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Dokumentenidentifikation DE69223931T2 30.04.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0545315
Titel Reagenszusammensetzungen und ihre Verwendung bei der Identifizierung und Charakterisierung von Retikulozyten in Vollblut
Anmelder Bayer Corp., Pittsburgh, Pa., US;
The Mount Sinai School of Medicine, New York, N.Y., US
Erfinder Fan, Sophie S., Milwood, New York 10546, US;
Ben-David, Daniel, Shrub Oak, New York 10588, US;
Collela, Gregory M., Bloomfield, New Jersey 07003, US;
Cupo, Albert, Scarsdale, New York 10583, US;
Fischer, Gena, Harrington Park, New Jersey 07640, US;
Ornstein, Leonard, White Plains, New York 10607, US
Vertreter Zobel, M., Dipl.-Chem. Dr., Pat.-Anw., 51061 Köln
DE-Aktenzeichen 69223931
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 27.11.1992
EP-Aktenzeichen 921203097
EP-Offenlegungsdatum 09.06.1993
EP date of grant 07.01.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.04.1998
IPC-Hauptklasse G01N 15/14
IPC-Nebenklasse G01N 1/30   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betriff Reagenszusammensetzungen und deren Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung von Zellen in Proben von Vollblut, insbesondere betrifft die Erfindung Beagenszusammensetzungen und deren Verwendung zur (i) Identifizierung von Retikulozyten und zur (ii) gleichzeitigen Messung von Volumen, Hämoglobin-Konzentration und Hämoglobin-Gehalt großer Zahlen einzelner Retikulozyten und Erythrozyten in einer Vollblutprobe durch Lichtstreu- und Fluoreszenz- Fließzytometrieverfahren.

Bei allen höheren Lebewesen besteht Blut aus einem wässrigen flüssigen Anteil (dem Plasma), worin Korpuskel verschiedener Arten suspendiert sind: die roten Blutzellen (Erythrozyten), die weißen Blutzellen (Leukozyten) und die Blut-Plättchen. Plasma weist eine Zusammensetzung aus ca. 90% Wasser, 9% Protein, 0,9% Salzen und Spuren weiterer Materialien wie Zucker, Harnstoff, Harnsäure und dgl. auf.

Die Zellen oder Korpuskel des peripheralen Bluts (d.h. des Bluts ausserhalb des Knochenmarks) werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: die Erythrozyten, deren Primärzweck der Transport von Sauerstoff ist, und die Leukozyten, deren Primärfunktionen das Immunsystem und die Zerstörung von körperfremden Materialien betreffen. Zusätzlich zu diesen beiden Hauptgruppen enthält das Blut auch die sogenannten Blut-Plättchen, die bei Hämostasie wichtig sind.

Die Endstufen der Erythrozytreifung erfolgen nach deren Freisetzung aus dem Knochenmark, wobei diese Zellen im peripheralen Blut zirkuliert werden. Diese jungen roten Zellen, oder "Retikulozyten", haben ihren Kern verloren, und somit ihre Befähigung zur Teilung oder zur Synthese von Ribonucleinsäure (RNA) . Obwohl diese Funktionen aufgehört haben, sind Retikulozyten immer noch metabolisch aktiv und zur Synthese von Protein befähigt, indem sie Eisen zur Häm-Synthese aufnehmen und die notwendigen metabolischen Reaktionen durchführen, die zur Aufrechterhaltung eines energiereichen Zustands erforderlich sind. Diese Zellen lassen sich gewöhnlich leicht von reifen Erythrozyten unterscheiden, indem man sie Lösungen kationischer Farbstoffe aussetzt, die mit der anionischen RNA in den Retikulozyten reagieren und in ein feines oder grobes gefärbtes "Retikulum" innerhalb der Retikulozyten ausgefällt werden, was den Retikulozyten ihren Namen gibt.

Obwohl Retikulozyten normalerweise nur ca. 0,5 bis 2% der gesamten roten Blutzellpopulation ausmachen, kann sich dieser Prozentsatz unter abnormen Bedingungen drastisch verändern. Beispielsweise sind Retikulezyt-Zählungen viele Jahre lang als eine diagnostische Hilfsmaßnahme zur Untersuchung von Blutdyscarsien, als ein Index der Regeneration roter Blutzellen im Anschluß an Hämorrhage sowie zur Erfassung und Verfolgung früher Toxizität bei Chemotherapie bestimmter bösartiger Erkrankungen herangezogen worden.

Nucleinsäuren (RNA und DNA) sind Polyanionen, die mit praktisch jedem kationischen Farbstoff gefärbt werden können. Die RNA in Retikulozyten kann nur mit wenigen kationischen Farbstoffen (einschließlich Brilliant-Kresylblau (BCG), Neu-Methylenblau (NMB), Auramin O (AuO), Acridin- Orange (AO), Thiazol-Orange (TO) und Pyronin Y (PY)) gefärbt werden. Unter diesen Farbstoffen kann nur eine Untergruppe dazu gebracht werden, die Zellen rasch zu durchdringen (und dabei zu färben). Die Untergruppe schließt NMB und AO ein. Umsatz und Ausmaß der Färbung von Retikulozyten hängen von der extrazellulären Konzentration des Farbstoffs, der Eindringgeschwindigkeit des Farbstoffs durch die Retikulozytmembran sowie der Stärke der spezifischen Bindungskonstante zwischen dem kationsichen Farbstoff und der Retikulozyt-RNA ab. Die letzteren beiden Eigenschaften unterscheiden sich und sind nicht leicht vorhersagbar für jeden Farbstoff, so daß Versuche rein auf Basis von Versuch und Irrtum notwendig sind, um geeignete Retikulozyt-Färbungen herauszufinden. Nicht alle kationischen Substanzen sind dazu befähigt, intakte rote Zell- (und Retikulozyt)membranen zu durchdringen, und die Natur der Anionen, die notwendigerweise die Kationen begleiten, kann bewirken, ob oder ob nicht die kationische Substanz rasch, langsam oder überhaupt nicht eindringt. Hydrophobe Moleküle durchdringen im allgemeinen rote Zellmembranen rascher als hydrophile Moleküle und kleine Moleküle durchdringen im allgemeinen Membranen schneller als große Moleküle. Nur eine Untergruppe von Salzen oder Puffermitteln, die mit diesen kationischen Farbstoffen vermischt sind, die nun Retikulozyten zu färben vermögen, ermöglicht eine rasche Färbung; d.h., der "richtige" Farbstoff mit dem "falschen" Puffer kann für immer" verhindern, Retikulozyten zu färben Erneut sind Testreihen auf Basis von Versuch und Irrtum notwendig, um geeignete Formulierungen bzw. Zubereitungen von Retikulozyt-Färbungsmischungen herauszufinden und bereitzustellen. Somit ist es, trotz verschiedener "Regeln", die sich als Richtlinien heranziehen lassen, immer noch nicht möglich, von vornherein vorauszusagen, ob und unter welchen Bedingungen ein besonderer kationischer Farbstoff rasch einzudringen und Retikulozyten zu färben vermag.

Das grundsätzliche Konzept der Fließzytometrie beruht im wesentlichen darauf, Zellen, 1 zu einem Zeitpunkt, durch einen spezifischen Fühlbereich laufen zu lassen. In typischer Weise läßt man, mittels hydrodynamischer Fokussierung, einzelne Zellen durch die Fühlzone laufen, die aus einer fokussierten Lichtquelle und einem Nachweissystem für die Messung gestreuten, absorbierten oder fluoreszenten Lichts besteht. Die Wirkung, die ein Partikel auf das Licht ausübt, durch welches es hindurchgeht, kann auf verschiedene Weise nachgewiesen werden. Im allgemeinen weist das Teilchen einen Brechungsindex auf, der sich von dem Medium unterscheidet, in welchem es suspendiert ist. Es wird daher Licht, mit dem es beleuchtet wird, durch einen Bereich von Winkeln und mit variierenden Intensitäten streuen, welche von diesem Brechungsindexunterschied, der Partikelgröße, dessen Form und internen Abweichungen bei Brechungsindex und Struktur sowie von der Wellenlänge des Beleuchtungslichts abhängen (für homogene Kugeln liefert die Mie-Streutheorie eine vollständige Beschreibung der Verteilung und Intensitäten von gestreutem Licht). Ein Partikel kann auch ein wenig des einfallenden Lichts absorbieren. Im letzteren Fall kann ein Teil des absorbierten Lichts als Fluoreszenz reemittiert werden, und zwar in typischer Weise bei einer längeren Wellenlänge als die Wellenlänge des absorbierten Lichts.

Diese und weitere Effekte können mit Licht-Detektoren gemessen werden, die angeordnet sind, um unterschiedliche Winkelintervalle von gestreutem, ungestreutem und fluoreszentem Licht zu messen.

Sind Partikel so klein wie Zellen, in typischer Weise mit einem Durchmesser von weniger als 15 µm, kann die Anzahl an Photonen im Beleuchtungsstrahl sehr klein sein, die durch deren Passage bei hoher Geschwindigkeit (in typischer Weise hunderte bis tausende weiträumige Zellen pro Sekunde) beeinflußt werden, und insbesondere verglichen mit der Anzahl von Photonen pro Sekunde, die auf den beleuchteten Teil des Suspensionsstroms fallen (und verglichen mit der Hintergrundbeleuchtung eines Absorptionsdetektor (und sogar eines Fluoreszenzdetektor) ). Daher hängen die Empfindlichkeitsgrenzen des Nachweises kleiner besonderer Unterschiede zwischen Partikeln in kritischer Weise vom Photonenfluß (der mindestens von der intrinsischen "Helligkeit" der Lichtquelle abhängt) und von der Größe der Störungen des Photonenflusses ab, die durch weitere kleine und große Unterschiede zwischen Partikeln erzeugt werden.

Die Hauptquellen von Störungsrauschen bei bzw. in Absorptions-, Streu- und Fluoreszenz-Fließzytometriesignalen können für jede Art von Signalen ziemlich unterschiedlich sein. In erster Näherung sind die Größen von Fluoreszenzsignalen aus gefärbten oder ungefärbten Zellen nahezu unbeeinflußt von Form oder Orientierung der Zellen, aus denen die Signale heraustreten, wogegen Streu- und Absorptionssignale sehr stark von Form und Orientierung beeinflußt sind. Als ein Extrembeispiel übt die native bikonkave Form menschlicher Erythrozyten eine tiefe Wirkung auf die Ansorptions- und Streusignale aus, die sie erzeugen, wobei es sich um Effekte handelt, die größer als die kleinen Absorptionssignale typischer, klassisch gefärbter Retikulozyten sind. Dies stellt den Hauptgrund dafür dar, warum, vor der vorliegenden korrespondierenden Erfindung, die in der US-Anmeldung mit der Anmeldenummer 07/802.593 mit der Bezeichnung "Reagent Compositions and Their Use in the Identification and Characterization of Reticulocytes in Whole Blood", gleichzeitig hiermit eingereicht und den Berechtigten der vorliegenden Erfindung zugeordnet, beschrieben ist, Absorptionsfließzytometrieverfahren zur Retikulozyt- Zählung oder ganz allgemein zur Messung niedriger Konzentrationen absorbierender Moleküle in Zellen nicht angewandt worden sind. Andererseits haben nur schwach fluoreszente Materialien in Zellen oder (z.B. ungebundene Fluoreszenz-Farbstoffe) in ihrem Umgebungsmedium eigentlich keine Auswirkung auf Absorptions- oder Streusignale.

