-Variante codiert, die für eine proteolytische Einwirkung unempfindlich ist. Anschließend wird dieses zuletzt genannte DNA-Fragment unter geeigneten Bedingungen exprimiert, wobei man die genannte gp160-Variante erhält. Eine solche gp160-Variante, welche die Hauptschnittstelle nicht mehr enthält, wird nachstehend als eine nichtschneidbare gp160-Variante vom Typ A bezeichnet.

Vorzugsweise kann die Region, die für die Nebenschnittstelle codiert, außerdem für identische Zwecke modifiziert werden. Unter diesen Bedingungen erhält man eine nicht-schneidbare gp160-Variante vom Typ A', die weder die Hauptschnittstelle noch die Nebenschnittstelle enthält.

Zu diesem Zweck gibt man beispielsweise an, daß die Schnittstelle REKR, KEKR oder KAKR und die Schnittstelle KRR jeweils durch die Sequenzen Asn-Glu-His-Gln (NEHQ) und GIN-Asn-His (QNH) ersetzt werden können.

Andererseits ist es auch erforderlich, daß ein gp160 in einer löslichen Form erhalten wird. Ein solches gp160 entspricht einem nativen gp160, bei dem die Transmembran-Region von hydrophober Natur unterdrückt worden ist. Diese Transmembran-Region ist in der Zone, die dem gp40 entspricht, angeordnet ab dem Aminosäurerest in der Position 659 bis zu dem Aminosäurerest in der Position 680. Auf eine zusätzliche, jedoch überflüssige Weise kann eine andere hydrophobe Region, die von dem Aminosäurerest in der Position 487 bis zu dem Aminosäurerest in der Position 514 reicht, deletiert (gelöscht) werden.

Auf ähnliche Weise umfassen die für die Synthese einer löslichen gp160-Variante erforderlichen Mittel offensichtlich das entsprechende DNA- Fragment, das durch Modifizierung des ursprünglichen DNA-Fragments erhalten werden muß.

Ein Vergleich der Sequenzen der verschiedenen bereits bekannten gp160 hat mindestens drei Domänen ergeben, deren Sequenz von einem gp160 zum anderen hypervariabel ist. Diese drei Domänen werden derzeit als die Domänen (oder Schleifen, Ringe) V&sub1;, V&sub2; und V&sub3; bezeichnet.

Die beiden ersten Domänen V&sub1; und V&sub2; sind zwischen dem Cystein-Rest in der Position 96 und dem Cystein-Rest in der Position 171 angeordnet, während die dritte Domäne V&sub3; ab dem Cystein-Rest in der Position 271 bis zu dem Cystein-Rest in der Position 306 angeordnet ist.

Es gibt auch eine letzte Domäne, die einen bestimmten Grad der Variabilität aufweist, der jedoch als geringer angesehen wird. Es handelt sich um die Fixierungsstelle am Rezeptor CD4 der T-Helfer-Lymphozyten; diese ist etwa angeordnet ab dem Aminosäurerest in der Position 340 bis zu dem Aminosäurerest in der Position 440.

Unabhängig von dem betrachteten gp160 haben Impfversuche gezeigt, daß die dritte hypervariable Domäne im wesentlichen dazu dient, eine geeigtiete Immunität zu erzielen. Wegen der hypervariablen Natur dieser Domäne ist jedoch der entwickelte Schutz nur wirksam gegenüber dem Virus-Stamm, aus dem das verwendete gp160 stammt.

Schließlich scheint es, daß die erste und die zweite Domäne, die hypervariabel sind, sowie die Fixierungsstelle am Rezeptor CD4 den Grad der Immunität beeinflussen, den man erzielen kann.

Ein Impfstoff von generellem Interesse muß den Schutz der Individuen gegen die Mehrzahl der HIV-Virussstämme, die in der Welt grassieren, erlauben. Infolgedessen muß ein Impfstoff auf Basis von gp160 verschiedene gp160 enthalten, von denen jedes von einem unterschiedlichen Virus-Stamm abgeleitet ist. Um einen solchen Impfstoff herzustellen, ist es zunächst zweckmäßig, die für die Produktion der nicht-schneidbaren und löslichen gp160- Variante bestimmten Mittel, die jedem Virus-Stamm entsprechen, herzustellen. In erster Nährung handelt es sich dabei jedesmal darum, das DNA-Fragment zu klonieren, das für das gp160 eines vorgegebenen Virus-Stammes codiert, um daraus seine Sequenz zu bestimmen, dieses DNA-Fragment zu modifizieren, um durch Substitution oder Deletion Schnittstellen und hydrophobe Regionen zu unterdrücken, und dann schließlich dieses auf diese Weise modifizierte DNA-Fragment unter geeignete Expressions-Bedingungen zu setzen. [)a dieser Arbeitsgang für jedes gp160 erneut durchgeführt werden muß, ist die Herstellung eines solchen Impfstoffes vermutlich lang und teuer.

Darüber hinaus können die Virus-Stämme im Verlaufe der Zeit variieren, beispielsweise durch Mutation. Ein Stamm, der die Hauptinfektion in einem bestimmten Bereich der Erde in einem bestimmten Augenblick verursacht, kann als Infektionsmittel zurücktreten und ein anderer derartiger Stamm kann an seiner Stelle erscheinen. Es ist daher wichtig, daß man einen Impfstoff an die epidemiologischen Bedingungen schnell anpassen kann und im vorliegenden Fall eine gp160-Variante zum besten Zeitpunkt zur Verfügung hat.

