PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69032028T2 20.05.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0500791
Titel ENTWURF UND KONSTRUKTION VON NICHTINFEKTIÖSEN MENSCHLICHEN RETROVIRUSMUTANTEN MIT MANGEL AN GENOMISCHER RNA
Anmelder The United States of America Represented by the Secretary U.S. Department of Commerce, Washington, D.C., US
Erfinder GORELICK, Robert, J., Braddock Heights, MD 21714-0291, US;
REIN, Alan, R., Takoma Park, MD 20912, US;
ARTHUR, Larry, O., Walkersville, MD 21793, US;
HENDERSON, Louis, E., Mount Airy, MD 21771, US;
OROSZLAN, Stephen, Potomac, MD 20854, US
Vertreter Patentanwälte HANSMANN-KLICKOW-HANSMANN, 22767 Hamburg
DE-Aktenzeichen 69032028
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 31.10.1990
EP-Aktenzeichen 919006361
WO-Anmeldetag 31.10.1990
PCT-Aktenzeichen US9006231
WO-Veröffentlichungsnummer 9106318
WO-Veröffentlichungsdatum 16.05.1991
EP-Offenlegungsdatum 02.09.1992
EP date of grant 04.02.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.05.1998
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse C07K 7/04   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Störung von vitalen Protein- Strukturen, die allen Retroviren gemeinsamen sind und an der Selektion und Packung von genomer viraler DNA in infektiöse Virus-Partikel beteiligt sind. Die Erfindung betrifft insbesondere eine drastische Reduzierung oder vollständige Beseitigung der Infektiosität des menschlichen Immundefizit-Virus 1 (HIV-1) durch die Erzeugung von Mutanten, denen einige oder alle invarianten Reste fehlen, die zur Bildung der Struktur erforderlich sind.

Ein Viruspartikel ist ein "Bündel", in dem Viruscodierte Proteine die viralen Genome umgeben und schützen. Aus diesem Grund müssen die viralen Proteine die viralen Genome zum "Bündeln" (Packen) während des Zusammensetzens des Virus spezifisch erkennen und auswählen können. Über die an dieser Erkennung beteiligten Mechanismen ist nur sehr wenig bekannt, auch wenn im Falle der Retroviren eine nicht-codierende Sequenz in der Nähe des 5' Endes der viralen RNA erforderlich, (P. Shank et al (1980) J. Virol. 3', 450- 456; R. Mann et al (1983) Cell 33, 153-159), für eine wirksame Einkapselung der RNA jedoch nicht ausreichend ist (J. Sorge et al (1983) J. Virol. 48, 667-675; S. Goff et al (1987) Biochem. Biophys. Acta 907, 93-123). Ein natürlich auftretender Mutant des Avian-Sarcoma- Virus, der scheinbar die Fähigkeit zur selektiven Einkapselung von viraler RNA verloren hat, wurde zwar beschrieben (M. Linial et al (1978) Cell 15, 1371- 1381), jedoch wurde die für diesen Fehler verantwortliche Veränderung in den viralen Proteinen bis jetzt nicht identifiziert.

Alle Retroviren codieren ein Polyprotein, das Gag- Precursor genannt wird und eine bedeutende Rolle bei dem Prozeß des Zusammensetzens eines Virus spielt. Nachdem ein Virus zusammengesetzt und freigesetzt worden ist, werden die Polyproteine in die gag oder Kernproteine aufgespalten, die in den ausgereiften infektiösen Viruspartikeln gefunden werden. Eines dieser Proteine, das "Nucleocapsid" Protein, bindet Nukleinsäuren in vitro und wird offenbar mit genomer RNA in dem Virion verbunden. In allen Retroviren enthält das Nucleocapsid-Protein eine oder zwei Kopien der folgenden Sequenz:

-Cys-X-X-Cys-X-X-X-X-His-X-X-X-X-Cys-

(L. Henderson et al (1981) J. Biol. Chem. 256, 8400- 8406; S. Oroszlan et al (1985) Current Topics in Microbiology and Immunology, P. Vogt, ed., Springer- Verlag, New York, Seiten 221-233; S. Covey (1986) Nucl. Acids Res. 14, 623-633). Wie bereits beschrieben wurde (J. Berg (1986) Science 232, 485-486), hat diese Sequenz eine starke Ähnlichkeit mit den "Zink-Finger"- Proteinsequenzen, die an der Erkennung spezifischer DNA-Sequenzen durch eine große Vielzahl von eukaryotischen Transcriptionsfaktoren (R. Evans et al (1988) Cell 52, 1-3) beteiligt sind. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Zink-Finger nicht mit RNA zusammenwirken.

Die Tatsache, daß diese Art bei allen retroviralen Nucleocapsid-Proteinen überall und gleichzeitig vorhanden ist, legt die Vermutung nahe, daß sie eine wesentliche Funktion in dem viralen Lebenszyklus hat. Ihre Ähnlichkeit mit den "Zinkfingern" eröffnet die Möglichkeit, daß sie an dem spezifischen Zusammenwirken mit dem viralen Genom beteiligt ist, das während des Zusammenbaus des Virus auftritt. Aus diesem Grund untersuchten die Erfinder die Einflüsse von Mutationen in dieser Art auf die Infektiosität des Virus und auf seine Fähigkeit, genome RNA zu packen, wie es in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1988, Vol 85, 8420-8424 beschrieben ist. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß, wie nachfolgend noch beschrieben werden wird, diese Art tatsächlich an der Erkennung der spezifischen RNA beteiligt ist und daß Mutationen in der Art die Fähigkeit der viralen Proteine zerstören, die virale RNA während des Zusammenbaus des Virus spezifisch zu packen. In der internationalen Patentanmeldung WO 9105860 von Young et al werden Punkt-Mutanten von Moloney-Murin- Leukämie-Viren offenbart, bei denen die Zystein-Reste an den Positionen 1 und 4 der Art in Tyrosin-Reste umgewandelt wurden. Young et al bestätigen, daß die Mutationen die Unfähigkeit zur Packung der viralen RNA zur Folge haben und vermuten, daß die auf diese Weise hergestellten mutanten viralen Partikel immer noch eine Immunantwort erzeugen können.

Bis jetzt konnte jedoch noch nicht bewiesen werden, daß andere als die von Young et al offenbarten Mutanten sowohl nichtinfektiös als auch in der Lage sind, eine Immunantwort zu erzeugen, so daß sie zur Verwendung als Impfstoffe geeignet sein könnten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine biologische Rolle der folgenden Sequenz von Aminosäuren zu definieren, die in dem Nucleocapsid-Domain der gag Precursor-Polyproteine aller replikationsfähigen Retroviren gefunden wird:

-Cys-X-X-Cys-X-X-X-X-His-X-X-X-X-Cys-

wobei X variable Aminosäuren darstellt. Die invarianten Reste bilden einen Teil einer vitalen Proteinstruktur, wobei mindestens einer davon in allen Retroviren gefunden wird und an der Selektion und Packung der genomen viralen RNA in infektiöse Viruspartikel beteiligt ist. Eine Störung dieser Struktur führt zur Erzeugung von Virus-ähnlichen Partikeln, die in struktureller Hinsicht normal zu sein scheinen, die jedoch nicht das normale Komplement der viralen RNA enthalten. Aus diesem Grund ist ihre Infektiosität erheblich reduziert oder vollständig beseitigt.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, die Infektiosität des menschlichen Immundefizit-Virus 1 (HIV-1) durch die Erzeugung von Mutanten, denen einige oder alle invarianten Reste fehlen, die zur Bildung der Struktur erforderlich sind, erheblich zu reduzieren oder zu beseitigen.