Bei der Fluoreszenz-Fließzytometrie wird also, wenn die Lichtquelle genügend intensiv und Streulicht und System-Fluoreszenz minimiert sind, die Empfindlichkeitsgrenze zur Unterscheidung selektiv gefärbter Zellen von ungefärbten Zellen duch die Relativgröße der auftretenden "Hintergrund-Fluoreszenz" aus den Komponenten innerhalb der ungefärbten Zelle und/oder vom Niveau der Fluoreszenz des Medium im Probenstrom festgelegt, der die gefärbten und ungefärbten Zellen umgibt. Bei Retikulozyt- Färbungen liegt immer etwas Gleichgewichtskonzentration von Farbstoff in Lösung im Probenstrom vor, der die Zellen umgibt. Für ein gegebenes Niveau von Bindung an Retikulum-RNA sinkt das Verhältnis von externem Farbstoff zu Retikulum-gebundenem Farbstoff ab, und zwar in dem Maße, wie die spezifische Bindungskonstante des Farbstoffs an RNA ansteigt. Deshalb gilt, daß, je höher die Bindungskonstante ist, die notwendige externe Farbstoff-Konzentration und das "Hintergrund"-Signal umso niedriger und das Signal/Rausch-Verhältnis umso höher sind. Es wird auch, wenn die Fluoreszenzwirksamkeit des ungebundenen Farbstoffs niedriger als die Fluoreszenzwirksamkeit des Retikulum-gebundenen Farbstoffs ist, ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht. Tatsächlich hängen die Verfahren, in denen AuO, TO und Thioflavin T verwendet werden, von Unterschieden bei der gebundenen und ungebundenen Fluoreszenzwirksamkeit ab. Die im folgenden beschriebenen bevorzugten Verfahren hängen jedoch bezüglich des erreichten hohen Signal/Rausch-Verhältnisses und in 1 Fall bezüglich der niedrigeren nicht-spezifischen Fluoreszenz ungefärbter Zellen bei langen (roten) Wellenlängen hauptsächlich von hohen spezifischen Bindungskonstanten ab.

Es sind verschiedene halbautomatisierte Verfahren verfügbar, die zur Zählung des Prozentsatzes von Retikulozyten in einer antikoagulierten Probe von Vollblut anwendbar sind. Bei jedem der bestehenden Verfahren wird ein Verdünnungsmittel verwendet, das einen organischen kationischen Farbstoff, wie AO, AuO oder TO, enthält, um die RNA innerhalb der Retikulozyten zu färben Der Farbstoff durchdringt die Zellmembran und wird an die RNA gebunden, wobei gewöhnlich ein "Retikulum" innerhalb jedes Retikulozyt ausfällt. Die Menge des Signals aus gefärbter RNA ist grob proportional zum RNA-Gehalt. Nach entsprechender Färbung kann ein Fluoreszenz-Fließzytometer, das mit einer geeigneten Anregungslichtquelle (in typischer Weise einem Argonion-Laser, der bei 488 nm emittiert) und einem Emissionsnachweissystem ausgerüstet ist, zur Bestimmung des Prozentsatzes von Retikulozyten im Effluens herangezogen werden.

Es sind beispielhafte Verfahren zur Unterscheidung von Retikulozyten in Vollblutproben unter Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen und Anwendung von Fließzytometrieverfahren in der Patentliteratur offenbart.

Beispielsweise ist in US 3.684.377 von Adams und Kamentsky eine Farbstoffzusammensetzung zur differentiellen Blutanalyse offenbart, welche eine wässrige Lösung von AO enthält und einen pH-Faktor und eine Osmolalität innerhalb normaler physiologischer Bereiche für Humanblut aufweist. Die Farbstoffzusammenetzung kann zur Zählung von Retikulozyten durch Messung von An- oder Abwesenheit eines Fluoreszenzsignals mit einem Erythrozyt-Streusignal verwendet werden.

In US 3.883.247 von Adams ist ein ähnliches Verfahren wie das von Adams und Kamentsky offenbart, wobei eine Farbstoffzusammensetzung zur Anwendung gelangt, die AO mit einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup9; g/ml enthält.

US 4.336.029 von Natale offenbart eine Reagenszusammensetzung, die eine wässrige Lösung des Farbstoffs AO, Zitration und Paraformaldehyd bei einem pH-Wert von ca. 7,4 und bei isotonischer Osmolalität umfaßt. Die Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile wurden so ausgewählt, daß die Farbstoffaufnahme der Retikulozyten und Plättchen maximiert ist, und daß es ferner vorgesehen ist, daß die Farbstoffaufnahme innerhalb von 2 bis 5 Minuten der Vermischung von Blutprobe und Reagenszusammensetzung erfolgt. Ein automatisiertes Verfahren zum Nachweis von Plättchen und Retikulozyten unter Verwendung des Natale-Reagens ist in US 4.325.706 von Gershman et al. offenbart.

Im in US 4.707.451 von Sage Jr. offenbarten Reagens werden Retikulozyten mit Thioflavin T oder Chrysanilin gefärbt. Es erwies sich, daß eine Vollblutprobe wirksam gefärbt wurde, und zwar durch Vermischen einer 25 µl Anteilsmenge des Farbstoffs in einer isotonischen Kochsalzlösung (0,2 mg/ml) mit 10 µl antikoaguliertem Vollblut, wobei die Mischung ca. 7 Minuten lang inkubiert wurde.

US 4.883.867 von Lee et al. offenbart eine Farbstaffzusammensetzung zur Färbung von RNA oder DNA. Die Färbezusammensetzung enthält TO als die bevorzugte Farbstoffverbindung. Die Retikulozyten werden in einer Minimalzeit von 30 Minuten gefärbt.

Ein Reagens zur Retikulozyt-Zählung mit Fließzytrometrieverfahren ist in US 4.971.917 von Kuroda beschrieben, wobei das Reagens ein Carbonat-Salz enthält, um die nicht-spezifische Färbung der reifen Erythrozyten durch den Farbstoff, z.B. AuO, herabzusetzen, um zu verhindern, daß die reifen Erythrozyten irrtümlich als Retikulozyten bei der Analyse durch Fluoreszenz-Fließzytometrie gezählt werden.

US 4.981.803 beschreibt ein Reagens zur Retikulozyt-Zählung, welches zwei Lösungen umfaßt, nämlich eine Vorratslösung zur Färbung, worin ein Farbstoff AuO in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel gelöst ist, sowie eine Puffer-Lösung zur Einstellung optimaler Färbungsbedingungen.

Ein weiteres Retikulozyt-Färbungsreagens für Fluoreszenz- Fließzytometrieverfahren, welches AuO enthält, ist in US 4.985.176 von Kuroda et als offenbart. Diese Literaturstelle enthält die technische Lehre einer Inkubationszeit von Reagens und Probe über eine Zeitspanne von 30 Sekunden bis 20 Minuten.

Wie oben bereits festgetellt, vermag nur eine kleine Untergruppe kationischer Farbstoffe Retikulozyten selektiv zu färben, und eine nur noch kleinere Untergruppe dieser Farbstoffe durchdringt Retikulozyten rasch. Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten kationischen Farbstoffverbindungen färben die Retikulozyten in weniger als 5 Minuten, so daß eine Retikulozyt-Analyse durch Fließzytometrie kurz nach der Vermischung von Blutprobe und Reagenszusammensetzung durchgeführt werden kann, wodurch sich der vorliegende Erfindungsgegenstand rasch und einfach auf automatisierte Verfahren anwenden läßt.

Quaternierte AO-Derivate zur quantitativen Bestimmung von Retikulozyten sind in der korrespondierenden US-Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 07/444,255, eingereicht am 12. januar 1989 von Fan und Fischer mit der Bezeichnung "Compounds and Reagent Compositions and Their Use in the Quantitative Determination of Reticulocytes in Whole Blood" beschrieben. Diese Anmeldung führte zum US-Patent 5.075.556 vom 24.12.1991, welches durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. Das US-Patent korrespindiert ebenfalls mit EP 0 430 719. Das Reagens von Fan und Fischer enthält 10&supmin;&sup6; g/ml eines AO-Derivats in einer Puffer-Lösung, die ihrerseits Paraformaldehyd und Kahumoxalat enthält. Diese Reagenszusammensetzung färbt Retikulozyten zur quantitativen Fluoreszenz-Fließzytometrieanalyse von Retikulozyten in einer Blutprobe. Weder dieses Reagens noch eines der oben genannten Reagentien enthalten ein Kugelbildungsmittel zur Verhinderung der oben diskutierten Probleme, die mit Orientierungsrauschen zusammenhängen, und sie ermöglichen auch nicht die gleichzeitige Bestimmung weiterer diagnostisch signifikanter Parameter, wie die des Volumen und der Hämoglobin-Konzentration der Retikulozyten und Erythrozyten auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis.

Shapiro und Stevens offenbaren die Verwendung von Oxazin 750 zur Bestimmung des DNA-Gehalts durch Fließzytometrie in Flow Cytometry of DNA Content Using Oxazine 750 or Related Laser Dyes With 633 nm Excitation, Cytometry, Vol 7, s. 107-110 (1986). Die Zellen werden mit 10 bis 30 µMol Oxazin 750 gefärbt und durch die Zufügung von Ethanol zur DNA- Bestimmung fixiert. Shapiro und Stevens beanspruchen, daß Oxazin 750 nicht auftritt, um RNA innerhalb der Zellen zu färben Darüber hinaus ermöglichen es solche mit Oxazin 750 durchgeführten Protokolle nicht, Retikulozyten zu zählen oder weitere diagnostisch signifikante Parameter roter Blutzellen wie des Volumen und der Hämoglobin-Konzentration auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis gleichzeitig zu bestimmen.

