Warning: fopen(111data/log202010011202.log): failed to open stream: No space left on device in /home/pde321/public_html/header.php on line 107

Warning: flock() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 108

Warning: fclose() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 113
Virale Stämme gegen Pseudorabies vom Schwein und diese virale Stämme enthaltende Impfstoffe - Dokument DE69501180T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69501180T2 02.04.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0682108
Titel Virale Stämme gegen Pseudorabies vom Schwein und diese virale Stämme enthaltende Impfstoffe
Anmelder Fatro S.p.A., Ozzano Emilia, Bologna, IT
Erfinder Lomniczi, Bela, H-1124 Budapest, HU;
Meliota, Francesco, I-40064 Ozzano Emilia (Bologna), IT
Vertreter Türk, Gille, Hrabal, Leifert, 40593 Düsseldorf
DE-Aktenzeichen 69501180
Vertragsstaaten AT, BE, DE, ES, FR, GR, NL, PT
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 02.05.1995
EP-Aktenzeichen 951065549
EP-Offenlegungsdatum 15.11.1995
EP date of grant 10.12.1997
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.04.1998
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse A61K 39/245   

Beschreibung[de]
Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Virus-Stamm Suid herpesvirus 1, auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Virus- Stammes und auf Impfstoffe gegen Schweine-Pseudorabies oder gegen die Aujeszky-Krankheit, die aus dem neuen Virus-Stamm hergestellt sind.

Die Aujeszky-Krankheit oder Pseudorabies wird durch ein Virus hervorgerufen, das zu der Herpesviridae-Familie gehört, die vor allem Schweine befallen. In Tieren für die Vermehrung findet der pathogene Vorgang der Vermehrung des Virus hauptsächlich im Bereich der Genitalien statt: beim Eber verursacht sie eine vorübergehende Hypofertilität, bei der trächtigen Sau einen Abort, ein Absterben des Embryos und eine Totgeburt. Bei Ferkeln werden hauptsächlich die Nerven-Variante mit einer hohen Todesrate und selten die respiratorischen Formen beobachtet, mit fortschreitendem Alter nimmt das Vorkommen der respiratorischen Form zu und dasjenige der Nerven-Form nimmt ab. Wenn respiratorische Erkrankungen vorliegen, kann man eine Abnahme des Gewichtszuwachses beobachten.

Das Schwein stellt den Primärwirt dar mit einer Lokalisation in verschiedenen Organen und es stellt auch das einzige Reservoir für das Aujeszky- Virus dar. Andere Haustier- und Wildtierarten werden in natürlicher Weise infiziert: Rinder, Schafe, Hunde, Katzen und Nagetiere, sie steilen jedoch die Endform vom epidemiologischen Gesichtspunkt aus betrachtet dar, da die Infektion einen tödlichen Ausgang hat.

Stand der Technik

Das für die Aujeszky-Krankheit verantwortliche Virus gehört zur Familie der Herpesviridae, Unter-Familie α-Herpesvirinae, und nach der offiziellen Taxonomie wird es als Suid Herpesvirus 1 bezeichnet. Das vollständige Virion hat einen Durchmesser von 180 nm und weist eine DNA-Doppelhelix auf.

Die isolierten Viren-Stämme können nicht nach serologischen Standard- Verfahren differenziert werden und gehören daher zu einem neuartigen Serotyp, wobei eine bemerkenswerte Vielfalt in bezug auf Virulenz und Pathogenität zwischen den verschiedenen Stämmen zu beobachten ist.

Vor kurzem wurde eine Analyse des Virus-Genoms durchgeführt unter Verwendung von Restriktions-Enzymen, um die Stämme zu typisieren, wobei verschiedene Stämme identifiziert wurden, was epidemiologische, pathogene und prophylaktische Vorteile bietet.

Auf der Basis dieser Erforschung der Gene, die für die Proteine codieren, die für die Vermehrung verantwortlich sind, wurden die Virulenz und die Pathogenität und diejenigen, die für die Immunogenität und den Schutz verantwortlich sind identifiziert.

Die derzeit verwendeten Vaccine-Stämme wurden entweder nach klassischen Methoden oder unter Anwendung gentechnischer Verfahren attenuiert (abgeschwächt).