Die Figuren 1A und 1B zeigen die Eigenschaften von viralen Mutanten. Figur 1A zeigt die Protein- Immunomarkierungen. Die Viren wurden einem Glaskolben mit 150 cm³ entnommen, der 35 ml Medium enthielt und unter Verwendung von Antiserum gegen p30gag zur Erzeugung von Protein-Immunomarkierungen behandelt wurde. Linie 1 stellt Mutanten C39S, Linie 2 wilde Arten von Mo-MuLV und Linie 3 negative KontrollpGCcos3neo dar. Ferner sind Protein-molekulare Größenmarkierungen (in Kib-Dalton) dargestellt. Figur 1B zeigt die Hybridisierung von viraler RNA. Die Virusproben werden gewonnen und auf gleiche Mengen von p30gag eingestellt. RNA wurde aus Virus-Pellets isoliert und zu einer Mo-MULV gag-pol Sonde hybridisiert (die sich von Xho I [Nucleotid 1560 (T. Shinnick et al (1981) Nature (London) 293, 543-548)] zu Sal I [Nucleotid 3705] erstreckte). Es bezeichnet: Linie 1: negative Kontroll- pGCcos3neo; Linie 2: Mutanten C26S; Linie 3: Mutanten C26S/C29S; Linie 4: Mutanten C29S; Linie 5: Mutanten Y28S; Linie 6: Mutanten W35S; Linie 7: Mutanten C39S; Linien 8 und 9: 1:100 bzw. 1:10-fache Verdünnungen von wilder Art von Mo-MuLV. Ferner sind RNA-molekulare Größenmarkierungen (in Kilobasen) dargestellt.

Figur 2 zeigt die Hybridisierung von RNA aus Viren, die in Kulturflüssigkeiten aus KiSV-transformierten Rattenzellen enthalten sind. K-NRK-Zellen wurden mit Plasmiden transfektiert, die Mutanten oder wilde Arten von Mo-MuLV Genomen enthielten. Außerdem wurden stabile Transfektanten mit G-418 ausgewählt. Die Virusproben wurden gewonnen und auf gleiche Mengen von p30gag eingestellt. RNA wurde aus Virus-Pellets isoliert und zu einer 1 Kilobase Pst I-Sal I Kirsten-ras Sonde hybridisiert (M. McCoy et al (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1577-1582). Es bezeichnet: Linie 1: negative KontrollpGCcos3neo; Linie 2: Mutanten C265; Linie 3: Mutanten C26S/C29S; Linie 4: Mutanten C295; Linie 5: Mutanten Y28S; Linie 6: Mutanten W355; Linie 7: Mutanten C39S; Linie 8: wilde Art von Mo-MuLV; Linien 9 und 10: 1:10 bzw. 1:100-fache Verdünnungen von wilder Art von Mo- MuLV. Ferner sind RNA-molekulare Größenmarkierungen (in Kilobasen) dargestellt.

Die Figuren 3A, 3B und 3C zeigen die ³H-Uridin- Zählungen von mit einem Sucroseband versehenen Mutanten und wilden Arten von Viren. Zellen mit Mutanten oder wilden Arten von Viren, die in Glaskolben mit 150 cm³ entwickelt wurden, wurden für 12 Stunden mit 4 ml eines Mediums etikettiert, das 0,1 mCi/ml [5-³H]-Uridin enthielt. Der Virus wurde durch Zentrifugation gewonnen. Für jede Probe wurden Viren aus drei Glaskolben auf einen 10 - 50 % Sucrose Gradient in 100 ml NaCl, 10 mM TRIS, pH 7,4, 1 mM EDTA geschichtet. Die Gradienten wurden 36 Stunden in einem Beckman SW-41 Rotor bei 40.000 Udr/min und 4ºC zentrifugiert. Vom Boden jeder Probe wurden etwa 1 ml Fraktionen entfernt. Es bezeichnet: (-q-) die Dichte der Fraktion in g/cm³, (-o-) ³H-CPM der Fraktion; Figur 3A: negative KontrollpGCcos3neo; Figur 3B: wilde Art von Mo-MULV und Figur 3C: Mutant C26S.

Figur 4 zeigt Protein-Immunomarkierungen von mutanten und wilden Arten von HIV-I unter Verwendung von p24 CA monoklonalen Antikörpern. Helazellen wurden mit mutanten und wilden Arten von viralen Klonen transfektiert. Vier Tage später wurden geklärte Kulturflüssigkeiten durch einen 1 ml Puffer aus 20 % Sucrose in mit Phosphat gepufferter Salzlösung pelettiert. Die Proben wurden auf gleiche Mengen von umgekehrten Transcriptase-Aktivitäten eingestellt und für Protein- Immunomarkierungen verarbeitet. Der p24 CA monoklonale Antikörperkomplex wurde unter Verwendung von Meerrettich Peroxidase-Einfärbung sichtbar gemacht. Die Proben wurden gemäß der Figur etikettiert.

Figur 5 zeigt die Infektiositäts-Prüfung von Supernatanten von Helazellen, die mit wilden Arten und mutanten HIV-I Klonen transfektiert sind. Geklärte Supernatanten von den transfektierten Helazellen wurden auf gleiche Mengen von umgekehrter Transcriptase- Aktivität in einem gleichen Volumen von Inoculum eingestellt. Diese Supernatanten wurden in Anwesenheit von 2 µg/mL Polybren 12 Stunden lang mit H9 Zellen inkubiert. Den Inkubationen wurden 9 mL des vollständigen Mediums mit 2 µg/mL Polybren zugesetzt, und die H9 Suspensionen wurden in einen 25 cm² Gewebe- Kultur-Glaskolben überführt. An den genannten Tagen wurden diesen H9 Kulturen Proben entnommen, die geklärt und auf das Vorhandensein von umgekehrter Transcriptase-Aktivität untersucht wurden. Die untersuchten Proben sind in der Figur genannt.

Figur 6 zeigt die Endpunkt-Verdünnungs-Prüfung von wilden Arten und dem C15S/C18S Mutanten. 1 mL geklärter Supernatanten aus Helazellen, die mit den entsprechenden Klonen transfektiert waren, wurden gemäß Figur 5 behandelt. Die wilde Art von viralen Supernatanten wurde ebenfalls mit Medium 10-, 100- und 1000-fach verdünnt, während der C15S/C18S-Mutant unverdünnt blieb. An den genannten Tagen wurden Proben entnommen, geklärt und auf das Vorhandensein von umgekehrter Transcriptase-Aktivität untersucht. Die untersuchten Proben und Verdünnungen sind in der Figur genannt.

Figur 7 zeigt die "nördliche" Analyse von mutanter und der wilden Art von HIV-I viraler RNA. Die Supernatanten wurden wie in Figur 4 beschrieben behandelt und für die nördliche Analyse verarbeitet. Ein Nick übersetzter HIV-I Klon mit voller Länge wurde zur Untersuchung für genome RNA verwendet. Die Proben sind in der Figur angegeben.

Gemäß der Erfindung wird die Infektivität von HIV-I, der mindestens eine Kopie folgender Aminosäuresequenz enthält:

-Cys-X-X-Cys-X-X-X-X-His-X-X-X-X-Cys-

(nachfolgend als Zysteinreihe bezeichnet), erheblich reduziert oder vollständig beseitigt, indem Mutanten erzeugt werden, denen einige oder alle invarianten Reste fehlen, die einen Teil einer vitalen Proteinstruktur bilden, die allen Retroviren gemeinsam ist und an der Auswahl und Packung von genomer viraler RNA in infektiöse Viruspartikel beteiligt ist.

Die Erfindung ist auf den nicht-infektiösen menschlichen Immundefizit- Virus 1 (HIV-1) gerichtet. Dieser Virus enthält zwei hochkonservierte Zysteinreihen. Wie im nachfolgenden Beispiel 2 beschrieben wird, sind in beiden Zysteinreihen von HIV- 1 Mutationen vorgenommen worden, und die Ergebnisse zeigen, daß Änderungen von einer der Zysteinreihen zu nichtinfektiösen oder nur sehr schwach infektiösen Partikeln führt.

Beispiele für spezifische Retroviren, für die die Sequenzdaten der Reihen verfügbar sind, können der nachfolgenden Tabelle 1 entnommen werden.

Tabelle 1:

a: unterstrichene Reste sind invariant.

Die invariante Natur der Zysteinreihe wurde zuerst 1981 beschrieben (L. Henderson et al (1981) J. Biol. Chem. 256, 8400-8406), ihre vitale Bedeutung für die virale Replikation ist jedoch bisher nicht bekannt gewesen.

