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Dokumentenidentifikation DE69126486T2 15.01.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0472706
Titel INDUZIERUNG EINES SCHUTZES GEGEN VIRALE INFEKTIONEN
Anmelder Institut Pasteur, Paris, FR
Erfinder Girard, Marc, F-75015 Paris, FR;
Kieny, Marie-Paule, F-67100 Strasbourg, FR;
Leclerc, Claude, F-75015 Paris, FR
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Wuesthoff & Wuesthoff, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69126486
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 16.03.1991
EP-Aktenzeichen 919063867
WO-Anmeldetag 16.03.1991
PCT-Aktenzeichen EP9100509
WO-Veröffentlichungsnummer 9114449
WO-Veröffentlichungsdatum 03.10.1991
EP-Offenlegungsdatum 04.03.1992
EP date of grant 11.06.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.01.1998
IPC-Hauptklasse A61K 39/21

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft eine Impfzusammensetzung, die die gleichzeitige oder nacheinander erfolgende Verwendung eines prägenden (priming) Antigens, in diesem Falle des Glycoproteins von einem Virus, wie HIV, SIV oder einem beliebigen Lentivirus, das in der Lage ist, AIDS in seinem natürlichen Wirt zu induzieren, oder von einem Retrovirus vom Typ HTLV-I oder HTLV-II umfaßt, und eine Amplifizierungszusammensetzung, die synthetische Oligopeptide umfaßt, die frei oder an ein Trägermolekül gebunden sind, und in der die Oligopeptide den Neutralisierungsepitopen für eben dieses Glycoprotein entsprechen.

Eine wirksame Impfzusammensetzung gegen Viren muß eine rasche Neutralisierung der Viren bewirken, um die Viren daran zu hindern, sich möglicherweise in Form eines latenten Provirus innerhalb der Chromosomen ruhender Zellen zu schützen oder Zuflucht in den zellulären Kompartimenten oder Gewebekompartimenten zu finden, wo sie sich außerhalb der Reichweite des Immunsystems befanden.

Aufgrund von früheren Experimenten, die sowohl an Schimpansen im Falle von HIV als auch an Makaken im Falle von SIV ausgeführt worden sind, ist klar, daß eine Inokulation mit dem Hüllglycoprotein des Virus allein es nicht ermöglicht, eine vollständig schützende Immunantwort zu erhalten. Insbesondere erzeugt das Hüllglycoprotein des Virus keine ausreichende Konzentration an neutralisierenden Antikörpern, um einen Schutz gegen eine Infektion zu bewirken.

Dementsprechend besteht im Stand der Technik ein Bedürfnis für eine Zusammensetzung, die eine ausreichende Konzentration an neutralisierenden Antikörpern gegen eine Virusinfektion in einem Wirt, der für die Infektion durch das Virus empfänglich ist, induzieren kann.

Diese Erfindung trägt dazu bei, diese Bedürflüsse im Stand der Technik zu erfüllen. Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung die Immunogenitat von mindestens einem Hüllglycoprotein eines Virus zu verstärken, indem das Glycoprotein mit mindestens einem Peptid, und vorzugsweise zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit einer Gruppe von Peptiden, kombiniert wird, das bzw. die von der Sequenz des Hüllglycoproteins abgeleitet ist bzw. sind und Virus- Neutralisierungsepitopen entspricht bzw. entsprechen, d.h. Aminosäuresequenzen entspricht bzw. entsprechen, die an der Produktion von neutralisierenden Antikörpern in dem Wirt, dem sie verabreicht werden, beteiligt sind.

Dementsprechend stellt diese Erfindung eine Zusammensetzung zum Verstärken der Immunogenität eines Hüllglycoproteins eines Virus in einem Wirt bereit. Die Zusammensetzung umfaßt mindestens ein Hüllglycoprotein des Virus und mindestens ein von der Aminosäuresequenz des Hüllglycoproteins abgeleitetes Peptid für eine Verabreichung an einen Wirt. Das Peptid umfaßt mindestens ein Virus-Neutralisierungsepitop. Das Hüllglycoprotein und das Peptid liegen in einer ausreichenden Menge vor, um neutralisierende Antikörper in dem Wirt nach einer Verabreichung zu induzieren.

Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zum Verstärken der Inununogenität eines Hüllglycoproteins eines bestimmten Virus bereit, wobei die Zusammensetzung als kombinierte Zubereitung für eine gleichzeitige, getrennte oder nacheinander erfolgende Verwendung umfaßt:

(A) mindestens ein Hüllglycoprotein des Virus oder ein Fragment von mindestens 50 Aminosäuren des Glycoproteins und

(B) mindestens ein von der Aminosäuresequenz des Hüllglycoprotein abgeleitetes Peptid, wobei das Peptid mindestens ein Virus-Neutralisierungsepitop umfaßt und das Hüllglycoprotein und das Peptid in einer ausreichenden Menge verabreicht werden, um neutralisierende Antikörper in dem Wirt zu induzieren.

Für den Zweck der Erfindung soll der Begriff "Zusammensetzung" eine kombinierte Zubereitung umfassen, in der die Bestandteile - in diesem Falle das Hüllglycoprotein und das Peptid oder die Peptide, das bzw. die von dem Hüllglycoprotein abgeleitet ist bzw. sind - in einer Mischung prasentiert werden können oder nebeneinander prasentiert werden können und dementsprechend gleichzeitig, getrennt oder in Zeitabständen an den Wirt verabreicht werden können.

Beispielsweise können das oder die in der Zusammensetzung vorliegende(n) Peptid(e) getrennt von anderen Bestandteilen gehalten werden, damit diese nacheinander verabreicht werden können, um die immunogene Reaktion, die durch das Hüllglycoprotein geprägt oder geprimt wird, zu verstärken.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die das vorstehend genannte Hüllglycoprotein und Peptid umfaßt mit den Maßgaben, daß das Hüllglycoprotein in einer ausreichenden Menge vorliegt, um die Induktion von neutralisierenden Antikörpern in einem Wirt, dem es verabreicht wird, zu prägen, und das mindestens eine Peptid in einer ausreichenden Menge vorliegt, um die Induktion persistierender neutralisierender Antikörper in dem Wirt, dem es verabreicht wird, zu verstärken.

Dementsprechend betrifft die Erfindung die Verwendung von mindestens einem der vorstehend beschriebenen Peptide zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Verstärken der Immunogenität eines Hüllglycoproteins eines Virus, wenn dieses Glycoprotein einem Wirt verabreicht wird, um neutralisierende Antikörper zu induzieren.

Die Zusammensetzung der Erfindung kann zur Herstellung immuntherapeutischer Arzneimittel verwendet werden. In diesem Falle wird die Zusammensetzung seropositiven Personen verabreicht, um die Konzentration neutralisierender Antikörper zu erhöhen und dementsprechend eine Kontrolle des Virus zu ermöglichen.

Verfahren wurden von J. Salk in "4º Colloque des Cent Gardes - Retroviruses of human AIDS and related animal diseases - Hrsg.:M. Girard, L. Valette - Fondation Mérieux - 1990, S. 273-278" und in "Nature 1989, Band 327, S. 473-476" beschrieben.

Diese Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zum Impfen eines Wirts gegen eine Infektion durch ein Virus bereit. Die Zusammensetzung umfaßt mindestens ein Hüllglycoprotein des Virus in einer ausreichenden Menge, um eine Impfüng in einem Wirt, dem das Hüllglycoprotein verabreicht wird, zu prägen (priming). Die Zusammensetzung enthält auch mindestens ein von der Aminosäuresequenz des Hüllglycoproteins abgeleitetes Peptid. Das Peptid umfaßt mindestens ein Virus-Neutralisierungsepitop des Glycoproteins. Die Zusammensetzung enthält das Peptid in einer ausreichenden Menge, um die Induktion persistierender neutralisierender Antikörper in dem Wirt zu verstärken.

Die Beschreibung der Erfindung in Bezug auf die Verwendung der definierten Zusammensetzung als Impfstoff kann auch auf die Verwendung dieser Zusammensetzung als immuntherapeutisches Arzneimittel angewendet werden, vorausgesetzt, daß die beschriebenen Mittel die Verstärkung der Produktion neutralisierender Antikörper ermöglichen.

Peptide und Hüllglycoproteine können kombiniert werden unter Bedingungen, die es diesen ermöglichen, durch nicht-kovalente physikalische Anlagerung oder durch kovalente chemische Bindung Wechselwirkungen auszuüben. Alternativ und in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Prägungs (Priming)-Impfung durch Injektionen von Hüllglycoprotein erzielt, wobei eine schützende Immunität nachfolgend durch die Injektion von immunogenen Peptiden, die den Neutralisierungsepitopen entsprechen, verstärkt wird.

Zwei von drei immunisierten Schimpansen wurden erfolgreich gegen eine Virusinfektion geschützt und das Virus wurde in einem dritten Tier für eine lange Zeitdauer unter Verwendung der Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung supprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß es diese Erfindung ermöglicht, einen Schutz gegen HIV-1 durch Immunisierung zu erzielen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Diese Erfindung wird vollständiger durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:

Fig. 1 anti-HIV-Antikörper-Konzentrationen darstellt, die durch ELISA (Genetic Systems Kit) im Schimpansen FUNFACE (C-339) und in einer Kontrolle (C-5 19) gemessen wurden. Die Ergebnisse sind als Serum-ELISA-Titer (1:Verdünnung, die eine positive Reaktion ergab) gegen die Zeit aufgetragen. Der Zeitpunkt Null in der Figur entspricht dem Tag der ersten Auffrischung (Booster) mit inaktiviertem HIV. Das Tier wurde in der 70. Woche testinfiziert (Challenge) (Pfeil).

Fig. 2 Konzentrationen von neutralisierenden Antikörpern in den Schimpansen FUNFACE (dunkle Kreise) und ROBERT (offene Kreise) in Reaktion auf die Injektion eines KLH-BRU-Peptidkonjugats (Pfeile) darstellt. Die Tiere erhielten Inokulationen zum Zeitpunkt 0 sowie in der 3. und 19. Woche (Pfeile) und wurden in der 24. Woche testinfiziert (Challenge).

Fig. 3 anti-HIV-Antikörperkonzentrationen darstellt, die durch ELISA in dem Schimpansen ROBERT (C-433) gemessen wurden. Die Ergebnisse sind als Serum-ELISA-Titer (1: Verdünnung, die eine positive Reaktion ergab) gegen die Zeit aufgetragen. Der Zeitpunkt Null entspricht dem Tag der ersten Antigeninjektion (gp160env, p27nef, p23vif und p18gag). Das Tier wurde in der 84. Woche testinfiziert (Pfeil).

Fig. 4 die Neutralisierung von HIV-1 BRU als Funktion der Serumverdünnung bei den Schimpansen JOJOTOO (499), IRA (151) und HENRY 11(531) zum Zeitpunkt t0 ( ) und 2 Wochen ( ) und 5 Wochen ( ) nach einer dritten Inokulation freier Peptide darstellt.

Fig. 5 die Neutralisierung von HIV-1 BRU (gepunktete Kurven) und HIV-1 ARV-2 (durchgezogene Kurven) als Funktion der Serumverdünnung im Schimpansen JOJOTOO (C- 499) zum Zeitpunkt t0 (C) und nach der dritten Inokulation freier Peptide ( ) darstellt.

Fig. 6 die gesamten HW-1-spezifischen Antikörpertiter für die Schimpansen C-339 (A), C-433 (B) und C-499 (C) zeigt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Schimpansen mit verschiedenen Immunogenen inokuliert (siehe Tabelle 1) oder mit HIV- 1 testinfiziert (Challenge). Titer sind als Kehrwert der höchsten Serumverdünnung, die bei Verwendung eines HIV-1-EIA-Kits (Genetic Systems) ein positives Ergebnis lieferte, definiert.

Fig. 7 die Titer neutralisierender Antikörper in Serum aus C-339, C-433 und C-499 während einer Immunisierung mit HIV- 1-Antigenen darstellt. Titer sind der Kehrwert der höchsten Serumverdünnung, die eine 90%-ige Verringerung der Anzahl von durch CEM-SS- Zellen (Nara, P.L., Hatch, W.C., Dunlop, N.M., Robey, W.G., Arthur, L.O., Gonda, M.A. & Fischinger, P.J. (1987), AIDS Res. Human Retroviruses 3, 283-302) gebildeten Synzytien ergab im Vergleich zu jenem, der mit Kontroliserum eines unbehandelten Schimpansen erhalten wurde.

Fig. 8 eine PCR-Analyse von DNA aus PBMC und Lymphknotengewebe, erhalten 6 Monate nach Testinfizierung (Challenge) der Schimpansen C-339 und C-433 mit HIV-1, zeigt.

(A) Mit Ethidiumbromid angefärbtes Gel amplifizierter HIV-Sequenzen nach zwei PCR-Runden mit ineinandergeschachtelten (nested) Sätzen von Primern. Die Größe des HIV- spezifischen amplifizierten Fragments ist 141 Basenpaare.

Bahn 1: 0,5 µg OX174-DNA, geschnitten mit HaeIII, als Molekulargewichtsmarker.

Bahnen 2-7: Positivkontrollen für die Empfindlichkeit, wobei jede zehnmal weniger Moleküle von pHXB2, geschnitten mit XbaI, als die vorangehende Probe enthielt, beginnend mit 3000 Molekülen in Bahn 2. Jede Probe wurde in Gegenwart von 1 µg DNA (der DNA- Menge in 1,5 x 10&sup5; Zellen) aus einem nicht infizierten Kontrollschimpansen, C-5 19, amplifiziert. Eine Negativkontrollprobe (Bahn 14) wurde identifiziert und als Quelle für zelluläre DNA aus nicht infiziertem Schimpansen verwendet; alle anderen Proben wurde blind getestet. C-487 war ein HIV-1-infizierter Schimpanse, der als Positivkontrolle verwendet wurde.