Die nach klassischen Methoden hergestellten Vaccine-Stämme sind der Stamm Bartha K61 und der Stamm Tatarov MK-25.

Der erste ist ein Stamm, der selektioniert wurde in bezug auf die Bildung von Plaques von geringer Größe in Zellkulturen, der attenuiert (abgeschwächt) und ohne das gl-Glycoprotein erhalten wurde, obgleich er noch das Enzym Thymidinkinase (TK) bildet.

Der Stamm Tatarov MK-25 wurde selektioniert durch Behandlung mit der mutagenen Chemikahe Bromuridin (BUDR), wobei man eine attenuierte (abgeschwächte) Mutante erhielt, die negativ war in bezug auf TK, nicht jedoch in bezug auf gl.

Die unter Anwendung von gentechnischen Verfahren attenuierten (abgeschwächten) Stämme vereinigen bis zu einem gewissen Grade die Merkmale der obengenannten Stämme K61 und MK-25 in sich: im allgemeinen sind in ihnen die Gene deletiert, die für TK (Thymidin-Kinase) zur Verminderung der Virulenz und für das Glycoprotein gl codieren zur Unterscheidung der Serum-Response der mit ihnen geimpften Schweine von derjenigen, die durch die Stämme vom Wild-Typ induziert wurde: typische Beispiele sind die Stämme 783 (EP 0141458) und Begonia.

Beschreibung der Erfindung

Es wurde ein neuer Stamm gefunden und er ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der eine starke Abschwächung der Pathogenität und eine ausgezeichnete Immunogenität aufweist, die für die Verwendung in lmpfstoffen gegen die Aujeszky-Krankheit nützlich ist.

Die neuen Impfstoffe sind daher charakterisiert durch die Tatsache, daß sie von einem neuen Virus-Stamm, dem sogenannten Lom Bart-Stamm, abgeleitet sind, der eine starke Immunogenität aufweist, jedoch nicht pathogen ist und außerdem einen genetischen Marker enthält, der seine Differenzierung von anderen Vaccine-Stämmen bei der Verwendung gegen die Aujeszky- Krankheit erlaubt.

Der neue LomBart-Stamm, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, wurde hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) unter der Hinterlegungs-Nummer V9401 2710.

Der neue LomBart-Stamm wurde erhalten durch Rekombination in einer Gewebekultur zwischen dem Bartha K61-Stamm und einem Stamm vom Wild- Typ, der einen erkennbaren (nachweisbaren) genetischen Marker trägt: der Stamm, der dabei erhalten wird, enthält den genetischen Marker, ist in gleicher Weise abgeschwächt und stärker immunogen als der Ausgangs-Stamm Bartha K61.

Der von dem Lom Bart-Stamm abgeleitete neue Impfstoff weist eindeutige Vorteile gegenüber den bekannten Impfstoffen auf und diese sind folgende:

- eine vollständige Sicherheit bei der Verwendung,

- einen Impf-Wirkungsgrad aufgrund seiner höheren Immunogenität,

- die Möglichkeit der Differenzierung desselben von anderen Vaccine- Stämmen aufgrund der Anwesenheit des genetischen Markers in dem Lom- Bart-Stamm. Dies bringt Vorteile auf dem Gebiet der Ausrottung der Erkrankung isofern mit sich, als sie jederzeit die Verifizierung erlaubt, ob der Vaccine-Stamm, der für Lebend-Impfstoffe verwendet worden ist, an den genetischen Rekombinations-Vorgängen "in vivo" beteilgt ist.

Der erfindungsgemäße neue LomBart-Stamm kann für die Herstellung von Lebend-Impfstoffen verwendet werden oder in monovalenten Formulierungen inaktiviert werden oder in Vaccinen verwendet werden, die andere lebende oder inaktive Elemente enthalten, für die Verwendung gegen die Aujeszky- Krankheit und andere Erkrankungen des Schweins, in lmpfstoffen, die andere virulente lebende Stämme, gewünschtenfalls nach einer vorherigen Abschwächung, oder virulente inaktive Stämme enthalten, für die Verwendung gegen die Aujeszky-Krankheit und andere Erkrankungen von zootechnischem Interesse.

