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Dokumentenidentifikation DE69220485T2 09.10.1997
EP-Veröffentlichungsnummer 0580635
Titel MODIFIZIERTE PFLANZENVIREN ALS VEKTOREN
Anmelder Agricultural Genetics Co. Ltd., Cambridge, GB;
Purdue Research Foundation, West Lafayette, Ind., US
Erfinder LOMONOSSOFF, George, Peter, Norwich NR4 7UH, GB;
JOHNSON, John, Emil, West Lafayette, IN 47907, US
Vertreter Patentanwälte von Kreisler, Selting, Werner et col., 50667 Köln
DE-Aktenzeichen 69220485
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 02.04.1992
EP-Aktenzeichen 929075836
WO-Anmeldetag 02.04.1992
PCT-Aktenzeichen GB9200589
WO-Veröffentlichungsnummer 9218618
WO-Veröffentlichungsdatum 29.10.1992
EP-Offenlegungsdatum 02.02.1994
EP date of grant 18.06.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.10.1997
IPC-Hauptklasse C12N 7/01
IPC-Nebenklasse C12N 15/83   A61K 39/135   A61K 39/21   A61K 39/125   A61K 39/12   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Viren als Träger (Vektoren) zur Herstellung oder Präsentation von Fremdpeptiden. Genauer bezieht sich die Erfindung auf die Genmanipulation von Virusnukleinsäure durch Einbau von Fremdnukleinsäuresequenzen, die in dem Virusteilchen (Virion) als Peptide exprimiert werden. In dieser Beschreibung bedeutet die auf ein Peptid oder die dafür kodierende Nukleinsäure angewandte Bezeichnung "fremd" ein Peptid oder Nukleinsäuresequenzen, die für das als Vektor verwendete Pflanzenvirus nicht natürlich sind. Derartige Sequenzen können wahlweise als exogene oder heterologe Sequenzen beschrieben werden. Die Bezeichnung "Peptid" schließt kleine Peptide und Polypeptide ein.

Die Verwendung von Viren als Träger von Fremdpeptiden ist auf dem Gebiet der zusammengesetzten Virusimpfstoffe ausgedehnt erforscht worden. Derartige Impfstoffe beruhen auf chimären Viren, die Hybride unterschiedlicher Tiervirusbestandteile sind. Üblicherweise stammt der Hauptbestandteil derartiger Hybride aus einem Virus, das harmlos ist oder gemacht worden ist und der untergeordnete Bestandteil ist ein ausgewählter antigener Bestandteil eines pathogenen Virus. Zum Beispiel kann ein Pockenvirus wie etwa Vaccinia oder ein abgeschwächter Poliovirus als Vektor für immunogene Bestandteile anderer Tierviren einschließlich Humanviren verwendet werden.

Die vorstehende Technik hat jedoch mehrere Nachteile. Derartige Impfstoffe werden aus Viren hergestellt, die in Zellkultursystemen gezüchtet wurden, welche in Aufbau und Betrieb kostspielig sind. Der Weg des zusammengesetzten Virus umfaßt die Genmanipulation lebender, ein Tier infizierender Viren mit dem Risiko, daß Mutationen zu neuen Virusformen mit veränderter Infektiösität, Antigenität und/oder Pathogenität führen können. Der als Vektor verwendete Tiervirus ist oft ein Virus, welchem das Tier bereits ausgesetzt worden sein kann und das Tier kann bereits Antikörper gegen den Vektor produzieren. Der Vektor kann deshalb durch das Immunsystem zerstört werden, bevor die eingebaute antigene Stelle des zweiten Virus eine Immunantwort erzeugt.

Die vorliegende Erfindung vermeidet die vorgenannten Nachteile durch die Verwendung eines grundlegend verschiedenen Typs Virusbestandteil beim Aufbau Fremdsequenzen exprimierender chimärer Viren. Obschon die Erfindung weiter eine besondere Bedeutung für die Lösung von Problemen hat, die bei der Herstellung von Virusimpfstoffen angetroffen werden, hat sie wie hierin nachstehend angegeben ein viel breiteres Konzept und Anwendungsgebiet.

Die vorliegende Erfindung verwendet Pflanzenviren als Vektorsysterne für die Expression von Fremdnukleotidsequenzen, d.h. Nukleotidsequenzen (RNA oder DNA), die in Pflanzenviren, wie sie in der Natur gefunden werden, nicht zugegen sind und die folglich für Peptide kodieren, die normalerweise in natürlich vorkommenden Pflanzenviren nicht angetroffen werden.

Die vorliegende Erfindung stellt zusammengesetzte Teilchen eines Pflanzenvirus bereit, das ein vorbestimmtes Fremdpeptid als Teil des Hüllproteins des Virus enthält, wobei die Teilchen sich in Pflanzen replizieren und zusammensetzen können, und in ganzen Pflanzen oder in Pflanzenzellen zusammengesetzt worden sind. Die Pflanzenviren der vorliegenden Erfindung sind deshalb modifizierte Formen der natürlichen Viren und werden der Bequemlichkeit halber als modifizierte Viren bezeichnet.

Die Fremdpeptide, die in Pflanzenviren gemäß dieser Erfindung eingebaut werden können, können sehr unterschiedliche Typen sein und unterliegen nur der Beschränkung, daß die Art und Größe des Fremdpeptids und die Stelle, an der es in oder auf dem Virusteilchen angebracht ist, nicht die Fähigkeit des modifizierten Virus beeinträchtigt, sich beim Kultivieren in vitro oder in vivo zusammenzusetzen. Im weitesten Sinne können modifizierte Viren aus allen biologisch brauchbaren Peptiden (üblicherweise Polypeptide) gebildet werden, deren Funktion eine besondere Konformation für ihre Aktivität erfordert. Dies kann durch die Verbindung des Peptids mit einem größeren Molekül unter z.B. Verbessern seiner Stabilität oder Präsentationsweise in einem besonderen biologischen System erreicht werden. Beispiele derartiger Peptide sind Peptidhormone, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Antigene mit einem Protozoen-, Virus-, Bakterien- oder Pilzursprung, Antikörper einschließlich anti-idiotypischer Antikörper, Immunregulatoren und Cytokine, z.B. Interferone und Interleukine, Rezeptoren, Adhesine und Teile oder Vorläufern irgendeines vorstehenden Peptidtyps. Das Peptid enthält vorzugsweise mehr als 5 Aminosäuren.

Unter dem breiten Bereich bioaktiver Peptidsequenzen, die an Pflanzenviren gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden sind, kommt den antigenen Peptiden eine besondere Bedeutung zu, welche die Grundlage von Impfstoffen, insbesondere Tier- (einschließlich Human-) Virusimpfstoffe, sind. Die Erfindung stellt für Impfstoffanwendungen ein besonders attraktives Epitoppräsentationssystem bereit. Wenn der antigene Peptidbestandteil für derartige Anwendungen verwendet wird, ist er auf dem Virusteilchen geeigneterweise so angeordnet, daß er von dem Immunsystem leicht erkannt wird, zum Beispiel durch Anordnung auf einem exponierten Teil des Virus-Hüllproteins. Auf Letzteres angewandt umfaßt die vorliegende Erfindung deshalb zusammengesetzte Teilchen eines modifizierten Pflanzenvirus, das ein Antigen enthält, welches von einem Pathogen, z.B. einem Tiervirus, stammt, das in eine exponierte Oberfläche des Hüllproteins des Pflanzenvirus eingebaut ist. Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung derartiger zusammengesetzter modifizierter Pflanzenvirusteilchen als immunogener Bestandteil eines Impfstoffs.

Im US-Patent 4 407 956 und den europäischen Anmeldungen 067 553, 194 809, 221 044 und den PCT-Anmeldungen WO87/06261 und WO90/00- 611 ist früher vorgeschlagen worden, die DNA und RNA gewisser Pflanzenviren als Vektoren für die Einführung exogenen Materials in Pflanzen entweder unter Verleihen neuer Eigenschaften an die Pflanze selbst oder unter Ermöglichen, daß gewisse wertvolle Verbindungen (z.B. Pflanzenmetaboliten) gewonnen werden, zu verwenden. Bei solchen früheren Vorschlägen richtet sich das Interesse vollständig auf die modifizierte DNA oder RNA des Pflanzenvirus seine Verwendung bei der phänotypischen Transformation von Pflanzen. Die meisten dieser früheren Beschreibungen sind theoretischer und spekulativer Art und keine offenbart Isolierung ganzer Teilchen (Virionen) eines Pflanzenvirus mit einem modifizierten Hüllprotein oder die Verwendung derartiger Teilchen für die Herstellung eines Tiervirus-Impfstoffes oder für andere Zwecke. In Febs Letters (1990) 269, 73-76, beschreiben Takamatsu et al. Versuche zum Exprimieren eines Fremdpeptids aus 5 Aminosäuren, das mit dem Carboxy-Terminus des Hüllproteins des Tabakmosaikvirus kondensiert ist. In den beschriebenen Versuchen wurden jedoch keine modifizierten Pflanzenvirusteilchen hergestellt.

Zum Herstellen modifizierter Pflanzenvirusteilchen gemäß dieser Erfindung wird die Pflanzenvirus-Nukleinsäure durch Einführen einer für das Fremdpeptid kodierenden Nukleotidsequenz, z.B. ein Tiervirus-Antigen an dem Teil des Pflanzenvirusgenoms, das für einen exponierten Teil des Hüllproteins kodiert, Infizieren von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit der modifizierten Virusnukleinsäure und Ernten der zusammengesetzten Teilchen des modifizierten Virus, modifiziert. Dieses Verfahren wird am besten durch direkte Manipulation der Virus-DNA im Fall von DNA-Viren oder durch Manipulation einer der RNA eines RNA-Virus entsprechenden cDNA durchgeführt. Im Falle eines RNA-Virus wird üblicherweise ein RNA-Transkript der modifizierten DNA zur Beimpfung von Pflanzenzellen oder vorzugsweise ganzen Pflanzen hergestellt, um so vor dem Ernten zusammengesetzter Teilchen des modifizierten Virus einen Vermehrungsschritt zu erreichen. Im Falle eines DNA-Virus wird die DNA selbst in die Pflanze eingeführt. Auf diese Weise wird das Fremdpeptid anfänglich als Teil des Capsidproteins exprimiert und wird dadurch als Teil des ganzen Virusteilchens produziert. Das Peptid kann auf diese Weise als Konjugatmolekül hergestellt werden, das zur Verwendung als solches vorgesehen ist. Wahlweise kann die genetische Modifikation des Virus so gestaltet sein, daß die Freisetzung des gewünschten Peptids durch die Anwendung geeigneter Mittel gestattet wird, die eine Abspaltung aus dem Virusteilchen bewirken.

