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Dokumentenidentifikation DE69221225T2 19.03.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0522291
Titel Verfahren zum Reinigen von Hepatits-A-Virus (HAV), so gereinigter Virus und Impfstoffzusammensetzungen, die ihn enthalten
Anmelder Biocine S.p.A., Siena, IT
Erfinder Pellegrini, Vittoria, I-53100 Siena, GB;
Fineschi, Nicoletta, I-53100 Siena, GB;
Zuckerman, Arie J., Royal Free Hospital, London NW3 2PF, GB
Vertreter Vossius & Partner GbR, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69221225
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 05.06.1992
EP-Aktenzeichen 921095246
EP-Offenlegungsdatum 13.01.1993
EP date of grant 30.07.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.03.1998
IPC-Hauptklasse C12N 7/02
IPC-Nebenklasse C12N 7/00   A61K 39/29   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Es wird ein Verfahren zur Reinigung des Hepatitis A-Virus (HAV) beschrieben, bei dem das Material aus den Kulturzellen nach Zellyse und Zentrifligation einer Gelfiltration unterworfen wird und das so erhaltene Eluat einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen wird.

Stand der Technik

Das Hepatitis A-Virus (HAV) ist ein Picomavirus von ikosaedrischer Gestalt mit 32 Capsomeren auf seiner Oberfläche, das vier wichtige VP1-Strukturpolypeptide präsentiert und zwar MSW mit einem Molekulargewicht von 30.000-33.000, VP2 mit einem Molekulargewicht von 24.000-27.000, VP3 mit einem Molekulargewicht von 21.000-23.000 und VP4 mit einem Molekulargewicht von 7.000-14.000.

Die vier Proteine sind diejenigen, die für die antigene Virusstärke verantwortlich sind, und sind daher diejenigen, bei denen Reinigungsverfahren dazu beitragen, sie nachzuweisen und zu isolieren, um einen inaktivierten Impfstoff mit einem guten Reinheitsgrad herzustellen.

Mit Reinigungsverfahren wird versucht, zelluläre Verunreinigungen und Wachstumsfaktoren zu entfernen, welche beim Virusherstellungsverfahren verwendet werden.

Verschiedene Verfahren zur partiellen Virusreinigung, sowohl für Impfzwecke als auch zur Viruscharakterisierung, wurden beschrieben. Zum Beispiel durch die Virussedimentation mittels eines 20%igen Saccharosekissens und anschließender Zentrifugation in einem Cäsiumchloridgradienten [Provost P.J. et al., J. of Medical Virology 19 (1986), 23-31], durch Ammoniumsulfatpräzipitation und Sedimentation mit einem 20%igen Saccharosekissen und einem Cäsiumchloridgradienten [Flehmig B. et al., J. of Medical Virology 22 (1987), 7-16], mittels eines Lysepuffers, Einfrieren, Auftauen, Beschallen zum Freisetzen des Virus, Ultrafiltration mit Tangentialströmung und Reinigung in einem Cäsiumchloridgradienten [Flehmig et al., The Lancet, 13. Mai (1937), 1039], durch verschiedene Reinigungszyklen und anschließende Freon- oder Chloroformextraktion, gefolgt von einer Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie und Reinigung in einem Cäsiumchloridgradienten [Locarnini S.A., Intervirology 10 (1978), 300-308].

Alle vorstehend erwähnten Verfahren verwenden in mindestens einem Schritt Ultrazentrifügationssysteme und sehr teuere Materialien, wie Cäsiumchlorid, und sind deshalb, obwohl in einem kleinen Maßstab ausgezeichnete Ergebnisse erzielt werden, für eine industrielle Produktion kaum geeignet, bei der die Verfahrensdauer, die Kosten und die Verfügbarkeit von geeignetem Personal in Betracht gezogen werden muß.