Der Impfstoff kann hergestellt und in Form einer lyophilisierten Suspension oder in Form einer Lösung in den Handel gebracht werden für die Verabreichung durch Injektion oder auf oralem Wege. Die pharmazeutischen Formen enthalten eine Dosis des LomBart-Stammes und Exzipienten, Adjuvantien und Konservierungsstoffe. Die wirksame Dosis des LomBart-Stammes liegt in dem Bereich von 10² bis 10&sup6; und darüber in den abgeschwächten Vaccinen und sie beträgt mindestens 10&sup8; in den inaktivierten Vaccinen. Die üblicherweise in Lebend-Impfstoffen angewendete Dosis beträgt 10&sup5;-10&sup6; pro Tier. Die indizierte Verabreichung kann parenteral für inaktivierte Impfstoffe, parenteral, endonasal oder intradermal für Lebend-Impfstoffe erfolgen.

Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt die Verteilung der Virus-DNA-Fragmente in einem Agarose-Gel nach der Behandlung mit dem Enzym Kpn1. Die Bande C (LomBart- Stamm) zeigt die Anwesenheit des F1+F2-Markers und das Fragment I', das aus der Deletion des Gens gl resultiert. Die Bande A bezieht sich auf den virulenten Bezugs-Stamm, während die Bande B sich auf den Bartha K61-Stamm bezieht.

Die Fig. 2 zeigt die physikalische Karte der Virus-Stamm LomBart-DNA: Die Verteilung der Restriktionsstellen des Enzyms Kpn1. Die Zeichnung zeigt die anomale Restriktionsstelle für das Fragment F, die in zwei Subfragmenten (F1+F2) resultiert, die den Marker darstellen; sie zeigt außerdem die Position der Deletion des Gens I.

Die Fig. 3 stellt die nasale Exkretion des erfindungsgemäßen Stammes bei sechs Schweinen während eines Zeitraums zwischen 1 und 12 Tagen nach Verabreichung von 10&sup7; PFU des Virus-Stammes dar.

Die Fig. 4 und 5 zeigen die Körperwachstumskurven von nichtgeimpften (Fig. 4) und von mit den Bartha- und Lam Bart-Stämmen geimpften Schweinen (Fig. 5).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der LomBart-Stamm, wurde erhalten durch Rekombination in einer Gewebekultur zwischen dem Original-Bartha K61-Stamm (A. Bartha (1961): "Magyar Allatorvosok Lapja",16, 42- 45) und dem natürlichen ADV-53-Stamm, isoliert 1982 in Ungarn, der einen erkennbaren (nachweisbaren) genetischen Marker trägt (B. Lomniszi, E. Nagy, A. Kuked, L. ZSak (1989) in "Vaccination and control of Aujeszky disease", J.T. Van Oirschot ed. Kluwer Academic Pubi., Dordrechtloston, London).

Der so erhaltene LomBart-Stamm unterscheidet sich von dem Bartha K61-Stamm in bezug auf zwei unterschiedliche Eigenschaften:

a) er enthält innerhalb seiner DNA einen leicht erkennbaren (nachweisbaren) Marker aufgrund einer zusätzlichen Restriktionsstelle, und

b) er bildet größere Plaques in Hühnerembryo-Fibroblast-Kulturen, eine Eigenschaft, die in Korrelation steht zu einer höheren Immunogenizität, die auch experimentell verifiziert wurde.

Beschreibung des genetischen Markers des LomBart-Stammes

Der LomBart-Stamm weist eine zusätzliche Restriktionsstelle innerhalb seiner DNA auf, die mit dem Enzym Kpn1 erkennbar (nachweisbar) ist. Dieses Enzym ist auch das beste zum Nachweis der Genom-Deletion.