Zum Herstellen eines modifizierten Virus im Handelsmaßstab ist es nicht notwendig, für jeden Ansatz der Virusherstellung infektiöses Impfmaterial (DNA- oder RNA-Transkript) herzustellen. Stattdessen kann ein Anfangsimpfmaterial zum Infizieren von Pflanzen verwendet werden und das sich daraus ergebende modifizierte Virus kann in den Pflanzen unter Produzieren ganzer Viren oder Virus-DNA als Impfmaterial für nachfolgende Ansätze weitergeleitet werden.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine besonders wertvolle Gruppe von Viren zur Verwendung als Vektoren diejenige, bei der die für das Capsid kodierende Nukleinsäure eine Struktureinheit ist, die von derjenigen getrennt ist, die für andere funktionelle Moleküle kodiert und deren Hüllproteine eine β-Faßstruktur haben. Ein Vorteil der Verwendung von Viren, welche diese Struktur haben, ist, daß die Schleifen zwischen den einzelnen Strängen des β-Faltblattes zur Inserierung von Fremdpeptiden geeignete Stellen liefern. Die Modifizierung einer oder mehrerer Schleifen ist für die Expression von Fremdpeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung eine bevorzugte Strategie. Diese Gruppe schließt die Comoviren wie etwa das Kuhpocken-Mosaikvirus und das Bean pod mottle-Virus und die Nepoviren wie etwa das Tomaten-Ringflecken-Virus und das latente Erdbeeren-Ringflecken- Virus ein. Ein Vorteil der Comoviren ist, daß ihr Capsid sechzig Kopien von jeweils 3 unterschiedlichen (β-Fässern enthält, die einzeln manipuliert werden können. Andere Virusgruppen mit ähnlichen dreidimensionalen Strukturen, aber einem einzigen (β-Faßtyp schließen die Tombusviren und die Sobemoviren ein. Andere Gruppen Pflanzen- und Tierviren, die sich strukturelle Ähnlichkeiten teilen, aber deren Hüllproteine keine (β-Faßstruktur besitzen, zum Beispiel die Pflanzen- und Tierrhabdoviren, können ebenfalls gemäß dieser Erfindung modifiziert werden.

Die Fremd-RNA oder -DNA kann in einer Vielfalt von Anordnungen in das Pflanzenvirusgenom inseriert werden. Sie kann zum Beispiel als ein Zusatz zu der bestehenden Nukleinsäure oder als Ersatz für einen Teil der bestehenden Sequenz inseriert werden, wobei die Wahl hauptsächlich durch die Struktur des Capsidproteins und der Leichtigkeit bestimmt wird, mit der ein Zusatz oder ein Austausch durchgeführt werden kann, ohne die Fähigkeit des genetisch modifizierten Virus, sich in Pflanzen zusammenzusetzen, zu beeinträchtigen. Die Bestimmung der erlaubten und geeignetsten Größe des Zusatzes oder Deletion für die Zwecke dieser Erfindung kann in jedem Einzelfall durch einen Versuch nach der vorliegenden Offenbarung erreicht werden. Die Verwendung von Additionsinserts scheint in einigen Fällen eine größere Freiheit als Ersatzinserts zu bieten.

Gemäß dieser Erfindung ist die Vermehrung des modifizierten Virus und die Herstellung beträchtlicher Mengen davon in Pflanzenwirten ein wichtiger Teil der neuen Strategie der Erfindung zum Herstellen von Antigenen für Impfstoffe und andere Peptidtypen in vorteilhafter Weise. Wie vorstehend angegeben kann die inserierte heterologe Nukleotidsequenz diejenigen einschließen, die für Aminosäuren kodieren, welche leicht gespalten werden, so daß das gewünschte Material nach dem Vermehrungsschritt von den Virusteilchen getrennt werden kann. Als Alternative zur gesamten Spaltung des Peptids kann es in einigen Fällen möglich und erwünscht sein, das Peptid in einer Form freizusetzen, in der es innerhalb des Hauptteils des Capsids unversehrt bleibt, aber von der Virusnukleinsäure getrennt ist.

In den vielen Epitopen, die auf der Oberfläche des CPMV-Capsids exprimiert werden können, sind die aus den Picornaviren, wie etwa der Maul-und-Klauenseuche-Virus (FMDV), Poliovirus, Human- Rhinovirus (HRV) und Hepatitis-A-Virus (HAV), entweder mit gp41 oder gp120 des Humanimmunschwächevirus (HIV) verbundene Epitope oder das aus dem Haupthüllprotein des Human-Papillomavirus (HPV) stammenden Epitop, eingeschlossen.

Auf die Herstellung von Impfstoffen angewandt besitzt die vorliegende Erfindung viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Impfstoffen, rekombinanten Impfstoffen auf der Grundlage von Tierviren und Peptidimpfstoffen, wie zum Beispiel:

1. Niedrigere Herstellkosten, da aus infizierten Pflanzen sehr hohe Ausbeuten reinen Virus erhältlich sind und kein Herstellschritt einer Gewebekultur notwendig ist.

2. Verbesserte Sicherheit, da Pflanzenviren Tiere nicht infizieren und sich darin nicht replizieren können und somit nicht zu virulenten Formen mutieren können, wie es bei herkömmlichen und rekombinanten Tiervirus-Impfstoffen der Fall sein kann.

3. Einige Pflanzenviren, insbesondere Comoviren, sind außergewöhnlich stabil und gereinigte Zubereitungen können getrocknet und viele Jahre bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, ohne ihre Infektiösität zu verlieren. Diese Eigenschaft erlaubt die Entwicklung langsam freisetzender Impfstoffe, wobei sich die Zahl der zum Erhalt der Immunität erforderlichen Injektionen verringert.

4. Es ist unwahrscheinlich, daß Tiere Pflanzenviren ausgesetzt worden sind und sie besitzen deshalb noch keine Antikörper auf den Vektor, wodurch die Wirksamkeit des zusammengesetzten Impfstoffs erhöht wird.

5. Da die Pflanzenviren kleiner als die meisten Tierviren sind, die bisher als Vektoren verwendet worden sind, z.B. Vaccinia, erlauben sie im Gegensatz zur homologen Rekombination in vivo (Transfizierung) die Einführung chimärer Gene durch Manipulation in vitro.

Zum Demonstrieren dieses Systems wurde der Langbohnen-Mosaik-Comovirus (CPMV) ausgewählt. Die dreidimensionale Struktur des CPMV wurde in atomarer Auflösung gelöst, was die Identifizierung zur Modifizierung geeigneter Stellen ohne Aufbrechen der Teilchenstruktur ermöglicht hat.

Um die breite Anwendbarkeit dieser Erfindung zu zeigen, wurden antigene Stellen von drei verschiedenen Tierviren verwendet. Zwei waren Viren, die der Picornavirusgruppe der Tierviren angehören - Maul-und-Klauenseuchevirus (FMDV) und Human-Rhinovirus (HRV). In dieser Gruppe gibt es mehrere wichtige Pathogene, insbesondere FMDV, Poliomyelitis (Polio) und Hepatitis A.

Das dritte ausgewählte Virus war das Humanimmunschwächevirus (HIV), das keine Ähnlichkeit mit irgendeinem bekannten Pflanzenvirus besitzt und für das gegenwärtig keine erfolgreichen Impfstoffe verfügbar sind.

Die Erfindung wird nun unter Bezug auf die folgenden begleitenden Zeichnungen weiter beschrieben:

Figur 1 zeigt einen Vergleich der Capsidstrukturen von einfachem T=3-Virus, Picornavirus und Comovirus. In jedem Fall stellt ein Trapez ein β-Faß dar. Somit besteht das große Capsidprotein (L oder VP37) von Comoviren aus zwei kovalent verbundenen β-Fässern, die zu den Untereinheiten vom C- und B-Typ des T=3-Virus oder VP2 und VP3 der Picornaviren äquivalent sind. Das kleine Capsidprotein (S oder VP23) von Comoviren enthält ein einziges β-Faß, das den Untereinheiten vorn A-Typ des T=3-Virus oder VP1 eines Picornavirus entsprechen.

Figur 2 zeigt die Sekundärstruktur und Konnektivität eines kanonischen β-Fasses. Die einzelnen Stränge des β-Faltblattes sind als B bis G markiert und die Amino- (NH&sub2;) und Carboxytermini (COOH) des Proteins sind angegeben.

Figur 3 zeigt die Plasmide (A) pPMM2902 und (B) pBT7-123. Die punktierten Bereiche stellen die CPMV-spezifischen Regionen der Plasmide dar, wobei die kodierenden Regionen durch die breiteren Abschnitte bezeichnet werden, auf denen die verschiedenen viruskodierten Proteine markiert sind. Relevante Restriktionsenzymstellen sind angegeben. Die Einzelheiten des Plasmidaufbaus werden in Holness et al. (1989) und Dessens und Lomonossoff (1991) angegeben.

Figur 4 zeigt die Region der CPMV-M-RNA, die für die aminoterminalen 40 Aminosäuren von VP23 kodiert. Die Zahlen unter der Nukleotidsequenz beziehen sich auf die M-RNA-Sequenz und die Stellung der einzigen Nhe1-Stelle ist angegeben. Die am Bilden der βB- und βC-Stränge von VP23 beteiligten Aminosäuren sind über der Aminosäuresequenz des Proteins angegeben, das unter Verwenden des Einbuchstaben-Standardcodes dargestellt ist.

Figur 5 zeigt (A) die Nukleotidsequenz der beim Aufbau von pFMDV verwendeten Oligonukleotide zusammen mit der Aminosäuresequenz, für die der obere (positive) Strang kodiert und (B) die Struktur von VP23 nach der Inserierung der FMDV-spezifischen Oligonukleotide. Die mit einem Pfeil versehene Region zeigt die Ausdehnung des inserierten FMDV-Epitops an. Die während des Klonierens nicht wiederhergestellte Nhe1-Stelle wird durch xNhe1 bezeichnet. Die in der inserierten Sequenz vorliegende diagnostische Bgl11-Stelle ist ebenfalls angegeben.

Figur 6 zeigt den Aufbau des Plasmids pFMDV. Die Darstellung der verschiedenen CPMV-spezifischen Regionen erfolgt wie in Figur 3. Die FMDV-spezifische Region, die in VP23 inseriert ist, wird als schwarzer Abschnitt in der CPMV-spezifischen Kodierungsregion dargestellt.