Zu diesem Zweck wurde ein neues Verfahren zur Herstellung einer geeigneten gp160-Variante unabhängig von dem betrachteten Virus-Stamm gefunden. In dem Maße, in dem man über eine Expressions-Cassette zur Herstellung einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante verfügt, die von einem ersten Virus-Stamm abgeleitet ist, erlaubt dieses Verfahren die Herstellung einer ähnlichen Variante, die von einem zweiten Virus-Stamm abgeleitet ist, unter Vermeidung der vollständigen Klonierung des DNA- Fragments, das für das gp160 des zweiten Virus-Stammes codiert, und die Modikationen, die sich daraus ergeben.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Herstellung einer Expressions-Cassette, die eine DNA-Einheit umfaßt, die entweder für einen Vorläufer einer nicht-schneidbaren und löslichen Hybrid-gp160-Variante oder für eine nicht-schneidbare und lösliche Hybrid-gp160-Variante codiert, wobei die genannte Variante eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die umfaßt:

i) eine erste Region, die von dem gp160 eines ersten Stammes des HIV- Virus abgeleitet ist und in dem zuletzt genannten gp160 von der Aminosäure in der Position X bis zur Aminosäure in der Position Y angeordnet ist, wobei X eine Zahl von 1 bis 271 und Y eine Zahl von 306 bis 482 bedeuten;

ii) eine zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren löslichen gp160- Vaiiante vom Typ A abgeleitet ist, die aus einem zweiten Stamm des HIV-Virus stammt und in dieser letztgenannten gp160-Variante von der Aminosäure in dei Position Y + 1 bis zur Aminosäure in der C-terminalen Position angeordnet ist, wobei Y wie oben definiert ist; und

iii) eine dritte Region, wenn X von 1 verschieden ist, die von dem gp160 des genannten zweiten Stammes des HIV-Virus abgeleitet ist und in dem zuletzt genannten gp160 von der Aminosäure in der Position 1 bis zur Aminosäure in der Position X - 1 angeordnet ist, wobei X wie oben definiert ist;

wobei das genannte Verfahren umfaßt:

a) die Klonierung eines DNA-Fragments, das für die genannte erste Region codiert fund

b) die Insertion des in der Stufe (a) klonierten DNA-Fragments in eine Stelle einer Cassette, die umfaßt:

m) stromaufwärts von der Stelle und aufeinanderfolgend:

i) einen Promotor,

ii) ein Translations-Initiierungscodon,

iii) gegebenenfalls eine erste DNA-Region, die für ein Signal- Peptid codiert, und

iv) eine zweite DNA-Region, wenn X wie oben definiert ist, jedoch von 1 verschieden ist, die für die genannte dritte Region der Aminosäure-Sequenz der genannten Hybrid- gp160-Variante codiert; und

n) stromabwärts von der Stelle und aufeinanderfolgend:

i) eine dritte DNA-Region, wenn Y wie oben definiert ist, die für die genannte zweite Region der Aminosäure-Sequenz der genannten Hybrid-gp160-Variante codiert, und

ii) ein Translations-Terminationscodon;

unter Bildung einer Expressions-Cassette, welche die genannte DNA-Einheit umfaßt.

Eine solche Expressions-Cassette ist ein unerläßliches Werkzeug, das die Herstellung einer Hybrid-gp160-Variante erlaubt, das in einem heterologen Expressions-System löslich und nicht schneidbar ist.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das DNA-Fragment, das für die genannte erste Region codiert, entsprechend einem beliebigen Anwendungsverfahren kloniert werden. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß diese Klonierung vorteilhaft nach dem PCR-Verfahren durchgeführt werden kann, wobei man von der Genom-DNA von Zellen ausgeht, die mit dem genannten ersten Stamm des HIV-Virus infiziert sind. Die Insertion des klonierten DNA- Fragments erfolgt in Restriktionsstellen, die ursprünglich in der Cassette vorhanden sind oder zu diesem Zweck auf geeignete Weise erzeugt worden sind, beispielsweise unter Verwendung eines Polylinkers. Eine Darstellung dieses Verfahrens findet sich in den nachstehend beschriebenen Beispielen.

Unter einer "DNA-Einheit, die für ein beliebiges Polypeptid" codiert, versteht man ein DNA-Segment, dessen erstes Codon in der 5'-Position und dessen letztes Codon in der 3'-Position jeweils für die erste Aminosäure in der N-terminalen Position und die letzte Aminosäure in der C-terminalen Position des Polypeptids codieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemaße Verfahren durchgeführt zur Herstellung einer Expressions-Cassette, die eine DNA-Einheit umfaßt, die für einen Vorläufer einer nicht-schneidbaren und löslichen Hybrid-gp160-Variante codiert.

Unter einem "Vorläufer einer gp160-Variante gemäß der Erfindung" versteht man ein Polypeptid, das ein Signal-Peptid und eine reife gp160- Variante umfaßt; wobei das N-terminale Ende der genannten Variante mit dem C-terminalen Ende des Signal-Peptids verbunden ist durch eine Peptid- Bindung. Dieser Vorläufer ist das Anfangsprodukt der Expression der DNA- Einheit. Er liegt insbesondere in dem Cytoplasma der Wirts-Zelle, assoziiert in der N-terminalen Position mit einem Methionin-Rest der Translationsinitiierung vor. Das Signal-Peptid erlaubt die Initiierung des Transfers der gp160-Variante in das Endoplasma-Reticulum. Bei diesem Transfer wird das Signal-Peptid durch proteolytische Spaltung entfernt zur Ausbildung der reifen Form der gp160-Variante. In dem nachfolgenden Text wird mit dem Ausdruck "gp160- Variante" ausschließlich auf seine reife Form Bezug genommen.

Das Signal-Peptid kann irgendein gebräuchliches Signal-Peptid sein. Es muß jedoch ausgewählt werden unter Berücksichtigung des Wirts-Organismus, der für die Produktion der erfindungsgemäßen gp160-Variante bestimmt ist. Wenn beispielsweise der Wirts-Organismus eine Säugetier-Zelle ist, kann das Signal-Peptid zweckmäßig unter den Signal-Peptiden der Vorläufer der gp160 der verschiedenen Stämme des HIV-Virus selektioniert werden, unabhängig von dem Ursprung der ersten, zweiten und dritten Regionen der erfindungsgemäßen Variante. Alternativ kann man synthetische Signal-Peptide verwenden. Solche Signal-Peptide sind beispielsweise Hybrid-Signal-Peptide, deren N-terminales Ende aus dem Vorläufer des gp160 des genannten zweiten Stammes des HIV-Virus stammt und dessen C-terminales Ende aus dem Vorläufer des gp160 des genannten ersten Stammes des HIV-Virus stammt. Es sei insbesondere darauf hingewiesen, daß das Signal-Peptid des Vorläufers des Glycoproteins eines Stammes des Tollwut-Virus ebenfalls verwendet werden kann. Für den Fachmann ist selbstverständlich, daß diese Liste nichtbeschränkend ist.