Die Fig. 1 zeigt die Verteilung der Fragmente des Bartha K61-Stammes, des LomBart-Stammes und eines Stammes vom Wild-Typ zum Vergleich, die durch Behandlung mit dem Enzym Kpn1 nach einer Agarosegel- Elektrophorese erhalten wurden. Während die virulenten und Bartha K61- Stämme das typische Muster des Prototyp-Virus für Pseudorabies zeigen, erscheint das Fragment F des LomBart-Stammes nicht an seiner üblichen Position, sondern läuft "zerschnitten" in Fform von zwei Fragmenten von mehr oder minder gleicher Größe zwischen den Fragmenten K und I. Dies ist darauf zurückzuführen, daß bei dieser Variante eine Restriktionsstelle, die empfindlich ist für das Restriktionsenzym Kpn1, etwa in der Mitte des Fragments F auftritt, was zu einer Aufteilung in die beiden Subfragmente F1 und F2 führt.

Wie vorhersehbar, ist die Summe der Molekulargewichte der beiden Subfragmente (F 1=3.2: F2=3x10&sup6; Dalton) gleich dem Molekulargewicht des Fragments F (6.2x10&sup6; Dalton) (Fig. 2).

Der genannte genetische Marker (identifiziert durch das Zeichen Kpn F1+F2) ist bei den Virus-Stämmen, die in Europa isoliert wurden, extrem selten und stellt somit ein ausgezeichnetes Charakteristikum zur Identifizierung eines Virusstammes dar.

Herstellung des LomBart-Stammes

Die Quelle für den Marker Kpn F1+F2 ist der Stamm mit der Bezeichnung ADV-53, der in Ungarn 1982 isoliert wurde, der dieses Charakteristikum in natürlicher Weise besitzt.

Um den Marker Kpn F1+F2 in dem Vaccine-Stamm K61 zu induzieren, wurde eine natürliche Rekombination zwischen den beiden Stämmen durch gemeinsame Kultivierung in einer Zellkultur induziert.

Die Zellinie Pk15 wurde gleichzeitig mit einer Kultur, die etwa 10&sup7; Plaque-bildende Einheiten (P.F.U.) des K61-Stammes enthielt, und einer anderen Kultur, die etwa 10&sup7; PFU des ADV-53-Stammes enthielt, infiziert. Nach 1-stündiger Absorption bei 37ºC wurden die nicht-gebundenen Virus-Teilchen durch wiederholtes Waschen entfernt. Die Zellkultur wurde 48 h lang bei 37ºC inkubiert, danach wurde der Kulturüberstand entnommen, zentrifugiert und die so erhaltene Virus-Kultur wurde titriert unter Anwendung des Plaque-Assays auf eine Hühnerembryo-Fibroblast-Kultur. Es wurden mehrere Dutzend Plaques isoliert, das entsprechende Virus wurde auf Pk15-Zellen kultiviert, durch Ultrazentrifugieren gereinigt und die Virus-DNA wurde extrahiert und analysiert durch Agarosegel-Elektrophorese nach der Behandlung mit dem Restriktionsenzym Kpn1.

Die auf diese Weise klonierten Virus-Kulturen zeigen den DNA-Marker F1+F2 und die Deletion des Kpn1-Fragments (Fig. 1) und sie wurden weiter selektioniert und kloniert unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Plaque-Verfahrens und die neue DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Kpn1 und BamHI analysiert.

Die Analyse mit dem BamHI-Enzym bestätigt, daß die Virionen, deren DNA eine Deletion des Fragments Kpn1 aufweist, auch eine Deletion des Fragments Bam7 aufweist, weil diese Fragmente in dem Virus-Genom teilweise einander entsprechen. Auf diese Weise bestätigt die Analyse mit dem Restriktionsenzym BamHI die Anwesenheit der Deletion in der neuartigen kurzen DNA-Region (Us), die ihrerseits für die Deletion des für das Glycoprotein gl codierenden Gens verantwortlich ist.

Schließlich wurde die Virulenz von gl-negativen und F1+F2-positiven Virus-Mutanten untersucht durch Injektion von mindestens 10&sup5; PFU durch intracerebrale Verabreichung an 1 Tag alte Küken; keine dieser Mutanten wies eine Pathogenität auf.

Eine dieser Mutanten wurde auf diese Weise selektioniert, zweimal nach dem Plaque-Verfahren weiter kloniert für alle nachfolgenden Analysen und als "LomBart-Stamm" bezeichnet.