Verfahren zur Erzeugung (Konstruktion) von nichtinfektiösen Retroviren mit Substitutionen, Zusätzen oder Weglassungen von invarianten und variablen Resten innerhalb der Zysteinreihe umfassen zum Beispiel eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (M. Zoller et al (1982) Nucl. Acids Res. 10, 6487-6500) gemäß der Beschreibung des nachfolgenden Beispiels 1. Zusätzlich umfassen andere Verfahren, mit denen Mutanten erzeugt werden können, eine Kassetten- Mutagenese (J. Wells et al (1985) Gene 34, 315-323) und Natriumbisulfid-Mutagenese (R. Pine et al (1987) Methods Enzymol. 154, 415-430) von Einzelstrang DNA- Bereichen, die durch das Spalt- (gap-) Duplexverfahren hergestellt werden (W. Kramer et al (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367) und Polymerase Kettenreaktion (A. Hemsley et al (1989) Nucl. Acids Res. 17, 6545- 6551).

Die erfindungsgemäßen nichtinfektiösen Retroviren können zur Zubereitung von Impfstoffen verwendet werden. Wie oben erwähnt wurde, wird die Infektiosität von Mutanten erheblich reduziert oder vollständig beseitigt, da die Mutanten nicht das normale Komplement der viralen RNA enthalten. Die Oberflächenkomponenten der Mutanten sind jedoch identisch mit den Oberflächenkomponenten eines lebenden Virus, der virale RNA enthält. Somit können sich Antikörper gegen die Oberflächenkomponenten der Mutanten bilden, und die so erzeugten Antikörper sind gegen lebende Viren mit entsprechenden Oberflächenmerkmalen wirksam. Auf diese Weise können die nicht-infektiösen Retroviren zur Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden, die sicher in der Anwendung und wirksam gegen jeden Retrovirus sind.

Im Hinblick auf HIV-1 Mutanten wird angenommen, daß in den mutanten Virionen (soweit sie nicht von gp120 stammen) Epitopen enthalten sind, die bis jetzt bei anderen Untersuchungen mit viralen Protein- Untereinheiten, Peptiden, durch Hitze oder auf chemische Weise inaktivierten Impfstoffen nicht entdeckt worden sind. Es wird erwartet, daß diese starke Antikörper-Reaktionen auslösen und weniger variabel sind als die env Epitopen, die gegenwärtig untersucht werden. Es wird deshalb erwartet, daß ein größerer Bereich von HIV-1 Arten einer Immunisierung gegen diese gemeinsamen Epitope ausgesetzt ist.

Um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von infektiösen Revertanten zu vermindern, können in ein retrovirales Genom zusätzliche Veränderungen eingeführt werden, durch die nichtinfektiöse Partikel gewonnen werden, wobei diese Partikel trotzdem im wesentlichen die ursprungsähnliche Struktur behalten. Zu diesen gehört: Entfernen des packenden oder psi Bereiches des Genoms, der in dem 5' Teil des Genoms liegt und eine Erkennung und Packung der genomen RNA verhindert; Veränderung des proviralen 3' U3 Bereiches, wodurch Virionen erzeugt werden, die auch dann, wenn sie kleine Mengen von RNA enthalten, eine Transcription auf nachfolgende Infektionszyklen nicht initiieren könnten; Entfernen der Gencodierung für das Integrase (IN) Protein, wodurch eine nachfolgende Integration von proviralen Sequenzen in das zellulare Host-Genom verhindert wird; sowie Realisierung von mehrfachen Veränderungen in dem Klon, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Reversionen vermindert wird.

Die erfindungsgemäßen nichtinfektiösen Retroviren können auch bei der Entwicklung von wirksamen diagnostischen Verfahren für alle bekannten Retroviren sowie zur Entwicklung von wirksamen therapeutischen Mitteln verwendet werden. Wie oben bereits erwähnt wurde, wird mit der Erfindung die Bestimmung der biologischen Funktion der Zysteinreihe ermöglicht, die - wie herausgefunden wurde - an der Selektion und Packung von genomer viraler RNA in infektiöse Viruspartikel beteiligt ist. Da sich die strukturellen Merkmale aller bekannten Retroviren mit Ausnahme dieser Komponente, die allen gemeinsam ist, voneinander unterscheiden, kann jedes Verfahren, mit dem die Zysteinreihe entdeckt wird oder das auf ihre Funktion einwirkt, zur Erfassung aller bekannten Retroviren verwendet werden. Somit stellt die Zysteinreihe zum Beispiel ein Ziel für hinterlassene Reagenzien dar, die bei der Entwicklung von wirksamen diagnostischen Verfahren sowie der Entwicklung von therapeutischen Mitteln verwendet werden können.

Zum Beispiel wird erwartet, daß die Entwicklung von mutanten HIV Viren, die normalerweise für nur einen Zyklus (Runde) die Host-genome DNA infizieren und sich in diese integrieren können, von großer Bedeutung für AIDS-Studien und die Massen-Herstellung von Virionen für Reagens-Zwecke ist. Dieses Verfahren kann natürlich an jeden intakten retroviralen Klon angepaßt werden. Da zum Beispiel die mutanten HIV-1 Virionen ihre genome RNA aufgrund der Unfähigkeit der Nucleocapsid-Protein- Domäne, ihr Genom zu erkennen, nicht packen, ermöglicht eine sequentielle Transfektion einer Zysteinreihe eines mutanten Klons und ein Klon mit einem SV-40 (oder einem anderen geeigneten) Promotor, der mit gag oder gag-pol Genen verbunden ist, eine Komplementierung von mutanten Virusproteinen, was zu einer Packung der mutanten retroviralen Genome führt. Das komplementierende SV- 40/gag Genom wird nicht gepackt, da kein Packungssignal vorhanden ist. Der sich ergebende Virus kann - mit normalen gag Proteinen und mutanter genomer RNA - einer Infektionsrunde unterzogen werden und seinen Provirus in empfängliche Zellen, wie periphere Blut-Leukozyten (PBLs) oder aufgebaute Zellinien, integrieren. Diese Zellen werden dann stabile integrierte mutante Genome haben, die mutante Virionen erzeugen. Diese mutanten Virionen, die aus dieser stabilen Integration ausgedrückt werden, sind, wie bereits erwähnt wurde, unfähig, ihre RNA Genome zu packen, da die einzigen, in diesen Zellen erzeugten Nucleocapsid-Proteine in dem empfindlichen Bereich der Zysteinreihe geändert werden.

Bei einer anderen Ausführungsform werden mutante virale Arten, die nur für einen Zyklus infektiös sind, in PBLs eingeführt, die von einem Patienten isoliert wurden und nachfolgend wieder in den Blutstrom des Patienten eingebracht. Die infektierten PBLs drücken dann defekte Viren aus, die als eine konstante Quelle von Immunogen wirken. Während einer Zeitperiode sterben die PBLs aus und die mutanten Virionen werden, da sie nicht infektiös sind, vom Patienten beseitigt.

Bei einer weiteren Ausführungsform werden H-9 oder andere geeignete Zellen, die einen stabil integrierten mutanten Provirus enthalten, in ähnlicher Weise erzeugt. Solche Zellen sind dann eine kontinuierliche Quelle von mutanten, nicht infektiösen Viruspartikeln, so daß sich eine höhere Sicherheit bei Labor- oder diagnostischen Untersuchungen ergibt.

Bei einer weiteren Ausführungsform werden die mutanten Viren für die Zwecke von Reagenzien in der retroviralen Grundlagenforschung verwendet. Die Viren haben die zusätzliche Sicherheit, daß sie nicht infektiös sind und dennoch in jeder Hinsicht normal zu sein scheinen, mit Ausnahme des Fehlens von genomer RNA. Die mutanten Viren können als Reagenzien zur Erfassung von Antikörpern in infizierten Individuen verwendet werden, so wie es gegenwärtig mit entsprechenden Einrichtungen der Fall ist, die retrovirale env Komponenten-Proteine oder Peptide verwenden. Es wird erwartet, daß auf diesen Virionen andere, weniger variable Epitope vorhanden sind, die eine Erfassung einer größeren Vielzahl von viralen Arten ermöglichen.