Figur 7 zeigt Plasmid pMT7-601. Die Darstellung der verschiedenen CPMV-spezifischen Regionen erfolgt wie in Figur 3. Relevante Restriktionsstellen sind angegeben.

Figur 8 zeigt den Aufbau eines "Substitutions"-Vektors durch ortsgerichtete Mutagenese. Der Stern zeigt den T-Rest an, der durch ortsgerichtete Mutagenese in C geändert ist, wodurch eine neue Aat11-Stelle geschaffen wird.

Figur 9 zeigt (A) die Nukleotidsequenz der beim Aufbau von pMT7-HIV verwendeten Oligonukleotide zusammen mit der durch den oberen (positiven) Strang kodierten Aminosäuresequenz und (B) die Struktur von VP23 nach der Inserierung der HIV-spezifischen Oligonukleotide. Die mit einem Pfeil versehene Region zeigt die Ausdehnung des inserierten HIV-Epitops an. Die in der inserierten Sequenz vorliegende diagnostische Pvu1-Stelle ist ebenfalls angegeben.

Figur 10 zeigt (A) die Nukleotidsequenz der beim Aufbau von pMT7-HRV verwendeten Oligonukleotide zusammen mit der durch den oberen (positiven) Strang kodierten Aminosäuresequenz und (B) die Struktur von VP23 nach der Inserierung der HRV-spezifischen Oligonukleotide. Die mit einem Pfeil versehene Region zeigt die Ausdehnung des inserierten HRV-Epitops an. Die in der inserierten Sequenz vorliegende diagnostische Cla1-Stelle ist ebenfalls angegeben.

Figur 11 zeigt den Aufbau der Plasmide pMT7-HIV und pMT7-HRV. Die Darstellung der verschiedenen CPMV-spezifischen Regionen erfolgt wie in Figur 3. Die in VP23 inserierten HIV- und HRV-spezifischen Regionen werden in der CPMV-spezifischen Kodierungsregion als schwarze Abschnitte dargestellt.

Figur 12 zeigt einen "Western-Blot" von Proteinextrakten der Blätter von fünf Langbohnenpflanzen (Bahn A bis E), die mit einem Gemisch von pMT7-FMDV-1- und pBT7-123-Transkripten beimpft wurden. Der Blot wurde mit einem auf das FMDV-Epitop spezifischen Serum untersucht. Die Bahnen "Blind" und "WT" enthalten Extrakte von Blättern, die entweder blindbeimpft beziehungsweise mit Wildtyp-CPMV-RNA beimpft wurden. Die als "Virus" markierte Bahn enthält gereinigtes Wildtyp-CPMV. Die Größen der Markerproteine ist auf der rechten Seite des Blots dargestellt.

Comoviren

Comoviren sind eine Gruppe von wenigstens vierzehn Pflanzenviren, die hauptsächlich Leguminosen infizieren. Ihre Genome bestehen aus zwei Molekülen einzelsträngiger RNA unterschiedlicher Größe mit positivem Sinn, welche in isometrischen Teilchen von ungefähr 28 nm Durchmesser getrennt verkapselt sind. Die beiden Typen Nukleoproteinteilchen werden nach ihrem Verhalten in Cesiumchlorid-Dichtegradienten als mittlerer (M) und unterer (B) Bestandteil bezeichnet, wobei die RNA in den Teilchen als M- beziehungsweise B-RNA bekannt ist. Beide Teilchentypen haben eine identische Proteinzusammensetzung, die aus jeweils 60 Kopien eines großen (VP37) und eines kleinen (VP23) Hüllproteins besteht. Außer den Nukleoproteinteilchen enthalten Comoviruszubereitungen eine wechselnde Menge leerer (nur Protein) Capside, die als oberer (T) Bestandteil bekannt sind.

Im Falle des typischen Mitglieds der Comovirusgruppe, Langbohnen-Mosaikvirus (CPMV), ist bekannt, daß sowohl M- als auch B-RNA polyadenyliert sind und ein kleines Protein (VPG) kovalent an ihren 5'Terminus gebunden ist. Begrenztere Untersuchungen an anderen Comoviren legen nahe, daß diese Eigenschaften von der RNA aller Mitglieder dieser Gruppe geteilt werden. Beide RNA aus CPMV sind sequenziert worden und es wurde gezeigt, daß sie aus 3481 (M) und 5889 (B)-Nukleotiden (B) bestehen, wobei die Poly- (A)Schwänze ausgeschlossen sind (van Wezenbeek et al., 1983; Lomonossoff und Shanks, 1983). Beide RNA enthalten einen einzelnen, langen, offenen Leserahmen, wobei die Expression der Virusgenprodukte durch die Synthese und nachfolgende Spaltung großer Vorläuferpolypeptide erfolgt. Obschon beide RNA für die Infektion ganzer Pflanzen erforderlich sind, ist die größere B-RNA zu einer unabhängigen Replikation in Protoplasten befähigt, obschon in diesem Fall keine Virusteilchen erzeugt werden (Goldbach et al., 1980). Diese Beobachtung, verbunden mit früheren genetischen Untersuchungen, weist nach, daß die Hüllproteine durch M-RNA kodiert werden.

Eine 3,5Å-Elektronendichtekarte von CPMV zeigt, daß eine eindeutige Beziehung zwischen CPMV und den T=3-Pflanzenviren wie etwa den Tombusviren, insbesondere Tomato bushy stunt (TBSV), und den Sobemoviren, insbesondere Southern bean mosaic (SBMV), besteht. Die Capsidien dieser letzten Viren setzen sich aus 180 identischen Hüllprotein-Untereinheiten zusammen, die jeweils aus einer einzelnen β-Faßdomäne bestehen. Diese kann drei verschiedene Stellungen, A, B und C, innerhalb der Virionen einnehmen (Figur 1). Von den beiden CPMV-Hüllproteinen wurde gezeigt, daß sie aus drei verschiedenen β-Faßstrukturen bestehen, von denen zwei aus VP37 und eine aus VP23 stammt. Somit besteht jedes CPMV-Teilchen wie die T=3-Viren aus 180 β-Faßstrukturen. Die einzelne Domäne aus VP23 besetzt eine Stellung, die zu derjenigen der TBSV- und SBMV-Untereinheiten vom A-Typ analog ist, wogegen die N- und C-terminalen Domänen von VP37 die Stellung der Untereinheiten vom C- beziehungsweise B-Typ einnehmen (Figur 1).

Die Röntgendiffraktionsanalyse von CPMV-Kristallen und einem weiteren Mitglied der Gruppe, Bean pod mottle-Virus (BPMV), zeigt, daß die 3-D-Strukturen von BPMV und CPMV sehr ähnlich sind und für die Comovirusgruppe allgemein typisch sind.

In den Strukturen von CPMV und BPMV besteht jedes β-Faß im Prinzip aus 8 Strängen antiparalleler β-Faltblätter, die durch Schleifen wechselnder Länge verbunden sind. Die Konnektivität und Nomenklatur der Stränge wird in Figur 2 angegeben. Die ebenen β-Faltblätter werden B-, C-, D-, E-, F-, G-, H- und I-Blätter genannt und die Verbindungsschleifen werden als βB-βC-, βD-βE-, βF-βG- und βH-βI-Schleifen bezeichnet.

Die Comoviren sind auch mit den tierischen Picornaviren strukturell verwandt. Die Capsidien von Picornaviren bestehen aus jeweils 60 Kopien dreier unterschiedlicher Hüllproteine VP1, VP2 und VP3, wobei jedes aus einer einzelnen β-Faßdomäne besteht. Wie im Fall der Comoviren werden diese Hüllproteine durch Spaltung eines Vorläuferpolyproteins freigesetzt und werden in der Reihenfolge VP2 - VP3 - VP1 synthetisiert. Der Vergleich der dreidimensionalen Struktur von CPMV mit derjenigen von Picornaviren hat gezeigt, daß die N- und C-terminalen Domänen von VP37 VP2 beziehungsweise VP3 äquivalent sind und daß VP23 VP1 äquivalent ist (Figur 1). Die Äquivalenz zwischen der strukturellen Stellung und der Genreihenfolge legt nahe, daß VP37 einer ungespaltenen Form der beiden Picornavirus-Capsidproteine VP2 und VP3 entspricht.

Einer der Hauptunterschiede zwischen den Comoviren und Picornaviren ist, daß den Proteinuntereinheiten der Comoviren die grossen Insertionen zwischen den Strängen der in Picornaviren angetroffenen β-Fässer fehlen, obschon die grundlegende Architektur der Teilchen sehr ähnlich ist. Die vier Schleifen βB-βC, βD-βE, βF-βG und βH-βI - siehe Figur 2) zwischen den β-Faltblättern sind zum Aufrechterhalten des strukturellen Zusammenhalts der Virionen nicht kritisch, werden aber gemäß dieser Erfindung als Stellen der Expression von Fremdpeptidsequenzen wie etwa antigenen Stellen von Tierviren verwendet.

Modifizierung des CPMV-Virus

Zum Ausführen von Insertionen in das CPMV-Hüllprotein ist es nötig, ein Mittel zum Manipulieren des Virusgenoms zu besitzen. Ein cDNA-Klon voller Länge von CPMV-M-RNA (pPMM2902) in dem Transkriptionsvektor pPMI stand zur Verfügung (siehe Figur 3A) (Ahlquist und Janda, 1984, Holness et al. (1989) und Holness (1989)). Wir haben gezeigt, daß Transkripte aus pPMM2902 sich vermehren können, wenn sie in Langbohnen-Mesophyllprotoplasten in Gegenwart hochgereinigter Virionen-B-RNA der Elektroporese unterzogen werden und es deshalb gestatten, daß an dem Virushüllprotein Modifikationen gemacht werden, ohne die Vermehrung und das Zusammensetzen des Virus zu beeinflussen.

Im Hinblick auf die mögliche Gefahr, daß zum Bereitstellen der zur Virusreplikation mit pPMM2902 erforderlichen Proteine aus Virionen gereinigte B-DNA mit Wildtyp-M-RNA kreuzverunreinigt ist, haben wir einen cDNA-Klon voller Länge von B-RNA, pBT7-123 aufgebaut (siehe Figur 38). Die B-RNA-Kopie voller Länge befindet sich unmittelbar stromabwärts eines modifizierten T7-Promotors. Auf die Linearisierung mit dem Restriktionsenzym Mlu1 folgend können Transkripte mit zu natürlicher B-RNA identischer Größe durch T7-RNA-Polymerase hergestellt werden. Ein Gemisch von Transkripten aus pPMM2902 und pBT7-123 führt bei der Elektroporese in Langbohnen-Protoplasten zu einer vollständigen Virusinfektion und ersetzt daher die Verwendung natürlicher B-RNA.