Erfindungsgemäß wird außerdem eine nicht-schneidbare und lösliche Hybrid-gp160-Variante vorgeschlagen, die umfaßt:

i) eine erste Region, die aus dem gp160 eines ersten Stammes des HIV-Virus stammt und in diesem gp160 angeordnet ist von der Aminosäure in der Position X bis zu der Aminosäure in der Position Y, wobei X eine Zahl von 1 bis 271 und Y eine Zahl von 306 bis 482 darstellen;

ii) eine zweite Region, die aus einer löslichen, nicht-schneidbaren gp160-Variante vom Typ A stammt, die aus einem zweiten Stamm des HIV- Virus stammt und in dieser letztgenannten gp160-Variante angeordnet ist von der Aminosäure in der Position Y + 1 bis zur Aminosäure in der C-terminalen Position, wobei Y wie oben definiert ist; und

iii) eine dritte Region, wenn X von 1 verschieden ist, die von dem gp160 des genannten zweiten Stammes des HIV-Virus abgeleitet ist und in dem zuletzt genannten gp160 angeordnet ist von der Aminosäure in der Position 1 bis zur Aminosäure in der Position X - 1, wobei X wie oben definiert ist.

Die erste sowie die zweite und die dritte Region der erfindungsgemäßen gp160-Variante können von dem gp160 eines beliebigen Stammes des HIV- Virus abgeleitet sein, mit der Maßgabe, daß der erste Stamm von dem zweiten verschieden ist. Vorzugsweise stammt die erste Region aus dem gp160 eines Virus-Stammes, der unter den Stämmen HIV-2 Rod, HIV-1 Eli, HIV-1 RF, HIV- 1 SF2C, HIV-1 SC und HIV-1 MN selektioniert worden ist, wobei letzterer ganz besonders bevorzugt ist. Desgleichen stammen die zweite und die dritte Region vorzugsweise aus dem gp160 des Stammes HIV-1 Bru.

Unter dem Ausdruck "nicht-spaltbare gp160-Variante vom Typ A" versteht man eine gp160-Variante, die

- entweder von einem gp160 eines Virus-Stammes vom Typ HIV-1 abgeleitet ist und keine Haupt-Schnittstelle mehr enthält,

- oder von einem gp160 eines Virus-Stammes vom Typ HIV-2 abgeleitet ist und keine Schnittstelle mehr enthält.

Wenn die gp160-Variante von einem gp160 eines Virus-Stammes vom Typ HIV-1 abgeleitet ist, ist diese Variante vorzugsweise eine solche vom Typ A', d.h. sie enthält weder die Hauptschnittstelle noch die Nebenschnittstelle.

Unter einer "löslichen gp160-Variante" versteht man eine gp160- Variante, die von einem nativen gp160 abgeleitet ist, das keine Transmembran-Region mehr enthält oder deren native Transmembran-Region in der Weise mutiert worden ist, daß ihre Verankerungsfunktion in der Membran nicht mehr gewährleistet werden kann. Darüber hinaus kann eine solche lösliche Variante zweckmäßig eine hydrophobe Region nicht mehr enthalten.

Unter dem Ausdruck "Expressions-Cassette" versteht man ein DNA- Segment, das eine DNA-Einheit, die exprimiert werden soll, sowie die für die Expression dieser letzteren erforderlichen Elemente umfaßt. Die Expression einer DNA-Einheit wird erzielt durch Transkription der zuletzt genannten DNA- Einheit in eine Messenger-RNA und durch Translation dieser Messenger-RNA in Protein. Infolgedessen sind die unerläßlichen Elemente ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor (zur Initiierung der Transkription), ein Translations-Initiierungs-Codon (ATG-Codon) und ein Translations-Terminations- Codon (TAG, TAA oder TGA-Codon). Außerdem kann eine Expressions- Cassette auch weitere Elemente enthalten, z.B. einen Translations-Terminator.

Für den Fachmann ist es ohne weiteres möglich, einen geeigneten Promotor und einen geeigneten Terminator auszuwählen als Funktion des Wirts-Organismus, in dem man die DNA-Einheit zu exprimieren wünscht, und als Funktion des Vektors, in den die Expressions-Cassette inseriert werden soll um ihre Replikation zu gewährleisten.

Dementsprechend wird erfindungsgemäß außerdem eine Expressions- Cassette vorgeschlagen, die eine DNA-Einheit, die entweder für einen Vorläufer einer erfindungsgemäßen gp160-Variante oder für eine erfindungsgemäße gp160-Variante codiert, sowie die für die Expression der genannten DNA- Einheiten erforderlichen Elemente umfaßt.

Um ihre autonome Replikation in einem Wirts-Organismus zu gewährleisten, kann eine erfindungsgemäße Expressions-Cassette in verschiedene Vektor-Typen inseriert werden, die einen an den Wirts-Organismus angepaßten Replikations-Ursprung aufweisen, beispielsweise ein Plasmid oder ein Virus Die Vektoren vom viralen Typ haben insbesondere die Fähigkeit, in ihrem Genom eine beträchtliche Menge von Fremd-DNA zu integrieren, ohne ihrer Replikationsfähigkeit zu schaden. Zu ihnen zählen beispielsweise die Pox- Viren, wie das Vaccine-Virus, das Kanarienvogel-Pox-Virus und das aviäre Variola-Pox-Virus; die Baculoviren als solche und die Adenoviren, wie das Adenovirus 2 oder das Adenovirus 5.

Außer ihrer Verwendung in einem heterologen Produktionssystem können bestimmte dieser Vektoren vom viralen Typ als Impfmittel fungieren. Es handelt sich dabei insbesondere um Pox-Viren und Adenoviren.