Bei einer weiteren Ausführungsform werden die mutanten Viren bei der Entwicklung von anti-retroviralen Mitteln verwendet. Aufgrund der hervorragenden Empfindlichkeit des konservierten Aminosäurebereiches gegenüber einer Veränderung wird erwartet, daß die Entwicklung von chemischen Reagenzien, die auf die Aminosäuresequenz zielen, großen Nutzen bei der Bekämpfung einer retroviralen Infektion hat. Diese Reagenzien binden sich an diesen Bereich des Proteins und machen es nutzlos für die Erkennung seiner genomen RNA, so daß ein nichtinfektiöser Virus entsteht.

Weiterhin können aufgrund der stark konservierten Eigenschaft dieser Reihen, die in allen retroviralen Nucleocapsid-Proteinen gefunden werden, Prüfverfahren zur Erfassung aller Retroviren jeglicher Art entwickelt werden. Diese Prüfverfahren sind bei der Identifizierung von Retroviren nützlich, die in eine Anzahl von Krankheiten verwickelt worden sind. Die Prüfverfahren können die Erfassung von gemeinsamen Nucleotid-Sequenzen, die in der gag Gencodierung für diese konservierte Zysteinreihe gefunden werden, oder die Erfassung von Nucleocapsid-Proteinen, die diesen gemeinsamen Bereich enthalten, einschließen.

Die Erfindung soll im Detail anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben werden. Diese Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen die Erfindung nicht einschränken.

Beispiel 1

Erzeugung von Mutationen im Moloney Murin Leukämie- Virus Nucleocapsid-Protein, p10gag; Methodik:

Zellinien: Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) wurden bereits beschrieben (M. Gottesman, ed. (1985) Molecular Cell Genetics (Wylie-Interscience, New York), Seite 883; A. Rein et al (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7246-7250). Die K-NRK Linie von Rattenzellen, transformiert durch das Kirsten Sarcoma Virus (KiSV) (S. Aaronson et al (1971) J. Gen. Virol. 13, (245-252)) war ein Geschenk von Steve Showalter (National Center Institute-Frederick Cancer Research Facility).

Bakterien: Library- effiziente DH5a fähige Zellen, die für Transformationen unter Beteiligung von nicht-M13 Plasmiden verwendet werden und DH5aF' fähige Zellen, die für Transformationen mit Plasmidkonstruktionen vom Typ M13 verwendet werden, wurden von den Bethesda Research Laboratories bezogen. Die Transformationen dieser Hosts mit Plasmidkonstruktionen wurden entsprechend den Protokollen des Herstellers durchgeführt.

Plasmide: alle viralen Subklone wurden von einem infektiösen Klon des Moloney Murin Leukämie-Virus abgeleitet (M-MuLV), der ursprünglich von D. Steffen (A. Rein et al (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7246-7250) erhalten wurde. Ein vollständiger infektiöser Klon (mit der Bezeichnung pRR88), der die M-MuLV Genome in einem selektierbaren Vektor enthält, wurde unter Verwendung von 14,0-kilobase (Kb) Eco RI - Xho I Fragmenten aus einem Klon des M-MuLV in Charon 4A Vektor und des 6,5 kb Eco RI - Sal I Teils des pgccos3neo selektierbaren Vektors (ein Geschenk von Gray Crouse, Emory University, Atlanta, GA), der eine modifizierte Version des eine SAl I Seite enthaltenden pSV2neo Vektors ist (P. Southern et al (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 5177-5181) konstruiert; pUC118 (J. Vieira et al (1987) Meth. Enzym. 153, 3-11) war ein Geschenk von J. Vieira (Rutgers Campus, State University of New Jersey, New Brunswick, NJ). Ein c-Kiras Klon, pSW11,1 (M. Mccoy et al (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1577-1582) war ein Geschenk von M. Barbacid (National Cancer Institute-Frederick Cancer Research Facility)

Klonende und mutagenesische Reagenzien: alle in dieser Arbeit verwendeten klonenden Enzyme stammten entweder von den New England Biolabs oder den Bethesda Research Laboratories. Alle verwendeten Plasmidzubereitungen hatten Cäsiumbänder (Cäsium-bandiert). Mutagene Oligonudeotide und der Pst I - Xho I Adaptor (siehe unten) wurden auf einem Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer zubereitet. Die Sequenzen der mutagenen Oligonucleotide sind in der folgenden Tabelle 2 aufgelistet:

Tabelle 2:

a: Nucleotidposition der M-MULV Sequenz (T. Shinnick et al (1981) Nature (London) 293, 543-548)

Mutagenese: Die Mutagenese wurde in einem pUC118 Subkion von Moloney MULV (mit der Bezeichnung pRR89), der sich von der Xho I Seite (Nudeotide 1560 [T. Shinnick et al (1981) Nature (London) 293, 543-548]) zu der Sal I Seite (Nudeotide 3705) erstreckte, unter Verwendung eines Oligonucleotids als Einzelstrang- Adaptor oder "Bandhilfe" zwischen der Moloney Xho I Seite und der pUC118 Pst I Seite durchgeführt. Der Adaptor war 5' phosphorisiert (M. Zoller et al (1982) Nucl. Acids Res. 10, 6487-6500) und hatte die folgende Sequenz: 5'-TGAGGCTGCA-3'. Die Ligation wurde mit einem 500-fachen molaren überschuß des Adaptors über den Vektor und die 2145 pb Beifügung (die Ligation bestand aus 0,1 pmol der 2145 pb Beifügung und 0,01 pmol des pUC118 Vektors) durchgeführt. Einzelstrang-DNA wurde durch Superinfizierung von TG1 Bakterien erzeugt, die den Moloney Subklon mit M13K07 (ein Geschenk von J. Vieira) gemäß der Beschreibung (J. Vieira et al (1987) Meth. Enzym. 153, 3-11) enthielten. Andere Plasmidvektoren, aus denen man Einzelstrang-DNA für Mutagenese-Schablonen wiedergewinnen kann, umfassen Vektoren der Serien M13mp, der Serien pUc100 oder Bluescript Vektoren. Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung von Reagenzien und Verfahren durchgeführt, die durch Amersham Corp. (Arlington Heights, IL) zur Verfügung gestellt wurden. In jedem Fall wurden zu prüfende mutante Plasmide durch Ketten-Abschluß-Sequenzierung von Einzelstrang-DNA (F. Sanger et al (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) unter Verwendung von Sequenase (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) zwischen der Xho I Seite und der Sac I Seite bei Nucleotid 2554 analysiert. Schablonen zur Sequenzierung wurden durch Einfügung von mutanter 1003 bp Pst I - Sal I Seite bei Nucleotid 2554 konstruiert. Schablonen zur Sequenzierung wurden durch Einfügung von mutanten 1003 bp Pst I - Sal I Fragmenten in homologe Begrenzungsseiten von M13mp18 konstruiert. Oligonudeotide zur Verifizierung der mutanten 994 bp Xho I - Sac I Sequenzen wurden gemäß obiger Beschreibung zubereitet und sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgelistet.

Tabelle 3:

a: Nucleotidposition der M-MULV Sequenz (T. Shinnick et al (1981) Nature (London) 293, 543-548)

Dieses 994 BP Xho I - Sac I Fragment, das die Sequenz wilder Art mit Ausnahme für den gewünschten Bereich enthält, wurde dann bei der Rekonstruktion des intakten M-MuLV Genoms verwendet. Mutante Viruskonstruktionen wurden durch Ligatur des mutanten 994 BP Xho I - Sac I Fragmentes, das aus pRR89 hergestellt wurde (siehe oben) mit den 5,1 kb Sac I - Cla I und den 13 kb Xho I - Cla I Teilen aus dem infektiösen Klon (PRR88) durchgeführt. Um sicherzustellen, daß die rekonstruierten mutanten Plasmide außer der gewünschten Mutation keine Defekte enthielten, wurde das 994 BP Xho I - Sac I mutante Fragment in jedem Fall durch das entsprechende Fragment aus der wilden Art pRR89 ersetzt. Die sich ergebenden Plasmide (die wie oben beschrieben konstruiert wurden) verursachten eine voll infektiöse M-MuLV bei Transfektion in Hamsterzellen, basierend auf kurzlebigen Infektiositätsreihen. Mutationen werden wie folgt bezeichnet: eine Mutation, die den Zystein-Codon an Position 26 von p10gag zu einem Serin-Codon verändert, wird C26S genannt.