Wir haben die βB-βC-Schleife in VP23 zur Fremdpeptid-Inserierung ausgewählt. Diese Schleife ist auf der Oberfläche des Virusteilchens eindeutig exponiert und das Computermodell hat gezeigt, daß es unwahrscheinlich ist, daß sogar große, an dieser Stelle inserierte Schleifen die Wechselwirkung zwischen den für die Capsidstruktur und -stabilität verantwortlichen benachbarten Untereinheiten beeinträchtigen. Diese Schleife besitzt eine einzige Nhe1-Stelle in Position 2708 der M-RNA-spezifischen Sequenz, wo Fremdsequenzen inseriert werden können (siehe Figur 4).

Die hauptsächlichen antigenen Stellen des Picornavirus Maul-und- Klauenseuche-Virus (FMDV) und Human-Rhinovirus (HRV) und des Lentiretrovirus Humanimmunschwäche-Virus (HIV) wurden dazu verwendet, die Verwendung dieser Erfindung bei der Herstellung von Impfstoffen gegen Tierviren zu veranschaulichen.

Planung und Aufbau von pFMDV, ein cDNA-Klon voller Länge von CPMV-M-RNA, das ein für einen Abschnitt des FMDV-Schleifenproteins kodierendes DNA-Insert enthält

Zum Inserieren der "FMDV-Schleife" in die βB-βC-Schleife von VP23 von CPMV wurden zwei komplementäre Oligonukleotide chemisch synthetisiert, die beide 81 Reste lang sind. Ihre Sequenzen sind in Figur 5A angegeben. Das Oligonukleotid mit positivem Sinn enthält die Sequenz, die für die Aminosäurereste 136-160 aus VP1 des FMDV-Serotyp-Ol-Stammes BFS 1860 kodiert. Die Nukleotidsequenz der Oligonukleotide wurde so ausgelegt, daß sie die in CPMV angetroffene Präferenz der Kodonverwendung berücksichtigt und schließt eine Bgl11-Stelle in der Sequenzmitte zum Erleichtern der Durchmusterung ein. Wenn die Oligonukleotide verknüpft werden, ergeben sie eine doppelsträngige DNA-Sequenz mit Nhe1- kompatiblen Enden. So können die Oligonukleotide in die einzige Nhe1-Stelle von pPMM2902 inseriert werden. Die Wirkung einer derartigen Inserierung auf die Sequenz des VP23 wird in Figur 5B dargestellt. Zum Erleichtern der Inserierung der FMDV-Schleife wurden die FMDV-spezifischen Oligonukleotide zuerst in einen M13-Subklon von pPMM2902 ligiert, der die für VP23 kodierende Sequenz enthielt. Dies geschah, um den die FMDV-spezifische Sequenz beherbergenden Klonen zu ermöglichen, durch Sequenzanalyse leicht identifiziert zu werden. Alle Standard-DNAManipulationen wurden gemäß Maniatis et al. (1982) durchgeführt. Die Einzelheiten des Aufbaus von pFMDV sind nachstehend angegeben und werden in Figur 6 schematisch dargestellt.

SCHRITT 1. Das Plasmid pPMM2902 wurde mit dem Restriktionsenzym Sst1 verdaut, das innerhalb der CPMV-M-RNA-spezifischen Sequenz an Stellung 2296 und 3423 schneidet, aber innerhalb der Sequenz des Plasmids pPM1 nicht schneidet. Auf die Agarosegelelektrophorese folgend wurden sowohl das große (6,0 kb) als auch das kleine (1,1 kb) Fragment durch Elektroelution von dem Gel gereinigt. Das Sst1-Fragment mit 1,1 kb wurde mit der durch Sst1 geschnittenen DNA aus dem Bakteriophagen M13mpl8 in der phosphatasebehandelten, replikativen Form ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren des E. coli-Stammes JM101 mittels des Calciumchloridverfahrens verwendet. Das Sst1-Fragment mit 1,1 kb aus M-RNA enthaltende Plaques wurden durch den Lac-Komplementierungstest und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen und einer, M13- JR1, wurde für die weitere Arbeit ausgewählt.

SCHRITT 2. Die doppelsträngige, replikative Form der DNA aus M13-JR1 wurde aus infizierten Zellen des E. coli-Stammes JM101 durch das Verfahren von Birnboim und Doly (1979) isoliert. Die gereinigte DNA wurde durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym Nhe1 linearisiert und das linearisierte Plasmid wurde mit Kalbsdarmphosphatase behandelt. Die beiden Oligonukleotide mit den Nhe1-verträglichen Termini, die für die Aminosäurereste 136 bis 160 von VP1 aus FMDV kodieren, wurden mit ATP unter Verwenden von Polynukleotidkinase phosphoryliert und durch Kochen und langsames Abkühlen miteinander verknüpft. Die verknüpften Oligonukleotide wurden in Nhe1-verdautes M13-JR1 ligiert, das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren des E. coli-Stammes JM101 verwendet und das Transformationsgemisch wurde auf einem JM101- Rasen ausplattiert. Eine große Anzahl Plaques wurde auf den Platten vorgefunden, von denen 20 zur Sequenzanalyse selektiert wurden. Bakteriophagen wurden in JM101 vermehrt und die einzelsträngige DNA wurde genau wie von Sanger et al. (1980) beschrieben isoliert. Die Nukleotidsequenz der Region der Bakteriophagen-DNA um die Nhe1-Stelle wurde durch das von Biggin et al. (1983) abgeänderte Didesoxyverfahren mittels eines zu den Nukleotiden 2735-2752 der M-RNA-Sequenz komplementären 18mer, 5'AGT-TAC-TGC-TGT-AAC-GTC-3', als Primer bestimmt. Von den analysierten Plaques besaß ein als M13-usha1 bezeichneter eine einzelne Kopie der gewünschten Sequenz in der richtigen Ausrichtung.

SCHRITT 3. M13-usha1 wurde im E. coli-Stamm JM101 vermehrt und die DNA in replikativer Forrn wurde aus den infizierten Zellen durch das Verfahren von Birnboim und Doly (1979) isoliert. Die DNA wurde mit Sst1 verdaut und das Fragment mit 1,1 kb wurde durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment wurde mit dem großen (6,0 kb) Sstl-Fragment aus pPMM2902 (siehe oben) ligiert, das mit Kalbsdarmphosphatase behandelt worden war. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren des E. coli-Stammes JM83 mittels des Calciumchloridverfahrens verwendet. Das Transformationsgemisch wurde auf L-Agarplatten ausplattiert, die 100 µg/ml Carbenicillin enthielten, und die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. 12 Carbenicillin-resistente Kolonien wurden zur weiteren Untersuchung selektiert. Die Kolonien wurden als 1-ml-Kulturen in L-Brühe vermehrt, es wurden Plasmid-"Minipreps" hergestellt und durch Restriktionsenzymverdauung analysiert. Aus den durch Verdauung mit den Enzymen Sst1, Bgl11 und EcoRV erhaltenen Mustern war es möglich abzuleiten, daß 4 Kolonien aus CPMV-Klonen voller Länge bestanden, welche die Sequenz der FMDV-spezifischen Oligonukleotide in der richtigen Ausrichtung enthielten. Einer davon, pFMDV, wurde nachfolgend in großem Maßstab vermehrt und die Plasmid-DNA wurde durch das Verfahren von Birnboim und Doly (1979) isoliert und durch Zentrifugieren mittels Cesiumchlorid/Ethidiumbromid-Gradienten (Maniatis et al. (1982)) weiter gereinigt.

Eigenschaften von pFMDV-Transkripten

1. Gereinigte pFMDV-DNA wurde durch Verdauung mit EcoR1 linearisiert und mittels E. coli-RNA-Polymerase, genau wie von Holness et al. (1989) für pPMM2902 beschrieben, transkribiert. Die Elektrophorese der Produkte an Formaldehyd enthaltenden Agarosegelen (Lehrach et al., 1977) zeigte die Anwesenheit von Transkripten an, die mit authentischer Virus-M-RNA zusammen wanderten.

2. Auf die Behandlung mit DNasel und Lithiumchloridfällung unter Entfernen der Matrizen-DNA folgend wurden die Transkripte in vitro in dem Message-abhängigen Kaninchen-Retikulozytensystem (Pelham und Jackson 1976) in Anwesenheit von ³&sup5;S-Methionin translatiert. Die Produkte wurden durch Elektrophorese an SDS enthaltenden Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970) untersucht und durch Autoradiographie des getrockneten Gels sichtbar gemacht. Die Autoradiographien zeigten die Anwesenheit zweier Proteine mit 105 und 95 kDa an, die mit den Translationsprodukten natürlicher M-RNA zusammen wanderten.

3. Die Fähigkeit von pFMDV-Transkripten, in Pflanzenzellen repliziert zu werden, wurde wie folgt untersucht: LangbohnenMesophyllprotoplasten wurden, wie von de Varennes et al. (1985) beschrieben, hergestellt. Transkripte aus pFMDV wurden mit Transkripten aus pBT7-123 (das Plasmid, das eine B-RNA-Kopie voller Länge enthält) gemischt und wie durch Holness et al. (1989) beschrieben, in die Protoplasten überführt. Als Kontrolle wurde eine Probe derselben Protoplastenzubereitung mit einem Transkriptgemisch aus pBT7-123 und pPMM2902 der Elektroporese unterzogen. 72 Stunden nach der Elektroporese wurden die Protoplasten geerntet und die Nukleinsäuren wurden, wie bei de Varennes et al. (1985) beschrieben, extrahiert. Proben der RNA wurden an Formaldehyd enthaltenden Agarosegelen (Lehrach et al., 1977) der Elektrophorese unterzogen und die Nukleinsäuren wurden auf Hybond N-Membranen (Amersham International) geblottet. Die Nukleinsäuren wurden durch Bestrahlung mit UV-Licht mit den Membranen vernetzt. Die Membranen wurden mittels pPMM2902 in Form eines Hindl11-Fragmentes untersucht, das den Nukleotiden 482-2211 der M-RNA entsprach, die, wie von Feinberg und Vogelstein (1983) beschrieben, mit ³²P markiert worden war. Proben aus Protoplasten, die mit pBT7-123 und entweder pPMM2902 oder pFMDV-1 der Elektroporese unterzogen wurden, zeigten die Anwesenheit M-RNA-spezifischer Sequenzen, was bestätigte, daß die Anwesenheit der für die FMDV-Schleife kodierenden Sequenz die Transkripte nicht an der Replikation hinderten. Zur Bestätigung, daß die Nachkommenschaft der pFMDV-Replikation die Sequenz behielt, welche für die FMDV-Schleife kodierte, wurden Replika-Membranen mit dem FMDV- Oligonukleotid mit positivem Sinn untersucht, welches unter Ergeben einer (+)-sinnspezifischen Sonde "oligomarkiert" wurde (Feinberg und Vogelstein, 1983). Die Probe aus Protoplasten, die mit einem Gemisch aus pBT7-123- und pFMDV-Transkripten der Elektroporese unterzogen wurden, ergab an der für M-RNA erwarteten Stelle ein eindeutiges Signal, ein Signal, das bei der pPMM2902- Kontrolle abwesend war.