Biologische Eigenschaften des LomBart-Stammes 1) Eigenschaften, die "in vitro" nachweisbar sind

Der Bartha K61-Stamm war selektioniert worden als eine die Aujeszky- Krankheit hervorrufende Virus-Mutante, die beim Kultivieren auf Hühnerembryo-Fibroblasten oder auf Schweinenierenzellen Plaques mit einer geringen Größe (K von "Kicsi = klein im Ungarischen) bildet.

Dagegen bildet der LomBart-Stamm geringfügig größere Plaques als K61 48 h nach der Infektion der Zellkulturen ist es möglich, nach Färbung mit Neutralrot deutlich sichtbare Plaques mit einem Durchmesser von mindestens 1 mm festzustellen. Diese Plaque-Dimension und dieser Plaque-Typ sind auch typisch für andere Vaccine-Stämme (beispielsweise den Stamm 783 (EP 0141458) und DT-B (EP 0263 207B1).

Trotz des Anstiegs der Plaque-Dimension gegenüber dem K61-Stamm, der nach mehr als 72-stündiger Kultur einen Durchmesser von nur 1 mm erreicht, sind die Ränder der Plaques ebenso klar wie diejenigen der durch vollständig virulente Stämme gebildeten Plaques.

Der minimale Titer, der typisch für LomBart-Stamm-Kulturen in stationären Pk15-Zellkulturen ist, beträgt 3-5x10&sup8; PFU/ml.

2) Deletion des gl Glycoprotein-Gens aus dem LomBart-Stamm-Genom

Es wurde oben bereits angegeben, daß die Untersuchung durch Agarosegel-Elektrophorese der LomBart-Stamm-DNA-Fragmente, die durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym Kpn1 erzeugt worden sind, zeigt, daß das Fragment I (entsprechend der Us-Region des Genoms) um etwa 3 Millionen Dalton kleiner ist gegenüber dem virulenten Stamm, so daß es in dem Agarosegel viel schneller wandert (das in der Fig. 1 durch I' angezeigte Fragment).

Diese Deletion hat die gleiche Dimension wie diejenige, die in dem Bartha K61-Stamm vorhanden ist und führt zur Deletion des gl-negativen Gens.

Die Deletion des gl-Gens in dem LomBart-Stamm wird weiter gezeigt durch die Tatsache, daß keines der inokulierten Ferkel jemals eine Serokonversion gegenüber dem gl-Protein nach der endonasalen Infektion aufwies (Tabelle 3). Selbst nach wiederholten intramuskulären Injektionen über 4 Monate hinweg wiesen die Schweine keine Serokonversion gegenüber gl auf.

3) Unschädlichkeit des LomBart-Stammes a) Fehlen einer Pathogenität bei 1 Tag alten Küken

Es wurde mehrfach gezeigt, daß viele für die Aujeszky-Krankheit attenuierte Viren-Stämme nicht-virulent sind für neugeborene Küken (z.B. Bartha K61 und die Thymidinkinase-negativen Stämme), so daß dieser Nachweis routinemäßig verwendet wird zur Durchführung eines Screening (Siebtests) zur Bestimmung der Stamm-Pathogenität. Es ist bekannt, daß die virulenten Stämme oder einige Stämme, die früher in attenuierten Lebend-Impfstoffen verwendet wurden (der BUK-Stamm) die Küken töten, wenn diese in einer Dosis von 10²-10³ PFU intracerebral inokuliert werden.

In den durchgeführten verschiedenen Assays wurden stets Kulturen des LomBart-Stammes, die 10&sup5; PFU/µl enthielten, verwendet. Eine Gruppe von 5 einen Tag alten Küken wurde intracerebral inokuliert (50 µl) und zusammen mit einer ähnlichen Gruppe, die mit 50 µl PBS inokuliert worden war, beobachtet.

Alle inokulierten Küken überlebten die Infektion, ohne daß sie irgendwelche klinischen Symptome zeigten und wuchsen normal auf ebenso wie die Kontrolltiere.

b) Fehlen einer Pathogenität bei Schafen

Schafe sind extrem empfindlich gegenüber dem Aujeszky-Krankheits- Virus und aus diesem Grund wurden sie stets verwendet zur Überprüfung der Unschädlichkeit der Vaccine-Stämme wie Bartha K61.