Transfektion und Gewebe-Kultur-Erhaltung: virale DNA- Konstruktionen wurden in die Eierstöcke des chinesischen Hamsters (CHO) und die K-NRK Linie von Rattenzellen eingebracht, die mit Kirsten Sarcoma Virus durch Kalziumphosphat Coniederschlag transformiert waren (F. Graham et al (1973) Virology 52, 456-467). 48 Stunden nach der Transfektion wurden die die viralen Konstruktionen enthaltenden und somit Neomycinresistenten Zellen unter Verwendung von 400 µg/ml G418 (Geneticin, Bethesda Research Laboratories) selektiert. CHO Zellen wurden in alpha-modifiziertem Eagle- Medium in Anwesenheit von 5 % fötalem Kalbserum, 400 µg/ml G418 und 0,3 µM Dexamethasone in einer Atmosphäre, der 5 % CO&sub2; zugegeben wurde, bei 37ºC kultiviert. K-NRK Zellen wurden in Dulbeccos-modifiziertes Eagle-Medium mit 10% fötalem Kalbserum unter identischen Bedingungen eingebracht.

Virusprüfungen: die Infektiosität und die umgekehrten Transcriptase-Prüfungen wurden wie beschrieben durchgeführt (R. Bassin et al (1971) Nature (London) 229, 564-566; A. Rein et al (1979) J. Virol. 29, 494- 500; A. Rein (1982) Virology 120, 251-257; B. Gerwin et al (1979) J. Virol 31, 741-751). Alle Infektivitäts- Prüfungen mit Ausnahme der SL Brennpunkts-Prüfung wurden in NIH/3T3 Zellen durchgeführt. Bei allen Experimenten, bei denen Viren gewonnen wurden, wurden die Zellen vor der Gewinnung für mehrere Tage mit 3 x 10&supmin;&sup7; M Dexamethasone (Sigma, St. Louis, MO) behandelt.

Isolation von Viren und viraler RNA: Kulturen von mit mutanten und wilden Arten von viralen Konstruktionen transfektierten Zellen wurden auf einen Zusammenfluß von näherungsweise 80 % in 150 cm² Glaskolben aufgezogen. Die Zellen erhielten einen Flüssigkeitswechsel mit 35 ml ihrer entsprechenden Medien (siehe oben) und wurden über Nacht inkubiert. Die Viren wurden durch Zentrifugation durch ein 4 ml Kissen aus 20 % Saccharose in mit Diethyl-pyrocarbonat behandelter, Phosphat gepufferter Salzlösung (R. Dulbecco et al (1954) J. Exp. Med. 99, 167-182) bei 25.000 Udr/min für 2,5 Stunden in einem Beckman SW-27 Rotor bei 4ºC gewonnen.

Protein- Immunomarkierungen und Immunoausfällungen: virale Proteine wurden wie beschrieben mit NaDodSo&sub4;- PAGE unter Verwendung von 10-20 % Acrylamid Gradient- Gelen fraktioniert und auf diazotiertes Papier überführt (J. Symington et al (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 177-181). Ziegen-Antiserum wurde auf p30gag verwendet (R. Versteegen et al (1980) J. Virol. 33, 983-992), und der Antigen-Antikörper Komplex wurde mit ¹²&sup5;I-Protein G (Amersham Corp.) sichtbar gemacht. Immunoausfällungen unter Verwendung von Protein A Sepharose (Pharmacia) wurden entsprechend früherer Verfahren (A. Schultz et al (1983) J. Virol. 46, 355- 361; A. Schultz et al (1979) J. Virol. 30, 255-266) durchgeführt. Antisera für das wichtigste gag Protein (p30gag) und für das env Protein gp70 wurden von Dr. Alan M. Schultz (Laboratory of Molecular Virology and Carcinogenesis, NCI Frederick Cancer Research Facility, Frederick, Maryland) geliefert. Die densiometrische Analyse der Autoradiogramme wurde unter Verwendung eines Biomed Instruments Soft Laser Scanning Densitometer, Model SL504 durchgeführt.

Nucleinsäure-Hybridisierung: RNA wurde wie beschrieben aus den Viruspartikeln isoliert (M. Bender et al (1987) J. Virol. 61, 1639-1646). Virale RNAs wurden auf denaturierenden Agarose Gels (T. Maniatis et al (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)) getrennt, zu einer Nitrocellulose überführt und mit ³²p- markierten, mit Nick übersetzten Sonden wie beschrieben hybridisiert (T. Maniatis et al (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York), P. Thomas (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205). Die hybridisierten Filter wurden dreimal in 2XSSC, 0,01% NsDodSO&sub4; bei 42ºC für 5 Minuten, zweimal in 1xSSC, 0,01% NaDodSO&sub4; bei 54ºC für 20 Minuten und zweimal in 0,5xSSC bei 54ºC für 5 Minuten gewaschen (1xSSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat).

Ergebnisse: Wie oben beschrieben wurde, wurde die Seiten-gerichtete Mutagenese ausgeführt und fünf Punkt- Mutationen erzeugt, die einzeln jede der unterstrichenen Aminosäuren wie folgt zu Serin umwandelten:

Zusätzlich wurden doppelt mutierend codierende Serine an den Positionen 26 und 29 erzeugt.

Intakte Moloney MuLV Genome, die diese Mutationen enthielten, wurden in den selektierbaren Vektor pGCcos3neo eingebracht. Die Mutanten wurden anfänglich sowohl in Hamster-, als auch in Mäusezellen transfektiert. Die Mutanten wandelten sich jedoch in den Mäusezellen häufig in wilde Arten um, und zwar vermutlich durch Rekombination mit endogenen MuLV Sequenzen (J. Colicelli et al (1987) Virology 160, 518- 522). Aufgrund dieses Problems wurden die in diesem Beispiel beschriebenen Versuche in Hamsterzellen durchgeführt

Massenkulturen von neo' Zellen wurden mit mehreren Arten von Prüfungen auf eine Erzeugung von Viruspartikeln untersucht. Wie in der folgenden Tabelle 4 gezeigt ist, wurden Kulturflüssigkeiten gefunden, die Partikel-bezogene umgekehrte Transcriptase-Aktivität mit im wesentlichen den gleichen Werten wie die Kontrollkultur enthielten, die mit der wilden Art elterlicher Plasmide transfektiert wurde.

Tabelle 4: Bigenschafien von p10gag

a: p30, Protein-Immunomarkierungsergebnisse (siehe Fig. 1A) sind in willkürlichen densiometrischen Einheiten angegeben;

b: RT, umgekehrte Transcriptase-Aktivität, pmol von [H³]TMP eingebracht pro ml Kulturflüssigkeit (B. Gerwin et al (1979) J. Virol. 31, 741-751);

c: FIU/ml, Brennpunkt-erzeugende Einheiten/ml in der S&spplus;L&supmin; Brennpunktsprüfung (R. Bassin et al (1971) Nature (London) 229, 564-566);

d: CPFU/ml, komplementäre, Belag-erzeugende Einheiten/ml (A. Rein et al (1979) J. Virol. 29, 494- 500);

e: N.D., nicht bestimmt.

CHO Zellen wurden mit Plasmiden transfektiert, die mutante oder wilde Arten von MuLV Genomen enthielten. Stabile Transfektanten wurden mit G-418 selektiert. Kulturflüssigkeiten aus diesen Kulturen wurden wie dargestellt geprüft. Die Mutanten sind wie folgt bezeichnet: C26S ist ein Mutant, bei dem der Zysteincodon an der Position 26 des p10gag in einen Serincodon umgewandelt wird.