4. Zum Nachweis, daß Proteinuntereinheiten, welche die FMDV- Schleife enthalten, sich zu Virionen zusammensetzen, wurden Extrakte aus infizierten Protoplasten durch Immunsorbens-Elektronenmikroskopie auf die Anwesenheit von Virusteilchen untersucht. Proben von Protoplasten, die mit einem Gemisch aus pBT7-123- und pFMDV-Transkripten der Elektroporese unterzogen wurden, wurden durch wiederholten Durchgang durch eine 23er Nadel lysiert. Die Extrakte wurden in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde für die Untersuchung zurückbehalten. Proben von 10 Mikroliter der Überstände wurden mit goldenen Elektronenmikroskopgittern (em) inkubiert, die mit anti-CPMV- Antiserum überzogen worden waren. Nach dem Waschen und Anfärben mit Uranylacetat wurden die Gitter mittels eines JEOL 1200 Elektronenmikroskopes untersucht. Teilchen mit 28 nm Durchmesser konnten wahrgenommen werden, welche das charakteristische Aussehen von CPMV-Virionen hatten. Dies zeigt, daß die Anwesenheit der FMDV-Schleife in VP23 das Zusammensetzen des Virus nicht verhindert.

Die vorangehende Beschreibung weist nach, daß gemäß dieser Erfindung modifizierte Pflanzenviren sich vermehren und zu Virusteilchen zusammensetzen können, wenn sie der Elektroporese zu Pflanzenprotoplasten unterzogen werden. Zum Herstellen modifizierter Pflanzenviren in großem Maßstab ist es notwendig, ein Konstrukt herzustellen, das direkt in ganze Pflanzen eingeimpft werden kann und das sich wie bei dem vorstehend beschriebenen Protoplastensystem repliziert und zu Virusteilchen zusammensetzt. Wir haben deshalb pPMM2902 in einer solchen Weise modifiziert, daß die sich daraus ergebenden Transkripte eine "Kappen"-Struktur an ihren 5'Enden einbauen und die RNA-Synthese durch einen wirksameren Promotor angetrieben wird. Die Schritte bei der Modifizierung von pPMM2902 unter Herstellen von pMT7-601 (Figur 7) werden nachstehend genau beschrieben.

Entwicklung eines Systems, das ganze Langbohnendflanzen infizieren kann Aufbau von pMT7-601

Der erste Strang der cDNA für gereinigte CPMV-M-RNA wurde genau wie bei Lomonossoff et al. (1982) beschrieben unter Verwenden von pdT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer synthetisiert. Die Synthese des zweiten Stranges wurde unter Verwenden des folgenden Oligonukleotids gestartet:

Die Synthesebedingungen waren wie bei Lomonossoff et al. (1982) und Shanks et al. (1986) beschrieben.

2. Die doppelsträngige cDNA wurde mit den Restriktionsenzymen Pst1 und BamH1 (welches die M-RNA-Sequenz in Stellung 1504 spaltet) verdaut und das Pst1/BamH1-Fragment mit 1,5 kb wurde mit durch Pst1/BamH1 verdautes M13mp18 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren des E. coli-Stammes JM101 verwendet. Einen rekombinanten Phagen beherbergende Inserts wurden durch den lac-Komplementierungstest nachgewiesen und auf die Anwesenheit des richtigen Inserts durch die von Biggin et al. (1983) abgeänderte "T-Spur"-Analyse (Sanger et al., 1980) geprüft. Ein Klon, M13-MT7-6, wurde für die weitere Analyse selektiert und die Sequenz der 5'terminalen 200 Nukleotide der M-RNA-spezifischen Sequenz wurde wie durch Biggin et al. (1983) beschrieben bestimmt und von ihr wurde gezeigt, daß sie zu der Sequenz in pPMM2902 äquivalent ist.

3. Die doppelsträngige, replikative DNA wurde durch das Verfahren von Birnboim und Doly (1979) aus Zellen von E. coli -JM101, die mit M13-MT7-6 infiziert waren, isoliert. Die doppelsträngige DNA wurde mit Pst1 und Bgl11 (das die M-RNA-Sequenz an Position 189 spaltet) verdaut und das freigesetzte Fragment mit 200 bp wurde durch Elektrophorese an und Elektroelution aus einem Agarosegel (Maniatis et al. (1982)) gereinigt.

4. Das Plasmid pPMM2902 (Holness et al. 1989) wurde mit Pst1 und Bgl11 unter Herstellen zweier DNA-Fragmente mit 1,1 und 6,0 kb verdaut. Das kleinere (1,1 kb) Fragment enthält die Sequenz des E. coli-Promotors, der an die ersten 189 Nukleotide der Sequenz der CPMV-M-RNA gebunden ist, während das größere (6,0 kb) Fragment den Restes der M-RNA-Sequenz an pUC9 gebunden enthält. Der Verdau wurde mit Kalbsdarmphosphatase behandelt, die beiden Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und das Fragment mit 6,0 kb wurde durch Elektroelution isoliert.

Das Pst1/Bgl11-Fragment mit 200 bp aus M13-MT7-6 und das Fragment mit 6,0 kb aus pPMM2902 wurden miteinander ligiert (Maniatis et al., 1982) und das Gemisch wurde zum Transformieren des E. coli-Stammes JM83 verwendet. Eine Anzahl Carbenicillinresistenter Kolonien wurde nachgewiesen und von einer, pMT7-601,

wurde gezeigt, daß sie die gewünschte Struktur hatte. Mengen des Plasmids pMT7-601 in großem Maßstab wurden deshalb wie für pFMDV beschrieben hergestellt.

6. Nach der Linearisierung mit EcoR1 konnte das Plasmid pMT7- 601 mittels T7-RNA-Polymerase unter Ergeben einer RNA transkribiert werden, die beim Analysieren auf Formaldehyd enthaltenden Agarosegelen (Lehrach et al., 1977) in der Größe mit natürlicher Virionen-M-RNA identisch war. Die Transkriptausbeute war ungefähr 1 µg M-Transkript voller Länge je µg linearisierte Matrizen-DNA.

7. Wenn ein Gemisch der T7-Transkripte aus pMT7-601 und pBT7- 123 der Elektroporese in Langbohnen-Mesophyll-Protoplasten unterzogen wurde, zeigte die Northern-Blot-Analyse der Nachkommen-RNA, daß Transkripte aus pMT7-601 biologisch aktiv sind. Die zur Protoplastenisolierung und Nukleinsäureanalyse verwendeten Verfahren waren mit den zum Analysieren der biologischen Eigenschaften von pFMDV verwendeten identisch.

Infektiösität eines Gemisches verkappter pBT7-123- und pMT7-601-Transkripte bei Langbohnenpflanzen

Proben von pBT7-123 und pMT7-601 wurden mit Mlu1 beziehungsweise EcoR1 linearisiert. Teile der linearisierten Matrizen wurden mittels T7-RNA-Polymerase in Anwesenheit von GpppG im wesentlichen wie von Ziegler-Graaf et al. (1989) beschrieben transkribiert. Die Transkriptionsreaktionen enthielten 0,1 mg/ml linearisierte DNA-Matrize, 40 mM Tris-HCl pH 8,0, 25 mM NaCl, 8 mM MgCl&sub2;, 2 mM Spermidinhydrochlond, jeweils 0,5 mM UTP, ATP und CTP, 0,025 mM GTP, 0,5 mM GpppG, 0,05 mg/ml BSA, 10 mM DTT, 200 Einheiten/ml RNAguard und die Transkription wurde durch den Zusatz von T7-RNA-Polymerase auf eine Endkonzentration von 1400 Einheiten/ml gestartet. Die Inkubation betrug 2 Stunden bei 37ºC. Nach 30, 60 und 90 Minuten wurden Anteile (5 µl auf 1 ml Transkriptionsreaktion) einer 5 mM GTP-Lösung zugesetzt. Auf die Transkription folgend wurde EDTA auf eine Endkonzentration von 15 mM zugesetzt und die Unversehrtheit der Transkripte wurde durch Elektrophorese auf Formaldehyd enthaltenden Agarosegelen geprüft. Die Transkriptionsgemische wurden mit 2 Volumina Phenol/Chloroform (1:1 Vol./Vol.) extrahiert und die Nukleinsäuren wurden zweimal mit Ethanol gefällt. Die Nukleinsäuren wurden durch Zentrifugieren geerntet, mit Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Nukleinsäuren wurden in 50 mM Trisphosphat, pH 8,0, zur Beimpfung auf Pflanzen gelöst.

Die primären Blätter 10 Tage alter Langbohnen (Vigna unguiculata var. California blackeye) wurden mit Karborund angeschliffen und ein 1:1-Gemisch (Gew./Gew.) aus pMT7-601 und pBT7-123 stammender Transkripte wurde unter leichtem Reiben auf die Blätter aufgebracht. Eine Vielfalt Transkriptkonzentrationen wurde verwendet, aber in allen Fällen betrug das endgültige Impfmaterialvolumen 50 µl. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß wenn insgesamt 5 µg eines jeden Transkripts je Primärblatt angewandt wurden, 100% der beimpften Pflanzen regelmäßig für eine CPMV-Infektion charakteristische Symptome entwickelten. Die Anwesenheit CPMV-spezifischer Sequenzen sowohl in den beimpften als auch oberen Blättern derartiger Pflanzen wurde durch "Dot-Blot"-Analyse bestätigt. Proben der beimpften und dreiblättrige Blätter wurden mit einem Korkbohrer Nr. 10 genommen und mit 0,4 ml 10 mM Natriumphosphat mazeriert und extrahiert. Die Proben wurden zentrifugiert und 5 µl des Überstandes wurden auf Nitrocellulosefilter aufgebracht, die zuvor mit 20XSSC befeuchtet wurden. Die Nukleinsäure wurde durch Bestrahlung mit UV-Licht mit den Membranen vernetzt und mittels einer ³²P-"oligomarkierten" (Feinberg und Vogelstein, 1983) Sonde, die aus den Nukleotiden 482-2211 der M-RNA-Sequenz bestand, untersucht. Die Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen der Filter waren wie bei Maniatis et al. (1982) beschrieben. Nach dem Trocknen wurden die Filter der Autoradiographie unterzogen. Ein starkes Hybridisierungssignal zeigte die Anwesenheit CPMV-spezifischer Sequenzen an.