Aus diesem Grund betrifft die Erfindung ferner einen Virus-Vektor, in dessen Genom eine erfindungsgemäße Expressions-Cassette inseriert ist.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung erhält man auch eine Zelle, die durch eine erfindungsgemäße Expressions-Cassette transformiert worden ist. Die Expressions-Cassette, welche die Zelle transformiert, kann von einem Plasmid transportiert (übertragen) werden oder sie kann alternativ in das Genom der Wirts-Zelie integriert sein.

Der für die Herstellung der erfindungsgemäßen gp160-Variante bestimmte Wirts-Organismus kann irgendein beliebiger Zell-Typ sein, vorzugsweise eine Eukaryontenzelle. Diese umfaßt beispielsweise Pilze wie Hefen, Insektenzellen und Säugetierzellen.

Erfindungsgemäß werden außerdem zwei alternative Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen gp160-Variante vorgeschlagen:

- das erste Verfahren umfaßt die Kultivierung einer erfindungsgemäßen Zelle und die Gewinnung (Abtrennung) der genannten Variante aus der Kultur; und

- das zweite Verfahren umfaßt das Infizieren einer Zellen-Kultur mit eiiiem erfindungsgemäßen viralen Vektor und die Gewinnung (Abtrennung) der genannten Variante aus der Kultur.

Eine p160-Variante sowie ein viraler Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung weisen eine Impf-Aktivität gegenüber einem HIV-Virus auf und sind infolgedessen verwendbar als pharmazeutische Produkte, die insbesondere zur Behandlung oder zur Verhinderung von AIDS bestimmt sind.

Gegenstand der Erfindung sind demzufolge:

i) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung (Heilung) oder Verhinderung von AIDS, die als therapeutisches Agens mindestens eine gp160-Variante oder einen viralen Vektor gemäß der Erfindung enthält;

ii) ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von AIDS, das umfaßt das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer gp160-Variante oder eines viralen Vektors gemäß der Erfindung an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf;

iii) die Verwendung einer gp 160-Variante oder eines viralen Vektors gemäß der Erfindung als therapeutisches Agens für die Behandlung oder Verhinderung von AIDS.

Vorzugsweise kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung mehrere erfindungsgemäße gp160-Varianten enthalten, wobei jede gp160-Variante mindestens eine dritte hypervariable Domäne (Schleife, Ring V&sub3;) aufweist, die von den anderen in der Zusammensetzung vorhandenen Varianten verschieden ist. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung erlaubt es, ein Individuum gegen verschiedene HIV-Stämme richtig zu schützen.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann außerdem weitere therapeutische Agentien enthalten, beispielsweise ein Peptid, das im wesentlichen der dritten hypervariablen Domäne eines gp160 (nachstehend als Peptid V&sub3; bezeichnet) entspricht. Vorzugsweise weist ein solches Peptid eine Sequenz auf, die im wesentlichen identisch ist mit der Sequenz der dritten Domäne einer gp160-Variante, die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist. Auf entsprechende Weise können auch mehrere Peptide V&sub3; in der Zusammensetzung vorhanden sein. Insbesondere kann man dann, wenn die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verschiedene gp160-Varianten enthält, ohne weiteres die entsprechenden Peptide V&sub3; zugeben.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf konventionelle Weise hergestellt werden. Insbesondere kombiniert man eine erfindungsgemäße gp160-Variante mit einem Verdünnungsmittel oder einem Träger, das (der) vom pharmazeutischen Gesichtspunkt aus betrachtet akzeptabel ist. Schließlich kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Impf-Adjuvans wie Alaun enthalten. Alternativ kann dieses Adjuvans unmittelbar vor der Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zugesetzt werden.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf irgendeinem konventionellen Wege, wie er auf dem Gebiet der Impfstoffe üblich ist, insbesondere auf subcutanem Wege, beispielsweise in Form einer injizierbaren Lösung oder Suspension, verabreicht werden. Die Verabreichung kann in einer Einheitsdosis oder in einer ein- oder mehrfachen Wiederholung nach einem bestimmten Zeitintervall erfolgen. Die geeignete Dosierung variiert in Abhängig keit von verschiedenen Parametern, beispielsweise dem behandelten Individuum oder der Art der Verabreichung.

Alternativ kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung als Teil eines Behandlungs-Klts vorliegen. Ein solcher Kit kann beispielsweise enthalten:

- einerseits eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine erfindungsgemäße gp160-Variante enthält, und

- andererseits eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein V&sub3;-Peptid enthält,

- sowie einen Hinweis, der die Instruktionen bezüglich der aufeinanderfolgenden oder gleichzeitigen Verabreichung der in dem Kit enthaltenen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthält.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Sequenz der Aminosäuren der Vorlufer der nativen gp160 der Virusstämme HIV-1 Bru (a), HIV-1 MN (b), HIV-1 Eli (c), HIV-1 RF (d), HIV- 1 SC (e) und HIV-1 SF2C (f). Die Aminosäurereste der Signal-Sequenzen sind in der Position -1 bis -29 numeriert. Der Methionin-Rest in der Position -30 entspricht dem Translations-Initiierungscodon. Die Aminosäurereste der reifen gp160 sind in der Position 1 bis 841 numeriert. Der Stern (*) symbolisiert die Identität der Aminosäurereste mit einer gegebenen Position, während der Punkt (.) eine konservative Veränderung anzeigt (unterschiedliche Aminosäuren, die jedoch zur gleichen Klasse gehören);

Fig. 2 die Sequenz der Aminosäuren der Vorläufer der nativen gp160 der Virus-Stämme HIV-1 Bru (a) und HIV-2 Rod (b). Die Aminosäurereste der Signal-Sequenzen sind in der Position -1 bis -29 numeriert. Der Methionin- Rest in der Position -30 entspricht dem Translations-Initiierungscodon. Die Aminosäurereste der reifen gp160 sind in der Position 1 bis 841 numeriert. Der Stern (*) symbolisiert die Identität der Aminosäurereste mit einer gegebenen Position, während der Punkt (.) eine konservative Veränderung anzeigt (unterschiedliche Aminosäuren, die jedoch zur gleichen Klasse gehören);