Die virulenten Aujeszky-Krankheits-Stämme töten Schafe in Dosen unter 10² PFU bei parenteraler Verabreichung.

Beispiel 1

Zur Beurteilung des Fehlens einer Virulenz des LomBart-Stammes bei Schafen wurden bei 5 Schafen intramuskulär in den Nacken 5x10&sup6; Virus-PFU injiziert, diese wurden zur Bestimmung klinischer Symptome und der Körper- Temperatur beobachtet.

Keines der Schafe wies innerhalb eines Zeitraums von zwei Wochen nach der experimentellen Infektion Symptome, einen Gewichtsverlust oder Fieber auf.

c) Fehlen einer Pathogenität bei Ferkeln

Der LomBart-Stamm ist absolut unschädlich für das Schwein.

Beispiel 2

Fünf 7 Wochen alte Ferkel, die aus Krankheits4reien Zuchtfarmen stammten und absolut frei von Antikörpern waren, wurden auf endonasalem Wege mit 2 x 10&sup6; PFU des LomBart-Stammes infiziert. Das Körpergewicht und die Körper-Temperatur wurden 14 Tage lang nach der Infektion täglich bestimmt und es wurden nasale Proben entnommen, um die exkretierten Viren quantitativ zu bestimmen.

Keines der Ferkel wies klinische Symptome oder Fieber auf und es trat auch keine Abnahme des Körpergewichts-Zunahme-Index auf.

Das Virus hatte sich vervielfacht im Bereich der Nasenschleimhaut und wurde in Werten von etwa 10&sup5; PFU/ml 7 bis 8 Tage lang exkretiert: die mittlere Exkretion des LomBart-Stammes ist etwas größer als diejenige, die bei dem Bartha K61-Stamm nachweisbar ist.

Beispiel 3

Es wurde auf genau die gleiche Weise durchgeführt unter Verwendung von vier Wochen alten Ferkeln, die auf endonasalem Wege mit 10&sup7; PFU des LomBart-Stammes infiziert wurden. Auch in diesem Falle blieben die Ferkel absolut frei von klinischen Symptomen, wuchsen normal und der Gehalt an Viren, die auf dem nasalen Wegen exkretiert wurden, betrug etwa 10&sup5; PFU/ml (Fig. 3 und Tabellen 1 und 2).

In beiden Assays erreichte der ELISA-Antikörper-Titer nach 14 Tagen Werte, die von 400 bis 600 variierten, wie er typisch für Ferkel ist, die mit Vaccine-Stämmen infiziert worden sind.

Tabelle 1: Gewicht von 4 Wochen alten Ferklen nach endonasaler Infektion mit10&sup7; PFU des LomBart-Stammes

* Kontroll-Ferkel im Kontakt mit den anderen Tieren

Tabelle 2: Seroconversion von 4 Wochen alten Ferkeln nach endonasaler Infektion mit 10&sup7; PFU des LomBart-Stammes

4) Immunogenität und Schutz-Wirkungsgrad gegenüber Wild-Typ-Infektionen

a) Immunogenität Beispiel 4

10 Wochen alte Ferkel wurden mit einem attenuierten Lebend-Impfstoff, hergestellt aus LomBart-Stamm-Kulturen, in abnehmenden Dosen von 10&sup6; bis 10¹ PFU immunisiert; es wurde gezeigt, daß schon 10 PFU ausreichten, um eine Antikörper-Response in den geimpften Tieren zu induzieren. Der ELISA- Titer der Antikörper variierte von 100 bis 800 ohne Korrelation mit der Impfstoff-Dosis. Wenn die Ferkel 1 Monat nach der ersten Injektion einer Auffrischungs-Impfung unterworfen wurden, war es möglich, einen Anstieg der sekundären Antikörper festzustellen, der charakterisiert war durch einen ELISA- Antikörper-Gehalt, der von 800 bis 3200 variierte (Tabelle 3).