Wie oben erwähnt, weisen rote Blutzellen menschlicher und vieler weiterer Säugetiere die Form bikonkaver Scheiben auf. Die Menge an durch solche asymmetrischen roten Blutzellen gestreutem Licht schwankt mit der Orientierung der Zellen. Demzufolge erzeugen zwei identische rote Blutzellen sehr unterschiedliche gestreute Lichtsignale, wenn sie durch die Fühlzone laufen, es sei denn ihre Orientierungen in der Zone sind identisch. Zwei rote Blutzellen, die identisch sind, mit der Ausnahme, daß in einer eine kleine Menge von gefärbtem Retikulum vorliegt, erzeugen im allgemeinen große Signalunterschiede auf Streulichtdetektoren wegen ihrer unterschiedlichen Orientierungen.

In US 4.575.490 und 4.412.004 von Kirn und Ornstein ist die technische Lehre für ein Verfahren zur Beseitigung von Orientierungsrauschen bei der Messung des Volumen roter Blutzellen in einem Fließzytometer enthalten. Deren Verfahren beinhaltet, daß man ungefärbte rote Blutzellen isovolumetrisch in die Kugelform überführt, um jegliche Orientierungsunterschiede zwischen den Zellen zu beseitigen, um eine zuverlässigere und genauere Messung des Zellvolumen zu ermöglichen. Jede rote Blutzelle wird aus einer bikonkaven Form in eine perfekte Kugelform mit einem oberflächenaktiven Kugelbildungsmittel überführt. Ein "pufferndes" Proteinund/oder Aldehyd-Fixierungsmittel werden zusammen mit dem Kugelbildungsmittel verwendet, um die Lysis der Erythrozyten zu verhindern. Die von Kim und Ornstein beschriebenen oberflächenaktiven Mittel können nicht zusammen mit Retikulozyt-Färbungen verwendet werden, weil es sich, wie von den hier auftretenden Erfindern herausgefunden, erwiesen hat, daß sie mit den kationischen Farbstoffen, die zur Färbung und Ausfällung des Retikulum verwendet werden, rasch reagieren und aufallen.

In JP-84-0201273, entsprechend JP 1 079163, von TOA Medical Electronics Co., Ltd., ist ein Reagens zur Messung von Blutzellen offenbart, welches aus einem kationischen oder nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel zur Überführung roter Blutzellen in die Kugelform, aus einem Fixierungsmittel und einem basischen Fluoreszenz-Farbstoff besteht. Das TOA-Reagens enthält ein Fixierungsmittel, z.B. Glutaraldehyd.

In US 4.735.504 von Tycko ist der für rote Blutzellen vorgesehene Kanal des TECHNICON H 1 Systems offenbart, und zwar ein Fließzytometer, welches ein voll automatisiertes Verfahren sowie Mittel bzw. Maßnahmen zur Bestimmung der individuellen und durchschnittlichen Erythrozyt- Volumina (MCV) sowie individueller und durchschnittlicher Korpuskular- Hämoglobinkonzentrationen (MCHC) der Eryhtrozyten in einer antikoagulierten Vollblutprobe bereitstellt. Bei diesem Verfahren werden die roten Blutzellen in einer 2 µl Anteilsmenge einer Vollblutprobe zuerst verdünnt und dann unter Anwendung des eben beschriebenen Verfahrens von Kim und Ornstein isovolumetrisch in die Kugelform überführt. Nach einer Inkubationsdauer von 20 Sekunden laufen die Zellen, im wesentlichen 1 zu einem Zeitpunkt, durch die beleuchtete Meßzone innerhalb des für die roten Zellen vorgesehenen Kanals des Analysiergeräts. Es wird die Größe des Lichts gemessen, das durch diese Zellen in zwei getrennte Winkelintervalle gestreut wird. Die Auswahl von Lichtquelle und Nachweiswinkeln sind bei dieser Anwendungsform kritisch. Ist die Lichtquelle ein Helium-Neon- Laser, der Licht bei 633 nm emittiert, betragen die beiden Streulichtsammelwinkelintervalle 2 bis 3 Grad (2 - 3º) und 5 bis 15 Grad (5 - 15º). Sobald der Gehalt des gestreuten Lichts in jedem Intervall für eine Zelle bekannt ist, werden Volumen und Hämoglobin-Konzentration für diese Zelle durch Vergleich mit durch die Mie-Streutheorie vorhergesagten Werten ermittelt. Das Volumen (V) und die Hämoglobin-Konzentration (HC) für jede Zelle werden im Gedächtnis abgespeichert, und es werden MCV und MCHC bei der Beendigung des Probenmeßzyklus durch im Stand der Technik bekannte Verfahrensweisen berechnet, wie dies bei Tycko diskutiert ist. Das V- und HC-Verteilungszytogramm und die V- und HC-Histogramme werden unter Anwendung dieser Berechnungen erstellt.

Bei keinem der obigen Verfahren kann zwischen Retikulozyten und Nicht-Retikulozyten unterschieden werden, und die früher beschriebenen und durchgeführten Verfahren können nicht dazu angewandt werden, die diagnostisch signifikanten Parameter der Retikulozyten und Erythrozyten wie Volumen und Hämoglobin-Konzentration auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis getrennt zu bestimmen.

Eine weitere Schwierigkeit bei Ermittlung und Aufzeichnung von Retikulozyt-Zählungen mit einem Fließzytometer beruht darauf, zwischen Retikulozyt-Nachweissignalen, Signalen reifer roter Blutzellen und Systemrauschen zu unterscheiden. Die gefärbten Stränge von RNA sind bei jungen Retikulozyten zahlreich und erzeugen relativ große Signale beim Nachweis mit einem Fließzytometer. Allerdings enthalten reifere Zellen weniger gefärbte RNA und erzeugen kleinere Signale, die durch das Rauschen des Fließzytometer-Meßsystems maskiert sein können.

Es beteht ein Bedarf für Verfahren und Reagentien zur Identifizierung von Retikulozyten und zur getrennt durchgeführten gleichzeitigen Messung von Volumen, Hämoglobin-Konzentration und Hämoglobin-Gehalt von Retikulozyten und Erythrozyten in einer Vollblutprobe durch Lichtstreu- und Absorptions- oder Fluoreszenz-Fließzytometrieverfahren.

Ausgangspunkt unserer Überlegungen war es, daß wir einen kationischen Farbstoff in einer Variante des gut bekannten Standes der Technik zur Färbung des Retikulum verwenden wollten. Wir waren auch daran interessiert, Fließzytometrieverfahren zu entwickeln, die Fluoreszenz zum Nachweis von Retikulozyten nutzen konnten. Wir hatten auch die Hoffnung, durch Anwendung isovolumetrischer Kugelbildung und der vorgenannten Verfahrensweisen von Tycko im Hinblick auf ein Fluoreszenzverfahren dazu befähigt zu werden, Retikulozyten sowie das Volumen reifer roter Zellen und Hämoglobin auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis mit einem Reagens gleichzeitig zu messen, welches ebenfalls Retikulozyten selektiv färbte. (Es sei angemerkt, daß, falls die Kugelbildung vollständig, nicht isovolumetrisch, aber mit einem bekannten Faktor X der Isotonizität abläuft, unter Anwendung des Verfahrens von Tycko mit einer Korrektur um 1/x für das Volumen und mit einer Korrektur um X für die Protein-, z.B. Hämoglobin-, Konzentration Originalwerte berechnet werden können.)

Zur Anwendung des Verfahrens von Tycko ist eine Lichtquelle erforderlich, die monochromatisches Licht in einem Bereich emittiert, wo Hämoglobin sehr durchsichtig ist; dabei handelt es sich in sehr typischer Weise um eine Lichtquelle wie einen roten Helium-Neon-(HeNe)-Laser oder um einen Laser mit einer sogar noch längeren Wellenlänge. Dies bedeutet, daß, falls diese Wellenlänge für die Absorptionsmessung auch herangezogen wird, der Farbstoff ein blauer Farbstoff mit einer starken Absorption von rotem Licht sein muß.

Soll derselbe Farbstoff für Fluoreszenz verwendet werden, muß er einen vernünftig hohen Quantenwirkungsgrad und eine entsprechende Stoke's Verschiebung sowie eine hohe Bindungskonstante aufweisen, so daß er bei einer genügend niedrigen Konzentration verwendet werden kann, so daß Strom-Fluoreszenz das Fluoreszenzsignal Rauschverhältnis nicht in unannehmbarer Weise verschlechtert. Es wurde herausgefunden, daß Oxazin 750 nicht nur die Bedingungen für ein Absorptions/Streuverfahren, sondern auch für ein Fluoreszenz/Streuverfahren zur Bestimmung von Retikulozyt- RNA-Konzentration, Zellzahl und reifem und Retikulozyt-Zellvolumen und von Hämoglobin-Gehalt auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis erfüllt. Im Gegensatz dazu, versagt NMB, das über eine nur geringe Fluoreszenzwirksamkeit verfügt, bei einem derartigen Fluoreszenz/Streuverfahren.

Alternativ dazu, steht, bei erhöhten Kosten und entsprechender Komplexität, unter Verwendung eines Farbstoffs zur Färbung von Retikulozyten, welcher grün bis rot fluoresziert, wenn er mit blauem Licht angeregt wird, wie die Farbstoffe AO, AOEOH, TO und AuO, und zwar durch Bereitstellung eines Argonion- oder HeCd-Laser mit einer Emissionslinie bei 488 oder 441 nm zur Beleuchtung der Fließzelle koaxial mit dem roten Laser, ein Verfahren zur Verfügung, das ebenfalls die gleichzeitige Bestimmung von Retikulozyt-RNA-Konzentration, Zellzahl und reifem und Retikulozyt-Zellvolumen und des Hämoglobin-Gehalts auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis ermöglicht.

Es wurden Kugelbildungsmittel für rote Zellen, wie vorgeschlagen gemäß der technischen Lehre von Kirn und Ornstein, von den hier auftretenden Anmeldern untersucht und aufgefunden, wobei nicht-ionische, kationische und zwitterionische oberflächenaktive Mittel zur mit kationischen Farbstoffen hergestellten Kompatibilität verwendet wurden. Wie beim Verfahren von Kirn und Ornstein verwendeten wir ein Protein (in typischer Weise Rinderserurnalbumin), um die Konzentration der oberflächenaktiven Mittel zu "puffern", um die Lysis der roten Zellen zu verlangsamen. Eine Anzahl solcher oberflächenaktiver Mittel (z.B. Triton X100 und Laurylpropylamidobetain) funktionierten zufriedenstellend. Wir fanden dann in unerwarteter Weise heraus, daß Laurylpropylamidoprotein und einige weitere zwitterionische oberflächenaktive Mittel (z.B. DAPS und TDAPS) keine Protein-Pufferung benötigten, um die Lysis roter Zellen zu verzögern, und daß sie ideale alternative Kugelbildungsmittel für alle Arten von Blutzellen für die Verfahren von Kim und Ornstein darstellen. Weil sie keine Protein-Pufferung benötigen, wird ein stabileres und einfacheres Reagens ermöglicht, das hergestellt werden soll (die Fixierungsstufen von Kim und Ornstein sind nicht länger obligatorisch; ausserdem werden die in Protein-haltigen Reagentien auftretenden Probleme bakteriellen Wachstums ebenfalls vermieden) . Diese Erfindung ist Gegenstand der korrespondierenden US-Anmeldung mit der Nummer 07/802674, mit der Bezeichnung "Reagent Compositions and their Use in Sphering Cells", gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung eingereicht und den Berechtigten der vorliegenden Erfindung zugeordnet.