Fig. 3 die Nucleotid-Sequenz des Fragments PstI-PstI des Vektors pTG1163, der umfaßt die Sequenz, die für einen Vorläufer einer nichtschneidbaren löslichen gp160-Bru-Variante (in der eine Transmembran- Domäne fehlt) codiert, sowie die Sequenz der Aminosäuren dieses Vorläufers;

Fig. 4 in schematischer Form die Stufen der Konstruktion der Bacteriophagen M13TG4168 und M13TG4174;

Fig. 5 die Nucleotid-Sequenz, die für den Vorläufer von gp120-MN codiert, sowie die Aminosäure-Sequenz dieses Vorläufers. Die Oligonudeotide OTG2624 und OTG2625, die für die Amplifikation eines DNA-Fragments bestimmt sind, das mindestens für die dritte hypervariable Domäne von gp120- MN codiert, sind oberhalb ihrer Hybridisierungsregion angegeben;

Fig. 6 die Nucleotid-Sequenz, die für den Vorläufer von gp120-Eli codiert, sowie die Aminosäure-Sequenz dieses Vorläufers. Die Oligonudeotide OTG2624 und OTG2625, die für die Amplifikation eines DNA-Fragments bestimmt sind, das mindestens für die dritte hypervariable Domäne von gp120- MN codiert, sind oberhalb ihrer Hybridisierungs-Region angegeben;

Fig. 7 die Nucleotid-Sequenz, die für den Vorläufer von gp120-RF Codiert, sowie die Aminosäure-Sequenz dieses Vorläufers. Die Oligonudeotide OTG2624 und OTG2625, die für die Amplifikation eines DNA-Fragments bestimmt sind, das mindestens für die dritte hypervariable Domäne von gp120- RF codiert, sind oberhalb ihrer Hybridisierungs-Region angegeben;

Fig. 8 die Nucleotid-Sequenz, die für den Vorläufer von gp120-SF2C codiert, sowie die Aminosäure-Sequenz dieses Vorläufers. Die Oligonudeotide OTG2624 und OTG2625, die für die Amplifikation eines DNA-Fragments bestimmt sind, das mindestens für die dritte hypervariable Domäne von gp120- SF2C codiert, sind oberhalb ihrer Hybridisierungs-Region angegeben.

In den folgenden Beispielen versteht man zur Erleichterung der Beschreibung und des Verständnisses unter der" Signal-Sequenz" eine Signal- Sequenz, die den Translationsinitiierungs-Methionin-Rest einschließt.

Beispiel 1: Herstellung einer Insertions-Cassette, die von dem Bacteriophagen M13TG4168 getragen wird

Wie in der Fig. 3 dargestellt, umfaßt das in der europäischen Patentanmeldung EPA 245 136 beschriebene DNA-Fragment PstI-PstI des Plasmids pTG1163 eine DNA-Sequenz: die für einen Vorläufer einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Bru-Variante codiert. Dieses DNA-Fragment PstI-PstI wird in den Bacteriophagen M13mp701 (wie von M.P. Kieny et al. in "Gene" (1983), 26:91, beschrieben) inseriert: der vorher mit PstI digeriert worden ist zur Bildung des Bacteriophagen M13TG4137 (Fig. 4). Die in der Fig. 3 angegebene Numerierung der Nucleotide des Fragments PstI-PstI dient in der nachfolgenden Beschreibung des Beispiels 1 als Bezug (Referenz).

Das Plasmid pTG1163 wird mit PstI und KpnI geschnitten und in den Bacteriophagen M13TG130 inseriert (wie er von M.P. Kieny et al., supra (1983), beschrieben worden ist), der vorher mit PstI und KpnI digeriert wurde. Man erhält so den Bacteriophagen M13TG4147 (Fig. 4).

Der Bacteriophage M13TG4137 wird mit BglII geschnitten, mit dem Klenow-Enzym (Boehringer Mannheim) behandelt, um freie Enden zu erhalten, dann mit EcoRI geschnitten. Das bei dieser Digestion erhaltene Fragment EcoRI-BglIIº, das die den Nucleotiden 1424 bis 2644 entsprechende Sequenz umfaßt (Fig. 3) wird in den Bacteriophagen M13TG4147 inseriert, der vorher mit EcoRV und EcoRI digeriert worden ist. Man erhält so den Bacteriophagen M13TG4158, der umfaßt:

i) ein den Nucleotiden 1 bis 138 entsprechendes DNA-Fragment,

ii) die verbleibende Sequenz des Polylinkers des Bacteriophagen M13TG4147, d.h. ATCGCATGCG, und

iii) ein den Nucleotiden 1424 bis 2644 entsprechendes DNA- Fragment.

Der Einfachstrang-Anti-sens-Bacteriophage M13TG4158 dient als Matrix für eine Mutations-Deletion, die durchgeführt wird unter Verwendung des Amersham-Kits und des Oligonucleotids OTG2623, dessen Sequenz die folgende ist:

Diese Mutagenese erlaubt es, gleichzeitig ein Fragment von 184 Basenpaaren, das die Nucleotide 67 bis 138, die Sequenz ATCGCATGCG und die Nucleotide 1424 bis 1525 umfaßt, zu deletieren und Schnittstellen für die Enzyme SphI in der 5'-Stellung und SmaI in der 3'-Stellung zu erzeugen, die zwischen den Nucleotiden 66 und 1526 inseriert werden. Man erhält so den Bacteriophagen M13TG4168, der umfaßt:

i) ein den Nucleotiden 1 bis 66 entsprechendes DNA-Fragment,

ii) die DNA-Sequenz GCATGCATCCCG, welche die Schnittstellen (Spaltungsstellen) der Enzyme SphI und SmaI uumfaßt, und

iii) ein den Nucleotiden 1526 bis 2644 entsprechendes DNA- Fragment.