Bahnen 8-11: DNA aus PBMC von C-339, C-487, C-433 bzw. C-519.

Bahnen 12-15: DNA aus Lymphknotengewebe von C-487, C-433, C-519 bzw. C-339.

(B) Mit Ethidiumbromid angefärbtes Gel eines amplifizierten Teils des β- Globingens (Scharf; S.J., Horn, G.T. & Erlich, H.A. (1986), Science 233, 1076-1078) als interne Kontrolle.

(C) Oligonukleotidhybridisierung von PCR-amplifizierten Sequenzen. In (A) gezeigte PCR-Reaktionsprodukte wurden denaturiert und mit [³²P]-markiertem Primer SK102, der vollständig innerhalb der amplifizierten Sequenz hybridisiert, hybridisiert; die Produkte wurden nach einer Polyacrylamidgelelektrophorese und Autoradiographie entsprechend Kwok und Kellogg (Kwok, S. & Kellogg, D.E. (1990) in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications: Hrsg.: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White, T.J. (Academic Press, Inc., San Diego, CA), S.337-347) untersucht.

Fig. 9 eine Immunoblotanalyse von Antikörpern gegen spezifische HIV- 1-Proteine nach einer Immunisierung und Testinfizierung (Challenge) der Schimpansen C-433, C-339 und C-499 darstellt. Serumproben wurden 1:200 verdünnt und mit einem kommerziell erhältlichen Kit (Diagnostics Pasteur) untersucht. Für die gezeigten Proben wurden Seren einen Monat vor der Testinfizierung (angezeigt durch einen Pfeil) und dann in Abständen von 4 Wochen gesammelt. Die Molekulargewichte von HIV-1-Proteinen sind für positives Kontrollserum gezeigt.

Fig. 10 anti-gp 160-ELISA-Titer in erfindungsgemäß behandelten Rhesus-Affen zeigt.

Fig. 11 anti-V3 BRU-Antikörper-Titer in erfindungsgemäß behandelten Rhesus-Affen zeigt.

Beste Weise zum Ausführen der Erfindung

Frühere Versuche, Schimpansen gegen eine HIV-Infektion durch Impfung zu schützen, sind fehlgeschlagen trotz der Verwendung mehrerer verschiedener Typen von Impfstoffen: synthetische Peptide, lebendes rekombinantes Vaccinia-Virus (VV), das HIV-Antigene exprimierte, native oder rekombinante gp 120- oder gp 160-Hüllantigene und inaktiviertes Ganz-Virus. Über das Fehlschlagen, einen Schimpansen gegen eine Testinfektion mit infektiösem HIV durch vorangehende Impfung mit rekombinantem VV, gefolgt von Formalin- und β-Propiolacton-inaktiviertem Ganz-HIV, zu schützen, ist in der Vergangenheit berichtet worden.

Dieses Fehlschlagen führte zu zwei Überlegungen, auf denen die vorliegende Strategie beruht:

1 - Ein Schutz gegen eine Infektion mit zelifreiem HIV erfordert wahrscheinlich hohe Konzentrationen an neutralisierenden Antikörpern (Ab). Sollte das Virus einer Ausrottung durch neutralisierende Ab oder antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC) entgehen, könnte das Virus leicht vor dem Immunsystem geschützt bleiben entweder als integriertes Provirus und/oder durch Infektion von Zellen im Knochenmark oder dem Zentralnervensystem. Eine Replikation des Virus, sogar wenn diese nur begrenzt stattfindet, könnte zu dem frühzeitigen Entstehen von Neutralisierungsentrinnungsmutanten führen. Dementsprechend könnte eine schnelle Neutralisierung des Virus der Testinfizierung (Challenge) ein Schlüssel für eine erfolgreiche Impfung sein.

2 - Bis 1990 ist eine Induktion von neutralisierenden Ab durch sämtliche an Schimpansen untersuchten Impfstoffe bestenfalls mittelmäßig gewesen. Dies könnte deren Versagen erklären, die Tiere gegen eine Infektion zu schützen. Um wirksam zu sein, sollte dementsprechend ein Impfstoff höhere Titer an neutralisierenden Antikörpern als jene, die bislang erzielt worden waren, induzieren.

Es wurde dementsprechend danach gestrebt, die höchstmöglichen Titer an neutralisierenden Antikörpern bei Schimpansen durch Protokolle mit aufeinanderfolgenden Immunisierungen unter Verwendung einer Mehrzahl von Immunogenen zu bewirken.

Ein Schimpanse, C-339, wurde anfänglich mit vier Injektionen (nach 0, 1, 2 und 6 Monaten) von 250 µg Formalin- und β-Propiolacton-inaktiviertem Ganz-HIV, gemischt mit SAF-1, unter Einsatz einer Konzentration von 1 mg Threonyl-MDP immunisiert. Das Tier entwickelte hohe HIV-ELISA-Titer (1:200000 unter Verwendung des ELAVIA-Kits von Diagnostic Pasteur mit einem Ausschluß von 0,1) und zeigte eine starke Reaktivität im Western- Blot gegenüber gp160, gp120 und gp41 env und gegenüber p55, p40, p25 und p18gag. Seine Titer an neutralisierenden Antikörpern erreichten 1:400 bzw. 1:64 unter Einsatz zweier unterschiedlicher Neutralisierungsassays; der erste Assay stellte auf eine 50%-ige Inhibition der Bildung immunfluoreszierender Foci an MT4-Zellen und der zweite auf eine 90%-ige Inhibition der Synzytien-Bildung bei CEM-SS-Zellen ab. Unter Einsatz eines stringenteren Assays (100%-ige Inhibition von reverser Transkriptase-Produktion in frischen humanen PBL) betrug der maximale Titer neutralisierender Ab 1:160, erhalten unmittelbar nach der Auffrisch (Booster)-Injektion. Diese Titer persistierten jedoch nicht, sondern nahmen schnell auf geringere Konzentrationen ab.

In einem Versuch, die Titer neutralisierender Ab des Schimpansen C-339 zu erhöhen, erhielt das Tier wiederholt Auffrischimpfüngen mit rekombinantem löslichem gp160env aufgereinigt aus dem Überstand von BHK-2 1-Zellkulturen, die mit VV-1163 infiziert waren, einer VV-env-Rekombinante, die ein gp 160-Molekül exprimierte, das eine Deletion der Transmembrandomäne und eine Modifikation der gp120/gp41-Spaltstelle durch ortsgerichtete Mutagenese zur Verhinderung einer Spaltung enthielt. Das Vaccinia-Virus VV- 1163 kann unter Einsatz der von Kieny et al., Protein Engineering 2: 219-226 (1988) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Antigen wurde durch nacheinander erfolgende Lektin- und Kationenaustauschchromatographie aufgereinigt und wurde dann intradermal an mehreren Stellen des Thorax (125-150 µg pro Injektion) mit einer Humandosis von BCG injiziert. Dem folgten drei aufeinanderfolgende intramuskuläre Injektionen des mit SAF formulierten Antigens. ELISA und Titer von neutralisierenden Antikörpern wurden routinemäßig untersucht; jedoch blieben beide während und nach dieser Reihe von Immunisierungen unverändert.

Das Versagen von gp160env, Antikörperantworten zu verstärken, beruhte nicht auf einem Mangel an Immunogenität, wie gezeigt wurde, indem parallel ein unbehandelter Schimpanse, C-519, der vorab HIV-Antigenen nicht ausgesetzt worden war, immunisiert wurde. Bei Verwendung des gleichen Immunisierungsprotokolls wie für C-339 entwickelte C- 519 schnell eine starke anti-gp160 Ab-Antwort und seine ELISA-Titer erreichten 200000 nach zwei Injektionen. Dementsprechend beruhte das Versagen von C-339, auf die Injektionen von gp160env anzusprechen, nicht auf einem Mangel der Stärke des Immunogens, sondern am wahrscheinlichsten auf einer nicht identifizierten, immunologischen Blockierung in dem Tier. Es wurde gefolgert, daß eine derartige Beeinträchtigung umgangen werden könnte, indem dem Tier nur jene Epitope des gp120-Moleküls injiziert wurden, die für eine Induktion neutralisierender Ab erforderlich waren.

Es ist gezeigt worden, daß HIV-neutralisierende Ab primär gegen die typspezifische, hypervariable Schleife aus der V3-Region von gp120 gerichtet sind. Dementsprechend wurde unter Verwendung von Bisdiazobenzidin ein 25-meres Oligopeptid mit der Sequenz jener Schleife oder jenes Loops 4-(YNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGN) aus dem HIV-I BRU (IIIb)-Stamm mit KLH quervemetzt. C-339 wurde das Peptid-Träger-Konjugat in Gegenwart von SAF (300 µg Peptid) in den Wochen 0, 3 und 19 injiziert. Es wurde keine Erhöhung des ELISA-Titers beobachtet, aber es wurden nach der zweiten Injektion anhaltende Titer von neutralisierenden Ab erhalten. Das Tier wurde in Woche 26 (siehe unten) zusammen mit einem anderen Schimpansen, ROBERT, C-433, der einem parallelen, obgleich verschiedenen Immunisierungsablauf unterzogen worden war, testinfiziert (Challenge).

Der Schimpanse C-433 war mit VV-1139 geprägt worden (Priming), einer VV- Rekombinante, die die gleiche ungespaltene Version von gp160env wie VV-1163 exprimiert, die jedoch die Transmembrandomäne enthält. Das Vaccinia-Virus VV-1139 kann unter Verwendung der von Kieny et al., Protein Engineering 2:219-226 (1988) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Eine Skarifikation erfolgte mit 2 x 108 PFU der VV-Rekombinante und wurde in den Wochen 4 und 22 wiederholt. Das Tier wurde dann mit je 125-150 µg von rekombinantem löslichem gp160, aufgereinigt wie vorstehend beschrieben, und rekombinantem p18gag, p27nef und p23vif (aufgereinigt aus E. coli), gemischt mit SAF, immunisiert. Die Injektionen erfolgten in den Monaten 0, 1, 2 und 6 und führten zu einem ELISA-Ab-Titer von 1:400000. Wieder blieben jedoch die Titer von neutralisierenden Ab niedrig (1:400 und 1:128 mittels Assays auf der Grundlage immunfluoreszierender Foci- bzw. Synzytien- Bildung). Dementsprechend wurde C-433 das gleiche V3-Peptid-KLH-Konjugat gemäß demselben Immunisierungsprotokoll wie C-339 injiziert. Der Titer von neutralisierenden Antikörpern von C-433 wurde unverzüglich um ein Mehrfaches verstärkt und das Tier parallel mit C- 339 testinfiziert (Challenge).

Die zwei Schimpansen wurden unter Einsatz einer titrierten Virus-Stammkultur (III B- Stock, Lot No. 40) vom National Cancer Institute (ein freundliches Geschenk von Larry Arthur, NCI, Frederick, MD) testinfiziert. Die Stammkultur, die 10&sup4; TCID50/ml enthielt, wurde 1:100 verdünnt und 1 ml der Verdünnung intravenös beiden immunisierten Tieren injiziert. Um die nicht erforderliche Verwendung eines Tieres zu vermeiden und unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die Virus-Stammkultur zweimal in Schimpansen titriert und deren Infektiosität für Schimpansen auf übliche Weise festgestellt worden war, wurde kein unbehandelter Kontrollschimpanse in diesem Experiment eingesetzt. Die ID50 dieser Virus- Stammkultur für Schimpansen war äquivalent zu 4 TCID50 und in zwei Experimenten führte die Injektion von 40 TCID50 in Schimpansen zu dem Aufireten von nachweisbarem Virus in PBL bereits zwei Wochen nach der Injektion und wurde von einer Serokonversion nach 4 Wochen gefolgt.

Im Gegensatz dazu folgten der Testinfizierung (Challenge) der Schimpansen C-339 und C-433 durch 100 TCID50 keine nachweisbaren Erhöhungen der Antikörper-Titer während der 24 Wochen, die seit dem Zeitpunkt der Testinfizierung verstrichen waren. Zusätzlich entwickelte C-433 keine anti-p25gag-Ab, C-339 entwickelte keine anti-p27nef-Ab und beide Tiere entwickelten keine anti-p66pol-Ab.

PCR-Tests, die 6, 12 und 24 Wochen nach der Testinfizierung (Challenge) an PBL von beiden Schimpansen vorgenommen wurden, waren negativ, wohingegen der unzureichend immunisierte Schimpanse (C-487), der vor einem Jahr testinfiziert worden war (Challenge) und eine Infektion entwickelt hatte, bei PCR positiv war. Schließlich wurde kein Virus durch Cokultivierung von PBL weder von C-339 noch von C-433 mit humanen PBL wiedergewonnen, wie aufgrund des Fehlens von RT-Aktivität nach 6 Wochen Kultur festgestellt wurde.

Es versteht sich, daß der Ausdruck "Neutralisierungsepitope" verwendet wird, um im Falle von HIV-1 das Haupt-Virus-Neutralisierungsepitop zu bezeichnen, wie u.a. von Putney et al. in 1986 (Science 234:1392-1395) und Rusche et al. in 1988 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3198-3202) beschrieben, bei dem die Sequenz ungefähr den Aminosäuren 296 bis 331 des HIV-1-Hüllglycoproteins entspricht, wie in der Arbeit von Myers et al. (Human Retroviruses and AJDS 1989, Los Alamos, Natl. Lab.) beschrieben wurde. Gleichfalls umfaßt von der Erfindung sind Peptide, die äquivalenten Regionen von verschiedenen HIV- 1 -Varianten oder anderen Retroviren, HIV-2, HTLV-I oder HTLV-II bei Menschen, FIV, FeLV oder anderen Lentiviren in Tieren entsprechen und die den Neutralisierungsepitopen des betreffenden Virus entsprechen.