In der Europäischen Patentanmeldung EP-A-302692 wird ein Verfahren zur Reinigung des Hepatitis A-Virus beschrieben, das eine Beschallung zur Zellyse, gefolgt von einer Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und nachfolgender Konzentration, eine Chromatographie an Anionenaustauscherharzen und schließlich eine Gelfiltrationschromatographie verwendet. Auch dieses Verfahren weist besonders im Hinblick auf die Anwendung von Beschallung sowie organischen Phasenextraktions- und Konzentrationsverfahren in einem industriellen Maßstab bestimmte operative Schwierigkeiten auf.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, die erwähnten Nachteile zu beseitigen, und ist deshalb ein bedeutsamer Beitrag zur Reinigung in einem industriellen Maßstab und zur Produktion eines für die Verwendung als Impfstoff geeigneten gereinigten HAV- Virus.

Diploide menschliche MRC-5-Zellen, die von der Weltgesundheitsorganisation zur Herstellung von Impfstoffen für den menschlichen Gebrauch als geeignet bezeichnet wurden, welche gemäß herkömmlicher Verfahren gezüchtet und gewonnen wurden, wurden verwendet.

Die Zellen wurden bei der dreißigsten Passage mit HAV infiziert. Nach einem Inkubationszeitraum von 21 Tagen wurde das Zellsubstrat mit PBS-A gewaschen, um möglichst viel des fötalen Rinderserums zu entfernen, das im Kulturmedium vorliegt und für das Substrat unerläßlich ist.

Die infizierten Zellen wurden gemäß üblicher Verfahren in Trypsin-EDTA aufgenommen und in isotonischem Puffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, pH 7,5) resuspendiert, dies bewirkt die Zellyse und daher die Freisetzung des Virus, und eingefroren.

Zum Zeitpunkt der Reinigung wird das Material aufgetaut und mit 2% Triton- X-100 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, wobei etwa alle 5 Minuten gerührt wird; das Material wird dann mittels Zentrifügation gewonnen, um die Zellfragmente zu entfernen; diese Behandlung erlaubt die Solubilisierung von Membranlipiden, mit denen das Virus eng assoziiert ist. Der nächste Schritt ist eine Gelfiltration unter Verwendung eines Gelfiltrationsbettes sowohl von Agarose als auch von Dextran, z.B. Sepharose CL-4B (Pharmacia), die mit 0,1 bis 0,2% Triton-X-100 enthaltendem TNE-Puffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,2-7,6) oder 0,1 M Glycinpuffer mit 0,2% Desoxycholat, pH 8,5, äquilibriert sind. Das eluierte Material wird in 20 ml-Fraktionen gesammelt, die auf die Gegenwart von HAV mittels eines ELISA-Tests getestet werden. Bei diesem Durchgang werden Ausbeuten von 85 bis 95% mit einer etwa achtfachen Reinheitszunahme (30-50 µg Virus pro mg Protein) erhalten.

Das in dem vorhergehenden Schritt erhaltene Bluat wird dann unter Verwendung von Anionenaustauscherharzen, wie z.B. DEAB-Sepharose CL-6B, die in 0,1 bis 0,2% Triton-X- 100 enthaltendem TNE-Puffer äquilibriert ist, einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen; bei diesen Bedingungen wird das Virus an der Schicht adsorbiert, während der Anteil der Verunreinigungen nicht zurückgehalten wird.

Nach Waschen der Säule mit TNE, um das Detergens zu entfernen, wird unter Absenkung des pH-Werts und Erhöhung der Ionenstärke eine Elution durchgeführt. Zu diesem Zweck kann ein Phosphatpuffer mit einem kontinuierlichen pH-Gradienten von 7,4 bis 4 und einer Ionenstärke von 0 bis 0,3 M NaCl verwendet werden. Die Ausbeute in diesem zweiten Schritt liegt in bezug auf den vorhergehenden Schritt in der Größenordnung von 50%, und die Reinheit des gewonnenen Virus ist um das 6- bis 10fache erhöht (bei einem durchschnittlichen Virusgehalt von 70% an dem gesamten Protein). Das auf diese Weise gereinigte Virusmaterial wird über eine Membran mit einer Porenweite von 0,22 µm gefiltert und mit 1:200 Formalin bei 35ºC 5 Tage unter kontinuierlichem Rühren inaktiviert.