Beispiel 2: Herstellung einer Expressions-Cassette für die Synthese einer Hybrid-gp160 Bru-MN-Variante

Wie in der Fig. 5 dargestellt, wird das DNA-Fragment, das für den Hauptabschnitt eines Vorläufers von gp120-MN codiert, nach der genetischen Amplifikationsmethode PCR (Polymerase-Kettenreaktion kloniert), die durchgeführt wird unter Verwendung der genomischen DNA von Human-CEM- Zellen, die mit dem Virus-Stamm HIV1-MN infiziert worden sind. Diese Klonierung wird mit Hilfe der Oligonudeotide OTG2624 und OTG2625 durchgeführt, die jeweils eine Schnittstelle für das Enzym Sphi in die 5'-Stellung des amplifizierten DNA-Fragments und eine Schnittstelle für das Enzym SmaI in die 3'- Stellung des amplifizierten DNA-Fragments einführen. Die Sequenzen dieser Oligonudeotide sind die folgenden:

Das amplifizierte DNA-Fragment SphI-SmaI entspricht den Nucleotiden 53 bis 1505, wie in der Fig. 5 dargestellt, unter Berücksichtigung der Sequenz- Modifikationen, die durch die Oligonudeotide OTG2624 und OTG2625 bewirkt worden sind. Dieses Fragment wird in den durch SphI und SmaI geschnittenen Bacteriophagen M13TG4168 inseriert. Man erhält so den Bacteriophagen M13TG4174, der ein DNA-Fragment umfaßt, das für einen Vorläufer eines Hybrid-gp160 Bru-MN-Proteins codiert. Das Fragment PstI des Bacteriophagen M13TG4174, das für die Hybrid-gp160-Bru-MN-Variante codiert, wird in das Transfer-Plasmid pTG186poly (beschrieben von M.P. Kieny et al. in "Biotechnology" (1986) 4: 790) stromabwärts von dem Promotor E7.5k und in das Innere des Gens des Vaccine-Virus&sub3; das für die Thymidin-Kinase codiert, inseriert. Man erhält so das Plasmid pTG5156.

Das Plasmid pTG5156 wird nachstehend für den Transfer des Expressions-Blockes des Hybrid-gp160 Bru-MN-Proteins in das Genom des Vaccine- Virus, Stamm Kopenhagen, nach der von M.P. Kieny et al. in "Nature" (1984), 312, 163-166 beschriebenen Verfahren verwendet. Man erhält so den Vektor des Vaccins WTG5156.

Beispiel 3: Herstellung einer Expressions-Cassette für die Synthese einer Hybrid-gp160 Bru-Eli-Variante

Das Plasmid pTG186poly wird mit BamHI geschnitten, mit dem Klenow- Enzym behandelt, mit SmaI geschnitten, um den Hauptabschnitt des Polylinkers zu deletieren, dann wieder mit sich selbst religiert unter Bildung des Plasmids pTG186PE. Der Polylinker behält nurmehr die Schnittstellen für die Enzyme PstI, SalI und EcoRI bei.

Das DNA-Fragment PstI-PstI des oben beschriebenen Bacteriophagen M13TG4168, das umfaßt:

i) ein den Nucleotiden 1 bis 66 entsprechendes DNA-Fragment des in der Fig. 3 dargestellten DNA-Fragments,

ii) die DNA-Sequenz GCATGCATCCCG, welche die Schnittstellen der Enzyme SphI und SmaI umfaßt, und

iii) ein den Nucleotiden 1526 bis 2644 entsprechendes DNA- Fragment des in der Fig. 3 dargestellten DNA-Fragments,

wird in das Plasmid pTG186PE inseriert, das vorher mit PstI geschnitten worden ist, stromabwärts von dem Promotor E7.5k und in das Innere des Gens des Vaccine-Virus, das für die Thymidin-Kinase codiert. Man erhält so das Plasmid pTG5160.

Wie in der Fig. 6 dargestellt, wird das DNA-Fragment, das für den Hauptabschnitt eines Vorläufers von gp120-Eli codiert, nach der genetischen Amplifikations-Methode PCR kloniert, die durchgeführt wird unter Verwendung der genomischen DNA von Human-CEM-Zellen, die durch das Virus HIV 1-Eli infiziert worden sind, als Ausgangsmaterial. Diese Klonierung wird mit Hilfe der Oligonucleotide OTG2624 und OTG2625 durchgeführt, die jeweils eine Schnittstelle für das Enzym SphI in die 5'-Stellung des amplifizierten DNA- Fragments und eine Schnittstelle für das Enzym SmaI in die 3'-Stellung des amplifizierten DNA-Fragments einführen. Das amplifizierte DNA-Fragment SphI-SmaI entspricht den in der Fig. 6 dargestellten Nucleotiden 53 bis 1490 unter Berücksichtigung der Sequenz-Modifikationen, die durch die Oligonucleotide OTG2624 und OTG2625 bewirkt worden sind. Dieses Fragment wird in den Bacteriophagen M13TG131 (beschrieben von M.P. Kieny et al., supra (1983)) inseriert, der vorher mit SphI und SmaI geschnitten worden ist unter Bildung des Bacteriophagen M13TG4197. Dann wird das Fragment SphI-SmaI des Bacteriophagen M13TG4197 in das Transfer-Plasmid pTG5160 (wie oben beschrieben) inseriert, das vorher mit SphI und SmaI geschnitten worden ist. Man erhält so das pTG5193.

Das Plasmid pTG5193 wird danach verwendet zum Transfer des Expressions-Blockes des Hybrid-gp160 Bru-Eli-Proteins in das Genom des Vaccine-Virus, Stamm Kopenhagen, nach der von M.P. Kieny et al., supra (1984), beschriebenen Methode. Man erhält so den Vektor des Vaccins VVTG5193.