Auch im Rahlnen der Erfindung umfaßt sind Peptide, die jenen entsprechen, die als Neben (minor)-Neutralisierungsepitope bekannt und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zu konservierten Regionen des Hüllglycoproteins gehören und Antikörper induzieren, die in der Lage sind, in relativ geringen Titem mehrere verschiedene Isolate des betreffenden Virus, beispielsweise mehrere verschiedene Isolate von HIV- 1 oder sogar verschiedene Isolate von HIV-1 und auch von HIV-2, zu neutralisieren. Ein Beispiel für ein Nebenepitop kann in der Arbeit von Chanh et al. in 1986 (The EMBO Journal, 5:3065-3071) und in jener von Evans et al. in 1989 (Nature 339:385-388) gefünden werden.

Immunogene Peptide von Haupt- und Nebenneutralisierungsepitopen werden vorzugsweise miteinander gemischt, um den größtmöglichen Schutz sicherzustellen. Sie können in freiem Zustand, nicht an ein Trägermolekül gekoppelt verabreicht werden. Sie können auch mit einer Sequenz von Aminosäuren, die eines oder vorzugsweise mehrere T-Epitop(e) von einem oder mehreren Stuktur- oder Nicht-Struktur-Protein(en) desselben Retrovirus oder eines immunologisch mit dem erstgenannten kreuzreaktiven Retrovirus aufweist, insbesondere wie in der Französischen Patentanmeldung von Girard-Gluckman-Bahraoui Nr.89.11044 vom 18. August 1989 (FR-A-2 650 954) beschrieben, kombiniert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden immunogene Peptide, die Neutralisierungsepitopen entsprechen, chemisch an Sequenzen von Aminosäuren, die T-Epitopen entsprechen, gekoppelt. In einem anderen Fall werden die Peptide an ein Trägermolekül gekoppelt, das die gewünschten T-Epitope trägt, indem man sie beispielsweise mit einem bifünktionalen Reagens oder irgendeinem anderen gewünschten Kopplungsmittel reagieren läßt.

Als Trägermolekül kann jedes von dem viralen Genom kodierte Protein (im Falle von HIV die von tat-, rev-, vif-, pol-, vpr-, vpx-, vpu-, gag- env- oder nef-Genen produzierten Proteine) oder andere Moleküle (vom Proteintyp), wie HBS-Antigen, HBC-Antigen, Tetanus- Toxoid, Hämocyanin, humanes Albumin, oder Polypeptide (beispielsweise Polylysin) oder geeignete Lipopeptide verwendet werden.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, bei der die Hüllglycoprotein- Moleküle und neutralisierenden Haupt- und Nebenpeptide (entweder frei oder an Trägermoleküle gebunden) in derselben Impfzubereitung kombiniert werden, tritt der Prägungs- oder Priming-Effekt der Hüllglycoproteine nach der ersten oder den ersten paar Injektion(en) von Impfstoff auf und der Amplifikationseffekt aufgrund von Peptiden unmittelbar danach.

Dementsprechend ist es ein Gegenstand der Erfindung, ein erstes Antigen, in diesem Falle die verschiedenen Hüllglycoproteine von jedem der betreffenden Retrovirus-Serotypen, das die Wirkung hat, die Antwort des Immunsystems zu prägen, und ein zweites Antigen, in diesem Falle die synthetischen Peptide, die Haupt- und möglicherweise auch Nebenneutralisierungsepitopen der verschiedenen Serotypen des betreffenden Virus entsprechen, für eine Impfüng (vorzugsweise aufeinanderfolgend, aber, sofern erforderlich, auch in einer Mischung) zu verwenden zu dem Zweck, die initiale Antwort zu amplifizieren und zu konsolidieren, insbesondere durch Induktion von neutralisierenden Antikörpern in langandauernden, hohen Titern. Diese Erfindung ermöglicht es, eine Immunität zu induzieren, die ungefähr sechs Monate und sogar ein Jahr oder länger andauert.

Die zur Prägung oder Priming der Antwort des Immunsystems verwendeten Glycoproteine sind vorzugsweise vollständige Moleküle, wie sie vor einer möglichen Spaltung erhalten werden. Dementsprechend ist im Falle von HIV-1 gp 160 gegenüber gp 120 zu bevorzugen und das gleiche trifft für andere Retroviren zu. Dies ermöglicht, insbesondere anti-gp41- Antikörper zu induzieren, was ein günstiges Anzeichen bei Virus-Trägern ist (Klasse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5225-5229).

Die die "Amplifizierverbindung" bildenden Peptide können frei oder an Trägermoleküle physikalisch gebunden (insbesondere durch hydrophobe Bindungen) oder chemisch gebunden (insbesondere durch kovalente Bindungen) sein. Sie können auch mit anderen Peptiden, die T-Epitopen entsprechen, oder sogar an Peptide, Lipopeptide, Glycopeptide, aliphatische Ketten, Fettsäuren oder jede beliebige Kombination von diesen, die in der Lage ist bzw. sind, das Immunsystem zu stimulieren und/oder spezifisch die "Amplifizier"-Peptide zu Zielen für Antigen-präsentierende Zellen zu machen, assoziiert sein.

Von diesem Gesichtspunkt aus ist es eine besonders vorteilhafte Prasentation von Peptiden, die HIV-Neutralisierungsepitopen entsprechen, diese vorzugsweise durch kovalente chemische Bindungen an eine aliphatische Sequenz, insbesondere wie in 1989 von Deres et al. (Nature 342:561-564) beschrieben, zu binden. Die auf diese Weise präsentierten amplifizierenden Peptide können nicht nur eine B-Zell-Antwort, sondern auch eine HLA Klasse I-restringierte CTL-CDB&spplus;-Antwort, wie von Takanashi et al. in 1988 beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3105-3109), induzieren.

Wenn das Virus ein hohes Ausmaß an antigener Variabilität wie im Falle von HIV-1 und HIV-2 aufweist, ist es erforderlich, als prägendes (priming) Antigen nicht nur ein, sondem mehrere Hüllglycoproteine mit verschiedenen Sequenzen zu verwenden, wobei jede Sequenz einem Isolat oder einer Gruppe von Isolaten des betreffenden Virus entspricht, um so viele Prägungs- oder Priming-Phänomene, wie gewünscht, zu erhalten, da jede für ein einzelnes Isolat oder eine einzelne Gruppe von Isolaten spezifisch ist. In diesem Fall versteht es sich, daß die amplifizierenden Peptide aus der Mischung von Neutralisierungspeptiden von jedem der betreffenden Isolate, wie nachstehend angegeben, zusammengestellt sind.

Eine erfindungsgemäße Praparation von HIV-1-Amplifizierungs-Peptiden ist durch die Tatsache gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der nachfolgend im Ein-Buchstaben- Aminosäurecode beschriebenen Sequenzen oder einen Teil dieser Sequenzen enthält:

Die Produktion der amplifizierenden Moleküle der Erfindung unter Verwendung einer Sequenz, die mindestens ein Neutralisierungsepitop und insbesondere eines von jenen aus der vorstehend angegebenen Liste und eine Trägersequenz mit mindestens einem T-Epitop enthält, kann durch Verbinden dieser Sequenzen oder durch physikalische Kombination in derselben Zusammensetzung erzielt werden,

Um vollständig wirksam zu sein, müssen die prägenden (priming) und amplifizieren den Antigene verstärkt werden, beispielsweise und vorzugsweise durch Lipid-Adjuvantien, wie Derivate von Muramyldipeptid in Lipidemulsionen oder unvollständiges Freund- Adjuvans.

Die prägenden (priming) und amplifizierenden Antigene werden vorzugsweise intramuskulär einem Wirt, wie einem Primaten, und insbesondere einem Menschen verabreicht. Es folgen typische Immunisierungszeitpläne, die für gp 160 und HIV-Peptide eingesetzt werden können.

Es versteht sich, daß diese Immunisierungszeitpläne lediglich repräsentativ sind und daß die Zeitpläne variiert werden können, um die optimale Antwort im Wirt zu erhalten. In ähnlicher Weise können die Mengen an prägenden (priming) und amplifizierenden Antigenen variiert werden. Beispielsweise können ungefähr 150 µg gp 160 in Syntex SAF-1-Adjuvans, wie angegeben, verabreicht werden, gefolgt von einer Verabreichung der Peptide in Mengen von typischerweise 100 µg jedes Peptids.

Schließlich können die relativen Anteile der beteiligten Peptide entsprechend den gewünschten endgültigen Anteilen jedes Peptids in der endgültigen Zubereitung variiert werden. Insbesondere werden diese Anteile als Funktion der Immunogenität jedes Peptids und der Anzahl funktionaler Gruppen, die jedes trägt und die in der Lage sind, in die Konjugationsreaktion mit komplementären fünktionalen Gruppen einzutreten, zumindest wenn diese Peptide an ein Trägermolekül gekoppelt sind, angepaßt.

Bei einer besonderen Anwendung der Erfindung wird die Injektion amplifizierender Peptide durch die Verabreichung von Partikeln, Virus oder Bakterien ersetzt, die Rekombinanten sind, die das Neutralisierungsepitop des betreffenden Virus auf ihrer Oberfläche und/oder während ihrer Vermehrung exprimieren und auf diese Weise in der Lage sind, neutralisierende Antikörper gegen dieses Retrovirus zu induzieren: HBC-Antigen-Partikel, HBS- Antigen-Partikel, Bakterien, die das Neutralisierungsepitop in Oberflächen- oder cytoplasmatischen Proteinen, wie beispielsweise dem lamB-Rezeptor, exprimieren, Picomavirus- Chimären, wie beispielsweise Poliovirus-HW-Chimären, Pockenvirus-Rekombinanten, Adenovirus-Rekombinanten oder Adenovirus-Chimären u.s.w. Abhängig von dem für die Präsentation des Neutralisierungsepitops ausgewählten Lebendvektor kann diese Verabreichung ausgeführt werden in Form von oral verabreichten Lebendimpfstoffen (beispielsweise von Chimären, gebildet aus Sabin-Poliovirusstämmen oder von humanen Adenoviren oder von attenuierten Stämmen von Salmonella, Shigella oder anderen Enterobakterien oder von jedem beliebigen Organismus, Virus, Hefe, Bakterien, die in der Lage sind, eine Immunantwort nach oraler Verabreichung zu induzieren) oder in Form von Lebendimpfstoffen, die über die parenterale Route (beispielsweise rekombinantes Pockenvirus) oder sogar in Form inaktivierter Impfstoffe über die parenterale Route (beispielsweise Chimären, gebildet aus dem Mahoney- Stamm von Poliovirus, oder inerte Partikel von HBsAg oder HBcAg) verabreicht werden.

In einer anderen besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Antigen (Hüllglycoprotein), das für Prägung (Priming) der Impfung injiziert wird, d.h. das Hüllglycoprotein des Virus, in Form von Partikeln, wie beispielsweise ISCOMs ("Immuno Stimulating COMplex", immunstimulierender Komplex, bestehend aus einer Assoziation eines antigenen Proteins mit einem Glycosid Quil A) oder Liposomen, präsentiert.

Das prägende (priming) Antigen und/oder das Peptid können auch mit lebenden rekombinanten Mikroorganismen, wie Viren oder Bakterien (beispielsweise dem Pockenvirus oder BCG: Bacillus Calmette-Guérin), oder jedem beliebigen Lebendimpfstoff, der modifiziert worden ist, um das Hüllglycoprotein oder das davon abgeleitete Peptid zu exprimieren, assoziiert sein.

Das Hüllglycoprotein und/oder das davon abgeleitete Peptid können auch durch inaktivierte Partikel, beispielsweise virale Partikel, wie beispielsweise das HIV-Virus oder einen Teil dieses Virus, oder Partikel ohne Genom präsentiert werden.

Von Haffar 0. et al. ist beschrieben worden, daß derartige Partikel ohne Genom Impfstoffe produzieren (Journal of Virology, Juni 1990, S.2653-2659).

Diese Teilchen können im Falle des HIV-Virus als HIV-ähnliche Teilchen bezeichnet werden: Zum Zwecke dieser Erfindung enthalten sie nicht das vollständige HIV-Genom, jedoch ermöglichen sie die Exposition der Viruskomponenten der Zusammensetzung der Erfindung an ihrer Oberfläche.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Hüllglycoprotein in einer Mischung mit anderen Antigenen kombiniert. Wenn beispielsweise das prägende (priming) Antigen das HIV-Hüllglycoprotein ist, können eines oder mehrere Antigene, wie gag-, nef-, vif-, pol-, GPG- oder GLG-Antigene, mit diesem kombiniert werden, da sie mit den Peptiden der Zusammensetzung kombiniert werden können.

Die Erfindung umfaßt auch die vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen, in denen das env-Glycoprotein durch ein Fragment desselben ersetzt oder mit einem Fragment desselben assoziiert ist. Dieses Fragment umfaßt vorteilhafterweise mehr als 50 Aminosäuren und ist dadurch gekennzeichnet, daß es die immunogenen Eigenschaften des Glycoproteines im Kontext der Erfindung aufweist.

Monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Glycoprotein und/oder Peptide der Zusammensetzung erkannten, können erhalten werden. Diese Antikörper können in einer Mischung assoziiert sein und beispielsweise für serotherapeutische Zwecke verwendet werden.

Monoklonale oder polyklonale Antikörper sind insbesondere nach Injektion einer Zusammensetzung der Erfindung in ein Tier erhältlich, wobei die Bestandteile der Zusammensetzung gleichzeitig, getrennt oder nacheinander dem Tier verabreicht werden und die erzeugten Antikörper neutralisierende Eigenschaften bezüglich der Infektion durch ein bestimmtes Virus aufweisen.