Demnach ist es eine grundsätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zur Identifizierung und Unterscheidung von Unterklassen von Zellen von Interesse in einer Vollblutprobe durch Fluoreszenzfließzytometrie anzugeben und zur Verfügung zu stellen, wobei man die Probe mit einer wässrigen Reagenszusammensetzung vermischt, die eine Farbstoffverbindung, die die Ribonucleinsäure von Zellen färbt, ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel als Kugelbildungsmittel, welches den Farbstoff nicht ausfällt, sowie einen Puffer zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Zusammensetzung bei ca. 6 bis ca. 9 umfaßt, um eine Zellsuspension zu bilden, und wobei man die Zellsuspension, im wesentlichen eine Zelle zu einem Zeitpunkt, durch einen Bereich fokussierter optischer Beleuchtung laufen läßt, man das von jeder Zelle gestreute und fluoreszierte Licht nachweist und mißt und die Zellen der Unterklassen von Interesse zumindest teilweise auf der Grundlage des gestreuten und fluoreszierten Lichts unterscheidet.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die obigen Verfahren zur Zählung von Retikulozyten in einer Vollblutprobe mittels Fluoreszenz-Fließzytometrie anzugeben und zur Verfügung zu stellen, wobei die kationische Farbstoffverbindung Oxazin 750 in der Reagenszusammensetzung angewandt wird, die ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel enthält. Der Farbstoff färbt die RNA im Retikulum der Retikulozyten in der Probe.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die obigen Verfahren und Reagenszusammensetzungen zur gleichzeitigen Kugelbildung roter Blutzellen und von Retikulozyten sowie zur Färbung von Retikulozyten anzugeben, ohne die rasche Lysis der in die Kugelform überführten Zellen, insbesondere der Erythrozyten, zu verursachen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die obigen Verfahren und Reagenszusammensetzungen zur gleichzeitigen Bestimmung von Volumen, Hämoglobin-Konzentration und Hämoglobin-Gehalt von Retikulozyten und Erythrozyten in einer Vollblutprobe durch Fluoreszenz- und Streulicht-Fließzytometrie anzugeben.

Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die obigen Verfahren und Reagenszusammensetzungen zur gleichzeitigen Unterscheidung und zur entsprechenden Zählung einer jeden der roten Blutzellen und der Retikulozyten innerhalb einer Blutprobe sowie zur Bestimmung von Volumen, Hämoglobin-Gehalt, Hämoglobin-Konzentration, mittlerem Erythrozyt-Volumen und der mittleren Korpuskularhämoglobinkonzentration eines jeden Zelltyp anzugeben, welche aus Messungen auf einer Zelle-zu-Zelle- Basis ermittelt werden.

Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Reagenszusammensetzungen zur in einer Vollblutprobe durchgeführten Identifizierung und Unterscheidung von Retikulozyten und Erythrozyten bereitzustellen, worin die Reagenszusammensetzungen ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel in einer wirksamen Menge umfassen, um die Erythrozyten und Retikulozyten isovolumetrisch in die Kugelform zu überführen. Gemäß der Erfindung umfaßt die Reagenszusammensetzung auch die organische kationische Farbstoffverbindung Oxazin 750, um das Retikulum der Retikulozyten in der Vollblutprobe zu färben.

Schließlich ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, obige Verfahren und Reagenszusammensetzungen zur gleichzeitigen Unterscheidung und entsprechenden Zählung der jeweiligen roten Blutzellen und der Retikulozyten innerhalb einer Blutprobe und zur Bestimmung von Volumen, Hämoglobin-Gehalt, Härnoglobin-Konzentration, mittlerem Erythrozyt-Volumen und der mittleren Korpuskular-Hämoglobinkonzentration jeder Zelle anzugeben, welche aus Messungen auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis unter Anwendung einer einzelnen Rotlicht-Laserquelle ermittelt werden.

Die obigen und weitere Gegenstände bzw. Gesichtspunkte sowie signifikante Vorteile der vorliegenden Erfindung sollten durch die nun folgende detaillierte Beschreibung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen noch weiter verdeutlicht werden, in denen:

Fig. 1A bis 1E schematische Darstellungen der Beleuchtungsoptiken, Nachweisoptiken bzw. des Nachweissignalverarbeitungssystems von Streu/Fluoreszenz-Fließzytometern zur Durchführung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung sind,

Fig. 2A(1) und 2B(1) Zytogramme der Lichtstreuung gegen Fluoreszenz und Fig. 2A(2) und 2B(2) Zytogramme von Rotlicht-Niederwinkelstreuung gegen Rotlicht-Hochwinkelstreuung für eine Vollblutprobe sind, die Retikulozyten enthält, die mit AOEOH bzw. Oxazin 750 gemäß Beispiel 1 gefärbt wurden; und Fig. 2(C) ein Zytogramm von HC gegen V mit Retikulozyten, dargestellt mit "+" und mit roten Zellen als " " ist,

Fig. 3A und 3B den Vergleich des Prozentsatzes von in einer Vollblutprobe unter Verwendung der AOEOH- bzw. Oxazin 750-Reagentien nachgewiesenen Retikulozyten mit dem NCCLS-Bezugsverfahren gemäß Beispiel 2 zeigen,

Fig. 4A und 48 die Korrelation zwischen den MCV- und MCHC-Daten für Retikulozyten zeigen, die mit dem AOEOH-haltigen Reagens und dem Technikon H 1Jr.-Bezugsverfahren gemäß Beispiel 3 gefärbt wurden,

Fig. 5A und 5B die Korrelation zwischen den MCV- und MCHC-Daten für Retikulozyten zeigen, die mit dem Oxazin 750-haltigen Reagens und dem TECHNICON H 1Jr.-Bezugsverfahren gemäß Beispiel 4 gefärbt wurden, und

Fig. 6A und 6B Zytogramme sind, in denen die aus Beispiel 5 erhaltenen Daten dargestellt sind.

Gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung enthält eine Reagenszusammensetzung einen organischen kationischen Farbstoff zur Färbung der Retikulozyten und eine Puffer-Lösung zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von ca. 6 bis ca. 9. Der Farbstoff kann der blaue Absorptionsfarbstoff Oxazin 750 (erhältlich von Excitron, Inc. von Dayton, Ohio) mit der Struktur:

oder die blauen anregbaren Fluoreszenz-Farbstoffe sein, welche AO und quaternierte Derivate von AO der allgemeinen Struktur sind:

worin gilt: Y ist ein Anion; R ist, jeweils unabhängig, eine Methyl- oder Ethylgruppe; und X ist eine Hydroxyethylgruppe oder eine Benzylgruppe, die in einer ortho-Position mit einer R&sub1;-Gruppe und/oder in einer para- Position mit einer R&sub2;-Gruppe substituiert ist, worin R&sub1; ein Wasserstoffatom oder Fluor und R&sub2; ein Wasserstoffatom, Fluor oder eine Trifluormethylgruppe sind.

Vorzugsweise sind Y ein Anion, R eine Methylgruppe und X eine Hydroxyethylgruppe oder eine para-substituierte Benzylgruppe. Am meisten bevorzugt sind Y Bromid oder Jodid und X eine Hydroxyethylgruppe.

Die Synthesestufen zur Herstellung quaternierter Derivate von AO sind in der vorgenannten US 5,075,556 von S. Fan und G. Fischer beschrieben. Oxazin 750 ist von Excitron, Inc. von Dayton, Ohio, erhältlich. Die bevorzugten blau-anregbaren Farbstoffverbindungen der vorliegenden Erfindung sind 3,6-Bis(dimethylamino)-10-benzylacridiniumbromid,3,6- Bis(dimethylamino)-10-(2-fluor)benzylacridiniumbromid,3,6- Bis(dimethylamino)-10-(4-fluor)benzylacridiniumbromid und 3,6- Bis(dimethylamino)-10-(4-trifluormethyl)benzylacridiniumbromid und 3,6- Bis(dimethylamino)-10-(2-hydroxyethyl)acridiniumjodid. Die am meisten bevorzugte blau-anregbare Farbstoffverbindung ist 3, 6-Bis (dimethylamino)- 10-(2-hydroxyethyl)acridiniumjodid (AOEOH) wegen der hydrophilen Eigenschaft der Hydroxylgruppe.

Die Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält die blau-anregbare Farbstoffverbindung in einer Menge von ca. 3 bis ca. 12 µg/ml (eines quaternierten AO-Derivats zur blau-anregbaren Fluoreszenzfärbung) oder ca. 0,2 bis ca. 1,2 µg/ml Oxazin 750 (zur Rot-anregbaren Fluoreszenzfärbung). Vorzugsweise ist die Farbstoffverbindung in einer Menge von ca. 6 bis ca. 9 µg/ml (AOEOH) oder von ca. 0,4 bis ca. 0,6 µ g/ml (Oxazin 750) vorhanden.

Das Puffer-System der Reagenszusammensetzung enthält geeignete Puffer zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Reagenszusammensetzung bei ca. 6 bis ca. 9. Die Lösung kann einen oder mehrere der folgenden Bestandteile in der angegebenen Konzentration enthalten, wobei die Endosmolalität mit KCl oder NaCl auf ca. 250 bis ca. 330 mOsm eingestellt ist:

Vorzugsweise wird die Lösung so zubereitet, daß der pH-Wert der Reagenszusammensetzung bei ca. 7 bis ca. 8 gehalten wird, und sie kann einen oder mehrere der folgenden Bestandteile in den angegebenen Konzentrationsbereichen enthalten, wobei eine Osmolalität von ca. 280 bis ca. 300 mOsm eingestellt ist:

Es ist herausgefunden worden, daß die Reagenszusammensetzung bestimmte Anionen und Kationen enthalten sollte, um es für den Farbstoff zu erleichtern, daß er die Membran der roten Zellen durchdringt. Solche Anionen können Bicarbonat, Chlorid, Borat, Barbiturat, Oxalat (Ox) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) einschließen. Aber nicht alle Anionen haben sich als wirksam erwiesen, das Eindringen des Farbstoffs durch die Zellmembranen hindurch zu begünstigen. Sind beispielsweise eines oder mehrere der folgenden Anionen, nämlich Malat, Tartrat oder Phosphat, in den Reagenszusammensetzungen als die wichtigeren Anionen enthalten, konnte eine nur geringfügige Unterscheidung, falls überhaupt, zwischen Retikulozyten und Erythrozyten durchgeführt werden. Mögliche Kationen schließen Kalium, Natrium, Trishydroximethylaminomethan (Tris) oder Triethanolamin (TEA) ein.

