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Dokumentenidentifikation DE69408631T2 02.07.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0652227
Titel VERFAHREN ZUR REINIGUNG EINES HYDROPHOBEN POLYPEPTIDES
Anmelder Tokyo Tanabe Co., Ltd., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder TAKEI, Tsunetomo, Tokyo Tanabe Company Limited, Kita-ku, Tokyo 115, JP;
AIBA, Toshimitsu, Tokyo Tanabe Company Limited, Kita-ku, Tokyo 115, JP;
SAKAI, Kaoru, Tokyo Tanabe Company Limited, Kita-ku, Tokyo 115, JP;
FUJIWARA, Tetsuro, Morioka-shi, Iwate 020, JP
Vertreter HOFFMANN · EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69408631
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 28.04.1994
EP-Aktenzeichen 949145825
WO-Anmeldetag 28.04.1994
PCT-Aktenzeichen JP9400731
WO-Veröffentlichungsnummer 9425480
WO-Veröffentlichungsdatum 10.11.1994
EP-Offenlegungsdatum 10.05.1995
EP date of grant 25.02.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.07.1998
IPC-Hauptklasse C07K 1/14
IPC-Nebenklasse C07K 14/00   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren für hydrophobe Polypeptide, und im besonderen ein Reinigungsverfahren für hydrophobe Polypeptide, die stärkere Oberflächenaktivität in Verbindung mit einer Lipidmischung aufweisen.

Hintergrund

Atemnotsyndrom des Neugeborenen ist eine Krankheit, die schwerwiegende Atemwegserkrankungen als Folge von Lungenkollaps aufgrund eines Mangels an einer lungenoberflächenaktiven Substanz auslöst und mit hoher Mortalität bei Frühgeborenen beobachtet wird. In den letzten Jahren wurde bei der Behandlung des Atemnotsyndroms des Neugeborenen eine Ergänzungstherapie entwickelt, bei der eine lungenoberflächenaktive Substanz über eine Trans-Atemweg von außen verabreicht wird, und diese Therapie hat sich als erfolgreich erwiesen.

Einige Erfinder dieser Erfindung isolierten Lipoprotein aus lungenoberflächenaktiver Substanz, die von Tieren abstammt, und sie stellten fest, daß das Lipoprotein eine wesentliche Komponente für die Lungenoberflächenaktivität ist, und daß die lungenoberflächenaktive Substanz, einschließlich der durch Kombinieren des Lipoproteins mit einer Lipidmischung hergestellten komplexen Lipid-Lipoproteinmischung, ausgezeichnete Oberflächenaktivität aufweist, nämlich die Wirkung der Oberflächenspannungsverringerung, wobei ein alveoläres Raumvolumen erhalten wird, das ausreicht, um normale Atmung witer zu gewährleisten und zwar indem die Oberflächenausdehnungszeit verkürzt und die Gleichgewichtsoberflächenspannung verringert wird. Dadurch eignet sich das Lipoprotein für die Behandlung von Atemnotsyndrom des Neugeborenen (siehe japanische Patentveröffentlichungsnr. Hei 3-78371 Gazette).

Außerdem stellten die Erfinder dieser Erfindung fest, daß ein synthetisch hergestelltes Polypeptid mit einer Teilstruktur von Apoprotein C (Sequenz Nr. 11, hiernach als "SP-C" bezeichnet), das ein spezifisches Apoprotein der Lungenoberfläche von Säugern ist, starke Oberflächenaktivität aufweist, wenn es mit einer Lipidmischung kombiniert wird (Japanische Patentveröffentlichungsnr. Hei 4-98093).

Die Reinigung von SP-C und des oben beschriebenen synthetisch hergestellten Polypeptids mit Teilstruktur von SP-C war aufgrund der äußerst niedrigen Löslichkeit dieser Peptide in der beweglichen Phase, was auf ihre sehr starken hydrophoben Eigenschaften unter Bedingungen der üblichen Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (hiernach als "HPLC" bezeichnet) zurückzuführen ist, jedoch sehr schwierig

Im allgemeinen wird ein hydrophobes Protein oder Polypeptid als eines mit einem verhältnismäßig hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren (einschließlich Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Leucin, Valin und Methionin) definiert. In Tabelle 1 sind die Gesamtzahl der Aminosäurereste in bestimmten Proteinen, die Zahl der hydrophoben Aminosäurereste und der hydrophobe Aminosäurengehalt (Zahl der hydrophoben Aminosäurerestel Gesamtzahl der Aminosäurereste) gezeigt. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, sind die oberflächenaktive Substanz Apoprotein B (hiernach als "SP-B" bezeichnet) und SP-C hochhydrophobe Proteine im Vergleich zu den anderen Proteinen.

Tabelle 1

Für die Reinigung solcher hydrophober Polypeptide wurde weitläufig ein Verfahren angewendet, das Umkehrphasen-HPLC verwendet, wobei ein polares Lösungsmittel, wie H&sub2;O, Acetonitril und Methanol, als bewegliche Phase verwendet wird.

Für die bewegliche Phase ist zum Beispiel Umkehrphasen-HPLC bekannt, die ein gemischtes Lösungsmittel verwendet, das durch Zugabe einer organischen Säure (wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure) zu einem polaren Lösungsmittel (wie H&sub2;O, Acetonitril oder Methanol) erhalten wird, wobei eine Spurenmenge von Trifluoressigsäure von lediglich 0.5% verwendet wurde (japanischen Patentveröffentlichungsnummer Hei 1-501282 Gazette)

Auf der anderen Seite war es aufgrund der niedrigen Löslichkeit der Proteine in der beweglichen Phase schwierig, Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung dieses Lösungsmittels als bewegliche Phase bei der Reinigung von hydrophoben Proteinen wie SP-B und SP-C, die in dem von Tieren abstammenden lungenoberflächenaktiven Mittel enthalten sind, durchzuführen.