BEISPIEL 1: Immunisierung eines Schimpansen mit HIV-1 BRU und dem Glycoprotein dieses Isolats; Amplifikation der Antwort mit einem an KLH gekoppelten BRU env-Oligopeptid

Schimpanse 339 (FUNFACE) wurde zuerst mit drei Injektionen von 250 µg aufgereinigtem HIV 1 BRU-Virus, inaktiviert durch Behandlung mit 0,025 % Formalin für 48 h bei 30ºC und 0,025 % β-Propiolacton für 30 min bei 37ºC, in Kombination mit Syntex-Adjuvans, das 1 mg/ml Threonyl-MDP in einer Emulsion von 5 % Squalan und 2,5 % Pluronpolymer enthielt, in Zeitabständen von einem Monat immunisiert. Diesen Injektionen folgte eine erste Auffrischung nach 7 Monaten und eine zweite Auffrischung ein Jahr später.

Das Tier erhielt dann fünf Injektionen von BRU-Virus-Hüllglycoprotein (gp160), aufgereinigt aus Überstand von BHK-21-Zellkulturen, die infiziert worden waren mit einer Vaccinia-Virus-Rekombinante (Stamm Vvenv 1163), die ein Genom aufwies, für das Techniken genetischer Rekombination verwendet worden waren, um die Sequenzen von HIV-1 BRU zu insertieren, die gp 160env kodieren, das durch ortsgerichtete Oligonukleotid-Mutagenese modifiziert worden war, um die an der gp120/gp41-Spaltung beteiligten Sequenzen zu eliminieren, und aus dem die hydrophobe Transmembrandomäne deletiert war, wie von Kieny et al. in 1988 beschrieben (Prot. Engineering 2:219-226). Das aufgereinigte Protein wurde in einer Menge von 125-150 µg pro intramuskuläre Injektion in Gegenwart von Syntex-Adjuvans verwendet. Um das Glycoprotein herzustellen, wurde das Kulturmedium der mit VV- 1163 infizierten BHK-Zellen durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat, dann mit Trichloressigsäure aufkonzentriert, und das Glycoprotein dann durch drei aufeinanderfolgende Durchgänge von Affinitätschromatographie über Lentil-Lektin, Ionenaustausch über Kationenaustauscherharz und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) aufgereinigt. Das auf diese Weise erhaltene gp 160 ist zu 95% rein. Es wird durch monoklonale Antikörper, die für gp 160 von HIV-1 spezifisch sind, und insbesondere durch neutralisierende Antikörper 110-4, die für das Hauptneutralisierungsepitop des BRU-Isolats spezifisch sind, erkannt. Darüberhinaus zeigt es eine starke Affinität für den CD4-Rezeptor von T4-Lymphozyten.

Die Konzentration von in Reaktion auf Injektionen von inaktiviertem Virus induzierten Antikörpern (ELISA-Bestimmung: 1/200000 mit dem ELAVIA-Kit von Diagnostics Pasteur; neutralisierender Titer: 1/400 durch Messung der 50%-igen Inhibition der Bildung von Immunfluoreszenz-Foci; 1/64 durch Messung der 90%-igen Inhibition der Synzytienbildung in CEM-SS-Zellen) wurde durch die Injektion von gp 160 nicht nennenswert verändert.

Das Tier erhielt 300 µg einer Präparation von synthetischem Peptid mit der Sequenz Y N T R K S I R I Q R G P G R A F V T I G K I G N entsprechend dem neutralisierungsepitop des BRU-Isolats, wobei der Tyrosinrest (Y) an Hämocyanin (KLH) mittels Bis(diazobenzidin) gekoppelt wurde, in Kombination mit Syntex-Adjuvans. Die Injektion wurde drei Wochen später einmal wiederholt und dann ein zweites Mal in Woche 19.

Diese Injektionen führten zu keinerlei Zunahme der durch ELISA gemessenen Antikörper-Titer (Figur 1), aber sie führten, wie aus Tabelle 1 und Figur 2 ersichtlich, zu einer bedeutenden Zunahme der neutralisierenden Antikörper, wie gemessen durch drei verschiedene Antikörper-Titrationsverfahren.

TABELLE 1 Induktion neutralisierender Antikörper im Schimpansen FUNFACE (C-339)

A: 90%-ige Inhibition von Synzytien in MT4-Zellen

B: 90%-ige Inhibition von Synzytien in CEM-SS-Zellen

C: 75%-ige Inhibiton von Immunfluoreszenz in H9-Zellen

FUNFACE wurde dann in Woche 26 durch Verabreichung einer intravenösen Injektion von 1 ml einer 1:100-Verdünnung oder 100 TCID50 einer HIV-1-Stammkultur mit einem Titer von 10&sup4; TCID50/ml, die freudlicherweise von Larry Arthur (NCI, Frederick) bereitgestellt worden war, testinfiziert (Challenge). Diese Stammkultur 040 war an zwei Gelegenheiten im Schimpansen titriert worden, was es Arthur et al. ermöglichte, zu bestimmen, daß deren ID50 für Schimpansen 4 TCID50 betrug. Die Injektion von 40 TCID50 dieser Stammkultur in nicht immunisierte Schimpansen führte zum Auftreten von nachweisbarem Virus in den Lymphozyten des Tieres, beginnend zwei Wochen nach der Injektion; dem folgte eine anti- HIV-Serokonversion innerhalb von 4 Wochen, wie in den zwei Proben beobachtet und von Arthur et al. in 1989 veröffentlicht wurde (J. Virol.).

Der Schimpanse FUNFACE zeigte offenbar einen vollständigen Schutz gegen eine Infektion mit 100 TCID50 der Stammkultur 040, da bis zu sechs Monaten nach der Testinfizierungs (Challenge)-injektion kein Virus in seinen Lymphozyten nachgewiesen wurde (wie entweder durch Genamplifikation mit pol- und gag-Sonden oder durch Cokultivierung mit humanen Lymphozyten und Assay auf reverse Transkriptase in 100000 x g-Pellets, erhalten aus Kulturüberständen, gemessen) und nach sechs Monaten keine anti-HIV-Anamnese- Antwort, wie durch ELISA oder durch Westem-Blot gemessen (Tabelle 2), und kein durch Westem-Blot nachweisbarer anti-nef-Antikörper vorlag.

TABELLE 2 Schicksal von anti-gp 160- und anti-Haupt-BRU-Neutralisierungsepitop-Antikörpern nach Verabreichung einer Testinfizierungs (Challenge)-Injektion an FUNFACE; es sind ELISA-Titer zu dem jeweiligen Zeitpunkt angegeben.
Antigen Tag der + 1 Monat +2 Monate + 3 Monate +4 Monate

BEISPIEL 2: Immunisierung eines Schimpansen mit rekombinanten Antigenen env, gag, nef und vif von HIV-1; Amplifikation der Antwort durch ein an KLH gekoppeltes BRU env-Oligopeptid

Der Schimpanse 433 (ROBERT) wurde zuerst mit drei aufeinanderfolgenden Skarifikationen von 2 x 10&sup8; PFU eines rekombinanten Vaccinia-Virus (Vvenv 1139), das gp 160env von HIV- 1 BRU exprimiert, und dann durch die intravenöse Verabreichung seiner eigenen Lymphozyten, die vorab in vitro durch das rekombinante Virus Vvenv 1139 infiziert und in Formaldehyd fixiert worden waren, geprägt bzw. geprimt. Das Tier erhielt dann drei aufeinanderfolgende intramuskuläre Injektionen in Zeitabständen von je 1 Monat, dann drei Auffrischungsimpfüngen in den Wochen 33, 38 und 40 und eine letzte Auffrischungsimpfung in Woche 66, bestehend aus einer Mischung von je 125-150 µg der folgenden Antigene, kombiniert mit Syntex-Adjuvans: gp160env, aufgereinigt, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, und die Proteine p189gag, p27nef und p23vif die in E. coli exprimiert und wie in der französischen Patentanmeldung Nr.89.11044 vom 18. August 1989 (FR-A-2 650 954) beschrieben aufgereinigt worden sind. Schließlich erhielt ROBERT das gleiche BRU-Peptid, gekoppelt an KLH und kombiniert mit Syntex-Adjuvans, unter Einsatz desselben Inokulationszeitplans wie FUNFACE in dem vorangehenden Beispiel.

Injektionen des Peptid-KLH-Konjugats führten zu keinerlei Anstieg der Antikörperkonzentrationen, wie durch ELISA gemessen (Fig. 3), führten jedoch zu einem bedeutenden Anstieg an neutralisierenden Antikörpern, wie in Fig. 2 und in Tabelle 3 ersehen werden kann. Die neutralisierenden Antikörper wurden gleichfalls unter Einsatz dreier verschiedener Verfahren gemessen:

TABELLE 3 Induktion von neutralisierenden Antikörpern im Schimpanen ROBERT (C-433)

A: 90%-ige Inhibition von Synzytien in MT4-Zellen

B: 90%-ige Inhibition von Synzytien in CEM-SS-Zellen

C: 75%-ige Inhibition von Immunfluoreszenz in H9-Zellen

Robert wurde dann parallel zu FUNFACE durch die intravenöse Inokulation von 100 TCID50 derselben Stammkultur 040 von HIV-1-Virus vom NCI wie in dem vorangegangenen Beispiel testinfiziert (Challenge). Auch hier scheint ein vollständiger Schutz gegen eine Infektion erhalten worden zu sein, wie aus der Abwesenheit von Virus in den Lymphozyten des Tieres und dem Negativergebnis der PCR sechs Monate nach der Testinfizierung und aufgrund des Fehlens von anti-p25gag- und anti-p27nef-Antikörpem wie auch aufgrund des Fehlens einer ananmetischen anti-HIV-Antwort, wie durch ELISA oder durch Western-B lot sechs Monate nach der Testinfizierung gemessen, geurteilt wurde. Die Tabelle 4 zeigt das gleiche Fehlen eines anamnetischen Efekts hinsichtlich des anti-gp160- und anti-BRU- Neutralisierungsepitops.

TABELLE 4 Schicksal von anti-gp 160- und anti-Haupt-BRU-Neutralisierungsepitop-Antikörpern nach Verabreichung einer testinfizierenden (Challenge) Injektion an ROBERT; es sind ELISA-Titer zu dem jeweiligen Zeitpunkt angegeben.
BEISPIEL 3: Immunisierung eines Schimpansen mit gp 160env und p18gag der HIV- 1 - Antigene; Amplifikation durch nicht an ein Trägermolekül gekoppelte HIV-env-Peptide.

Drei Schimpansen wurden in diesem Experiment eingesetzt: die Schimpansen JOJOTOO (499), IRA (151) und HENRY II (531).

Der erste, JOJOTOO, erhielt drei Injektionen in Zeitabständen von je einem Monat von 120-150 µg gp160env und p18gag, aufgereinigt wie vorstehend beschrieben und mit Syntex-Adjuvans gemischt. Dieser ersten Serie von Injektionen folgten drei Auffrischimpfungen mit demselben Antigen, die in den Wochen 33, 38 und 40 erfolgten, und eine letzte Auffrischimpfüng im Monat 14. Diese Injektionen führten zum Auftreten einer hohen Antikörperkonzentration, die durch Western-Blot und durch ELISA nachweisbar war und unmittelbar nach den ersten drei Injektionen begann, obwohl die Konzentration an neutralisierenden Antikörpern relativ niedrig war, wie nachfolgend beschrieben.

Der zweite Schimpanse, IRA, wurde mit je 108 PFU der vier rekombinanten Vaccinia- Virus-Stammkulturen, die gp160env, p55gag, p27nef bzw. p23vif von HIV-1 BRU exprimieren, immunisiert. Diese Inokulationen, die über die intradermale Route erfolgten, führten nicht zu dem Auftreten von irgendwelchen neutralisierenden Antikörpern, aber es war eine kaum signifikante Antikörperkonzentration (≤ 1:200) durch Westem-Blot oder durch ELISA nachweisbar. Der Schimpanse IRA wurde dann für zwei Jahre in Ruhe gelassen.

Der vierte Schimpanse, HENRY II, hatte keinerlei Kontakt mit HIV- oder SIV- Antigenen vor dem Tag des Experiments.

An diesem Tag erhielten die drei vorstehend beschriebenen Tiere intramuskulär Injektionen eines Cocktails, der zusammengesetzt war aus 21 synthetischen Peptiden entsprechend den 21 Sequenzen des Haupt-Neutralisierungsepitops (Loop V3) von HIV-1, die in Myers et al. (1989) veröffentlicht worden waren, in der Menge von 50 µg pro Peptid in Gegenwart von Syntex-Adjuvans. Jedes der Peptide hatte einen Gysteinrest an der N-terminalen Position und einen anderen an der C-terminalen Position und repräsentierte dementsprechend den vollständigen V3-Loop eines gegebenen Isolats (Aminosäuren 296-331 des BRU-Isolats und entsprechende Aminosäuren gemäß der Ausrichtung (Alignment) von Myers et al. (1989)). Die Tiere erhielten erneute Injektionen der gleichen Mischung 1 bzw. 2 Monate nach der ersten Injektion. Dieser Immunisierung mit der Peptid-Mischung (1,05 mg pro Injektion) folgte bei JOJOTOO eine signifikante anamnetische Reaktion, die gegen gp 160 des BRU-Isolats und gegen dessen Haupt-Neutralisierungsepitop gerichtet war, wie durch ELISA und unter Verwendung von aufgereinigtem gp 160 BRU oder BRU-Peptid als Antigen gemessen wurde (Tabellen 5 und 6).

TABELLE 5 Induktion von anti-gp 160 BRU-Antikörpem in Reaktion auf die Injektion eines Cocktails freier Peptide entsprechend 21 Sequenzen des HIV-1-Neutralisierungsepitops (ELISA-Titer: anti-gp 160 BRU)

NB: nicht bestimmt

TABELLE 6 Induktion von anti-BRU-Neutralisierungsepitop-Antikörpem in Reaktion auf die Injektion eines 21 Peptide enthaltenden Cocktails (ELISA-anti-BRU-Titer)

NB: nicht bestimmt

Die Titer, die bei IRA erhalten wurden, blieben sehr niedrig und sie waren bei HENRY II vollständig negativ. Diese Ergebnisse zeigen klar den Prägungseffekt (Priming- Effekt) auf die Immunantwort, der aus der Vorimmunisierung mit gp 160 resultiert.