Die Reagenszusammensetzung kann verwendet werden, Retikulozyten in einer Vollblutprobe zu identifizieren, und zwar unter Anwendung der Streu/Fluoreszenz-Fließzytometrie-Verfahrensweise. Das Verfahren beinhaltet in seiner breitesten Anwendungsform, daß man eine Anteilsmenge von Voliblut mit einer der obigen Reagenszusammensetzungen vermischt. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer läßt man dann die Probe/Reagens- Mischung, 1 Zelle zu einem Zeitpunkt, durch einen spezifischen Fühlbereich des Fließzytometer laufen. Mittels hydrodynamischer Fokussierung laufen einzelne Zellen durch die Fühizone, wo sie mit einer fokussierten Lichtquelle beleuchtet werden, die eine geeignete Beleuchtungswellenlänge aufweist. Mindestens 1 Streulichtsignal und mindestens 1 Fluoreszenzsignal werden für die Zelle auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis gemessen. Aus diesen Messungen lassen sich die Retikulozyten von den Erythrozyten unterscheiden.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Erfindung enthält die obige Reagenszusammensetzung ferner ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel, um die roten Blutzellen und Retikulozyten isovolumetrisch in die Kugelform zu überführen. Das zwitterionische Kugelbildungsmittel ist vorzugsweise ein Alkylamidobetain oder ein Alkylbetain wie Lauramidopropylbetain (LAB)

Zur wirksamen isovolumetrischen Kugelbildung der Retikulozyten und roten Blutzellen in einer Blutprobe beträgt die Konzentration des Kugelbildungsmittels in der Reagenszusammensetzung ca. 12 bis ca. 87,5 µg/ml LAB.

Wird diese Vollblut/Reagenszusammensetzungsmischung durch den Fühlbereich eines Fließzytometer geleitet, wird das durch 2 Winkelintervalle hindurch gestreute und von jeder Zelle fluoreszierte Licht gemessen, die Erythrozyten können von Retikulozyten unterschieden werden, und das Volumen, die Hämoglobin-Konzentration eines jeden Retikulozyt oder Erythrozyt können bestimmt werden. Die Anzahl an Retikulozyten und Erythrozyten sowie der Hämoglobin-Gehalt, das mittlere Zelivolumen, die mittlere Korpuskularhämoglobinkonzentration und das mittlere Zellhämoglobin der Retikulozyten oder Erythrozyten werden aus den gemessenen Werten für Zelle-zu- Zelle-Volumen und -Hämoglobin-Konzentration berechnet.

Wir haben herausgefunden, daß in der Gegenwart der oben beschriebenen Puffersysteme die Konzentrationen von Oxazin 750 oder AOEOH in der zur RNA-Färbung benötigten Reagenszusammensetzung niedrig ist, d.h., sie liegen im Bereich von ca. 0,2 bis ca. 1,2 µg/ml für Oxazin 750 und für AOEOH im Bereich von ca. 3,0 bis ca. 12 µg/ml, und der Puffer steigert die Eindringergebnisse beim Farbstoff, welcher die RNA in den Retikulozyten in weniger als 5 Minuten färbt. Eine derartig niedrige Farbstoffkonzentration minimiert die Nicht-Retikulozyt-Färbung reifer Erythrozyten und eine Fluoreszenz aus dem Strom, was zu einer guten Signalabtrennung vom Rauschhintergrund führt. Eine solch rasche Färbung macht die Reagenszusammensetzung in hohem Maße kompatibel mit automatisierten Verfahren.

Die Erfindung umfaßt demgemäß die im folgenden beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren, wobei der Umfang der Erfindung in den Ansprüchen angegeben und abgesteckt ist.

Bezüglich der Fig. 1A bis 1E sind stilisierte, funktionale und strukturelle Darstellungen von Teilen einer Fließzytometrievorrichtung gezeigt, welche zur Durchführung der Prinzipen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Tatsächlich stellt die Vorrichtung besondere Systeme dar, welche Modifikationen eines Systems sind, das im Handel unter der Handelsbezeichnung TECHNICON H 1 erhältlich ist und von hier auftretenden Berechtigten verkauft wird.

Die Vorrichtung beinhaltet die Prinzipien der Fließzytometrie zur Zellanalyse und schließt die Befähigung ein, das streuende Licht und fluoreszierende Reaktionen von Zellen auf spezifische Typen von Beleuchtung sensorisch zu erfassen. Es sind nur jene Komponenten gezeigt, die von primärem Interesse bezüglich der Erfindung sind. Somit veranschaulichen die Zeichnungen nicht alle der mechanischen und elektrischen Elemente, d.h. Motoren, Solenoide, Pumpen, Ventile, Sensoren, welche zu Antrieb und Steuerung der verschiedenen Komponenten der Vorrichtung erforderlich sind. Alle diese Elemente können jede bekannte, herkömmliche Form aufweisen, welche von einem normalen Durchschnittsfachmann realisiert werden können, der über die Kenntnis der Information verfügt, die im folgenden bezüglich der gewünschten Betriebsweise der verschiedenen Komponenten in einer Fließzytometrievorrichtung gemäß der Erfindung zur in der beabsichtigten Weise durchgeführten Behandlung der Proben vermittelt wird.

Beschrieben in ihren allgemeinsten Begriffen, liefern eine Schaft- Strom-Fließzelle und unterstützende Hydraulikelemente vorbereitete Zellen zum Punkt der Messung. Die Zellen sind auf ein zylindrisches Volumen eingegrenzt, das zentral zum Flächenguerschnitt des Fließkanals der Fließzelle liegt. Die Fließzellkonstruktion ist mit 1 Ausnahme identisch mit der im Technicon H 1-System angewandten. Der Fließzellkörper ist aus synthetischem geschmolzenen Silika (eher als aus Glas), um Hintergrundfluoreszenz aus der Fließzelle selbst zu minimieren. Das Hydrauliksystem ist ziemlich einfach und besteht aus nur 2 peristaltischen Pumpen und ihren Verbindungsleitungen. Die Mantelpumpe und die Leitung liefern den Mantelstrom mit einer Geschwindigkeit von 1,6 x 10&supmin;&sup7; m³/sec; die Probe wird mit einer Geschwindigkeit von 3,5 x 10-10 m³/sec geliefertder Fließkanal innerhalb der Fließzelle ist 250 µm auf 250 µm. Der sich ergebende zylindrische Probenstrom weist einen Durchmesser von 7 µm und eine Geschwindigkeit von 2,5 m/s auf.

Der Prirnärzweck ist es, ein optisches System bereitzustellen, das, bei einem Minimum, eine einzelne Farbfluoreszenzrnessung unterstützt, zusätzlich zu den beiden Streukanälen für rote Zellen, welche beim TECHNI- CON H 1-System zur Analyse roter Zellen erforderlich sind. Wie noch zu diskutieren sein wird, hängt das optische System vorn besonderen Farbstoff ab, d.h. blau anregbar oder rot anregbar, welcher zur Zellfärbung eingesetzt wird. Das optische System des Streu/Fluoreszenz-Fließzytometer kann ganz allgemein in zwei Untersysteme eingeteilt werden: a) die Beleuchtungsoptiken (Fig. 1A oder 1D) und b) die Sammeloptiken (Fig. 1B oder 1E).

Was nun als erstes Fig. 1A betrifft, sind die Beleuchtungsoptiken für einen blau-anregbaren Farbstoff ganz allgemein mit der Bzeugszifer 10 bezeichnet und beinhalten zwei Lichtquellen.

Ein Helium-Neon-(HeNe)-Laser 12 emittiert Licht bei 633 nm und 2 mW, welches für Streumessungen roter Zellen zur Bestimmung des Volumen und der Hämoglobin-Konzentration benötigt wird. Ein Argonion-Laser 14, der Licht bei 488 nm und 20 mW emittiert, wird zur Fluoroforanregung benötigt. 3 Staffeispiegel 16a, 16b und 16c und ein dichroischer Strahlspalter 18 werden zur passenden Anordnung des Beleuchtungssystems benötigt. Die Strahlen aus den Lasern werden gleichlaufend linear beim Strahlspalter 18 gemacht, welcher das blaue Licht aus dem Argonion-Laser 14 durchläßt und das rote Licht aus dem HeNe-Laser 12 reflektiert. Der sich ergebende Strahl wird dann zu einer Ellipse bei einer rechtwinkligen Öffnung (A-1) 20 durch ein Paar gekreuzter Zylinderlinsen 22 geformt. Die Brennpunktslänge der Zylinderlinse 22a, die am nächsten zur A-1-Öffnung liegt, beträgt 150 mm. Die Zentralachse dieser Linse liegt prallel zur längsten Abmessung der Öffnung. Die zweite Zylinderlinse 22b weist eine Brennpunktslänge von 300 mm auf. Die rechtwinklige Öffnung, die 89 µm hoch und 653 µm breit ist, wird in die Fließzelle 24 abgebildet, wobei eine Beugungs-beschränkte achrornatische Linse 26 verwendet wird, um das Meßvolumen abzustecken. Die Gesamtvergrößerung beträgt annähernd 0,25.

Die Öffnung ist unterfüllt in der langen Abmessung und überfüllt in der kurzen Abmessung. Die Zweckbestimmungen waren hier darauf gerichtet, die Beleuchtungsintensität zu maximieren und eine flache Intensitätsverteilung in der kurzen Abmessung des Bildes aufrechtzuerhalten, um Fehler wegen Intensitätsschwankungen von Zelle zu Zelle zu minimieren. Das Meßvolumen ist im wesentlichen elliptisch bezüglich der Form und ist 20 µm hoch und 65 µm breit bei den 1/e²-Punkten. Die kürzere Achse der Ellipse liegt parallel zur Fließrichtung, die bezüglich der Horizontalen senkrecht verläuft.

Zellen, die durch das Meßvolumen laufen, streuen einfallende Bestrahlung. Auch gefärbte Zellen absorbieren einfallende Strahlung. Die gefärbten Zellen fluoreszieren auch, wobei Energie bei einer Frequenz emittiert wird, die niedriger als diejenige ist, die absorbiert wurde. Diese optischen Signale werden in den Erfassungsoptiken, die in Fig. 1(B) dargestellt sind, erfaßt und nachgewiesen.