Die Kulturflüssigkeiten waren jedoch bei dem UV-XC Test und der S&spplus;L&supmin; Brennpunktsprüfung negativ, mit denen die Konzentration der MuLV Partikel gemessen wird, die eine wirksame Replikation in Mäusezellen ausführen können. Sie wurden auch in der komplementären Belag-Prüfung getestet. Bei diesem Test wird ein komplementärer "Helfer-" Virus der Prüfungs-Platte zugeführt. Alle Partikel, die auch nur eine einzige Runde einer Infektion in Mäusezellen in Gang setzen können, werden in dieser Prüfung erfaßt (A. Rein et al (1979) J. Virol. 29, 494-500). Alle Mutanten mit Ausnahme von Y28S waren bei der Einführung des M-MuLV Genoms in die Zielzellen (CPFU Wert) gemäß der Bestimmung bei diesem Test um mindestens fünf Größenordnungen weniger wirksam als die wilde Art. Die einzelne Punkt-Mutation in dem Y28S Mutant erzeugt auch Viren, die keine kontinuierlichen Runden von Infektion und Replikation (FIU Wert) ausführen können, dieser Virus konnte jedoch in der CPFU Prüfung Zellen mit einer Wirksamkeit infizieren, die etwa drei Größenordnungen geringer war als diejenige der wilden Art. Die Mutationen ermöglichen somit die Erzeugung von Viruspartikeln, die aktive umgekehrte Transcriptase enthalten, diese Virionen sind jedoch im Falle von fünf der Mutanten absolut nichtinfektiös und nur sehr schwach infektiös im Falle von Y28S. Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese, daß die Aminosäuren in der Finger-ähnlichen Sequenz von entscheidender Bedeutung für die Virus- Replikation sind.

Die Partikel wurden auch durch Protein-Immunomarkierung unter Verwendung von Antiserum gegen das wesentliche Kern-Protein p30gag untersucht. Figur 1A zeigt die mit dem Mutanten C39S (Linie 1) erzielten Ergebnisse, sowie die positiven und negativen Kontrollwerte. Wie zu erkennen ist, erzeugen die C39S Partikel Profile, die identisch mit denen der wilden Kontrollart sind. Mit allen Mutanten wurden im wesentlichen identische Ergebnisse erzielt. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Mutationen die Erzeugung von Viruspartikeln nicht beeinträchtigen. Ferner zeigen sie, daß die virale Protease in den Mutanten normal funktioniert und den gag Polyprotein Precursor in die ausgereiften gag Proteine aufspaltet. Bei anderen Untersuchungen der Kulturen, die die mutanten MuLVs enthielten, konnten durch elektronenmikroskopische Untersuchung von dünnen Sektionen normal aussehende, sich entwickelnde Partikel entdeckt und durch Radioirnmunoausfällung normale Werte von env Proteinen festgestellt werden.

Die Viruspartikel wurden auch auf das Vorhandensein von viraler RNA untersucht. RNA wurde aus den Partikeln isoliert und durch Hybridisierung auf das Vorhandensein von viralen Sequenzen getestet. Gleiche Mengen von Viren (gemäß der Prüfung durch Protein-Immunomarkierung für p30gag) wurden in jede Linie (Bahn) eingebracht. Wie in Figur 1B zu erkennen ist, enthielt keiner der Mutanten mit Ausnahme von Y28S erfaßbare virale RNA. Die Linien 9 und 8 enthalten aufeinanderfolgende 10- fache Verdünnungen einer wilden Art von Kontroll-RNA. Diese Kalibrierung zeigt, daß Y28S Partikel näherungsweise 1/10 virale RNA gegenüber der wilden Art enthalten, während die anderen Mutanten weniger als 1/50 des Wertes der wilden Art enthalten. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Mutationen eine Einkapselung der viralen RNA verhindern.

Die hier beschriebenen Mutationen liegen in einem Protein-codierenden Bereich der MuLV Genome. Im Prinzip kann die Unfähigkeit der mutanten Partikel, die virale RNA zu packen, entweder eine Änderung in dem viralen Protein, durch die es nicht mehr im Hinblick auf die Erkennung oder Packung der viralen RNA funktioniert, oder eine Änderung der "Packungs-" Sequenzen in der RNA selbst, durch die diese unerkennbar für die an der Einkapselung beteiligten viralen Proteine wird, wiederspiegeln. Aus diesem Grund wurde die Fähigkeit der Mutanten zur Packung einer zweiten RNA, von der bekannt ist, daß sie mit hoher Wirksamkeit durch wilde Arten von M-MuLV Proteinen gepackt wird, getestet. Plasmide, die die mutanten oder MuLV Genome wilder Art enthielten, wurden in die durch KiSV transformierte K- NRK Ratten-Zellinie transfektiert. Die stabilen Transfektanten wurden isoliert. Die durch diese Kulturen erzeugten Partikel wurden dann durch Hybridisation auf KiSV genome RNA analysiert. Die Befreiung hängt von der Fähigkeit des viralen gag Precursor Polyproteins ab, die Kirsten-ras genome RNA spezifisch zu erkennen und damit einen Komplex zu bilden. Wie in Figur 2 gezeigt ist, enthalten die mutanten Partikel alle weniger KiSV RNA als die Kontrollgruppe der wilden Art; im Hinblick auf die Linien 8 und 9 wurde erwartet, daß die Schwäche der KiSV RNA -Packung im Bereich zwischen 1/30 (Mutanten C26S und C26S/C29S) und 1/2 (Mutanten Y285) liegt. Diese Daten zeigen, daß die Mutationen in dem p10gag Codierbereich die Fähigkeit der viralen Proteine, die virale RNA zu packen, verschlechtert haben.

Es ist interessant, die Figur 2 mit Figur 1B zu vergleichen. Die Mutanten sind bei der Packung der MuLV RNA offenbar wesentlich schwächer als bei der KiSV RNA. Diese Diskrepanz bleibt bei den verschiedenen Experimenten gleich, da nahezu gleiche Ergebnisse wie die in Figur 1B gezeigten erzielt wurden, wenn der in Figur 2 gezeigte Fleck durch Erhitzen auf 100ºC "auseinandergezogen" und dann mit einer MuLV- spezifischen Sonde rehybridisiert wurde.

Die in Figur 2 analysierten Flüssigkeiten wurden ebenfalls durch Infektiositätsprüfungen für MuLV und KiSV getestet. Wie aus der folgenden Tabelle 5 hervorgeht, wurden geringe Werte von infektiösem KiSV durch die mutanten MuLVs "gerettet".

Tabelle 5:

a: p30, Protein-Immunomarkierungsergebnisse sind in willkürlichen densiometrischen Einheiten angegeben;

b: FIU/ml, Brennpunkt-erzeugende Einheiten von KiSV/ml. (A. Rein et al (1982) Virology 120, 251-257);

c: CPFU/ml, komplementäre, Belag-erzeugende Einheiten/ml;

d: KiSV spezifische Infektivität, FFU:p30 Verhältnis von Mutant/FFU:p30 Verhältnis der wilden Art.