Der Anstieg der anti-Peptid- und anti-gp160-Titer bei JOJOTOO war jedoch nicht von einem bedeutenden Anstieg des anti-HIV-ELISA-Titers begleitet, wie festgestellt werden kann (Tabelle 7), indem ein kommerziell vertriebener diagnostischer Kit (ELAVIA Diagnostics Pasteur) verwendet wird.

TABELLE 7 anti-HIV-Antikörper-Konzentration, gemessen durch ELAVIA

Im Gegensatz dazu folgte den Injektionen der Mischung synthetischer Peptide, die Neutralisierungsepitopen der 21 Isolate von HIV-1 entsprachen, ein sehr deutlicher Anstieg der Konzentration von Antikörpern, die das BRU-Isolat neutralisierten, wie in Tabelle 8 und in Figur 4 gezeigt. Es ist bemerkenswert, daß dieser Anstieg nur bei JOJOTOO, aber weder bei IRA noch bei HENRY II festgestellt wurde, was die Spezifität des Prägungseffekts (Priming-Effekts) einer Vorimmunisierung mit gp160 zeigt (Figur 4).

Die neutralisierende Antikörperantwort von JOJOTOO ist darüberhinaus spezifisch für das BRU-Isolat, wie in Fig. 5 ersehen werden kann: sein Serum neutralisiert nicht das SF2- Isolat (ARV-2), sondern neutralisiert nur das BRU-Isolat (HTLV-3=LAV1).

TABELLE 9 Konzentration neutralisierender Antikörper, die durch drei Injektionen einer Mischung von Peptiden, die den 21 bekannten Sequenzen des Haupt-Neutralisierungsepitops von HIV-1 entsprechen, induziert werden: zu 75% neutralisierende Titer, gemessen an CEM-T4-Zellen (Verfahren C in Tabelle 1)

Experimentelle Nachsorge-Ergebnisse

Der stringenteste Test für die Wirksamkeit experimenteller Impfstoffe gegen das humane Immundefektvirus vom Typ 1 (HIV-1) ist ein Schutz von Schimpansen vor einer Infektion nach einer Testinfizierung (Challenge) mit lebendem Virus. In der hier berichteten Studie wurden anhaltend hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern bei drei Schimpansen nach aufeinanderfolgenden Injektionen von verschiedenen HIV-1BRU-Antigen-Präparationen, die inaktiviertes Ganz-Virus oder aufgereinigte rekombinante Proteine enthielten, gefolgt von synthetischen Peptiden, die mit dem HIV-1-Haupt-Neutralisierungsepitop, V3, identisch waren, hervorgerufen. Die Tiere wurden intravenös mit 40 für Schimpansen infektiösen Dosen (entsprechend 100 für 50% von Gewebekulturen infektiösen Dosen, "TCID") einer Stammkultur von HIV-1RTLV-IIIB testinfiziert. Nach 6 Monaten Nachsorge erwiesen sich alle drei Tiere anhand serologischer und virologischer Kriterien, einschließlich PCR-Analyse und Fehlschlagen, Virus aus Lymphozyten aus peripherem Blut, Knochenmark und Lymphknotengewebe zu isolieren, als nicht infiziert. Von zwei Schimpansen, die 1 Jahr lang überwacht wurden, wurde Virus zum ersten Mal aus einem Tier in Woche 32 isoliert, aber der zweite Schimpanse war Virus-negativ bei sämtlichen Assays über 12 Monate hinweg. Das dritte Tier blieb Virus-negativ über 7 Monate Nachsorge und auch über 12 Monate Nachsorge hinweg.

Diese Ergebnisse zeigen an, daß es möglich ist, einen Schutz gegen eine HIV-1-Infektion durch Immunisierung zu bewirken oder eine HIV-1-Infektion durch Immunisierung bedeutend zu verzögern, was dementsprechend das Fundament für eine Entwicklung eines HIV-1- Impfstoffs bereitet.

Materialien und Methoden

Tiere: Die in dieser Studie eingesetzten Tiere waren mannliche erwachsene Schimpansen, die früher her in Hepatitis A-, B- und Nicht-A- und Nicht-B-Experimenten eingesetzt worden waren. Die Schimpansen wurden bei LEMSIP, New York University Medical Center, in Einrichtungen der biologischen Sicherheitsstufe 3 gehalten. Sämtliche experimentellen Verfahren erfolgten gemäß den Anstaltsrichtlinien zur Kontrollierung von Infektionskrankheiten, für den Schutz von Menschen und zum Halten von Primaten (Moor-Jankowski, J. & Mahoney, C.3. (1989), J Med. Primatol. 18, 1-26).

Immunogene: Über Sucrose-Gradienten aufgereinigtes Ganz-HIV wurde durch Inkubation mit 0,025% β-Propiolacton, gefolgt von 0,025% Formalin inaktiviert, und es wurde gezeigt, daß es kein infektiöses Virus enthielt, durch Fehlschlagen, Virus aus mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC) von immunisierten Schimpansen zu isolieren (Girard, M., Kieny, M.P., Gluckman, J.C., Barre-Sinoussi, F., Montagnier, L. & Fultz, P. (1990) in: Vaccines for Sexually Transmitted Diseases, Hrsg.: Meheus, A. & Spier, R. (Butterworth Co., Ltd., London), S.227-237). Rekombinantes gp160env wurde aus dem Kulturmedium von BHK21-Zellen isoliert, die infiziert worden waren mit VV-1163, einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das das gp160env-Gen exprimiert, das durch ortsgerichtete Mutagenese modifiziert worden ist, um die gp120/41-Spaltstelle zu zerstören und die Anker-Domäne von gp41 zu entfernen (Kieny, M.P., Lathe, R., Riviere, Y., Dott, K., Schmitt, D., Girard, M., Montagnier, L. & Lecocq, J.P. (1988), Prot. Engineering 2, 219-226); und Schmidt, D., Dezutter- Dambuyant, C., Hanau, D., Schmitt, D.A., Kolbe, H.V.J., Kieny, M.P., Cazenave, J.P. & Thivolet, J. (1989) Comptes Rendus Acad. Sci. Paris, 308(111), 269-275). Wo angegeben, wurde das Antigen mit rekombinanten p18gag-, p27nef-und p23vzf-Antigenen gemischt, die aus E. coli pTG2153, pTG1166 bzw. pTG1149, wie beschrieben, aufgereinigt worden waren (Guy, B., Riviere, Y., Dott, K., Regnault, A. & Kieny, M.P. (1990), Virology 176, 413-425; und Kolbe, H.V., Jaeger, F., Lepage, P., Roitsch, C., Lacaud, G., Kieny, M.P., Sabatie, J., Brown, S.W. & Lecocq, J.P. (1989), J Chromatography 476, 99-112). Vor jeder Immunisierung wurden inaktiviertes Ganz-HIV (250 µg virales Protein) oder die aufgereinigten rekombinanten Proteine (je 125-150 µg pro Dosis) mit dem Adjuvans SAF-1 (Allison, A.C. & Byars, N.E.

(1986), J Immunol. Methods 95, 157-168) gemischt und 2 ml der Mischung intramuskulär (i.m.) injiziert.

Ein Aliquot (19,8 mg) eines 25-Aminosäuren-Peptids mit der Sequenz Y- NTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGN (Putney, S.D., Matthews, T. J., Robey, W.G., Lynn, D.L., Robert-Guroff, M., Mueller, W.T., Langlois, A.L., Ghrayeb, 3., Petteway, S.R., Weinhold, K.J., Fischinger, P.J., Wong-Staal, F., Gallo, R.C. & Bolognesi, D.P. (1986), Science 234, 1392-1395; Rusche, J.R., Kavaherian, K., McDanal, C., Petro, 3., Lynn, D.L., Grimaila, R., Langlois, A., Gallo, R.C., Arthur, L.O., Fischinger, P.J., Bolognesi, D.P., Putney, S.D. & Matthews, T.J. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3198-3202; und Larosa, G.J., Davide, J.P., Weinhold, K., Waterbury, J.A., Profy, A.T., Lewis, J.A., Langlois, A.J., A.J., Dressman, G.R., Boswell, R.N., Shadduck, P., Holley, L.H., Karplus, M., Bolognesi, D.P., Matthews, T.J., Emini, E.A. & Putney, S.D. (1990), Science 249, 932-935) wurde zuerst mit Citraconsäure behandelt und wurde dann an 19,3 mg Hämocyanin aus der Schlüsselloch- Napfschnecke (KLH) durch N-terminale Tyrosyl-Verknüpfung unter Verwendung von Bisdiazobenzidin (pH 9,0) gekoppelt. Nachdem die Blockierung an den Aminogruppen entfernt worden war, wurde das Peptid-KLH-Konjugat 24 h gegen PBS dialysiert, um überschüssiges freies Peptid zu entfernen. Nach Formulierung mit SAF-1 erfolgten Immunisierungen mit dem V3-Peptid-KLH-Konjugat (300 µg Peptid pro Dosis) über die i.m.-Route.

Virus für die Testinfizierung (Challenge): Das Inokulum für die Testinfizierung (Challenge) stammte aus einer Stammkultur des HIV-1-Stamms HTLV-IIIB (erhalten von L. Arthur), die in Schimpansen titriert und bei anderen HIV-Impfstoff-Testinfizierungsstudien verwendet worden war (Arthur, L.O., Bess, J.W., Waters, D.J., Pyle, S.W., Kelliher, J.C., Nara, P.L., Krohn, K., Robey, W.G., Langlois, A.J., Gallo, R.C. & Fischinger, P.J. (1989), J Virol. 63, 5046-5053; und Berman, P.W., Gregory, T.J., Riddle, L., Nakamura, G.R., Champe, M.A., Porter, J.P., Wurm, F.M., Hershberg, R.D., Cobb, E.K. & Eichberg, J.W. (1990), Nature (London) 345, 622-625). Es wird angenommen, daß der Infektiositätstiter dieser HIV-1- Stammkultur 10&sup4; TCID&sub5;&sub0; pro ml und 4 x 10³ infektiöse Einheiten pro ml für Schimpansen ist. Die Schimpansen wurden i.v. mit 1 ml einer 1:100-Verdünnung testinfiziert. Aliquots derselben 1:100-Verdünnungen wurden als Vierfach-Proben durch zweifache Reihenverdünnung und Infektion von 1 x 10&sup5; H9-Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen titriert. Nach einer Inkubation für 6 Tage wurde die Infektion durch einen Immunfluoreszenz-Assay bewertet. Anhand dieses Verfahrens hatte das Testinfizierungs-Inokulum einen Titer von mehr als 64 immunfluoreszierende Foci-bildenden Einheiten (Endpunkt wurde nicht erreicht) für das erste Aliquot und von 170 für das zweite.

Neutralisierungsassay: Die Neutralisierungsaktivität in Serumproben von immunisierten Schimpansen wurde durch Inhibition der Synzytienbildung in CEM-SS-Zellen, wie beschrieben (Nara, P.L., Hatch, W.C., Dunlop, N.M., Robey, W.G., Arthur, L.O., Gonda, M.A. & Fischinger, P.J. (1987), AIDS Res. Human Retroviruses 3, 283-302) oder durch Inhibition von immunfluoreszierenden Foci in H9-Zellen bestimmt.

Virusisolierung: PBMC oder Knochenmarkszellen (erhalten als Punktate) von immunisierten und testinfizierten Schimpansen wurden mit normalen humanen PBMC kultiviert, wie beschrieben (Fultz, P.N., McClure, H.M., Swenson, R.B., McGrath, C.R., Brodie, A., Getchell, J.P., Jensen, F.C., Anderson, D.C., Broderson, J.R. & Francis, D.P. (1986), J. Virol., 58, 116-124). Bei einigen Experimenten wurden CD&spplus;4-angereicherte Lymphozyten aus Schimpansen-PBMC gewonnen durch Abtrennung mittels magnetischer Kömchen, an die für das CDB-Zelloberflächenantigen spezifische monokionale Antikörper angeheftet waren (Dynabeads, Robbins Scientific). Die CD&spplus;4-angereicherten Zellen wurden zwei Tage mit Concanavalin A (10 µg/ml) stimuliert, bevor sie allein kultiviert oder mit mit Phytohaemagglutinin (PHA) stimulierten normalen humanen PBMC in RPMI- 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, Glutamin, Gentamycin und rekombinantem Interleukin-2 (8 Einheiten/ml; Boehringer Mannheim) cokultiviert wurden. Durch Biopsien erhaltenes Lymphknotengewebe wurde mit Scheren zerhackt und mit humanen PBMC kultiviert. Alle Kulturen wurden weiterkultiviert und hinsichtlich reverse Transkriptase-Aktivität 6 Wochen lang überwacht, bevor sie verworfen wurden.