Das Licht, das von Zellen gestreut und fluoresziert wird, die das Meßvolumen durchlaufen, wird durch die Sammellinse 28 kollimattiert und dann in vier Kanäle aufgetrennt. Die numerische Öffnung der Sammellinse beträgt 0,34. Beim Strahlspalter 30 wird Licht mit einer Wellenlänge unterhalb 500 nm reflektiert Dieses Licht wird gefiltert, wobei wiederum ein 488 nm Engbandinterferenzfilter 32 angewandt wird. Ein ringförmiger Dunkelfeldstopp 34 wird eingesetzt, um nur blaues Licht durchzulassen, das in das Winkelintervall von 5 bis 15 Grad gestreut wird. Das gestreute Licht wird dann mit der Nachweislinse 36 auf eine Silizium-Fotodiode fokussiert, wo elektronische Signale erzeugt werden.

Das restliche Licht wird zu gleichen Teilen in zwei Strahlen beim Strahlspalter 40 aufgespalten. Die Hälfte der Energie wird auf die Rotstreukanäle reflektiert, und die andere Hälfte wird zum Rotfluoreszenzkanal durchgelassen. (Dieser Strahlspalter 40 kann durch einen geeigneten dichroischen Strahlspalter ersetzt sein, um das Signal/Rauschverhältnis im Fluoreszenzkanal zu verbessern). Das Licht, das in Richtung auf die Rotstreukanäle reflektiert wird, wird mit einem 633 nrn Engbandinterferenzfilter 42 gefiltert und dann durch den 50/50 (50% Reflexion, 50% Transmission) Strahlspalter 44 in 2 Strahlen aufgespalten. Dunkelstopps 46 und 48 werden in diesen beiden Rotstreukanälen verwendet, um Licht in den beiden Winkelintervallen zu sammeln, welches zur Bestimmung von Zell- V und -HC benötigt wird. Das gestreute Licht wird in jedem Kanal auf jede der beiden Silizium-Fotodioden 50 und 52 mit Detektorlinsen 54 bzw. 56 fokussiert, wo elektrische Signale erzeugt werden. Neutraldichtefilter 58, 59 und 60 werden in jedem Streukanal, dem blauen und roten, verwendet, um den dynamischen Bereich der Signale in einfacher Weise einzustellen, ohne den Vorverstärkerkreis zu modifizieren.

Das vom Strahlspalter 40 durchgelassene Licht wird bei 62 gefiltert, um lediglich fluoreszente Energie durchzulassen, und es wird dann mit der Detektorlinse 64 auf eine Fotoverstärkerröhre 66 durch eine Lochöffnung von 1 mm Durchmesser fokussiert, wo elektrische Signale erzeugt werden, die zur Größe der einfallenden Energie proportional sind. Das Vorliegen der Lochöffnung minimiert Schußrauschen, das durch von außen kommendes Licht erzeugt wird. Ein 2 mm breiter Blockungsstab 67, der vor der Nachweislinse angeordnet ist, durchschneidet den Hauptstrahl, wodurch Hintergrundlichtrauschen weiter herabgesetzt wird. Es gibt ein Sandwich von 4 Filtern 68 in diesem Kanal, umfassend einen 633 Kerbfilter (X2) 68a, ein Schott OG515 Farbglas 68b, ein Schott OG530 Farbglas 68c und ein Schott RG645 Farbglas 68d.

Der Nettoeffekt dieser Filterkombination ist die Blockung von allem Licht unterhalb 645 nm. Die Kerb- und OG-Filter 68a, 68b und 68c werden benötigt, weil der RG645-Filter 68d nicht genügend wirksam ist, um das gestreute Licht bei 633 und 488 nm vollständig zu blocken.

Der Zugewinn des Vorverstärkerstromkreises und die optische Dichte der Neutraldichtefilter in jedem Streukanal wurden gewählt, um mittlere Pulssignalniveaus von annähernd 2 Volt beim Ausstoß eines jeden Kanals zu erzeugen, als Technicon (TCN) optisches Testmaterial (OTM TCH T03-1704) untersucht und analysiert wurde. OTM besteht aus in die Kugelform überführten und hart-fixierten roten Blutzellen. Dieses Material ist von den hier auftretenden Berechtigten im Handel erhältlich und zur Anwendung am TECHNICON H 1-System angepaßt. Dies erlaubt dann den Feinabgleich des Gesamtzugewinns in jedem Kanal unter Anwendung eines Zugewinnverstärkers für Variable in der Nach-Signal-Nachweis-Verarbeitungshardware. Der Gesamtzugewinn im Fluoreszenzkanal wird durch die Einstellung der hochvoltigen Einspeisung der Fotoverstärkerröhre gesteuert.

Ein funktionales Block-Diagramm des Nach-Nachweissignal- Verarbeitungssystems ist in Fig. 1(C) gezeigt. Dieses System schließt Vorverstärker 67, einen Variablen-Zugewinnverstärker 68, ein Pulshöhenanalysiergerät 70, einen Analog-zu-Digital-Wandler 72 und Datenerfassungshardware (Computer) 74 und Software ein.

Der Zugewinnverstärker 68 für Variable enthält vier Stromkreise, welche Inversion und Amplitudenkonditionierung von bis zu 4 Inputsignalen ermöglichen.

Das Pulshöhenanalysiergerät 70, der Analog-zu-Digital-Wandler 72 und die Datenerfassungssoftware sind allesamt Komponenten des 4Cyte- Systems, das von Howard Shapiro, M.D., P.C. von Cambridge, Mass., gekauft wurde. Das Puishöhenanalysiergerät ist das 4Cyte Model FE Front End. Diese Komponente erzeugt gehaltene Pulshöhen darstellende Pulse von bis zu 4 Inputsignalen und ermöglicht die Festlegung des "gültigen" Puishöhenschwellenniveau. Die 4Cyte Model 1 Grenzflächenkarte wird zusammen mit der 4Cyte Software zur Analog-zu-Digital-Urnwandlung von bis zu 4 Inputsignalen und zur Erfassung dieser Werte im PAM-Memory des Wirtscomputer verwendet. Die digitalisierten Signale werden in Listenform gespeichert. Es gibt 5 8-Bit-Bytes an Information für jede Zelle, 1 für jeden der 4 gemessenen Parameter und 1 zur Beflaggung. Der Wirtscomputer für diese Versuche war ein IBM PC/XT-Klon, der mit einem Farbmonitor und einem Math-Coprozessor ausgerüstet war. Datenverringerung kann an jedem IBM- kompatiblen Computer durchgeführt werden.

Was nun Fig. 1D betrifft, ist das Beleuchtungsoptisystem für einen rot-anregbaren Farbstoff ganz allgemein mit der Bezugsziffer 110 bezeichnet und beinhaltet einen Helium-Neon-Laser 112, der einen 2 mW Lichtstrahl bei 633 nm emittiert. Der Strahl wird durch 2 Reflexionsspiegel 114 und 116 gefaltet, wodurch die Laserstrahiposition eingestellt bzw. abgeglichen wird. Durch den Abgleich fällt die Strahlachse mit der physikalischen optischen Achse der Beleuchtungsoptiken zusammen. Der Strahl wird dann durch das Paar von Zylinderlinsen 118 und 120 zu einem 192 x 77 µm elliptisch geformten Strahl geformt (bei 1/e²) . Die Abmessung von 192 µm wird durch die 150 mm Brennpunktslängenzylinderlinse 118 gebildet, und sie beleuchtet die lange Achse der A-1-Öffnung 122 (die parallel zur Blattebene in Fig. 1D liegt) . Die Abmessung von 77 pm wird durch die 60 mm Brennpunktslängenzylinderlinse 120 gebildet, und sie beleuchtet die kurze Achse der A-1-Öffnung. Die A-1-Öffnung weist eine Abmessung von 653 x 89 µm auf. Das Beleuchtungsdublett 123 erzeugt eine elliptisch geformte Gaussian-Intensitätsverteilung von 37,4 x 12,6 µm in der Fließzelle 124. Die kürzere Achse der Ellipse liegt parallel zur Fließrichtung, die vertikal verläuft, d.h. in Richtung des Pfeils 126.

Alle Zellen, die durch das Meßvolumen laufen, streuen und absorbieren die einfallende Strahlung. Das gestreute und fluoreszierte Licht wird erfaßt und in den Nachweisoptiken gemessen, die schematisch in Fig. 1E dargestellt sind. Das gestreute und fluoreszierte Licht wird durch die hochnumerische Öffnungs(Hi-NA)Linse 128 gesammelt und kollimatiert. Die numerische Öffnung der Sammellinse beträgt 0,34 nm. Der Strahl wird in zwei Teile durch den dichroischen Strahlspalter 130 geteilt, welcher Licht bei Wellenlängen von weniger als 670 nm durchläßt. Der Strahl 132 wird auf einen Fotoverstärker nach Filterung reflektiert und zur Fluoreszenzrnessung herangezogen, wogegen der durchgelassene Strahl 134 durch den 50/50 (50% Reflektion, 50% Transmission) Strahlspalter 136 weiter aufgespalten wird, um die beiden Streukanäle zu bilden. Der reflektierte Streukanal 138 weist einen 5 bis 15º-Dukelstopp 140 auf, wogegen der Transrnissionskanal 142 einen 2 bis 3º-Dunkelstopp 144 aufweist. Das Licht, das durch jeden dieser Dunkelstopps 140, 144 läuft, wird dann durch die Linsen 146 und 148 auf die Fotodioden 150 bzw. 152 herunterfokussiert. Neutraldichtefilter 154 und 156 sind eingesetzt, um die Lichtmengen an jeder Fotodiode auf ein Niveau herabzusetzen, das sich für die Standard-Detektoren und -Vorverstärker eignet.

Das vom Strahlspalter 130 reflektierte Licht wird durch die Linse 158 durch ein Engband(690 nm)filter 159 und durch eine Lochöffnung von 1 mm Durchmesser auf eine Fotoverstärkerröhre 160 fokussiert, wo elektrische Signale, die proportional zur Größe bzw. Stärke der einfallenden Energie sind, erzeugt werden. Ein 2 mm breiter Blockungsstab 157, der vor der Nachweislinse 158 angeordnet ist, durchschneidet den Hauptstrahl, wodurch Hintergrundlichtrauschen weiter herabgesetzt wird. Die durch die Fotodioden 150, 152 und die Fotoverstärkerröhre 160 erzeugten Signale werden in einem Nach-Nachweissignalverarbeitungssystem verarbeitet, das dem in Fig. 1C gezeigten ähnelt. In diesem Fall werden allerdings nur drei Signale, Rotniederwinkelstreuung, Rothochwinkelstreuung und Rotfluoreszenz verarbeitet (nicht die 4 bezüglich Fig. 1(C) diskutierten Signale).