K-NRK Zellen wurden mit Plasmiden transfektiert, die die bezeichneten viralen Genome enthielten. Stabile neor Transfektanten wurden isoliert. Die Kulturflüssigkeiten wurden wie angegeben geprüft. Die KiSV Titers waren jedoch wesentlich höher als die die Titer der MuLV Partikel, die die Prüfzellen (d.h. CPFU) infizieren konnten. Das Verhältnis der Mutanten zu den Werten der wilden Art der CPFU ist für die in den Tabellen 4 und 5 genannten Daten das gleiche, was die Reproduzierbarkeit dieser Ergebnisse zeigt. Die spezifischen Infektiositäten der durch die Mutanten geretteten KiSV (in der ganz rechten Spalte der Tabelle 5 angegeben) waren wesentlich geringer als der KiSV RNA Gehalt dieser Partikel (Figur 2). Die Bedeutung dieser quantitativen Vergleiche wird nachfolgend erläutert.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die mutanten Partikel hinsichtlich ihrer Fähigkeit, virale RNA zu packen, Mängel aufweisen. Es wurde als wichtig angesehen, zu bestimmen, ob diese Mängel die Unfähigkeit zur spezifischen Erkennung und Packung viraler RNA oder einen vollständigen Verlust der Kapazität zur Integration von RNA in Viruspartikel wiederspiegelte. Deshalb wurden die durch die Mutanten erzeugten Partikel auf das Vorhandensein von RNA getestet. Kulturen, die mutante oder wilde Arten von Viren erzeugen, wurden für 12 Stunden mit ³H-Uridin markiert. Die durch diese markierten Kulturen erzeugten Partikel wurden dann in Isopycnic Sucrose Gradienten mit einem Band versehen. In Figur 3 sind drei typische Gradienten gezeigt: eine Spitze der Radioaktivität liegt bei 1,16 g/ml in Flüssigkeiten, die wilde Arten oder C26S mutante MuLV enthalten, während in Flüssigkeiten von den Kontrollzellen, die nur mit dem plasmiden Vektor transfektiert wurden, keine Spitze beobachtet wird. Mit allen Mutanten wurden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse erzielt. Um zu bestätigen, daß die Spitze der Radioaktivität bei 1,16 g/ml eine RNA in Viruspartikeln repräsentiert, wurde ihre Empfindlichkeit gegenüber einer Verdauung mit pancreatischer Ribonudease untersucht. Wie aus der nachfolgenden Tabelle 6 hervorgeht, ergab sich, daß mindestens 50 % der Radioaktivität in den mutanten viralen Spitzen nach einer direkten Aussetzung durch entweder 100 µg/ml Rnase oder 1% Triton X-100 mit Säure ausfällbar blieb, daß sich jedoch eine vollständige Säure-Löslichkeit ergab, wenn sie vor der Rnase Verdauung mit 1 % Triton X-100 behandelt wurden ("Triton" ist eine eingetragene Marke).

Tabelle 6: ³H-Uridin-Markierung von viraler RNA

a: in der Tabelle sind TCA-ausfällbare CPM angegeben, die nach den angegebenen Behandlungen des Sucrosebandierten Virus zurückbleiben;

b: 1 % Triton-X 100 ("Triton" ist eine eingetragene Marke);

c: 100 µg/ml RNAse A.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die mutanten Partikel tatsächlich RNA enthalten. Die Mutationen in p10gag haben somit offensichtlich die Spezifizität der viralen Proteine für die virale RNA und nicht so sehr die Fähigkeit der Partikel zerstört, die RNA per se aufzunehmen.

Die hier erzielten Punktmutationen lagen alle in einer sehr stark erhaltenen Sequenz, die einige Ähnlichkeit mit den Metall-bindenden Domänen ("Zink-Finger") hat, die in einer Anzahl von eukaryotischen Transcriptions- Faktoren gefunden wurden. Die Erfinder haben herausgefunden, daß jeder Mutant Viruspartikel entstehen läßt, daß diesen Partikeln jedoch virale RNA fehlt. Da die Partikel tatsächlich einige RNA enthalten, haben die Mutationen die Spezifität beseitigt, mit der die viralen Proteine normalerweise die viralen Genome erkennen und einkapseln Somit scheint das fingerähnliche Sequenzmuster in dem p10gag eine wesentliche Rolle bei diesem Erkennungsvorgang zu spielen.

Die oben beschriebenen Experimente haben gezeigt, daß im Falle des Beispiel-Virus (M-MULV) die Zysteinreste in diesen Strukturen für einen infektiösen und replizierenden Virus absolut erforderlich sind, und die Erfinder gehen davon aus, daß ein ähnliches Erfordernis bezüglich dieser Reste für alle Retroviren besteht. Da der Histidin-Rest auch in den in Tabelle 1 angegebenen Beispielen invariant ist, wird davon ausgegangen, daß dieser Rest ebenfalls für infektiöse replizierende Viren erforderlich ist. Daraus wird gefolgert, daß jeder dieser Reste in einer bis jetzt nicht spezifizierten Weise wirkt, um es den gag Precursor- Polyproteinen zu ermöglichen, einen spezifischen Komplex mit viraler RNA einzugehen, wobei jedoch zusätzliche Funktionen nicht ausgeschlossen sind.

Die Verfahren der Seiten-gerichteten Mutagenese zur Einführung spezifischer Seiten, zum Löschen und Hinzufügen von Mutationen, sind hier verwendet worden, um die Funktion der invarianten Reste in der Reihe des Beispielvirus zu untersuchen. Es wird gefolgert, daß ähnliche Mutationen, die die Reste in den invarianten Reihen von jedem Retrovirus ändern, mutante Formen dieses Virus mit Eigenschaften erzeugen werden, die ähnlich den Eigenschaften des hier genannten Beispiels sind. Somit ist es für jeden Retrovirus möglich, invariante Reste in den Reihen zu mutieren und mutante Formen des Virus zu erzeugen, die in jeder Hinsicht normal sind, jedoch keine wesentlichen Werte von genomer viraler RNA enthalten und eine drastisch reduzierte oder keine Infektivität haben. Es wird erwartet, daß solche Mutanten wichtige Anwendungen als Immunogene oder als Quelle von ausgereiften viralen Proteinen ohne biologische Risiken haben.

Beispiel 2 Erzeugung von Mutationen in der gag Gencodierung für das Nucleocapsid-Protein des HIV-1

In der gag Gencodierung für das Nucleocapsid-Protein des HIV-1 wurden unter Verwendung der im obigen Beispiel 1 beschriebenen Verfahren Mutationen erzeugt.

Diese Mutationen, die durch die Technik der Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese eingeführt wurden, sind in der folgenden Tabelle 7 dargestellt:

Tabelle 7: Mutationen in dem Nucleocapsid-Protein des HIV-1

a: Die Ziffern beziehen sich auf die Position des Aminosäurerestes in dem ausgereiften HIV-1 NC Protein.

Die vollständigen mutanten HIV-1 Klone wurden unter Verwendung von CaPO&sub4; Niederschlägen in HeLa Zellen transfektiert. Die Viren wurden drei bis fünf Tage nach der Transfektion entnommen. Die entstandenen mutanten Viren waren durch verschiedene immunochemische, Protein-, Nucleinsäure- und Infektiositätsverfahren gekennzeichnet.

Mutante virale Supernatanten wurden unter Verwendung eines Dupont p24 Antigen Capture Kit auf das Vorhandensein von p24 getestet. Ferner wurde das Vorhandensein von umgekehrter Transcriptase (RT) - Aktivität durch Folgen der Einführung von ³H-TTP in Oligo-dT-poly(A) primer-template Komplexe geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 8 angegeben.

Tabelle 8: Eigenschaften der HIV-1 Mutanten

a: der p24CA Gehalt von geklärten Supernatanten aus Hela-Zellen, die mit mutanten und wilden Arten von HIV- I Klonen transfektiert waren, wurden unter Verwendung des DuPont HIV p24 Core Antigen ELISA Kit getestet;

b: die umgekehrte Transcriptase-Aktivität wurde durch Ausfällen von 0,5 mL geklärter Kulturflüssigkeit mit 0,25 mL von 50 % Polyethylenglykol (8000 MW) in 0,5 M NaCl bestimmt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation pellettiert und TNE Puffer aufgelöst. Die umgekehrten Transcriptase-Reihen wurden wie beschrieben auf 1/5 jeder Probe angewendet (A. Hoffman et al (1985) Virology 147, 326-335);

c: Verhältnis von p24CA (ng/mL) / RT Aktivität (cpm).

Die Mengen der erzeugten Viren waren ziemlich variabel. Es wird angenommen, daß dies die inhärenten Variabilitäten der Transfektionsverfahren wiederspiegelt. Fünf Tage nach der Transfektion wurde aus einer 24 Stunden Ernte von 30 mL Supernatant aus einer Confluent 150 cm³ Monoschicht von HeLa Zellen ein Mittelwert von 12 ng von p24 CA Protein pro mL Supernatant erfaßt. Die p24 Antigen Capture-Ergebnisse und RT Aktivitäten zeigten eine annehmbare Übereinstimmung. Dies bedeutet, daß die Mutanten normale Mengen von RT pro Viruspartikel hatte.