Polymerasekettenreaktion (PCR). Sowohl Einzel- (single round) als auch Doppelrunden (double round; nested)-PCR wurden periodisch mit PBMC oder Lymphknotenzellen aus testinfizierten Schimpansen ausgeführt. Einzeirunden (single round)-PCR erfolgte wie beschrieben (Laure, F., Rouzioux, C., Veber, F., Jacomet, C., Courgnaud, V., Blanche, S., Burgard, M. Griscelli, C. & Brechot, C. (1988), Lancet 2, 538-541). Kurz gesagt, wurden 2 µg DNA mit 2 Einheiten Taq-1-DNA-Polymerase für 40 Zyklen bei 94ºC, 55ºC und 72ºC (je 1 min) verwendet. Zwei Primerpaare wurden verwendet: eines entsprach den Nukleotiden 2393-2417 und 2675-2700, die von dem pol-Gen kodiert werden, und das andere entsprach den Nukleotiden 5367-5385 und 5694-5711, die von dem tat-Gen kodiert werden. Um die Spezifität der PCR zu zeigen, wurden amplifizierte DNA-Fragmente mit [³²P]-markierten internen pol- und tat-Gensonden hybridisiert. Die Positivkontrolle bestand aus DNA aus der 8E5- Zellinie, die persistierend mit LAV-1 infiziert ist. Für nested-PCR waren die Primer für die erste PCR-Runde, die wie beschrieben ausgeführt wurde (Mullis, K.B. & Faloona, F.A. (1987), Methods Enzymol. 155, 335-350),:

5'-GCTTCTAGATAATACAGTAGCAACCCTCTATTG-3',

entsprechend einer 3-Basen-Klammersequenz, einer Xba1-Restriktionsschnittstelle und den Nukleotiden 1025-1048 des HXB2-Genoms, und:

5'-GTCGGCCTTAAAGGCCCTGGGGCTTGTTCCATCTATC-3',

entsprechend einer 3-Basen-Klammersequenz, einer Not1-Restriktionsschnittstelle und den Nukleotiden 5573-5553 des HXB2-Genoms. Nach der ersten Runde wurden 2,5 µl des Produkts mit den Primem SK145 und SK150 (Kwok, S. & Kellogg, D.E. (1990) in: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications: Hrsg.: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White, T.J. (Academic Press, Inc., San Diego, CA), S.337-347) über einen Bereich der Nukleotide 1366 bis 1507 des HXB2-Genoms erneut amplifiziert. Immunisierungspläne (Tabelle 9) TABELLE 9: Immunisierungspläne von Schimpansen mit verschiedenen HIV-1-Antigenen

Für C-433 und C-339 wurden Immunisierungs- und Virus-Testimpfungszeiten von dem Zeitpunkt an berechnet, an dem C-433 seine erste Immunisierung mit VV-1139 erhielt, welcher als Woche 0 angesehen wird. Schimpanse C-433 wurde zuerst mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, VV-1139, immunisiert, das eine nicht-spaltbare Version des gp160env-Antigens von HIV-1BRU exprimiert (Kieny, M.P., Lathe, R., Riviere, Y., Dott, K., Schmitt, D., Girard, M., Montagnier, L. & Lecocq, J.P. (1988), Prot. Engineering 2, 219-226). VV-1139 wurde in den Wochen 0,8 und 21 durch Skarifikation am oberen Rücken mit einer zweizinkigen Nadel (2 x 10&sup8; PFU pro Inokulum) verabreicht. In der Woche 27 wurden PBMC von C-433 mit PHA stimuliert, in IL-2 enthaltendem Medium kultiviert und dann mit VV- 1139 bei einer Infektionsmultiplizität von 7 infiziert. Nach einer Kultur für zusätzliche 16 h wurden die PBMC mit 0,8% p-Formaldehyd fixiert und C-433 durch die i.v.-Route wieder injiziert (Zagury, D., Bernard, J., Cheynier, R., Desportes, I., Leonard, R., Fouchard, M., Reveil, B., Ittele, F.D., Lurhama, Z., Mbayo, K., Wane, J., Salaun, J.J., Goussard, B., Dechazal, L., Burny, A., Nara, P. & Gallo, R.C. (1988), Nature (London) 322, 728-731). In den Wochen 48, 54, 58, 81, 86, 88, 114 und 124 wurde C-433 i.m. mit Mischungen von aufgereinigten gp160env, p18gag, p27nef und p23vif (je 125-250 µg pro Dosis), formuliert mit SAF-1, inokuliert.

Schimpanse C-339 wurde zuerst in Woche 33 durch eine intramuskuläre Injektion von inaktiviertem HIV (125 µg virales Protein), gemischt mit SAF-1 (1 mg Threonylmuramyldipeptid), immunisiert, gefolgt von Auffrisch-Inokulationen in den Wochen 37, 41, 62 und 124. C-339 wurde dann nur mit aufgereinigtem gp160env (125 µg pro Dosis) in den Wochen 66, 74, 81, 85 und 87 inokuliert. Das V3-Peptid (300 µg Peptid pro Dosis) wurde i.m. in den Wochen 105, 108 und 126 verabreicht.

C-339 und C-433 wurden in Woche 131 mit 100 TCID&sub5;&sub0; von HIV-1HTLV-IIIB testinfiziert (Challenge). C-449 wurde i.m. mit einer Mischung von gp160env, p18gag und SAF-1 in den Wochen 0, 6, 10, 33, 38, 66 und 76 inokuliert. (Anmerkung: Woche 0 für C-499 entspricht Woche 48 für C-433 und C-339). Eine Mischung von 21 freien V3-Peptiden (100 µg pro Dosis) wurde i.m. mit SAF-1 in den Wochen 79, 83, 87 und 102 verabreicht. C-499 und C-087, eine unbehandelte Kontrolle, wurden in Woche 106 mit 100 TCID&sub5;&sub0; von HIVHTLV-IIIB testinfiziert (Challenge).

Ergebnisse

Eine Immunisierung des Schimpansen C-339 mit Formalin- und β-Propiolactoninaktiviertem Ganz-HIV, gemischt mit dem Adjuvans SAF-1, führte zu hohen Titern an Antikörpern gegen gag- und env-kodierte Proteine, wie durch Enzymimmunoassay (EIA) gemessen, einer geringen neutralisierenden Antikörperantwort und keiner nachweisbaren zelivermittelten Immunantwort. Im Bestreben, Immunantworten zu verstärken, wurde C-339 mit aufgereinigtem rekombinantem gp160env immunisiert. Nach einer intradermalen Inokulation von gp160env mit BCG in mehrere Stellen des Thorax erhielt C-339 vier aufeinanderfolgende intramuskuläre Injektionen des gleichen Antigens, formuliert mit SAF-1. Die Gesamt-EIA- Antikörper- und neutralisierenden Antikörper-Titer wurden periodisch bestimmt, jedoch blieben beide während des Verlaufs der Immunisierung unverändert und nahmen rasch ab, nachdem die Injektionen nicht mehr fortgesetzt wurden (Figur 6A).

Bei HIV-infizierten Individuen ist die Hauptmenge der HIV-neutralisierenden Antikörper gegen die dritte hypervariable Region des äußeren Hüllglycoproteins, die als V3-Loop bezeichnet wird (Putney, S.D., Matthews, T.J., Robey, W.G., Lynn, D.L., Robert-Guroff, M., Mueller, W.T., Langlois, A.L., Ghrayeb, J., Petteway, S.R., Weinhold, K.J., Fischinger, P.J., Wong-Staal, F., Gallo, R.C. & Bolognesi, D.P. (1986), Science 234, 1392-1395; Rusche, J.R., Kavaherian, K., McDanal, C., Petro, 3., Lynn, D.L., Grimaila, R., Langlois, A., Gallo, R.C., Arthur, L.O., Fischinger, P.J., Bolognesi, D.P., Putney, S.D. & Matthews, T.J. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3198-3202; und Larosa, G.J., Davide, J.P., Weinhold, K., Waterbury, J.A., Profy, A.T., Lewis, J.A., Langlois, A.J., A.J., Dressman, G.R., Boswell, R.N., Shadduck, P., Holley, L.H., Karplus, M., Bolognesi, D.P., Matthews, T.J., Emini, E.A. & Putney, S.D. (1990), Science 249, 932-935), gerichtet. Antikörper gegen Epitope innerhalb des Loops setzen die Virusinfektiosität außer Kraft, wahrscheinlich indem die Fusion der viralen Hülle mit der Zielzellmembran verhindert wird. Neutralisierende Antikörper gegen V3- Epitope können tatsächlich bis zu 40 bis 60 Minuten, nachdem Virus an die Zelle bindet, zugesetzt werden und immer noch eine Infektion verhindern (Nara, P.L., (1989) in: Vaccines 89, Hrsg.: Lerner, R.A., Ginsberg, H., Chanock, R.M. & Brown, F. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), S. 137-144). Dementsprechend wurde C-339 ein Oligopeptid von 25 Aminosäuren, das die V3-Sequenz von HIV-1BRU(IIIB) aufwies, vernetzt mit KLH und formuliert mit SAF-1, injiziert, um zu bestimmen, ob eine Immunisierung mit dem V3-Loop Titer von neutralisierenden Antikörpern erhöhen würde. Es wurde keine Veränderung des EIA-Titers beobachtet (Figur 6A), aber es wurde eine bedeutende Erhöhung der Titer an neutralisierenden Antikörpern, die mehrere Monate aufrechterhalten wurden, nach der zweiten Immunisierung in Woche 108 erhalten (Figur 7A).

Ein anderer Schimpanse, C-433, der durch eine Impfung mit VV-1139 (Kieny, M.P., Lathe, R., Riviere, Y., Dott, K., Schmitt, D., Girard, M., Montagnier, L. & Lecocq, J.P. (1988), Protein Engineering 2, 219-226) geprägt bzw. geprimt worden war, wurde wiederholt mit je 125-250 µg von rekombinanten löslichen gp160env, p18gag, p27nef und p23vzf immunisiert (Tabelle 1). Die durch diese Behandlungen induzierte anti-HIV-Antikörperantwort war eindeutig transient, wobei die Titer nach jeder Auffrischinjektion scharf anstiegen und dann rasch abnahmen (Figur 6B). Die neutralisierende Antikörper- und EIA-Titer von C-433 schwankten parallel dazu. Schließlich wurde C-433 das gleiche V3-Peptid-KLH-Konjugat wie C-339 entsprechend demselben Immunisierungsprotokoll injiziert. Nach der zweiten Injektion des V3-Peptid-Konjugats stiegen die Titer an neutralisierenden Antikörpern signifikant an und blieben danach hoch (Figur 7A); eine dritte Immunisierung 4 Monate später (Woche 126) bewirkte keine Veränderung der Titer.

Zu dem Zeitpunkt, zu dem C-433 zum ersten Mal die aufgereinigten rekombinanten Proteine erhielt (Woche 48), erhielt ein dritter Schimpanse, C-499, eine intramuskuläre Injektion von aufgereinigten gp160env und p18gag, formuliert mit SAF-1.C-499 erhielt sechs Auffrischinokulationen mit den gleichen Antigenen, gefolgt von einer Serie von vier Injektionen einer Mischung von 21 freien (nicht konjugierten) V3-Peptiden (Myers, G. (1990) in: Human Retroviruses and AIDS, Hrsg.: Myers, G., Josephs, S.F., Wong-Staal, F., Rabson, A.B., Smith, T.F. & Berzofsky, J.A. (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) in SAF-1. Wie bei C-339 und C-433 nahmen die EIA-Titer von C-499 rasch nach der Immunisierung mit den aufgereinigten HIV-Antigenen ab und es gab keine nachweisbare Wirkung der V3-Peptide auf den EIA-Titer. Es trat jedoch ein signifikanter Anstieg der Titer an neutralisierenden Antikörpern (auf > 2000) nach den V3-Peptid-Inokulationen auf (Figur 7B).

Testinfizierung (Challenge) mit infektiösem HIV: Da anhaltende neutralisierende Antikörpertiter erhalten wurden, wurden die Schimpansen C-433, C-339 und C-499 durch i.v. Inokulation von 100 TCID50 (40 infektiösen Dosen bei Schimpansen) von HIV-1 testinfiziert. Zum Zeitpunkt der Testinfizierung betrugen die 50%-igen Neutralisierungstiter anhand eines Immunfluoreszenzinhibitionsassays 1:2000, 1:280-350 bzw. 1:2000 und betrugen 90%-ige Neutralisierungstiter anhand eines Synzytieninhibitionsassays (Nara, P.L., Hatch, W.C., Dunlop, N.M., Robey, W.G., Arthur, L.O., Gonda, M.A. & Fischinger, P.J. (1987),AIDS Res. Human Retroviruses 3, 283-302 )1:512-1024, 1:128 bzw. 1:1024 für die Schimpansen C-433, C-399 bzw. C-499. Da die Immunisierung von C-499 zu einem unterschiedlichen Zeitpunkt gegenüber den anderen zwei Tieren initiiert wurde, fand die Testinfizierung von C-499 sechs Monate nach jenen von C-399 und C-433 statt, erfolgte jedoch zu dem gleichen Zeitpunkt wie jene eines unbehandelten Kontrolltieres, C-087. Virus wurde aus PBMC von C-087 zwei Wochen nach der Inokulation (PI) wie auch zu allen nachfolgenden Zeitpunkten isoliert, was zeigte, daß eine 1:100-Verdünnung der HIV-1-Stammkultur Schimpansen unter unseren Bedingungen leicht infizierte.

Versuche, HIV aus immunisierten und testinfizierten Schimpansen zu isolieren: Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Testinfizierung mit HIV-1 wurden drei Verfahren eingesetzt, um den Infektionsstatus der immunisierten Tiere zu bewerten. Zuerst wurden periodisch Versuche unternommen, HIV-Sequenzen in lymphoiden Zellen durch PCR nachzuweisen (Laure, F., Rouzioux, C., Veber, F., Jacomet, C., Courgnaud, V., Blanche, S., Burgard, M., Griscelli, C. & Brechot, C. (1988), Lancet 2, 538-541; Mullis, K.B. & Faloona, F.A. (1987), Methods Enzymol. 155, 335-350; und Kwok, S. & Kellogg, D.E. (1990) in: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications: Hrsg.: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White, T.J. (Academic Press, Inc., San Diego, CA), S.337-347). Es wurden aus PBMC der drei Schimpansen in Woche 3 und 3 und 6 Monate nach der Testinfizierung gewonnene DNA-Proben untersucht. Banden mit der erwarteten Mobilität bei der Elektrophorese wurden in DNA aus einem HIV-infizierten Kontrollschimpansen, aber nicht in PBMC aus den geimpften und test-infizierten Tieren oder aus einem unbehandelten Kontrolltier nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). 6 Monate nach der Testinfizierung wurden verschachtelte oder "nested"- Primersätze verwendet, um eine PCR-Analyse an DNA sowohl aus PBMC als auch Lympliknotengewebe der testinfizierten Schimpansen und Kontrolischimpansen auszuführen (Mullis, K.B. & Faloona, F.A. (1987) Methods Enzymol. 155, 335-350). Diese Technik ist empfindlicher als Standard-PCR, und bei diesen Experimenten (die mindestens siebenmal an sämtlichen Proben wiederholt wurden) wurde festgestellt, daß ungefähr ein Molekül viraler DNA ein starkes Signal erzeugte, wenn es in 1,5 x 10&sup5; Zelläquivalenten von DNA vorhanden war. Alle PBMC- und Lymphknotenproben waren konsistent negativ mit Ausnahme von jenen von einem früher infizierten Schimpansen, die stets positiv waren (Figur 8). Dementsprechend war 6 Monate nach der Testinfizierung keine virale DNA in PBMC und Lymphknotengeweben mit einer Häufigkeit von mehr als einer Kopie pro 10&sup6; Zellen vorhanden.