Beispiele

Die vorliegenden Beispiele beschreiben Reagenszusammensetzungen und Verfahren, die diese beinhalten, zur Identifikation von Retikulozyten und Charakterisierung von Retikulozyten und roten Blutzellen unter Anwendung von Fluoreszenzfließzytometrieverfahren. Es wurden im Handel erhältliche Standardmaterialien von Reagensreinheit verwendet, wann immer dies möglich war. Es sollte selbstverständlich sein, daß die folgenden Formulierungen und Vorgehensweisen lediglich zur beispielhaften Verdeutlichung angegeben sind, und daß weitere Bestandteile, Mengenverhältnisse und Verfahrensmaßnahmen gemäß den durch die Ansprüche definierten Offenbarungsgehalten der vorliegenden Erfindung angewandt werden können.

Beispiel 1: Streu- und Fluoreszenzmessungen zur Unterscheidung von Retikulozyten und Erythrozyten in einer Blutprobe unter Verwendung einer Reagenszusammensetzung, die ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel enthält

Der Farbstoff 3,6-Bis(dimethylamino)-10,2-hydroxyethylacridiniumjodid (AOEOH) wurde in einer 1 mg N,N-Dimethylformamid/ml Vorratslösung aufbewahrt. Ein Arbeitsreagens wurde hergestellt, indem man den Farbstoffvorrat zugab, um eine Endkonzentration von 6 bis 12 µg/ml Farbstoff zu ergeben. Die Endkonzentration von Lauramidopropylbetain betrug 12 bis 87,5 µg/mi. Eine Puffer-Lösung enthielt die folgenden Bestandteile in den angegebenen Konzentrationen:

Calciumchlorid 0,4 mM

Kaliumchlorid 4,0 mM

Magnesiumchlorid 40,0 mM

Natriumphosphat (dreibasig) 0,5 mM

Natriumcarbonat 20,0 mM

Die endgültige Osmolalität und der pH-Wert des Arbeitsreagens, das in der vorliegenden Untersuchung verwendet wurde, betrug 272 mMol/kg bzw. 8,1.

Es wurden Proben von Hand vermischt, und zwar in einer Weise, die das automatisierte TECHNICON H 1-Verarbeitungsschema für Proben roter Zellen simulierte. Glasteströhrchen wurden mit 5 mi Arbeitsreagens gefüllt. 5 µl einer Blutprobe wurden dann in das Reagens pipettiert, wobei das Reagens auf einem Vortex-Mixer gerührt wurde. Die 1:1000-Verdünnung von Blut wurde dann sofort in die Probenlinie der vorher beschriebenen Fließzytometrievorrichtung und des optischen Systems von Fig. 1A und 1B eingespeist. In ungefähr 2 Minuten durchlief die Probe die Fließzelle und wurde einer Argonion-Laserquelle zur Analyse von roten Zellen und Retikulozyten ausgesetzt. Jede Prode wurde zweifach gemessen, wenn das Probenvolumen dies ermöglichte.

Bei Betrachtung durch ein Mikroskop wurde festgestellt, daß die reifen roten Zellen und die Retikulozyten in einer zubereiteten Probe in der Kugelform vorlagen und die Retikulozyten bei Anregung durch blaues Licht im Roten fluoreszierten.

Bei der Beendigung der Analyse wurden die Rohdaten in der Form eines Blaustreuung- gegen Rotfluoreszenz-Zytogramm, Fig. 2A(1), dargestellt, worin die Ordinate die Relativinstensität von vorwärts gestreutem Licht und die Abszisse die Relativintensität von Rotfluoreszenz darstellen. Jeder auf dem Zytogramm gezeigte Punkt stellt eine Zelle dar. Deutliche Zellpopulationen wurden klar beobachtet, und zwar auf der Grundlage ihrer besonderen Streu- und Fluoreszenzsignale. Die Population reifer Erythrozyten fällt in den Bereich A zwischen der Ordinate und der Vertikallinie X. Diese Zellen zeigen hohe Streusignale und niedrige Zellfluoreszenzsignale. Die Retikulozytpopulation fällt in den Bereich rechts von X, und zwar in den Bereich B. Diese Zellen sind von den reifen Erythrozyten aufgrund der hohen Fluoreszenzsignale aus ihrer mit AOEOH gefärbten RNA unterscheidbar. Die Plättchenpopulation liegt innerhalb dem Bereich C unterhalb der Linie Y. Plättchen ergeben relativ niedrige Streusignale, verglichen mit den Retikulozyten.

Auf Basis der Fluoreszenztrennung zwischen reifen Erythrozyten und Retikulozyten kann die Retikulozyt-Zählung einer Patientenprobe ermittelt werden, indem man ein elektronisches "Fenster" erzeugt, das die Bereiche gestreuten Lichts und von Fluoreszenz absteckt, welche Retikulozyten und reife Erythrozyten identifizieren. Die Anzahl an Retikulozyten und reifen Erythrozyten, die in das "Fenster" fallen, wird bestimmt, und zwar so, daß der Prozentsatz der Retikulozyten und Erythrozyten, welche in der Gesamtzellpopulation vorhanden sind, bekannt ist. In Fig. 2A (1) sind das Retikulozyt-"Fenster" durch Bereich B und das "Fenster" der reifen Erythrozyten durch Bereich A bestimmt. Es sei angemerkt, daß in Fig. 2A(2) und in allen folgenden Streu/Streu-Zytogrammen die non-linearen Gitterüberlagen die Orte konstanten Volumens und eines konstanten Brechungsindex für perfekte Kugeln gemäß dem oben genannten Verfahren von Tycko angeben.

Der Bezugsprozentsatz von Retikulozyten in jeder Probe wurde unter Anwendung des händischen mikroskopischen Verfahrens ermittelt, das vom National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) empfohlen ist. Bei diesem Verfahren wurde ein kleines Volumen der Probe mit Neu- Methylenblau kräftig gefärbt. Eine herkömmliche Trockenkeuschmiere wurde dann hergestellt, und es wurde der Prozentsatz von Retikulozyten in der Probe mittels eines Mikroskops gezählt. Das Mikroskop war mit einem 100X Ölimmersionsobjektiv und einem 10X Okular ausgerüstet. Ein Minimum von 1000 Zellen wurde für jede Probe gezählt. Eine Miller-Scheibe wurde in das Okular des Mikroskops eingeführt, um die Zählgenauigkeit zu verbessern. Jede rote Zelle, die zwei oder mehr Partikel blauen Materials nach Färbung enthielt, wurde als ein Retikulozyt etikettiert.

Die Retikulozyt-Zählung der Patientenprobe wurde mit 1,7% in diesem Fließzytometrieverfahren gemessen. Dieselbe Blutprobe wurde auch mit dem NCCLS-Verfahren analysiert. Das Ergebnis war eine Retikulozyt-Zählung von 1,7%.

Es wurde ein zweiter Versuch durchgeführt, um das hohe Ausmaß der Unterscheidung zwischen Retikulozyt- und Erythrozytpopulationen zu belegen, wobei Zellen mit Oxazin 750 gefärbt und mit dem vorher beschriebenen Fluoreszenzfließzytometer und Optiksystem von Fig. 1D und 1E gemessen wurden. Der Farbstoff Oxazin 750 wurde in einer 1 mg N,N- Dimethylformamid/Vorratslösung aufbewahrt. Ein Arbeitsreagens wurde zubereitet, indem man den Farbstoffvorat auf eine Endkonzentration von 0,2 bis 1,2 µg/ml zum Kugelbildungsmittel und der oben beschriebenen Puffer- Lösung gab.

Es wurden dieselben Zubereitungsprotokolle wie oben beschrieben befolgt. In Fig. 2B(1) ist das Fluoreszenzgegen Niederwinkelstreuzytogramm einer normalen menschlichen Blutprobe dargestellt, die mit dem Oxazin 750 enthaltenden Reagens gefärbt wurde. Auf der Grundlage der Fluoreszenztrennung zwischen Erythrozyten und Retikulozyten wurde die Retikulozyt- Zählung der Probe mit 2,1% gemessen. Gemäß Analyse mit den NCCLS- Verfahren wurde eine Retikulozyt-Zählung von 2,1% erhalten. Fig. 2C zeigt die Retikulozyten als "+", überlagert auf reifen Erythrozyten, erhalten aus ähnlichen Daten wie Fig. 2A und 2B.

Beispiel 2: Korrelationsuntersuchung mit den Reagenszusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung sowie mit dem NCCLS- Verfahren

Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, um das Leistungsvermögen von AOEOH bei Verwendung in einer Reagenszusammensetzung im vorher beschriebenen Fluoreszenzfließzytorneter und mit dem optischen System von Fig. 1A und 1B und im NCCLS-Handverfahren zu vergleichen. Blutproben wurden von 39 Technicon-Angestellten und 23 Krankenhaus-Patienten erhalten. Die Krankenhausproben enthielten 3 mit Sichelzellen, 1 Thalassemie und 10 neo-natale Blutproben. Die 62 Blutproben wurden mit der in Beispiel 1 beschriebenen Reagenszusammensetzung gefärbt und bezüglich ihrem Retikulozyt-Gehalt analysiert. Retikulozyten im selben Satz von Blutproben wurden auch mit dem NCCLS-Verfahren gezählt.

Es wurden die Probenzubereitung und Analsenprotokolle wie oben bezüglich Beispiel 1 beschrieben befolgt.

Der Prozentsatz der aus diesen beiden Verfahren erhaltenen Retikulozyt-Zählungen ist in Fig. 3A verglichen. Bei einer Konzentration von 6 µg AOEOH/ml in der Reagenszusammesnetzung ergab sich eine enge Korrelation zwischen der Reagenszusammensetzung und Messungen, erhalten unter Anwendung des vorher beschriebenen Fluoreszenzfließzytometer und des optischen Systems von Fig. 1A und 1B, und den mit dem NCCLS-Bezugsverfahren erhaltenen Messungen. Der Korrelationskoeffizient für die Messung betrug 0,95.

Ein zweiter Versuch wurde durchgeführt, um das Leistungsvermögen von Oxazin 750-Reagens bei Verwendung im vorher beschriebenen Fluoreszenzfließzytometer mit dem optischen System von Fig. 1D und 1E und im NCCLS-Verfahren zu vergleichen. Die Probenzubereitung und die Analysenprotokolle von Beispiel 1 wurden befolgt. Blutproben wurden mit der Reagenszusammensetzung gefärbt und bezüglich ihrem Retikulozyt-Gehalt analysiert. Retikulozyten im selben Satz von Blutproben wurden mit dem NCCLS- Verfahren gezählt. Der Prozentsatz der Retikulozyt-Zählungen, erhalten aus diesen beiden Verfahren, ist in Fig. 3B verglichen. Der Korrelationskoeffizient für die Messung betrug 0,93.

Beispiel 3: Korrelationsuntersuchung mit der AOEOH enthaltenden Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und dem TECHNICON H 1 Jr.-Bezugsverfahren.