Während des Inaktivierungszeitraums werden Aufschlußbehandlungen durchgeführt, wobei das Material am zweiten Tag bei 50 bis 60 W 1 Sekunde/ml beschallt wird. Am dritten Tag wird das Material über eine 0,22 µm-Membran gefiltert und 25 mM L-Lysin HCl werden zugegeben. Nach der Inaktivierung wird die Suspension gegen PBS-A (1:100 Vol/Vol) etwa 36 Stunden unter einer eingeschalteten Pufferauswechselung dialysiert. Nach der Dialyse wird das Material einer Sterilfiltration unterzogen, und das Produkt durchläuft alle erforderlichen Kontrollen: Sterilität, Pyrogenizität, Inaktivierung, Antigenizität, pH-Wert, Stabilität, Formalinrückstand.

Experimenteller Teil

MRC-5-Zellen in der dreißigsten Passage in rotierenden 850 cm³-Flaschen werden mit HAV (Stamm LSH/S ATCC VR 2266) mit 0,5 MOI infiziert. Nach einem Inkubationszeitraum von 20 Tagen wird das Zellsubstrat dreimal mit serumfreien Medium gewaschen, wobei der letzte Waschschritt über Nacht durchgeführt wird. Am nächsten Tag werden die Zellen mit Trypsin-EDTA gemäß üblichen Verfahren abgelöst und wieder in isotonischem Puffer (10 mM Tris, mM NaCl, pH 7,5), 1 ml für je 100 cm² Zellkultur, suspendiert und eingefroren.

60 ml der gefrorenen Suspension, die aus etwa 5700 cm² Kultur erhalten wurde, werden aufgetaut und mit einem nichtionischen Detergens (2% Triton-X-100) 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur unter mäßigem Rühren alle 5 bis 10 Minuten behandelt.

Die Probe wird bei 400 g 10 Minuten unter Kühlen zentrifügiert, um Zellfragmente zu entfernen. Der Überstand wird durch Gelfiltration an einer 5 x 90 cm großen (K 10/100- Säule, Pharmacia) Agaroseharz-Säule (Sepharose CL-4B, Pharmacia), die mit 0,1% Triton-X- 100 enthaltendem Puffer aus 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, äquilibriert ist, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 75 ml/Stunde gereinigt. Das eluierte Material wird in 20 ml Fraktionen gesammelt, die auf die Gegenwart von HAV mittels eines ELISA-Tests getestet werden. Die HAV enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, wobei etwa 400 ml erhalten werden. Dieses Material wird mittels Ionenaustauschchromatographie weiter gereinigt, wobei etwa 200 ml bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 100 ml/Stunde auf eine 5 x 5 (Säule XK 50/30, Pharmacia) anionische Harzsäule (Sepharose CL-6B, Pharmacia) aufgegeben werden, die vorher in 0,1% Triton-X- 100 enthaltendem Puffer aus 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, äquilibriert worden war. Unter derartigen Bedingungen wird das Virus an der Matrix adsorbiert. Die Matrix wird mit Triton-X- 100-freiem Puffer gewaschen, um das Detergens zu entfernen, und das Virus wird bei einem Durchfluß von etwa 160 milstunde eluiert, wobei ein kontinuierlicher pH-Gradient und eine kontinuierliche Ionenstärke ausgehend von pH 7,4 und 0 mM NaCl bis zu pH 4 und 0,3 M NaCl angelegt wird. Das eluierte Material wird in Fraktionen von etwa 10 ml gesammelt, und die Fraktionen. die in einem ELISA-Test auf die Gegenwart von HAV positiv bewertet wurden, werden vereinigt.