Zweitens wurden in den Wochen 2, 4, 6 und 8 und in monatlichen Zeitabständen danach Versuche unternommen, Virus aus PBMC durch Cokultivierung von PBMC der Schimpansen mit von normalen Menschen gewonnenen Lymphozyten zu isolieren (Fultz, P.N., McClure, H.M., Swenson, R.B., McGrath, C.R., Brodie, A., Getchell, J.P., Jensen, F.C., Anderson, D.C., Broderson, J.R. & Francis, D.P. (1986), J. Virol., 58, 116-124). Da gezeigt worden ist, daß CD8&spplus;-Zellen eine Virusreplikation nicht nur bei HIV-infizierten Menschen (Walker, C.M., Moody, D.J., Stites, D.P. & Levy, J.A. (1986), Science 234, 1563-1566; und Tsubota, H., Lord, C.I., Watkins, D.I., Morimoto, C. & Letvin, N.L. (1989), J Exp. Med. 169, 1421-1434) und Schimpansen (P.N.F., unveröffentlichte Daten), sondern auch bei SIV- infizierten Makaken (Tsubota, H., Lord, C.I., Watkins, D.I., Morimoto, C. & Letvin, N.L. (1989), J Exp. Med. 169, 1421-1434) supprimieren, wurden bei einigen Experimenten Schimpansen-PBMC hinsichtlich CD8&spplus;-Lymphozyten verarmt, bevor die Kulturen angesetzt wurden. Im Gegensatz zur Virusausbeute aus dem Kontrolltier, C-087, wurde Virus weder aus Gesamt-PBMC noch aus CD4&spplus;-angereicherten Zellen von C-339, C-433 oder C-499 zu jedem Zeitpunkt während der ersten sechs Monate der Nachsorge gewonnen. Im 6. Monat PI wurden inguinale Lymphknotenbiopsien bei sämtlichen Tieren wie auch bei nicht infizierten und HIV-infizierten Kontrollschimpansen vorgenommen. Nach einer Cokultivierung mit normalen humanen PBMC wurde Virus aus dem Lymphknoten der infizierten Kontrolle, aber nicht aus jenen der immunisierten und testinfizierten Schimpansen gewonnen (Daten nicht gezeigt). Trotz der Tatsache, daß alle Versuche, Virus während der ersten sechs Monate nach der Testinfizierung zu isolieren, fehlgeschlagen waren, wurde Virus aus C-433 durch Cokultivierung von PBMC, die in Woche 32 und danach erhalten worden waren, und von Knochenmark, das 37 Wochen nach der Testinfizierung erhalten worden war, isoliert.

Schließlich wurden die testinfizierten Tiere hinsichtlich einer möglichen Serokonversion zu HIV-Antigenen, die nicht in deren Immunisierungspläne enthalten waren, überwacht. Eine Immunoblot-Analyse (Diagnostic Pasteur) zeigte, daß C-433 und C-499, die neben anderen Antigenen mit p18gag, aber nicht p25gag immunisiert worden waren, keine Serokonversion zu p25 während 7 Monaten Nachsorge zeigten; jedoch wurde in Woche 32 (7 S Monaten) PI eine schwache p25-Bande auf Immunoblots bei C-433 beobachtet, die an Intensität bei darauffolgenden Serumproben zunahm (Figur 9). Bei C-339, der mit inaktiviertem Ganz-HIV immunisiert worden war, gab es keine nachweisbaren Anstiege der EIA-Antikörper-titer oder der apparenten Antikörperkonzentrationen aufjegliche HIV-spezifischen Proteine (Figur 9). Auch wurden keine Antikörper gegen die vif- oder nef-Proteine im Serum von C-339 während 12 Monaten Nachsorge unter Verwendung aufgereinigter Antigene in Immunoblot-Assays nachgewiesen.

Die hier dargestellten Ergebnisse wie auch jene, die von Berman und Kollegen berichtet wurden (Berman, P.W., Gregory, T.J., Riddle, L., Nakamura, G.R., Champe, M.A., Porter, J.P., Wurm, F.M., Hershberg, R.D., Cobb, E.K. & Eichberg, J.W. (1990), Nature (London) 345, 622-625), zeigen klar, daß es möglich ist, eine protektive Immunantwort bei Schimpansen mit verschiedenen HW-1-Antigenen zu erzeugen. Es ist gezeigt worden, daß C-499 gegen eine Etablierung einer HIV-Infektion zumindest während 7 Monaten Nachsorge geschützt war, daß C-339 für 1 Jahr geschützt war und daß C-433 teilweise geschützt war, wie durch die 7-monatige Verzögerung des Auftretens von Virus nachgewiesen wurde. Es ist jedoch möglich, daß C-433 gleichfalls vollständig geschützt gewesen wäre, wenn die Testimpfüngsdosis die gleiche gewesen ware wie die, die von anderen verwendet worden ist (Berman, P.W., Gregory, T.J., Riddle, L., Nakamura, G.R., Champe, M.A., Porter, J.P., Wurm, F.M., Hershberg, R.D., Cobb, E.K. & Eichberg, J.W. (1990), Nature (London) 345, 622-625), die vierfach geringer war als die hier verwendete Dosis. Der Schutz wurde gezeigt durch: (1) Fehlschlagen, Virus aus PBMC während monatlicher Versuche und aus Lymphknotengewebe 6 Monate PI zu gewinnen; (ii) negative Hybridisierungssignale bei PCR-Analyse von DNA aus PBMC zu verschiedenen Zeitpunkten und aus Lymphknoten 6 Monate PI, und (iii) das Fehlen von Antikörperantworten, die normalerweise einer primären HIV-Infektion folgen oder die für ananmetische Reaktionen bei vorab geimpften und testinfizierten Tieren charakteristisch sind (Berman, P.W., Groopman, J.E., Gregory, T., Clapham, P.R., Weiss, R.A., Ferriani, R., Riddle, L., Shimasaki, C., Lucas, C., Lasky, L.A. & Eichberg, J.W. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 5200-5204; Arthur, L.O., Bess, J.W., Waters, D.J., Pyle, S.W., Kelliher, J.C., Nara, P.L., Krohn, K., Robey, W.G., Langlois, A.J., Gallo, R.C. & Fischinger, P.J. (1989), J Virol. 63, 5046-5053; Girard, M., Kieny, M.P., Gluckman, J.C., Barre-Sinoussi, F., Montagnier, L. & Fultz, P. (1990) in: Vaccines for Sexually Transmitted Diseases, Hrsg.: Meheus, A. & Spier, R. (Butterworth Co., Ltd., London), 5. 227-237).

Daß C-433 für 7 Monate geschützt schien, aber tatsächlich vom Zeitpunkt der Testinfizierung an infiziert war trotz wiederholt negativer Ergebnisse bei einer Virusisolierung und bei Nachweis durch PCR, ist beunruhigend und unterstreicht die Tatsache, daß HIV sequestriert sein kann, so daß es einem Nachweis sowohl anhand virologischer als auch serologischer Kriterien widersteht. Ein ähnliches Auftreten wurde für einen Makaken berichtet (Desrosiers, R.C., Wyand, M.S., Kodama, T., Ringler, D.J., Arthur, L.O., Sehgal, P.K., Letvin, N.L., King, N.W. & Daniel, M.D. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 86, 6353- 6357), der mit inaktiviertem Ganz-Virus immunisiert und dann mit infektiösem SIV testinfiziert worden war. In jener Studie wurde Virus erstmals 32 Wochen nach der Testinfizierung gewonnen und eine anamnetische Reaktion erst 39 Wochen nach der Testinfizierung beobachtet. Die Beobachtung bei natürlichen HIV-Infektionen, daß Personen anhand herkömmlicher Tests für längere Zeit seronegativ blieben, jedoch HIV durch PCR oder Virusisolierung nachgewiesen wurde (Ranki, A., Valle, S.L., Krohn, M., Antonen, J., Allain, J.P., Leuther, M., Franchini, G. & Krohn, K. (1987), Lancet 2, 589-593; und Jehuda-Cohen, T., Slade, B.A., Powell, J.D., Villinger, F., De, B., Folks, T.M., MeClure, H.M., Sell, K.W. & Ahmed-Ansari, A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 87, 3972-3976), legt nahe, daß stark gefährdete Individuen, wie Sexualpartner von HIV-infizierten Personen, möglicherweise trotz negativer serologischer, virologischer oder PCR-Analysen infiziert sein könnten.

Angesichts des komplexen Immunisierungsplans, dem die drei Schimpansen unterworfen wurden, ist es schwierig, zu bestimmen, welches der vielen Antigene und/oder Antigenformulierungen an dem Bewirken des teilweisen Schutzes beteiligt war. C-339 wurde nacheinander mit inaktiviertem HIV, aufgereinigtem gp160 und dem V3-Peptid-KLH-Konjugat immunisiert. C-433 wurde zuerst mit einer Vaccinia-Virus-gp160env-Rekombinante, dann mit einer Mischung aus aufgereinigten env-, p18gag-, neft und vif-Antigenen und schließlich mit dem V3-Peptid-KLH-Konjugat immunisiert. Der einfachste Immunisierungsplan war der von C-499; er bestand aus aufgereinigtem gp160env und p18gag, gefolgt von unkonjugierten V3- Peptiden. Die Antigene, die bei den drei Tieren gleichermaßen eingesetzt wurden, waren gp160env, p18gag und das V3-Peptid, aber ihre jeweilige Bedeutung muß noch ermittelt werden. Ein adäquater Schutz könnte mehrere antigene Determinanten, die auf mehr als einem viralen Protein gefunden werden, und/oder mehrere Präsentationen derselben antigenen Determinante erfordern.

Es ist von Interesse, daß früher getestete Prototyp-Impfstoffe (Berman, P.W., Groopman, J.E., Gregory, T., Clapham, P.R., Weiss, R.A., Ferriani, R., Riddle, L., Shimasaki, C., Lucas, C., Lasky, L.A. & Eichberg, J.W. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5200-5204; Arthur, L.O., Bess, J.W., Waters, D.J., Pyle, S.W., Kelliher, J.C., Nara, P.L., Krohn, K., Robey, W.G., Langlois, A.J., Gallo, R.C. & Fischinger, P.J. (1989), J Virol. 63, 5046-5053; Girard, M., Kieny, M.P., Gluckman, J.C., Barre-Sinoussi, F., Montagnier, L. & Fultz, P. (1990) in: Vaccines for Sexually Transmitted Diseases, Hrsg.: Meheus, A. & Spier, R. (Butterworth Co., Ltd., London), S.227-237; und Hu, S.L., Fultz, P.N., McClure, H.M., Eichberg, J.W., Thomas, E.K., Zarling, J., Singhal, M.C., Kosowski, S.G., Swenson, R.B., Anderson, D., C. & Todaro, G. (1987), Nature (London) 328, 721-723), die keine signifikanten Titer von neutralisierenden Antikörpern bei Schimpansen hervorriefen, nicht wirksam waren, eine experimentelle Infektion der Tiere zu verhindern. Die Beobachtung, daß andauernde Titer von neutralisierenden Antikörpern bei C-339 und C-433 nach zwei Injektionen des V3-Peptid- KLH-Konjugats und bei C-499 nach drei Injektionen von V3-Peptiden erzielt wurden (Figur 7), legt nahe, daß V3 vom Schimpansen-Immunsystem unterschiedlich erkannt werden könnte, wenn es als Peptid prasentiert wird, wie wenn es als Teil des gp160/120env-Moleküls präsentiert wird. Wir haben durch Immunaffinitätschromatographie festgestellt, daß praktisch die gesamte HIV-neutralisierende Aktivität im Serum der geschützten Schimpansen durch das V3-Peptid adsorbiert werden konnte (unveröffentlichte Daten von A.P.). Die Auffrisch- Inokulationen mit dem V3-Peptid oder den V3-Peptiden könnten erklären, warum eine Immunisierung mit gp160 zu einem Schutz von Schimpansen in den vorliegenden Experimenten führte, jedoch nicht in jenen, die von Berman et al. berichtet wurden (Berman, P.W., Gregory, T.J., Riddle, L., Nakamura, G.R., Champe, M.A., Porter, J.P., Wurm, F.M., Hershberg, R.D., Cobb, E.K. & Eichberg, J.W. (1990), Nature (London) 345, 622-625). In dieser letztgenannten Studie waren zwei Schimpansen nach einer Immunisierung mit gp120 geschützt und diese Tiere hatten drei- bis vierfach höhere Titer gegen die Haupt-Neutralisierungsdeterminante (PND), die im V3-Loop gefunden wird, als die beiden nicht vor einer Infektion geschützten Tiere.