Für alle folgenden Experimente wurde jeder Supernatant auf konstante Mengen von Viren auf der Basis der Daten der umgekehrten Transcriptase eingestellt. Es wurden Immunomarkierungen vorgenommen und Proteine durch Untersuchung mit monodonalen Antikörpern gegen p24 (Figur 4) sichtbar gemacht. Es schien, daß alle mutanten Virionen ihre gag Genprodukte in identischer Weise wie die wilden Arten von Viren verarbeiten, wodurch ein ausgereiftes CA Protein (p24) gewonnen wird. Dies zeigte, daß die virale Protease ausgedrückt worden war und richtig funktionierte. Ferner soll darauf hingewiesen werden, daß sowohl in den wilden Arten, als auch in diesen Mutanten mit diesen Antisera einige ungespaltene gag Precursoren erfaßt wurden. Somit wurde angenommen, daß die mutanten HIV-1 Virionen funktionale gag und pol Gene hatten, wie es in der in Figur 4 gezeigten Western Prüfung und aus den in Tabelle 8 genannten Daten der umgekehrten Transcriptase (RT) zu erkennen ist.

Das infektiöse Potential dieser Mutanten wurde durch Entnehmen von geklärten Supernatanten aus den transfektierten HeLa Zellen, Einstellen auf gleiche umgekehrte Transcriptase-Aktivitäten und Inkubieren mit H-9 Zellen für 12 Stunden in Anwesenheit von 2 µg/mL Polybren geprüft. Die H-9 Zellen wurden mit dem Zusatz von 2 µg/mL Polybren wie gewöhnlich transportiert. Die Produktion der Viren wurde durch Folgen der umgekehrten Transcriptase-Aktivität während des Zeitverlaufes bestimmt. Supernatanten aus HeLa Zellen, die mit der wilden Art des Klons transfektiert wurden, enthielten infektiöse Viren, was sich durch einen Anstieg der Supernatanten RT Aktivität der H9 Zellen fünf Tage nach der Infektion zeigte (siehe Figur 5). Supernatanten aus HeLa Zellen, die mit den mutanten HIV-1 Klonen transfektiert waren, erzeugten Viren, die gemäß der Bestimmung durch diese Analyse nicht infektiös waren. Auch nach 32 Tagen konnten die HeLa Supernatanten, die mutante Viren enthielten, keine RT Aktivität in den H9 Zellen induzieren. Ähnliche Kulturen wurden 44 Tage nach der Infektion analysiert, wobei die mutanten Viren immernoch kein Anzeichen einer Infektion zeigten. Die gleichen Ergebnisse waren zu beobachten, wenn diese Supernatanten auf menschliche periphere Blut- Lymphozyten angewandt wurden. Eine Endpunkt- Verdünnungsprüfung zeigte, daß die Mutanten mindestens 1.000-fach und möglicherweise sogar 10.000-fach weniger infektiös waren als identische Mengen von Viren wilder Art (auf der Basis der umgekehrten Transcriptase- Aktivitäten). Wie in Figur 6 gezeigt ist, sind wilde Arten von Viren aus Hela-Zellkulturflüssigkeiten auch nach 1.000-facher Verdünnung noch in der Lage, H9 Zellen und menschliche PBLs produktiv zu infizieren. Unverdünnte Mutanten, C15S/C19S können hingegen H9 Zellen oder menschliche PBLs nicht produktiv infizieren.

Es wurde unter Anwendung der "nördlichen" Analyse auf die Supernatanten versucht, in diesen Mutanten RNA zu finden. Die Proben wurden gemäß der Beurteilung durch die ³H-TTP eingeführten Daten (siehe obige Tabelle 8) auf gleiche Stärke der RT-Aktivität eingestellt. Die virale RNA wurde durch Elektrophorese auf einem Formaldehyd-Gel getrennt und isoliert. Die RNA wurde dann auf Nitrozellulose überführt und mit einer vollständig HIV-1 Nick-übersetzten Sonde untersucht. Wie in Figur 7 zu erkennen ist, hatte die wilde Art des Virus ein Band mit korrekter Größe, das 9,7 kBP entspricht. Die mutanten Virionen enthielten bei einem Vergleich mit einer gleichen Menge wilder Virusarten reduzierte Mengen von genomer RNA. In einer Verdünnung der wilden Art des Virus mit 1/10 und 1/100, die beide auf dem belichteten "Northern Film" entdeckt wurden, enthielten die Reihe #1 Löschung und die C36S Mutanten näherungsweise 2 bis 5 % der Menge von genomer RNA, die in der gleichen Menge wilder Arten von HIV-1 Partikeln enthalten sind, und die C36S/C39S Mutanten enthielten etwa 20 % der in der wilden Art gefundenen RNA. Es ist sehr interessant festzustellen, daß die Mutanten immer noch nichtinfektiös sind, obwohl sie im Vergleich zu einer gleichen Anzahl von Partikeln wilder Art einen Gehalt von 4 bis 20 % genomer RNA haben. Während das Fehlen der Infektiosität der Mutanten zum Teil auf dem Fehlen viraler RNA beruhen kann, legen die Ergebnisse jedoch nahe, daß es eine weitere Ursache gibt, die auf dieser konservierten Zysteinreihe in dem Nucleocapsid- Protein beruht, und daß diese Funktion gegenüber diesen Änderungen ebenfalls empfindlich ist. Diese Beobachtung ist in Moloney-MuLV Mutanten gemacht worden,

Wie die obigenexperimente zeigen, führt eine Änderung von einer der zwei konservierten Zysteinreihen des HIV- 1 zu nichtinfektiösen Virionen, die phänomelogisch ähnlich denjenigen sind, die in Mo-MuLV zu sehen sind, das nur eine konservierte Reihe aufweist. Somit wird angenommen, daß beide Reihen für eine wirksame Erkennung und Packung von homologer genomer RNA erforderlich sind.

Wie erläutert wurde, ist es möglich, eine Viruszusammensetzung zu entkoppeln, die aus einer Komplexbildung mit viraler RNA entsteht und heranreift, indem die invarianten Reste der Reihen geändert werden.

Daraus wird geschlossen, daß jedes Verfahren zur Änderung der chemischen oder biologischen Eigenschaften dieser Reste zur Erzeugung von nicht-infektiösen Viren führt. Somit kann jedes Reagens oder jede Kombination von Reagenzien, mit dem/der die biologische Funktion dieser invarianten Reste spezifisch geändert wird, die Grundlage für die Entwicklung von wirksamen therapeutischen und/oder prophylaktischen Verfahren für jeden Retrovirus bilden.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Reduzierung der Infektivität des menschlichen Immundefizit-Virus 1 (HIV-1), das das Einbringen mindestens einer Punktmutation in eine Zysteinreihe umfaßt, die in einem Nukleocapsid- Domain des gag Precursor-Polyproteins des Virus vorhanden ist und folgende Sequenz aufweist:

-Cys-X-X-Cys-X-X-X-X-His-X-X-X-X-Cys--

wobei jedes x unabhängig eine variable Aminosäure darstellt, vorausgesetzt, daß die mindestens eine Punktmutation an den beiden Positionen 1 und 4 der Zysteinreihe keine Tyrosine einbringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die mindestens eine Punktmutation ein invarianter Rest der Sequenz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die mindestens eine Punktmutation ein varianter Rest der Sequenz ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die mindestens eine Punktmutation in der Weise geartet ist, daß bei einer Messung durch eine Infektivitätsprüfung die Infektivität des Retrovirus um mindestens drei Größenordnungen reduziert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die mindestens eine Punktmutation in der Weise geartet ist, daß bei einer Messung durch eine Infektivitätsprüfung die Infektivität des Retrovirus um mindestens vier Größenordnungen reduziert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die mindestens eine Punktrnutation in der Weise geartet ist, daß bei einer Messung durch eine Infektivitätsprüfung der Retrovirus als nichtinfektiös anzusehen ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die mindestens eine Mutation in zwei der Zysteinreihen vorhanden ist.

8. Menschlicher immundefizienter Virus 1 (HIV-1) mit reduzierter Infektivität, der mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt worden ist.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com