Auf diese Weise wird ein Virus mit 70%iger Reinheit erhalten. Das so gereinigte Material wird über eine Membran mit einer Porenweite von 0,22 µm gefiltert und mit 1:2000 Formalin bei 35ºC 5 Tage unter kontinuierlichem Rühren inaktiviert. Während des Inaktivierungszeitraums werden Aufschlußbehandlungen durchgeführt: am zweiten Tag wird das Material bei 50 bis 60 W pro 1 Sekundell ml beschallt: am dritten Tag wird es über eine 0,22 µm-Membran gefiltert und 25 mM L-Lysin HCl werden zugegeben. Nach der Inaktivierung wird die Suspension gegen PBS-A (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 137 mM NaCl, 8,1 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4) in einem Verhältnis von 1:100 (Vol./Vol.) 36 Stunden unter einer eingeschalteten Pufferauswechselung dialysiert. Nach der Dialyse durchläuft das Material eine Sterilfiltration und wird dann den üblichen Kontrollen auf Sterilität, Pyrogenizität, Inaktivierung, Antigenizität, pH-Wert, Stabilität, Formalinrückstand unterworfen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Reinigung von Hepatitis Avirus (HAV), bei dem das Material aus der Kultur nach Zell-Lyse und Zentrifugation einer Gelfiltration unterworfen wird und das so erhaltene Eluat einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie unterworfen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Gelfiltration mit Agarose- oder Dextranmatrizes durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die verwendete Gelfiltrationsmatrix Sepharose CL-4B ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Gelfiltrationsmatrix mit einem Detergens enthaltenden Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,6 äquilibriert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Detergens enthaltende Puffer aus 10 mM Tris, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 7,4, besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Puffer 0,1 bis 0,2 % Triton-X-100 als Detergens enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Ionenaustausch chromatographie mit DEAE-Sepharose CL-6B durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die DEAE-Sepharose CL-6B mit einem Detergens enthaltenden Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,6 äquilibriert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Detergens enthaltende Puffer aus 10 mM Tris, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 7,4, besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Puffer 0,1 bis 0,2 % Triton-X-100 als Detergens enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Ionenaustausch- Chromatographiesäule durch Absenkung des pH-Werts und Erhöhung der Ionenstärke eluiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem ein Phosphatpuffer mit einem kontinuierlichen pH-Gradienten von 7,4 bis 4 und einer Ionenstärke von 0 bis 0,3 M NaCl als Elutionsmittel verwendet wird.

13. Verfahren zur Herstellung von inaktiviertem gereinigtern Hepatitis A-Virus (HAV), umfassend die Schritte der Reinigung von HAV nach einem Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 11 und der anschließenden Inaktivierung des in dem Eluat enthaltenen Virus mit 1:2000 Formalin.

14. Verfahren zur Herstellung von inaktiviertem gereinigtem Hepatitis A-Virus (HAV), umfassend die folgenden Schritte:

a) Züchtung und Gewinnung von MRC-5-Zellen, die mit dem HAV-Virus Stamm LSH/S (ATCC VR 2266) infiziert sind;

b) Lysieren der Zellen mit 2 % Triton-X-100 und Zentrifugation;

c) Durchführung einer Gelfiltration mit dem gewonnenen Material an Sepharose CL-4B, die mit 0,1 % Triton-X- 100 enthaltendem Puffer aus 10 mM Tris, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 7,4, äquilibriert ist;

d) Durchführung einer Anionenaustauschchromatographie mit dem Eluat von (c) an DEAE-Sepharose CL-6B, die mit 0,1 % Triton-X-100 enthaltendem Puffer aus 10 mM

1 Tris, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 7,4, äquilibriert ist;

e) Elution des an die Säule in (d) adsorbierten HAV-Virus in einem kontinuierlichen pH-Gradienten unter Verwendung eines Phosphatpuffers mit einem kontinuierlichen Gradienten von 7,4 bis 4 und einem Ionenstärkegradienten von 0 bis 0,3 M NaCl;

f) Inaktivierung des in (e) erhaltenen gereinigten Virus in 1:2000 Formalin.

15. Hepatitis Avirus (HAV)-Stamm LSH/S, hinterlegt unter ATCC VR 2266.

16. Gereinigtes und inaktiviertes HAV-Virus, das nach dem in Anspruch 14 beanspruchten Verfahren erhalten wurde.

17. Verwendung des inaktivierten Virus nach Anspruch 16 zur Herstellung von Impfstoffzusammensetzungen gegen Hepatitis A.

18. Impfstoffzusammensetzungen, die das Virus nach Anspruch 16 enthalten.







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