Aufbau von pMT7-FMDV-I, pMT7-HIV und pMT7-HRV

Zum Aufbau von pMT7-FMDV-I wurden pMT7-601 und pFMDV beide mit

dem Restriktionsenzym Sst1 verdaut, wobei der Verdau aus pMT7-601 nachfolgend mit Kalbsdarmphosphatase behandelt wurde. Sstl schneidet jedes Plasmid zweimal an Position 2296 und 3423 der M-RNA-spezifischen Region unter Freisetzen eines Fragmentes mit 1,1 kb. Wie zuvor erörtert, enthält dieses Sst1-Fragment die Region von VP23, welche die βB-βC-Schleife umfaßt, wo die FMDV- Schleifeninserierung durchgeführt wurde. Auf die Elektrophorese auf einem Agarosegel folgend wurden das Fragment mit 1,1 kb aus pFMDV und das Fragment aus pMT7-601 mit 5,1 kb, das die Vektorsequenz und den gesamten Rest der M-RNA-spezifischen Sequenz umfaßte, durch Elektroelution isoliert. Die beiden Sst1-Fragmente wurden zusammenligiert und das Gemisch wurde in den E. coliStamm JM83 transformiert. Eine Anzahl Carbenicillin-resistenter Kolonien wurde aufgenommen, es wurden "Minipreps" hergestellt und die Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsenzymverdauung unter Nachweisen die FMDV-Schleife enthaltender Rekombinanten untersucht. Ein derartiger Klon wurde nachgewiesen, pMT7-FMDV-I bezeichnet und im großen Maßstab gezüchtet. Alle DNA-Manipulationen waren wie für den Aufbau von pFMDV und pMT7-601 beschrieben.

Sowohl pFMDV als auch sein Derivat pMT7-FMDV-I besitzen eine direkte Inserierung in die βB-βC-Schleife von VP23. Um die Schleifengröße bei der Inserierung einer Fremdsequenz zu erhöhen, wurde ein Ersatzvektor entworfen, bei dem die Fremdsequenz die natürliche βB-βC-Schleife in VP23 ersetzt, anstatt ihr hinzugefügt zu werden. Bei der Nukleotidsequenz der Region des für VP23 kodierenden CPMV-Genoms schafft ein einzelner stiller Basentausch (U in C) an Position 2740 eine einzige Aat11-Stelle an der Aminosäure Valin 27. Die Änderung an der Sequenz der M-RNA wird in Figur 8 dargestellt. Das Schaffen der Aat11-Stelle ermöglicht, daß die für die sechs Aminosäuren aus der natürlichen β8-βC- Schleife in CPMV kodierende Nukleotidsequenz durch Verdauung mit Nhe1 und Aat11 entfernt wird. Die Sequenz kann anschließend durch jede Sequenz mit Nhe1- und Aat11-verträglichen Enden ersetzt werden.

Zwei unterschiedliche Sequenzen wurden entworfen, um die Sequenz zwischen der Nhe1- und Aat11-Stelle der mutierten M-RNA-Sequenz zu ersetzen. Die erste in VP23 zu ersetzende Sequenz bestand aus Oligonukleotiden, die für die Reste 735-752 aus dem Transmembranglykoprotein gp4l aus dem Humanimmunschwächevirus (HIV-1) kodierten. Diese Sequenz wurde als synthetisches Peptid für diese Region ausgewählt, wird in enzymverknüpften Immunsorbenstests (ELISA) durch Antiseren aus seropositiven AIDS-Patienten erkannt und kann Antikörper induzieren, die eine Reihe von HIV-1-Isolaten neutralisieren (Kennedy et al., 1986; Chanh et al., 1986; Dagleish et al., 1988). Die zweite Sequenz besteht aus der Nukleotidsequenz, die für die Reste 85-99 aus VP1 aus dem Human- Rhinovirus 14 (HRVL4) kodiert. In beiden Fällen wurden die Oligonukleotide so entworfen, daß sie Restriktionsenzymstellen zum Erleichtern des Durchmusterns enthielten. Die Sequenzen der Oligonukleotide und die Wirkung des Austausches auf die Aminosäuresequenz von VP23 wird in Figur 9 und 10 dargestellt. Die Schritte beim Aufbau von pMT7-HIV und pMT7-HRV werden nachstehend angegeben und sind in Figur 11 schematisch dargestellt.

SCHRITT 1. M13-JR-1 (siehe Figur 6) wurde in dem E. coli- Stamm CJ236 vermehrt und die dU-haltige, einzelsträngige DNA wurde wie von Kunkel (1985) beschrieben isoliert. Die Mutation von T in C an Position 2740 der M-RNA-Sequenz wurde durch oligonukleotidgerichtete Mutagenese der du-haltigen, einzelsträngigen M13-JR1-DNA mittels des Primers CTG-CTG-TGA-CGT-CTG-AAA-A wie von Kunkel (1985) beschrieben durchgeführt. Dies führte zum Aufbau des Klons M13-JRAat11. Die Mutation wurde durch Didesoxysequenzanalyse einzelsträngiger DNA (Biggin et al., 1983) und durch Restriktionsenzymverdauung der doppelsträngigen DNA in Replikationsform bestätigt.

SCHRITT 2. Die M13-JRAatll-DNA in Replikationsform wurde isoliert und mit Nhe1 und Aat11 verdaut und mit Kalbsdarmphosphatase behandelt. Die in Figur 9 und 10 dargestellten Oligonukleotidpaare wurden mit ATP unter Verwenden von Polynukleotidkinase phosphoryliert, durch Kochen und langsames Abkühlen miteinander verknüpft und in Nhe1/Aat11-verdautes M13-JRAat11 ligiert. Die inserierten Sequenzen beherbergende rekombinante M13-Klone wurden durch Sequenzanalyse der einzelsträngigen Bakteriophagen-DNA genau wie zuvor für pFMDV beschrieben nachgewiesen. Die zwei die erforderlichen Sequenzen enthaltenden Klone M13-HIV und M13-HRV wurden nachgewiesen und die doppelsträngige DNA in Replikationsform wurde isoliert und es wurde gezeigt, daß sie bei der Restriktionsenzymverdauung das erwartete Fragmentmuster ergibt.

SCHRITT 3. DNA in Replikationsform aus M13-HIV und M13-HRV wurde mit Sst1 verdaut und das M-RNA-spezifische Fragment mit 1,2 kb wurde nach der Elektrophorese des Verdaus auf Agarosegel durch Elektroelution isoliert. Die Fragmente mit 1,2 kb wurden wie zuvor für die Herstellung von pMT7-FMDV-I beschrieben in das große Sst1-Fragment aus pMT7-601 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren des E. coli-Stammes JM83 verwendet und Carbenicillin-resistente Kolonien wurden selektiert. Von zwei als pMT7-HIV und pMT7-HRV bezeichneten Klonen wurde durch Restriktionsenzymkartierung und Nukleotidsequenzanalyse gezeigt, daß sie die gewünschte Struktur enthielten.

Zur Transkription wurden pMT7-HIV und pMT7-HRV durch Verdauung mit EcoR1 linearisiert. Die Transkription mittels T7-RNA-Polymerase wurde genau wie für pMT7-601 und pBT7-123 beschrieben durchgeführt. Die sich daraus ergebenden Transkripte waren in der Größe mit natürlicher Virionen-RNA identisch.

Nachweis der Fähigkeit von pMT7-FMDV-I- und pMT7-HIV-Transkripten zur Replikation in Langbohnen-Protoplasten

Proben von 10 µg der in-vitro-Transkripte entweder von pMT7-601, pMT7-FMDV-I oder pMT7-HIV wurden mit Proben von 15 µg der Transkripte aus pBT7-123 gemischt und die Gemische wurden dazu verwendet, 10&sup6; Langbohnen-Mesophyll-Protoplasten der Elektroporese zu unterziehen. Proben wurden entweder sofort (0 Stunden) oder nach 72 Stunden Inkubation bei 25ºC am Licht genommen. Die Nukleinsäuren wurden aus einem Viertel jeder Probe extrahiert und auf einem 1% Formaldehyd enthaltenden Agarosegel, wie zuvor beschrieben, der Elektrophorese unterzogen. Die Nukleinsäuren wurden auf Hybond N geblottet, durch UV-Strahlung mit der Membran vernetzt und, wie zuvor beschrieben, auf CPMV-M-RNA-spezifische Sequenzen untersucht. In jedem Fall konnte bei den 72 Stunden ein starkes Hybridisierungssignal festgestellt werden, das in der Lage M-RNA entsprach, nicht aber bei den Proben mit 0 Stunden Inkubation, was zeigt, daß sich die Transkripte aus allen vier Konstrukten in Langbohnen-Protoplasten vermehren können.

Die restlichen drei Viertel jeder Protoplastenprobe wurden, wie zuvor beschrieben, lysiert und auf mit anti-CPMV-Serum überzogene Elektronenmikroskopgitter aufgebracht. Die Gitter wurden anschließend mittels eines JEOL 1200-Elektronenmikroskopes untersucht. Eine große Zahl Teilchen konnte in den Protoplastenproben mit 72 Stunden festgestellt werden, die mit pMT7-601-, pMT7- FMDV-I- und pMT7-HIV-Transkripten der Elektroporese unterzogen wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die durch pMT7-FMDV-I und pMT7-HIV kodierten modifizierten Hüllproteine sich zu Virionen zusammensetzen können.

Fähigkeit von pMT7-FMDV-I- und pMT7-HIV-Transkripten. sich in ganzen Langbohnenflanzen zu vermehren

Zum Nachweis der Fähigkeit von Transkripten aus pMT7-FMDV-I und pMT7-HIV, sich in ganzen Langbohnenpflanzen in Anwesenheit von Transkripten zu vermehren, die aus pBT7-123 stammen, wurden mit GpppG verkappte Transkripte, wie zuvor beschrieben, hergestellt. 6 Gruppen, die jeweils aus 5 und 10 Tage alten Langbohnen bestanden, wurden unter Verwenden des zuvor beschriebenen Verfahrens mit den Transkripten beimpft. In jedem Fall bezieht sich die Transkriptmenge auf die auf ein einzelnes Blatt aufgebrachte Menge.