Die Frage, ob der bei dem vorliegenden Experiment beobachtete Schutz nur auf neutralisierende Antikörper zurückzuführen war oder ob andere Immunmechanismen beteiligt waren, bleibt unbeantwortet. Zum Zeitpunkt der Testinfizierung wurde eine Antikörperabhängige zelluläre cytotoxische Aktivität im Serum von C-339, aber nicht in dem der anderen zwei Schimpansen nachgewiesen. HIV-spezifische proliferative Reaktionen auf die löslichen Proteine p18gag, gp160env und p27nef(Bahraoui, E., Yagello, M., Billaud, J.N., Sabatier, J.M., Guy, B., Muchmore, E., Girard, M. & Gluckman, J.C. (1990), AIDS Res. Human Retroviruses 6, 1087-1088; und Van Eendenburg, J.P., Yagello, M., Girard, M., Kieny, M.P., Lecocq, J.P., Muchmore, E., Fultz, P.N., Riviere, Y., Montagnier, L. & Gluckman, J.C. (1989), AIDS Res. Human Retroviruses 5, 41-50) wurden in PBMC von C-433 sowohl vor als auch nach der Virus-Testinfizierung, aber nicht in PBMC aus C-339 nachgewiesen. Interessanterweise zeigte C-433 nach einer Immunisierung mit dem V3-KLH-Konjugat eine andauernde, starke T-Helferzellen-Reaktivität gegen das V3-Peptid, während C-339 nur eine schwache Reaktion zeigte. Die Reaktionen von C-449 werden gegenwärtig untersucht. Wiederholte Versuche, cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) in PBMC der geimpften Schimpansen vor, am Tag der oder nach der Testinfizierung nachzuweisen, sind fehlgeschlagen. Es scheint dementsprechend, daß der beobachtete Schutz nicht mit der T-Helferzellen- oder CTL- Aktivität korrelierte.

Die hier dargestellten Ergebnisse legen nahe, daß HIV-Impfstoffe einen Schutz gegen eine Virusinfektion induzieren können. Die hohe neutralisierende Antikörperantwort, die von dem V3-Peptid induziert wird, war typspeziflsch; Serum der geimpften Tiere zum Zeitpunkt der Testinfizierung neutralisierte die mehr Unterschiede aufweisenden HIV-1-Isolate RF und MN nur marginal (unveröffentlichte Daten). Dementsprechend wird es erforderlich sein, einen Impfstoff zu entwickeln, der hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen die vielen HIV-Varianten induziert, aber die unlängst erfolgte Identifizierung von PND-Sequenzen (Larosa, G.J., Davide, J.P., Weinhold, K., Waterbury, J.A., Profy, A.T., Lewis, J.A., Langbis, A.J., A.J., Dressman, G.R., Boswell, R.N., Shadduck, P., Holley, L.H., Karplus, M., Bolognesi, D.P., Matthews, T.J., Emini, E.A. & Putney, S.D. (1990), Science 249, 932-935), mit denen eine Mehrzahl von Seren von HIV-infizierten Personen reagieren, kann das weniger beeindruckend erscheinen lassen, als früher angenommen. Der offensichtliche Erfolg, zwei Schimpansen zu schützen, und die Suppression von Virus über einen ausgedehnten Zeitraum in einem dritten Tier rechtfertigen weitere Bemühungen, einen HIV-Impfstoff zu entwickeln, mit der Erwartung, daß er eine langanhaltende schützende Immunität in Menschen ermöglicht.

Es wurden weitere Untersuchungen ausgeffihrt, um die Gültigkeit des dualen Immunisierungsverfahrens (Prägung (Priming) mit gp160, gefolgt von einer Auffrisch- oder Verstärkungsimpfüng mit synthetischen Peptiden mit der Sequenz des V3-Loops von gp120) sicherzustellen, um 3 Adjuvantien: Al(OH)&sub3;, das Syntex-Adjuvans, SAF-1, und unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA) zu vergleichen und um einen beschleunigten Zeitplan für die Immunisierung zu testen: gp160 in den Monaten 0 und 1, das V3-Peptid in den Monaten 3 und 4 und sowohl gp160 als auch V3 als letzte Aufftisch- oder Verstärkungsimpfung im Monat 6.

Das Experiment wurde in Rhesus-Makaken (4 Tiere pro Charge) unter Verwendung von 100 µg gp160 BRU für die Prägung (Priming) und einer Mischung von je 200 µg V3- BRU (Aminosäurereste 302-335 von gp120) und V3-MN (gleiche Reste) für die Auffrisch- oder Verstärkungsimpfung ausgeführt. Den Tieren wurde in monatlichen Abständen Blut abgenommen und anti-V3- und anti-gp-Antikörper (Ab)-Titer durch ELISA bestimmt. Neutralisierende Ab-Titer wurden durch die Inhibition des immunfluoreszierende Foci-Bildungsassay bestimmt.

anti-gp 160-Ab wurden durch ELISA unter Verwendung von mit aufgereinigtem gp160BRU beschichteten Vertiefungen gemessen. Eine rasche anti-gp160-Ab-Antwort wurde in den 3 Gruppen von Tieren beobachtet (Figur 10), aber die Reaktion auf das Antigen in den Gruppen mit IFA und SAF-1 war 5-bis 10-fach höher als jene in der Gruppe mit Aluminiumhydroxid. Die Injektion der V3-Peptide hatte keine Wirkung auf anti-gp160-Titer. Titer wurden mehrfach nach einer Erinnerungsinjektion von gp160 im Monat 6 verstärkt, jedoch zeigte wieder die Gruppe mit Aluminiumhydroxid eine 2-8-fach geringere Reaktion als die anderen zwei.

anti-V3 -Ab wurden durch ELISA unter Verwendung von mit dem BRU-Peptid beschichteten Vertiefungen gemessen. Die Antwort auf V3 war eindeutig biphasisch bei allen Gruppen, wobei eine starke Verstärkungswirkung bei Injektion des V3-Peptids im Monat 3 beobachtet wird (Fig. 11). Dementsprechend erhöhten sich anti-V3-Titer 10-fach zwischen den Monaten 3 und 4 und erreichten dann ein Plateau, was die bemerkenswerte Verstärkungswirkung einer V3-Peptid-Injektion bei gp160-geprägten oder -geprimten Tieren bestätigt. Dies wurde unabhängig von dem in dem Experiment verwendeten Adjuvans beobachtet.

Die Initialantwort auf V3, gemessen im Monat 3, war jedoch 5-6-fach höher in den SAF- 1 - und IFA-Gruppen als in der Gruppe mit Aluminiumhydroxid. Die endgültigen anti- V3-Titer waren insgesamt in den erstgenannten zwei Gruppen etwa 10-fach höher als in der letztgenannten. Ein zweistufiger Immunisierungszeitplan kann, wie folgt, definiert werden:

Prägung/Priming: gp160 in den Monaten 0 und 1

Auffrisch-/Verstärkungsimpfung: V3-Peptide im Monat 3

zweite Auffrisch/Verstärkungsimpfung: gp160 + V3-Peptide im Monat 6.

Die zweite Auffrischimpfiing kann zu einem späteren Zeitpunkt, z.B. im Monat 12, vorgesehen werden, um die anamnetische Reaktion weiter zu erhöhen.

Sämtliche Vor-Immun-Seren waren hinsichtlich neutralisierender Ab negativ. Titer von neutralisierenden Ab, die einen Monat nach der zweiten Auffrischungsimpfung (Monat 7) gemessen wurden, waren die folgenden:

Auch hier bestand wieder ein definitiver Vorteil in der Verwendung von SAF-1 oder unvollständigem Freund-Adjuvans gegenüber einer Verwendung von Aluminiumhydroxid, obwohl der relative Unterschied in den Titem zwischen den einzelnen Gruppen etwas weniger ausgeprägt war.

Zusammenfassend kann ein schneller zweistufiger anti-HIV-Immunisierungszeitplan für Primaten hohe anti-V3-, hohe anti-gp160- und hohe neutralisierende Ab-Antworten induzieren. Dieser Zeitplan umfaßt:

Eine Alternative zu diesem Zeitplan könnte sein:

Es besteht ein Vorteil darin, das Syntex-Adjuvans SAF-1 oder unvollständiges Freund- Adjuvans gegenüber Aluminiumhydroxid [Al(OH)&sub3;] zu verwenden, da endgültige Ab-Titer bei den erstgenannten 2 Adjuvantien 5- bis 15-fach höher sind im Vergleich zu dem letztgenannten.

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Anspruch[de]

1. Zusammensetzung zum Verstärken der Immunogenität eines Hüllglykoproteins eines bestimmten Virus oder eines Fragments von diesem,

wobei die Zusammensetzung als kombinierte Zubereitung für eine gleichzeitige, getrennte oder nacheinander erfolgende Verwendung umfaßt:

(A) mindestens ein Hüllglykoprotein des Virus oder ein Fragment von mindestens 50 Aminosäuren des Glykoproteins und

(B) mindestens ein von der Aminosäuresequenz des Hüllglykoproteins abgeleitetes Peptid, wobei das Peptid mindestens ein Virus-Neutralisierungsepitop umfaßt und das Hüllglykoprotein und das Peptid in einer ausreichenden Menge verabreicht werden, um neutralisierende Antikörper in dem Wirt zu induzieren.

2. Zusammensetzung zum Verstärken der Immunogenität eines Hüllglykoproteins eines bestimmten Virus,

wobei die Zusammensetzung als eine kombinierte Zubereitung für eine gleichzeitige, getrennte oder nacheinander erfolgende Verwendung umfaßt:

(A) mindestens ein Hüllglykoprotein des Virus oder ein Fragment des Glykoproteins, das dessen immunogene Eigenschaften aufweist, in einer ausreichenden Menge, um die Induktion neutralisierender Antikörper in einem Wirt, dem das Hüllglykoprotein verabreicht wird, zu prägen, und

(B) mindestens ein von der Aminosäuresequenz des Hüllglykoprotein abgeleitetes Peptid, wobei das Peptid mindestens ein Virus-Neutralisierungsepitop des Glykoproteins umfaßt und die Zusammensetzung das Peptid in einer ausreichenden Menge enthält, um die Induktion persistenter neutralisierender Antikörper in dem Wirt zu verstärken.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, in der das Virus aus der Gruppe, bestehend aus HIV, SW, HTLV-1, HTLV-2, FIV, FeLV, ausgewählt ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der das Hüllglykoprotein oder ein Fragment gp160 von HIV oder gp120 von HIV oder Fragmente dieser Glykoproteine ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der das mindestens eine Peptid eine Mischung von Peptiden von HIV-Glykoprotein umfaßt.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in der das mindestens eine Peptid an ein Trägermolekül, beispielsweise eine aliphatische Sequenz, gebunden ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in der das mindestens eine Hüllglykoprotein eine Mischung von Glykoproteinen aus HIV- 1 und HIV-2 umfaßt und das mindestens eine Peptid eine Mischung, die mindestens ein Peptid mit einem HIV-2-Neutralisierungsepitop enthält, umfaßt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in der das mindestens eine Glykoprotein eine Mischung von Glykoproteinen gp 160 aus verschiedenen HIV-Isolaten (Serotypen) ist und das mindestens eine Peptid eine Mischung der entsprechenden Neutralisierungsepitope ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in der das mindestens eine Hüllglykoprotein eine Mischung von Glykoproteinen gp 120 von verschiedenen HIV-Isolaten (Serotypen) ist und das mindestens eine Peptid eine Mischung der entsprechenden Neutralisierungsepitope ist.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in der das Peptid aus der Gruppe, bestehend aus env, gag und insbesondere pl 8gag, nef, vif, pol, oder GPG- oder GLG-Antigenen und Mischungen dieser Antigene, insbesondere p27nef und p23vif, ausgewählt wird.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in der das Hüllglykoprotein eines bestimmten Virus mit mindestens einem der aus gag, pol, nef oder vif ausgewählten Antigene und insbesondere mit einer Mischung von p27nef und p23vif kombiniert wird.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in der das Peptid mindestens ein Peptid ist, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus:

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in der das Peptid die folgende Aminosäuresequenz umfaßt:

YNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGN

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in der das mindestens eine Peptid das Hauptneutralisierungsepitop (Loop V3) von mindestens einem HW-1-Isolat umfaßt.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, in der die Zusammensetzung einen Hilfsstoff oder ein Adjuvans in einer ausreichenden Menge, um die Immunogenität des Hullglykoproteins zu prägen und/oder zu verstärken, enthält.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, in der der Hilfsstoff oder das Adjuvans Muramyldipeptid oder unvollständiges Freund- Adjuvans ist.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie oral, parenteral oder intradermal verabreicht wird.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, in der das Hüllglykoprotein oder ein Fragment desselben und das bzw. die davon abgeleitete(n) Peptid(e) nebeneinander präsentiert werden, um gleichzeitig, getrennt oder mit zeitlichem Abstand an den Wirt verabreicht zu werden.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, in der das Hüllglykoprotein mit einem pharmazeutischen Träger filr eine orale oder parenterale Verabreichung kombiniert wird.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, in der das Peptid mit einem pharmazeutischen Träger für eine orale Verabreichung kombiniert wird.

21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, in der entweder das mindestens eine Hüllglykoprotein des Virus oder/und das mindestens eine von dem Hüllglykoprotein abgeleitete Peptid präsentiert werden:

- entweder in Form von Teilchen, wie ISCOMS oder Liposomen,

- oder durch einen lebenden rekombinanten Mikroorganismus.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, in der der Mikroorganismus ein lebender rekombinanter Mikroorganismus, wie Viren oder Bakterien, beispielsweise ein Pockenvirus oder BCG, oder ein beliebiger Lebendimpfstoff ist, der modifiziert wurde, um das Hüllglykoprotein oder das von dem Hüllglykoprotein abgeleitete Peptid zu exprimieren.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, in der der Mikroorganismus von inaktivierten Teilchen, beispielsweise viralen Teilchen, wie dem HIV-Virus, oder Teilchen ohne Virusgenom, insbesondere ohne HIV-Genom, abgeleitet ist.

24. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung eines Impfstoffs.

25. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung eines immuntherapeutischen Arzneimittels.







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