Tabelle 3

Immunogenität des LomBart-Stammes: 10 Wochen alte Ferkel, die zweimal (in einem Abstand von 30 Tagen) mit abnehmenden Dosen des Virus geimpft worden waren

ELISA-Titer, ausgedrückt als Log2±-Standardabweichung-Gruppen von 5 Schweinen

1. Impfung

2. Impfung

b) Schutz durch den Impstoff Beispiel 5

In Versuchen, die nach dem klassischen Versuchsprotokoll für die Bewertung von Impfstoffen gegen die Aujeszky-Krankheit durchgeführt wurden, wurden Gruppen von fünf 10 Wochen alten Ferklen mit einem Impfstoff geimpft, der 10&sup5; PFU des LomBart-Stammes enthielt; nach 4 Wochen wurden die geimpften Schweine und die ungeimpfte Kontrollgruppe (5 Tiere pro Gruppe) auf endonasalem Wege mit 10&sup4; PFU des virulenten Virus (dem Rice-Stamm) infiziert.

Nach der experimentellen Infektion wiesen die Kontroll-Schweine starke Symptome der Aujeszky-Krankheit auf: einen Wach stumsstopp für 10 bis 12 Tage, Fieber > 41ºC, Atmungsstörungen für viele Tage, Atmungs-Symptome für mehr als 1 Woche, Nerven-Symptome bei 1 bis 2 Tieren in jeder Gruppe mit nachfolgendem Tod der betroffenen Schweine.

Dagegen waren bei der geimpften Gruppe die klinischen Symptome stark vermindert: der Wachstumsstopp war auf 1 bis 3 Tage beschränkt, das Fieber war niedrig (< 41ºC) in Abwesenheit irgendwelcher Atmungs- und Nerven-Symptomatologie und kein Todesfall (Fig. 4).

Die nasale Exkretion des Wild-Typ-Virus war nur geringfügig vermindert nach einer einzigen Impfung: die Exkretion hielt etwa 10 Tage an (im Vergleich zu 15 Tagen bei den nicht-geimpften überlebenden Schweinen) und auch die Gesamtmenge an eliminiertem Virus war vermindert.

In weiteren Versuchen wurden die Schweine zweimal in einem Abstand von 4 Wochen geimpft, dann nach weiteren 4 Wochen infiziert: in diesem Fall wurde offensichtlich zusätzlich zu dem Gesamtschutz gegen klinische Symptomatologie und gegen Fieber eine weitere Abnahme der nasalen Exkretion des Wild-Typ-Virus festgestellt: die Dauer der Eliminierung lag unter 8 Tagen und die Virus-Titer betrugen weniger als 1 bis 2 Logarithmen, verglichen mit den Kontroll-Tieren.

Die Schutz-Wirkung, welche die attenuierten Lebend-Impfstoffe auf Basis des LomBart-Stammes bieten, ist daher vergleichbar mit derjenigen, die unter den gleichen Versuchs-Bedingungen mit lmpfstoffen auf Basis von Thymidenkinase-negativen Stämmen festgestellt wurde.

c) Zunahme des lmpfschutzes gegenüber dem Bartha K61-Stamm Beispiel 6

Die höhere Immunogenität des LomBart-Stammes im Vergleich zu dem Bartha K61-Stamm kann indirekt zurückgeführt werden auf seine Eigenschaft, Plaques mit einem größeren Durchmesser in Hühner-Embryo-Fibroblasten zu bilden.

Um experimentell zu überprüfen, daß der LomBart-Stamm mehr Schutz bietet, wurde er im Vergleich zu dem Bartha-Stamm in Lebend-Impfstoffen, die niedrige Virus-Titer enthielten, getestet, um die nachweisbaren Immunogenitäts-Unterschiede zu verstärken.

Es wurden vier Gruppen von 6 zehn Wochen alten Ferkeln mit Impfstoffen auf Basis des LomBart-Stammes oder des K61-Stammes geimpft, zwei Gruppen in einer Dosis von 10 PFU/Tier (1 LomBart + 1 K61), die andere Gruppe in einer Dosis von 10²/PFU/Tier. Nach 4 Wochen wurden die geimpften Schweine auf endonasalem Wege mit 10&sup4; PFU des virulenten Virus infiziert.