Gruppe 1. Mit 50 mM Tris-phosphat, pH 8,0, blindbeimpft

Gruppe 2. Mit 1,5 µg natürlicher CPMV-Virionen-RNA beimpft

Gruppe 3. Mit jeweils 5 µg pMT7-601- + pBT7-123-Transkript beimpft

Gruppe 4. Mit jeweils 5 µg pMT7-FMDV-I- + pBT7-123-Transkript beimpft

Gruppe 5. Mit jeweils 5 µg pMT7-HIV + pBT7-123-Transkript beimpft

Die Symptome wurden auf täglicher Grundlage bewertet und Blattgewebeproben aus jeder Pflanze wurden 11 Tage nach der Beimpfung zur "Dot-blot"-Analyse genommen, welche wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde. Der Rest des Blattgewebes aus allen Pflanzen in Gruppe 4 und 5 wurde geerntet und zur späteren Verwendung eingefroren.

Ergebnisse

Keine Pflanze in Gruppe 1 (blindbeimpft) entwickelte irgendwelche Symptome bis zu 11 Tagen nach der Infektion (P.I.) und in dem Blattgewebe konnten durch "Dot-blot"-Analyse keine CPMV- spezifischen Nukleinsäuren nachgewiesen werden. Dies zeigt, daß während des Versuchs keine zufällige Infektion der Langbohnenpflanzen mit CPMV stattgefunden hatte. Alle Pflanzen in Gruppe 2 und 3 (entweder mit Virionen-RNA oder einem Gemisch von pMT7-601- und pBT7-123-Transkripten beimpft) zeigten 7 Tage P.I. starke Symptome sowohl an den beimpften als auch systemischen Blättern. Die "Dot-blot"-Analyse von Blattgewebe zeigte die Anwesenheit großer Mengen virusspezifischer RNA sowohl in den beimpften als auch systemischen Blättern aller Pflanzen. Dies bestätigt, daß die bei dem Versuch verwendeten Pflanzen gegenüber der Infizierung mit CPMV mittels entweder Virionen-RNA oder einem Gemisch aus Wildtyp-Transkripten voll empfänglich war.

11 Tage P.I. entwickelten die beimpften Blätter aller Pflanzen in Gruppe 4 (mit pMT7-FMDV-l-Transkripten beimpft) ein geflecktes Aussehen, das von dem normalerweise mit einer Wildtyp-Virusinfektion verbundenen verschieden war. Dieses Ergebnis zeigt, daß sich die Transkripte aus pMT7-FMDV-1 in ganzen Langbohnenpflanzen vermehren und von Zelle zu Zelle verbreiten können.

4 von 5 Pflanzen in Gruppe 5 (mit pMT7-HIV-Transkripten beimpft) entwickelten 11 Tage P.I. Symptome auf ihren systemischen Blättern. Die "Dot-blot"-Analyse zeigte, daß Pflanzen, welche die Symptome zeigten, sowohl in den beimpften als auch den systemischen Blättern beträchtliche Mengen virusspezifische Sequenzen besaßen. Dieses Ergebnis zeigt, daß sich Transkripte aus pMT7- HIV in ganzen Langbohnenpflanzen vermehren und verbreiten können.

Weitere Untersuchung der mit pMT7-FMDV-I und pMT7-HIV erhaltenen Ergebnisse pMT7-FMDV-I:

Um zu zeigen, daß modifizierte Viruscapsidproteine in den beimpften Blättern der Pflanzen aus Gruppe 4 synthetisiert wurden, wurden Proben des gefrorenen Blattgewebes fein zerkleinert und mit 1X Laemmli-Probenpuffer extrahiert. Die Extrakte wurden auf 15% Polyacrylamid-SDS-Gelen der Elektrophorese unterzogen und die Proteine wurden mittels einer halbtrockenen Transferzelle von Biorad auf Nitrocellulosemembranen überführt. Die Membranen wurden entweder mit gegen ganze CPMV-Virusteilchen angezüchtetem Serum oder mit einem gegen das synthetische Oligopeptid VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(CG), das den Resten 141-160 des VP1 des FMDV-Stammes Ol entsprach, angezüchteten Serum untersucht. Diese Sequenz entspricht dem Epitop, das in das VP23 in pMT7-FMDV inseriert wurde. Beide Antiseren wurden in Kaninchen angezüchtet. Die Western-Blot-Analyse wurde unter Verwenden von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen- IgG als zweitem Antikörper durchgeführt. Es wurde gefunden, daß die Proteinextrakte von allen fünf Pflanzen aus Gruppe 4 mit dem Anti-CPMV-Serum reagieren, was zeigt, daß die Virushüllproteine in den beimpften Blättern der Pflanzen aus Gruppe 4 synthetisiert wurden. Als ähnliche Blots mit dem AntiFMDV-Oligopeptidserum untersucht wurden, tauchte in den Extrakten aus jeder Pflanze von Gruppe 4 eine einzelne Bande auf (Figur 11). Diese Bande wanderte mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 24 kDa, was genau die erwartete Größe für das VP23 ist, das die FMDV-Schleife trägt. Kein Produkt ähnlicher Größe war zu erkennen, als Extrakte aus blindbeimpften oder Wildtyp-CPMV-beimpften Blättern analysiert wurden (Figur 11). Ähnlich reagierten gereinigte Wildtyp-CPMV-Hüllproteine mit dem FMDV-spezifischen Antiserum. Weiterhin verhinderte die Vorbehandlung des Anti-FMDV-Serums mit dem Peptid, das zu seiner Anzucht verwendet wurde, die Reaktion mit den Extrakten aus den Pflanzen von Gruppe 4, was die Spezifität der immunologischen Reaktion zeigte. Diese Ergebnisse zeigen, daß die beimpften Blätter der Pflanzen von Gruppe 4 CPMV-Hüllproteine enthielten, welche die FMDV-Schleife beherbergten.

pMT7-HIV:

Wie vorstehend erörtert, zeigte die "Dot-blot"-Analyse sowohl der beimpften als auch der systemischen Blätter aus den Pflanzen von Gruppe 5, daß sich Transkripte aus pMT7-HIV in ganzen Pflanzen vermehren und ausbreiten können. Die erhaltenen Signalstärken und die Tatsache, daß die Infektion systemisch wurde, zeigten, daß die Nachkommen-RNA verkapselt ist. Um zu beweisen, daß der HIV-spezifische Insert in der Nachkommen-DNA erhalten wurde, wurden "Dot-blots" von Extrakten aus Pflanzen von Gruppe 5 mit einer HIV-Insert-spezifischen Sonde untersucht. Diese wurde durch "Oligomarkierung" des beim Aufbau von pMT7-HIV verwendeten Oligonukleotids mit positivem Sinn hergestellt (siehe Figur 9). Die erhaltenen Ergebnisse zeigten die Anwesenheit der HIV-Sequenz in Extrakten der beimpften Blätter der vier Pflanzen, die Symptome zeigten.

ERWEITERUNG DER ERGEBNISSE MIT DAS FMDV-EPITOP BEHERBERGENDEM CPMV

Um die vorstehenden, mit aus pMT7-FMDV-I stammenden Transkripten erhaltenen Befunde zu erweitern, wurden fünf Gruppen von fünf Langbohnenpflanzen wie folgt mit wie zuvor beschrieben hergestellten verkappten Transkripten beimpft:

Gruppe 1: mit 50 mM Tris-phosphat, pH 8,0, blindbeimpft

Gruppe 2: mit 0,5 µg natürlicher CPMV-Virionen-RNA beimpft

Gruppe 3: mit 5 µg GpppG-verkappten pMT7-601- + pBT7-123-Transkripten beimpft

Gruppe 4: mit 5 µg GpppG-verkappten pMT7-FMDV-I- + pBT7-123-Transkripten beimpft

Die Symptome wurden auf einer täglichen Grundlage bewertet. 13 Tage nach der Beimpfung wurden dreifache Blattscheibenproben aus einem beimpften und einem dreiblättrigen Blatt jeder Pflanze entnommen. Die Proben wurden wie folgt behandelt:

Probe 1 (rohes Homogenisat): in 0,4 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, homogenisiert, zentrifugiert und der Überstand isoliert

Probe 2 (RNA-Extrakt): in flüssigem Stickstoff gefroren, fein zerkleinert und die Nukleinsäuren mit Phenol/Chloroform extrahiert. Nach der Ethanolfällung wurden die Nukleinsäuren zuletzt in 0,1 ml Wasser erneut suspendiert.

Probe 3 (Proteinextrakt): in flüssigem Stickstoff gefroren, fein zerkleinert und das Pulver in 0,1 ml 1x Laemmli-Probenpuffer gelöst.

"Dot-blots" wurden aus aliquoten Mengen von 5 µl aus Probe 1 und 2 hergestellt und entweder mit einer auf die Nukleotide 482-2211 von CPMV-M-RNA spezifischen Sonde (CPMV-spezifische Sonde), die, wie zuvor beschrieben, hergestellt wurde, oder mit einer auf das FMDVspezifische Insert spezifischen Sonde untersucht. Letztere wurde durch "Oligomarkieren" des in Figur 5 dargestellten Oligonukleotids mit positivem Sinn hergestellt. Western-Blots wurden aus aliquoten Mengen von Probe 3 hergestellt und wie zuvor beschrieben auf FMDV-spezifische Epitope untersucht. Eine ISEM wurde bei aliquoten Mengen von Probe 1 durchgeführt.

Ergebnisse

Auf keiner Pflanze aus Gruppe 1 (blindbeimpft) entwickelten sich irgendwelche Symptome. Dot-blots roher Homogenisate oder RNA- Extrakte zeigten, daß keine CPMV-spezifischen oder FMDV-spezifischen Sequenzen in Extrakten aus entweder den beimpften oder dreiblättrigen Blättern vorhanden waren. Die ISEM der rohen Homogenisate mittels Elektronenmikroskopiegitter, die mit Anti- CPMV-Serum überzogen waren, zeigte, daß keine Virusteilchen vorhanden waren. Die Western-Blot-Analyse der Proteinextrakte unter Verwenden des FMDV-spezifischen Serums zeigte die Abwesenheit irgendwelcher FMDV-Epitope. Diese Ergebnisse liefern die negative Kontrolle für den Rest der Versuche.