Beispiel 4: Herstellung einer Expressions-Cassette für die Synthese einer Hybrid-gp160 Bru-RFVariante

Wie in der Fig. 7 dargestellt, wird das DNA-Fragment, das für den Hauptabschnitt eines Vorläufers eines gp120-RF-Proteins codiert, nach der genetischen Amplifikationsmethode PCR kloniert, die durchgeführt wird unter Verwendung der genomischen DNA von Human-CEM-Zellen, die durch das Virus HIV1-RF infiziert worden sind, als Ausgangsmaterial. Diese Klonierung jeweils eine Schnittstelle für das Enzym SphI in die 5'-Stellung des amplifizierten DNA-Fragments und eine Schnittstelle für das Enzym Smal in die 3'-Stellung des amplifizierten DNA-Fragments einführen. Das amplifizierte DNA- Fragment SphI-SmaI entspricht den Nucleotiden 53 bis 1523, wie sie in der Fig. 7 dargestellt sind, unter Berücksichtigung der Sequenz-Modifikationen, die durch die Oligonucleotide OTG2624 und OTG2625 bewirkt worden sind. Dieses Fragment wird in den Bacteriophagen M13TG131 inseriert, der vorher nut SphI und SmaI geschnitten worden ist, unter Bildung des Bacteriophagen M13TG4198. Dann wird das Fragment SphI-SmaI des Bacteriophagen M13TG4198 in das Transfer-Plasmid pTG5160 (beschrieben in Beispiel 3) inseriert, das vorher mit SphI und SmaI geschniten worden ist. Man erhält so das Plasmid pTG5194.

Das Plasmid pTG5194 wird danach verwendet, um den Expressions- Block des Hybrid-gp160 Bru-RF-Proteins in das Genom des Vaccine-Virus, Stamm Kopenhagen, nach dem von M.P. Kieny et al., supra (1984), beschriebenen Verfahrens zu transferieren. Man erhält so den Vektor des Vaccins VVTG5194.

Beispiel 5: Herstellung einer Expressions-Cassette für die Synthese einer Hybrid-gp 160 Bru-SF2C-Variante

Wie in der Fig. 8 dargestellt, wird das DNA-Fragment, das für den Hauptabschnitt eines Vorläufers von gp120-SF2C codiert, nach der genetischen Amplifikationsmethode PCR kloniert, die durchgeführt wird unter Verwendung der genomischen DNA von Human-CEM-Zellen, die durch das Virus HIV1-SF2C infiziert worden sind, als Ausgangsmaterial. Diese Klonierung wird mit Hilfe der Oligonudeotide OTG2624 und OTG2625 durchgeführt, die jeweils eine Schnittstelle für das Enzym SphI in die 5'-Stellung des amplifizierten DNA-Fragments und eine Schnittstelle für das Enzym SmaI in die 3'-Stellung des amplifizierten DNA-Fragments einführen. Das amplifizierte DNA-Fragment SphI-SmaI entspricht den in der Fig. 8 dargestellten Nucleotiden 53 bis 1493 Linter Berücksichtigung der Sequenz-Modifikationen, die durch die Oligonucleotide OTG2624 und OTG2625 bewirkt worden sind. Dann wird dieses Fragment in den Bacteriophagen M13TG131 inseriert, der vorher mit SphI und SmaI geschnitten worden ist unter Bildung des Bacteriophagen M13TG4199. Das Fragment SphI-SmaI des Bacteriophagen M13TG4199 wird in das Transfer-Plasmid pTG5160 (wie in Beispiel 3 beschrieben) inseriert, das vorher mit SphI und SmaI geschnitten worden ist. Man erhält so das Plasmid pTG5195.

Das Plasmid pTG5195 wird anschließend für den Transfer des Expressions-Blocks des Hybrid-gp160 Bru-SF2C-Proteins in das Genom des Vaccine-Virus, Stamm Kopenhagen, nach der von M.P. Kieny et al., supra (1984), beschriebenen Methode verwendet. Man erhält so den Vektor des Vaccins VVTG5195.

Beispiele 6 bis 9: Herstellung und Reinigung der Hybride gp160 Bru-MN, Bru-Eli, Bru-RF und Bru SF2C:

BHK-21-Zellen werden in einem GMEM (Gibco)-Medium, das mit 10 % fötalem Kalbsserum (SVF) ergänzt worden ist, kultiviert. Wenn die Zellen am Zusammenwachsen sind (5,8x10&sup6; Zellen/ml) wird das Kulturmedium entnommen und der Zellrasen wird zweimal mit 50 ml PBS (Dulbecco-Phosphatpuffersalz; Seromed) gewaschen. Dann wird erneut frisches GMEM-Medium ohne SVF zugegeben. Danach gibt man eines der Viren des Vaccins VVTG5156, VVTG5193, VVTG5194 und VVTG5195, wie sie in den Beispielen 2 bis 5 vorstehend beschrieben worden sind, zu bis zu einer Infektiosität von 1 ufp/Zelle (eine Einheit bildende Bereiche) und die Infektion wird 72 h lang fortgesetzt. Das Lysat wird dann 20 min lang bei 10 000 g zentrifugiert, um die Zellbruchstucke zu eliminieren, und man trennt ab (gewinnt) die überstehende Flüssigkeit, die unter anderem ein Hybrid-gp160 und Virionen enthält.

Zu 20 ml des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Kulturüberstandes gibt man 1,3 ml einer 1 M Lösung von Zinkchlorid (ZnCl&sub2;) zu, um eine End- Konzentration an ZnCl&sub2; von 60 mM zu erhalten. Man läßt die Mischung 1 h lang in Eis stehen, dann trennt man den Flüssigkeitsüberstand von dem Niederschlag nach 20-minütigem Zentrifugieren mit 3000 UpM in einer Zentrifuge Minifuge RF Heraeus. Nach dieser Methode werden die Virionen sowie die Mehrzahl der kontaminierenden Proteine durch Ausfällung eliminiert. In jedem Fall erhält man so eine gereinigte Lösung der Hybrid-gp160-Variante.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung einer Expressions-Cassette, die eine DNA- Einheit umfaßt, die entweder für einen Vorläufer einer nicht-schneidbaren und löslichen Hybrid-gp160-Variante oder für eine nicht-schneidbare und lösliche Hybrid-gp160-Variante codiert, wobei die genannte gp160-Variante eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die umfaßt:

i) eine erste Region, die von der gp160 eines ersten Stammes des HIV- Virus abgeleitet ist und in der zuletzt genannten gp160 von der Aminosäure in der Position X bis zur Aminosäure in der Position Y angeordnet ist, wobei X eine Zahl von 1 bis 271 und Y eine Zahl von 306 bis 482 bedeuten;