Keines der mit Produktes auf Basis des LomBart-Stammes geimpften Schweine wies klinische Symptome auf. Die mit dem K61-Stamm geimpften Schweine wiesen starke Atmungs-Symptome und eine gewisse Verzögerung des Wachstums auf, alles in einer ausgeprägteren Weise bei den Tieren, die mit niedrigeren Dosen geimpft worden waren (Fig. 5 und Tabelle 4).

Tabelle 4: Anzahl der Schweine mit starken Atmungs-Symptomen nach der experimentellen Infektion (Gruppen von 6 Schweinen) Schweine, die mit dem LomBart-Stamm oder dem Bartha-Stamm geimpft worden waren

Herstellung von Impfstoffen aus dem LomBart-Stamm Beispiel 7 Herstellung eines attenuierten Lebend-Impfstoffes gegen die Aujeszky-Krankheit aus dem LomBart-Stamm A. Kultivierung des Virus

Zellen der kontinuierlichen Zellinie Pk15, die in Monoschichten kultiviert worden sind, werden mit dem LomBart-Stamm infiziert. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC ist der durch das Virus verursachte cytopathische Effekt bereits sichtbar. Nach weiterem 48-stündigem Wachstum wird die Virus-Kultur gesammelt, die Zellen und Zellbruchstücke werden durch Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge entfernt, der Kulturüberstand wird mit einem gleichen Volumen des Stabilisators SPGA gemischt und bei -70ºC eingefroren.

Die Titrierung des Virus-Gehaltes wird bei Pk15-Zellen mit einem aliquoten Anteil der Virus-Kultur durchgeführt.

Wenn einmal das Ergebniss der Titrierung erhalten worden ist, wird die Virus-Kultur schnell aufgetaut und auf Phiolen für die Lyophilisierung verteilt, nachdem eine Verdünnung durchgeführt worden ist, um einen Titer am Ende der Lyophilisierung von nicht unter 10&sup5; TCID&sub5;&sub0;/Dosis Impfstoff zu erhalten. Der Impfstoff wird dann lyophilisiert unter unter Vakuum am Ende des Verfahrens verpackt.

Beispiel 8 Herstellung eines gegen die Auieszky-Krankheit inaktiven Impstoffes aus dem LomBart-Stamm

Suspensionskulturen der kontinuierlichen Zellinie BHK-21 werden mit dem LomBart-Stamm infiziert; nach 40- bis 48-stündigem Wachstum werden die Zellen und Zellbruchstücke durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren entfernt, es wird eine Probe aus der das Virus enthaltenen Flüssigkeit entnommen zur Durchführung einer Virus-Titrierung.

Diese Kultur wird 12 h lang bei 37ºC mit binärem Ethylenimin behandelt, um das Virus zu inaktivieren. Am Ende des Inaktivierungs-Verfahrens wird ein aliquoter Anteil entnommen zur Kontrolle der Virus-Inaktivierung, während das Antigen bei 4ºC gehalten wird.

Am Ende des Titrierens wird das Antigen bei einem Tier von mindestens 10&sup9;TCID&sub5;&sub0;/Dosis, berechnet aus der nicht-inaktivierten Kultur, an Aluminiumhydroxid adsorbiert, das in einem Autoklaven sterilisiert worden ist, zur Herstellung des inaktiven Virusm, das an einem Aluminiumhydroxidgel adsorbiert ist.

Alternativ kann das Antigen bei einem Tier von mindestens 10&sup8;TCID&sub5;&sub0;/Dosis mit oberflächenaktiven Verbindungen (z. B. Mannitmonooleat, Sorbitanmonooleat, Tween 80, Span 80) und mit Mineral- oder Pflanzenölen oder mit einer Mischung derselben versetzt und dann mit einem Homogenisator (Ultra Turrax, Silverson oder einem anderen Typ) emulgiert werden zur Herstellung eines inaktiven emulgierten Impfstoffes.


Anspruch[de]

1. Pseudorabies-Virus, stammend von der Rekombination des Bartha K61-Stammes mit einem Stamm, der den genetischen Marker Kpn F1+F2 trägt.

2. Virus nach Anspruch 1, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Nummer V94012710.

3. Lebende oder inaktivierte Vaccinen gegen Schweine-Pseudorabies, die ein Virus nach Anspruch 1 oder 2 umfassen.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com