Derselbe Satz von Proben des Beispiels 2 wurde auch mit dem TECHNI- CON H 1 Jr.-System bezüglich der Indices der roten Zellen gemessen. Das automatisierte TECHNICON H 1 Jr.-System ist ein Fließzytometer, das gleichzeitig das Zelivolumen und die Härnoglobin-Konzentration individueller isovolumetrisch in die Kugelform überführter roter Blutzellen mißt.

Die Indices MCV und MCHC wurden getrennt am TECHNICON H 1 Jr.- Analysegerät bestimmt und mit den Werten verglichen, die mit der AOEOH enthaltenden Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. Fig. 4A und 4B zeigen die Korrelationsdaten für die Gesamtindices MCV bzw. MCHC roter Blutzellen. Die Korrelationskoeffizienten für die Messung betrugen 0,91 bzw. 0,97.

Beispiel 4: Korrelationsuntersuchung mit der Oxazin 750 enthaltenden Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und mit dem TECHNI- CON H 1-Bezugsverfahren.

Die Eryhtrozyt- und Retikulozyt-Indices MCV und MCHC wurden getrennt bestimmt und mit den Werten verglichen, die mit der Oxazin 750- Reagenszusammensetzng der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. Fig. 5A und 5B zeigen die Korrelationsdaten für die Gesamtwerte MCV bzw. MCHC roter Blutzellen.

Die Korrelationskoeffizienten für die Messung betrugen 0,93 bzw. 0,92.

Beispiel 5: Streu- und Fluoreszenzmessungen zur Unterscheidung von Retikulozyten und Erythrozyten in einer Blutprobe mit der Reagenszusammensetzung von Beispiel 2, enthaltend AOEOH und einen Puffer, welcher bei der Unterscheidung von Retikulozyten in Blut versagt.

Nicht alle Puffer können verwendet werden, um Retikulozyten gleichzeitig zu färben und in die Kugelform zu überführen. Dieses Beispiel belegt ein nur geringes Unterscheidungsvermögen zwischen Retikulozyten und Erythrozyten bei Verwendung des Färbungsfarbstoffs AOEOH und eines Phosphat-Puffer bei einem pH von 8,0 und einer Osmolalität von 290 mOsm (siehe Fig. 6A). Zum Vergleich, wird eine gute Trennung zwischen Retikulozyten und Erythrozyten klar beobachtet, und zwar bei Verwendung von Barbiturat-Puffer (12 µg/ml oberflächenaktives Mittel LAB) bei einem pH von 8,0 und einer Osmolalität von 290 mOsm (siehe Fig. 6B).

Es sind einige Vorteile der vorliegenden Erfindung, welche aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich sind, mit einer Reagenszusammensetzung und einem Verfahren zur Identifikation von Retikulozyten in einer Vollblutprobe sowie zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung des Volumen, des Hämoglobin-Gehalts und der Hämoglobin-Konzentration von Retikulozyten und Erythrozyten mit Fluoreszenzfließzytometrieverfahren verbunden.

Im Lichte des oben Gesagten ist ersichtlich, daß die verschiedenen Aufgaben der Erfindung gelöst sind und weitere vorteilhafte Ergebnisse erhalten wurden.

Da verschiedene Anderungen in den obigen Konstruktionen und Verfahren vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der durch die Ansprüche definierten Erfindung abzuweichen, soll alles, was in der obigen Beschreibung enthalten oder in den beigefügten Zeichnungen dargestellt ist, als beispielhaft und nicht einschränkend interpretiert sein. Beispielsweise können fraktionierte Proben von Blut in ähnlicher Weise verarbeitet und untersucht werden.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Identifizierung von Unterklassen von Zellen von Interesse aus weiteren Unterklassen von Zellen in einer Vollblutprobe durch Fluoreszenzfließzytometrie, wobei Stufen enthalten sind, in denen man:

a) eine Anteilsrnenge der genannten Blutprobe mit einer wässrigen Reagenszusammensetzung zur Bildung einer Suspension vermischt, worin die genannte Reagenszusammensetzung eine Farbstoffverbindung, die die Ribonucleinsäure von Zellen in der Unterklasse von Interesse färbt, einen Puffer zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von ca. 6 bis ca. 9 sowie ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel, das ein Kugelbildungsmittel ist, umfaßt,

b) die genannte Suspension von Stufe a) mit im wesentlichen einer Zelle zu einem Zeitpunkt durch eine Fläche fokussierter optischer Beleuchtung laufen läßt;

c) das gestreute Licht und das von jeder Zelle fluoreszierte Licht nachweist, und man

d) die genannten Zellen der genannten Unterklasse von Interesse mindestens in Teilen auf der Basis von genanntem gestreuten und fluoreszierten Licht unterscheidet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der genannte pH-Wert ca. 7 bis 8 beträgt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die genannte Unterklasse von Zellen von Interesse Retikulozyten sind.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die genannte optische Beleuchtung in Stufe b) eine Anregungswellenlänge im roten Bereich des Spektrums aufweist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die genannte optische Beleuchtung in Stufe b) eine Anregungswellenlänge im blauen Bereich des Spektrums aufweist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die genannten Unterklassen von Zellen, die in der genannten Blutprobe unterschieden werden, Erythrozyten und Retikulozyten sind.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Gesamtpufferkonzentration isotonisch ist, um die genannten Zellen in der genannten Blutprobe isovolumetrisch in die Kugelform zu überführen.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die genannte Farbstoffverbindung Oxazin 750 ist, das die Formel aufweist:

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei ferner die Stufe enthalten ist, in der man e) die Anzahl, das Volumen, die Hämoglobin-Konzentration und die RNA-Konzentraiton der Retikulozyten oder Erythrozyten in der genannten Probe auf der Grundlage desr gemessenen Größen und Stärken des genannten gestreuten und fluoreszierten Lichts bestimmt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprche 1 bis 9, worin das genannte oberflächenaktive Mittel ein Alkylbetain oder ein Alkylamidobetain ist.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das genannte oberflächenaktive Mittel Lauramidopropylbetain ist.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das genannte oberflächenaktive Mittel in einer Menge von ca. 12 bis ca. 87,5 µg/ml vorhanden ist.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, worin die genannte Farbstoffverbindung Oxazin 750 in der genannten Reagenszusammensetzung in einem Konzentrationsbereich von ca. 0,2 bis ca. 1,2 µg/ml vorhanden ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, worin die genannte Farbstoffverbindung Oxazin 750 in der genannten Reagenszusammensetzung in einem Konzentrationsbereich von ca. 0,4 bis ca. 0,6 µg/ml vorhanden ist.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, worin der genannte Puffer einen oder mehrere der folgenden einschließt: K/NaHCO&sub3; mit einer Konzentration von ca. 5 bis ca. 50 mM; MgCl&sub2; mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 88 mM; KCl mit einer Konzentration von ca. 4 bis ca. 104 mM; Na&sub3;PO&sub4; mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 1,5 mM; und CaCl&sub2; mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 0,4 mM, so daß die Endosmolalität der genannten Reagenszusammensetzung ca. 250 bis ca. 330 mOsm beträgt.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, worin der genannte Puffer einen oder mehrere der folgenden einschließt: Tris mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 150 mM; K&sub2;Ox mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 121 mM; oder Barbiturat mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 155 mM, so daß die Endosmolalität der genannten Reagenszusammensetzung ca. 280 bis ca. 300 mOsm beträgt.

17. Reagenszusammensetzung zur Verwendung bei der Identifizierung und Charakterisierung von Retikulozyten in einer Vollblutprobe, umfassend Retikulozyten und Erythrozyten, durch Fluoreszenz/Streufließzytometrie, wobei die genannte Regenszusammensetzung eine fuoreszierende, kationische Farbstoffverbindung in einer zur in den genannten Retikulozyten vorgesehenen Färbung von Ribonuceinsäure wirksamen Menge, eine Menge eines zwitterionischen oberflächenaktiven Mittels, die ausreicht, um eine isovolumetrische Kugelbildung der genannten Retikulozyten und Erythrozyten zu bewirken, sowie eine Puffer-Lösung zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der genannten Zusammensetzung bei 6 bis ca. 9 umfaßt

18. Reagenszusammensetzung gemäß Anspruch 17, worin der genannte pH- Wert der genannten Zusammensetzung ca. 7 bis 8 beträgt.

19. Reagenszusammensetzung gemäß Anspruch 17 oder 18, worin die genannte Farbstoffverbindung Oxazin 750 ist, das die Formel aufweist:

20. Reagenszusammensetzung gemäß Anspruch 19, worin die genannte Farbstoffverbindung Oxazin 750 in der genannten Zusammensetzung in einer Konzentration von ca. 0,2 bis ca. 1,2 µg/ml vorhanden ist.

21. Reagenszusammensetzung gemäß Anspruch 20, worin die genannte Farbstoffverbindung Oxazin 750 in der genannten Zusammensetzung in einer Konzentration von ca. 0,4 bis ca. 0,6 µg/ml vorhanden ist.

22. Reagenszusammensetzung gemäß einem der Anspruche 17 bis 21, worin das genannte zwitterionische oberflächenaktive Mittel ein Alkylbetain oder ein Alkylamidobetain ist.

23. Reagenszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22, worin das genannte oberflächenaktive Mittel Lauramidopropylbetain ist.

24. Reagenszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23, worin das genannte zwitterionische oberflächenaktive Mittel in der genannten Zusammensetzung in einer Konzentration von ca. 12 bis ca. 87,5 µg/ml vorhanden ist.

25. Reagenszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 24, worin der genannte Puffer einen oder mehrere der folgenden einschließt: K/NaHCO&sub3; mit einer Konzentration von ca. 5 bis ca. 50 mM; MgCl&sub2; mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 88 mM; KCl mit einer Konzentration von ca. 4 bis ca. 104 mM; Na&sub3;PO&sub4; mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 1,5 mM; und CaCl&sub2; mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 0,4 mM, so daß die Endosmolalität der genannten Reagenszusammensetzung ca. 250 bis ca. 330 mOsm beträgt.

26. Reagenszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 24, worin der genannte Puffer einen oder mehrere der folgenden einschließt: Tris mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 150 mM; K&sub2;Ox mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 121 mM; oder Barbiturat mit einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 155 mM, so daß die Endosmolalität der genannten Reagenszusammensetzung ca. 280 bis ca. 300 mOsm beträgt.

27. Reagenszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 26, worin die genannte Zusammensetzung ferner ein oder mehrere Anionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Bicarbonat, Chlorid, Borat, Barbiturat, Oxalat und aus Ethylendiamintetraessigsäure, oder ein oder mehrere Kationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kalium, Natrium, Trishydroximethylaminomethan und aus Triethanolamin, oder Mischungen davon enthält.







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