ii) eine zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren löslichen gp160- Variante vom Typ A abgeleitet ist, die aus einem zweiten Stamm des HIV-Virus stammt und in dieser letztgenannten gp160-Varianter von der Aminosäure in der Position Y + 1 bis zur Aminosäure in der C-terminalen Position angeordnet ist, wobei Y wie oben definiert ist; und

iii) eine dritte Region, wenn X von 1 verschieden ist, die von der gp160 des genannten zweiten Stammes des HIV-Virus abgeleitet ist und in der zuletzt genannten gp160 von der Aminosäure in der Position 1 bis zur Aminosäure in der Position X - 1 angeordnet ist, wobei X wie oben definiert ist;

wobei das genannte Verfahren umfaßt:

a) die Klonierung eines DNA-Fragments, das für die genannte erste Region codiert; und

b) die Insertion des in der Stufe (a) klonierten DNA-Fragments in eine Stelle einer Cassette, die umfaßt:

m) stromaufwärts von der Stelle und aufeinanderfolgend:

i) einen Promotor,

ii) ein Translations-Initiierungscodon,

iii) gegebenenfalls eine erste DNA-Region, die für ein Signal- Peptid codiert, und

iv) eine zweite DNA-Region, wenn X wie oben definiert ist, die für die genannte dritte Region der Aminosäure-Sequenz der genannten Hybrid-gp160-Variante codiert; und

n) stromabwärts von der Stelle und aufeinanderfolgend:

i) eine dritte DNA-Region, wenn Y wie oben definiert ist, die für die genannte zweite Region der Aminosäure-Sequenz der genannten Hybrid-gp160-Variante codiert, und

ii) ein Translations-Terminationscodon;

unter Bildung einer Expressions-Cassette, welche die genannte DNA-Einheit umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Einheit für einen Vorläufer einer nicht-schneidbaren und löslichen Hybrid- gp160-Variante codiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante abgeleitet ist, eine solche vom Typ A' ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Stamm des HIV-Virus der Stamm HIV 1-Bru ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Stamm des HIV-Virus unter den Stämmen HIV-1 MN, HIV 1 Eli, HIV-1 RF, HIV-1 SF2C und HIV-1 SC ausgewählt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Stamm des HIV-Virus der Stamm HIV-1 MN ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Y eine Zahl von 450 bis 482 ist und die zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante abgeleitet ist, eine soldie vom Typ A' ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Zahl von 1 bis 97 ist und die zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante abgeleitet ist, eine solche vom Typ A' ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Zahl von 1 bis 97 ist und die zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante abgeleitet ist, eine solche vom Typ A' ist und daß man ein DNA-Fragment, das für die genannte erste Region codiert, kloniert nach der PCR-Methode, wobei man von der Genom- DNA von Zellen ausgeht, die durch den genannten ersten Stamm des HIV- Virus infiziert sind.

Nicht-schneidbare und lösliche Hybrid-gp160-Variante, die eine Sequenz von Aminosäuren aufweist, die umfaßt:

i) eine erste Region der gp160 eines ersten Stammes des HIV-Virus, die in der zuletzt genannten gp160 von der Aminosäure in der Position X bis zur Aminosäure in der Position Y angeordnet ist, wobei X eine Zahl von 1 bis 271 und Y eine Zahl von 306 bis 482 darstellen;

ii) eine zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante vom Typ A abgeleitet ist, der aus einem zweiten Stamm des HIV-Virus stammt und in der zuletzt genannten gp160-Variante von der Aminosäure in der Position Y + 1 bis zur Aminosäure in der C-terminalen Position angeordnet ist, wobei Y wie oben definiert ist, und

iii) eine dritte Region, wenn X von 1 verschieden ist, die von der gp160 des genannten zweiten Stammes des HIV-Virus abgeleitet ist und in der zuletzt genannten gp160 von der Aminosäure in der Position 1 bis zur Aminosäure in der Position X - 1 angeordnet ist, wobei X wie oben definiert ist.

11. Hybrid-gp160-Variante nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160- Variante abgeleitet ist, eine solche vom Typ A' ist.

12. Hybrid-gp160-Variante nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Stamm des HIV-Virus der Stamm HIV 1-Bru ist.

13. Hybrid-gp160-Variante nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Stamm des HIV-Virus unter den Stämmen HIV- 1 MN, HIV-1 Eli, HIV-1 RF, HIV-1 SF2C und HIV-1 SC ausgewählt wird.

14. Hybrid-gp160-Variante nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Stamm des HIV-Virus der Stamm HIV-1 MN ist.

15. Hybrid-gp160-Variante nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Y eine Zahl von 450 bis 482 ist und die zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante abgeleitet ist, eine solche vom Typ A' ist.

16. Hybrid-gp160-Variante nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Zahl von 1 bis 97 ist und die zweite Region, die von einer nicht-schneidbaren und löslichen gp160-Variante abgeleitet ist, eine solche vom Typ A' ist.

17. Expressions-Cassette, wie sie nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 erhalten wird.

18. Expressions-Cassette, die umfaßt eine DNA-Einheit, die entweder für einen Vorläufer einer gp160-Variante oder für eine gp160-Variante, wie in einem der Ansprüche 10 bis 16 defineirt, codiert, und die für die Expression der genannten DNA-Einheit erforderlichen Elemente.

19. Zelle, die durch eine Expressions-Cassette nach Anspruch 17 oder 18 transformiert worden ist.

20. Viraler Vektor, in dessen Genom eine Expressions-Cassette nach Anspruch 17 oder 18 inseriert ist.

21. Verfahren zur Herstellung einer gp160-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 16, das umfaßt die Kultivierung einer Zelle nach Anspruch 19 und die Gewinnung (Abtrennung) der genannten Variante aus der Kultur.

22. Verfahren zur Herstellung einer gp160-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 16, das umfaßt das Infizieren einer Zellen-Kultur mit einem viralen Vektor nach Anspruch 20 und die Gewinnung (Abtrennung) der genaimten Variante aus der Kultur.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von Aids, die als therapeutisches Agens (Wirkstoff) eine gp160-Variante nach einem der Ansprüche 10 bis 16 enthält.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von Aids, die als therapeutisches Agens (Wirkstoff) einen viralen Vektor nach Anspruch 20 enthält.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com