Sowohl auf den beimpften als auch dreiblättrigen Blättern aus allen Pflanzen von Gruppe 2 (Virionen-RNA-beimpft) und (pMT7-601 + pBT7-123)-beimpften Pflanzen von Gruppe 3 entwickelten sich 7 Tage P.I. Symptome. 11 Tage P.I. hatten sich die Läsionen auf den Primärblättern auf einen Durchmesser von 2-3 mm ausgedehnt. Dot-blots sowohl der rohen Homogenisate als auch RNA-Extrakte zeigten die Anwesenheit CPMV-spezifischer aber nicht FMDV-spezifischer Sequenzen. Die ISEM mittels Gitter, die mit Anti-CPMV- Serum überzogen waren, zeigte die Anwesenheit einer großen Zahl CPMV-Teilchen in rohen Homogenisaten sowohl aus den beimpften als auch dreiblättrigen Blätter. Die Western-Blot-Analyse der Protein-Extrakte zeigte die Abwesenheit jeglicher FMDV-Epitope.

Kleine Läsionen (ungefähr 1 mm im Durchmesser) entwickelten sich 11 Tage P.I. auf den (pMT7-FMDV-I + pBT7-123)-beimpften Pflanzen von Gruppe 4. Dot-blots der aus den Blättern (Probe 2) extrahierten RNA zeigte die Anwesenheit sowohl CPMV- als auch FMDV- spezifischer Sequenzen in 3 beimpften der 5 Pflanzen von Gruppe 4. Die ISEM mittels Gitter, die mit Anti-CPMV-Serum überzogen waren, zeigte die Anwesenheit CPMV-artiger Virusteilchen in den rohen Homogenisaten aus 4 beimpften der 5 Pflanzen von Gruppe 4. Western-Blotting der Proteinextrakte (Probe 3) zeigte die Anwesenheit des FMDV-Epitops auf dem kleinen Hüllprotein in Extrak ten aus allen Pflanzen von Gruppe 4. Diese Ergebnisse bestätigen, daß Transkripte aus pMT7-FMDV-I sich in ganzen Langbohnenpflanzen vermehren können und zeigen, daß in derartigen Pflanzen Virusteilchen produziert werden.

HERSTELLUNG EINES VIRUS AUS TRANSKRIPT-BEIMPFTEN PFLANZEN

Zum Isolieren von Virusteilchen aus pMT7-FMDV-I-infiziertem Blattgewebe wurde das folgende Verfahren entwickelt:

22 Gramm Langbohnenprimärblätter, die mit jeweils 5 µg pBT7-123- und pMT7-FMDV-Transkripten beimpft worden waren, wurden 16 Tage nach der Beimpfung geerntet. Die Blätter wurden in 2 Volumina (ungefähr 50 ml) 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, bei 4ºC homogenisiert. Der Saft wurde durch zwei Lagen Mull filtriert, 15 Minuten bei 15000 g zentrifugiert und der Überstand wurde zurückgehalten. Das Pellet wurde mit wenigen ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, erneut extrahiert und zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt und 4 Stunden bei 4ºC in einer Beckman-Zentrifuge vom Typ 30 bei 27000 Upm zentrifugiert. Das sich daraus ergebende Pellet wurde über Nacht bei 4&sup5;C in 3,5 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, erneut suspendiert und nachfolgend 10 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, auf 4 ml aufgefüllt und 1 ml einer 1 M NaCl, 20% PEG 6000 enthaltenden Lösung wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der sich daraus ergebende Niederschlag wurde durch 10 Minuten Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt, in 0,25 ml 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, erneut suspendiert und die Lösung wurde durch 10 Minuten erneutes Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge geklärt. Der Überstand, der die Virusteilchen enthält, wurde anschließend entnommen und bei 4ºC aufbewahrt. Spektrophotometrisch wurde abgeschätzt, daß die Viruskonzentration in der Endsuspension ungefähr 1,5 mg/ml war. Die Western-Blot-Analyse des Virus mittels FMDV-spezifischem Antiserum zeigte die Anwesenheit von FMDV-Antigen, das mit der kleinen Hüllprotein-Untereinheit der chimären Virusteilchen verbunden war.

PASSAGE MODIFIZIERTER DNA

Zum möglichst wirkungsvollen Herstellen großer Mengen chimärem Virus ließ man aus Transkript-beimpften Blättern extrahierte RNA in Pflanzen umlaufen. Proben von 5 µl RNA-Extrakt aus einem pMT7-FMDV-I-beimpften Blatt wurden mit Tris-phosphat, pH 8,0, auf 50 µl verdünnt und auf die primären Blätter einer Gruppe von 5 Langbohnenpflanzen eingeimpft. Alle Pflanzen entwickelten für eine CPMV-Infektion typische Symptome und 23 Tage P.I. wurden die Primärblätter aus den Pflanzen geerntet. Die Blätter wurden in 0,1 M Natriumphosphatpuffer homogenisiert und das Virus wurde wie zuvor beschrieben extrahiert mit Ausnahme, daß man den Anfangsschritt der Hochgeschwindigkeits-Pelletierung wegließ. Auf diese Weise wurden insgesamt 3,0 mg Virus in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, isoliert. Diese Zubereitung wurde schließlich in einem Centriprep-Konzentrator (Amicon) auf eine Endkonzentration von 1,4 mg/ml eingeengt und ist als P1 bezeichnet worden.

Proben von P1 wurden durch Elektrophorese auf SDS-Gelen und Coomassieblau-Anfärbung untersucht und es wurde gezeigt, daß sie das erwartete Hüllproteinmuster enthielten. Die Western-Blot- Analyse mittels Anti-FMDV-Serum zeigte, daß die kleinen Hüllproteine die FMDV-Schleife enthielten. Aus den Virusteilchen extrahierte RNA war von der für M- und B-RNA des CPMV erwarteten Größe. Dies zeigt, daß ein chimäres Virus durch Umlauf der aus Transkript-beimpften Blättern stammenden RNA hergestellt werden kann.

Ein experimenteller Impfstoff wurde aus der Viruszubereitung P1 durch Dispersion in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Endkonzentration von 1 mg/ml hergestellt. Meerschweinchen wurden 40 µg P1-Impfstoff an Tag 0 und 28 injiziert. Vorläufige Ergebnisse zeigen, daß die Tiere Antikörper gegen die FMDV-Schleife produzieren, eine Antwort, die nicht beobachtet wird, wenn Wildtyp-Virus injiziert wird.

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Anspruch[de]

1. Zusammengesetzte Teilchen eines Pflanzenvirus, das ein vorbestimmtes Fremdpeptid als Teil des Virus-Hüllproteins enthält, wobei die Teilchen in der Lage sind, sich in Pflanzen replizieren und zusammensetzen zu lassen, und in ganzen Pflanzen oder in Pflanzenzellen zusammengesetzt worden sind.

2. Virusteilchen gemäß Anspruch 1, wobei das Fremdpeptid ein biologisch funktionelles Peptid ist, dessen biologische Anwendung die Präsentation des Peptids in Verbindung mit einem größeren Molekül oder Teilchen erfordert oder durch diese verstärkt wird.

3. Virusteuchen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid ein Antigen, vorzugsweise ein virales Antigen, noch mehr bevorzugt ein Antigen eines Tiervirus (einschließlich Human- Virus) ist.

4. Virusteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Fremdpeptid in eine exponierte Oberfläche des Hüllproteins des Pflanzenvirus eingebaut ist.

5. Virusteuchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Pflanzenvirus ein RNA-Virus ist.

6. Virusteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Virus-Hüliprotein eine β-Faß-Struktur hat und das Fremdpeptid vorzugsweise in eine Schleife eingefügt ist, die β-Faltblatt-Bereiche des Virus-Hüllproteins miteinander verbindet.

7. Virusteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Pflanzenvirus ein Como-Virus, vorzugsweise ein Langbohnenmosaikvirus (CPMV), ist.

8. Virusteuchen gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei das Fremdpeptid in die β8-βC-Schleife des Pflanzenvirus eingefügt ist und das eingesetzte Fremdpeptid die vorhandene Schleife erweitert oder einen Teil der vorhandenen Schleife ersetzt.

9. Virusteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Fremdpeptid ein Tiervirus-Antigen ist, das vom Virus der Maul- und Klauenseuche (FMDV), vom Human-Immunschwächevirus (HIV) oder von einem Hurnan-Rhinovirus (HRV) abgeleitet ist.

10. Impfstoff zum Schutz vor Erregern von Mensch oder Tier, der zusammengesetzte Pflanzenvirusteilchen gemäß einem der Ansprüche 3 bis 9 als immunogene Komponente umfaßt und bei dem es sich vorzugsweise um einen Impfstoff gegen ein Tiervirus handelt.

11. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenvirusteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend das Modifizieren der Nucleinsäure des Pflanzenvirus, die für das Hüllprotein codiert, durch Einführen einer Nucleotidsequenz, die für ein Fremdpeptid codiert, das Infizieren von Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenzellen oder Protoplasten mit der modifizierten viralen Nucleinsäure und das Ernten von zusammengesetzten Teilchen des modifizierten Virus.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem die eingeführte Nucleotidsequenz in den Teil der Nucleinsäure des Pflanzenvirus eingesetzt wird, der für einen exponierten Teil des Hüllproteins codiert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11, das auf ein RNA-Pflanzenvirus angewendet wird, umfassend das Einführen einer DNA-Sequenz, die für das Fremdpeptid codiert, in eine cDNA, die der RNA des Pflanzenvirus entspricht, die für einen exponierten Teil von dessen Hüllprotein codiert, das Herstellen eines RNA-Transcripts aus der so modifizierten cDNA, das Impfen von Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenzellen oder Protoplasten mit dem Transcript, falls notwendig, zusammen mit einer anderen RNA, die für die Vervielfältigung und den Zusammenbau ganzer Virusteilchen in dem Pflanzenmaterial erforderlich ist, und das Ernten von zusammengesetzten Teilchen des modifizierten Virus.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem die modifizierte cDNA hergestellt wird, indem man die DNA, in der das Fremdpeptid codiert ist, in ein DNA-Fragment einführt, das aus der cDNA des Pflanzenvirus herausgeschnitten wurde, und das modifizierte Fragment rekombiniert, so daß die cDNA des Pflanzenvirus in modifizierter Form wieder aufgebaut wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 14, bei dem hergestelltes modifiziertes Virus oder daraus extrahierte RNA in Pflanzen übergeführt wird, um weitere Erträge des modifizierten Virus herzustellen.







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