Außerdem ist es nicht möglich gewesen, die Verunreinigung dieser hydrophoben Polypeptide mit einer Spurenmenge von Verunreinigungen zu verhindern, selbst wenn Säulenfüllstoff auf Polyvinylalkohol-Basis und das vorgenannte polare Lösungsmittel als bewegliche Phase verwendet wurden. Wenn eine solche Verunreinigung vorhanden ist, ist die lungenoberflächenaktive Substanz gefärbt, und das hydrophobe Polypeptid kann keine ausreichende Oberflächenaktivität zeigen, da es polymerisiert und gerinnt.

Angesichts des vorgenannten war die Entwicklung eines verbesserten Reinigungsverfahrens erforderlich.

Offenbarung dieser Erfindung

Die Erfinder haben eingehende Untersuchungen durchgeführt, um auf ein Verfahren zum Reinigen hydrophober Polypeptide zu kommen, und sie haben ein ausgezeichnetes Verfahren ermittelt, worin das hydrophobe Polypeptid in Trifluoressigsäure (hiernach als "TFA bezeichnet) gelöst wird und eine HPLC durchgeführt wird, in der ein gemischtes Lösungsmittel, enthaltend TFA, als bewegliche Phase und ein Säulenfüllstoff auf Polyvinylalkohol-Basis verwendet wird.

Für das zu verwendende gemischte Lösungsmittel als bewegliche Phase kann ein gemischtes Lösungsmittel, enthaltend TFA in einer Konzentration von 3 bis 10 %, bevorzugt 5 bis 10 %, und am meisten bevorzugt 7 bis 10 %, verwendet werden. Für das als gemischtes Lösungsmittel zu verwendende Lösungsmittel werden halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform und 1,2-Dichlorethan verwendet. Wenn Aminosäuren mit einer Thiolgruppe, wie Cystein, in dem Peptid vorhanden sind, kann β- Merkaptoethanol oder dergleichen als Antioxidationsmittel für die Thiolgruppe zugegeben werden. Die Quantität von β-Merkaptoethanol, die zugegeben wird, ist im allgemeinen so, daß sie eine Endkonzentration von 0,1 mM ergibt.

Das Reinigungsverfahren dieser Erfindung kann auch verwendet werden zum Reinigen eines breiten Bereichs anderer hydrophober Polypeptide, sowie auch anderer hydrophober Lipoproteine (z.B. SP-B), die in der lungenoberflächenaktiven Substanz enthalten sind.

Beste Ausführungsform dieser Erfindung

Diese Erfindung wird des weiteren durch Bezugnahme auf die Beispiele erklärt.

In den Beispielen wurden 0,05 bis 5 mg rohes Polypeptid mit der Sequenz Nr. 1, das nach dem Festphasenverfahren synthetisiert wurde, für 75 Minuten der HPLC ausgesetzt unter Verwendung einer Asahipak GS-510- Säule (Durchmesser 7,5 X 500 mm) (Handelsname: Asahi, Kasei Co., Ltd.) und einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 mm/min.

Das Ergebnis der Reinigung wurde hinsichtlich der Farbe des erhaltenen Polypeptids und der Eigenschaften der Oberflächenaktivität der lungenoberflächenaktiven Substanz, die aus diesem Polypeptid hergestellt wurde, bewertet.

Zur Bestimmung der Farbe des Polypeptids wurde eine TFA-Lösung hergestellt.

Die Herstellung der lungenoberflächenaktiven Substanz wurde nach dem folgenden Verfahren durchgeführt. Zu jeder der Proben des gereinigten Polypeptids in einer TFA-Lösung (12 mg/0,5 ml) wurden 100 ml Chloroform- Methanollösung (2:1, V/V), enthaltend 1,2 Dipalmitoylglycero-(3)- phosphocholin (660 mg), 1,2-Diacyl-sn-glycero-(3)-phospho-(sn)-glycerol (220 mg) und Palminsäure (100 mg) zugegeben und die erhaltene Mischung wurde anschließend getrocknet und man ließ sie unter reduziertem Druck fest werden. Der erhaltene Rückstand wurde zur Herstellung einer lungenoberflächenaktiven Substanz in 100 ml H&sub2;O-Ethanolmischung (9:1, V/V) bei einer Temperatur von 40ºC für 15 Minuten suspendiert und anschließend für 36 Stunden bei -50ºC und einem Vakuum von 85 bis 100 µHg lyophilisiert.

Die Oberflächenaktivität wurde durch Messung der Wirkung der Oberflächenspannungsverringerung, der Streichbarkeit über eine gas-flüssige Grenzfläche und des Adsorptionsvermögens an eine gas-flüssige Grenzfläche gemessen.

Referenzbeispiel 1

10 mg des Polypeptids der Sequenz Nr. 1 (hydrophober Aminosäuregehalt: 81,4 %) wurden in Ameisensäure gelöst und Methanol-H&sub2;O-Lösung (70:30, V/V), enthaltend 10 mM β-Merkaptoethanol (das das Lösungsmittel ist, das als bewegliche Phase zu verwenden ist), wurde anschließend zur Herstellung einer Probenlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml zugegeben.

100 µl der Probenlösung wurden in die Säule, die mit der vorgenannten beweglichen Phase äquilibriert war, injiziert, und HPLC wurde in der beweglichen Phase durchgeführt. Der Nachweis wurde bei 250 nm durchgeführt und die Probenlösung wurde in 15 Fraktion geteilt. Jede Fraktion wurde anschließend getrocknet und man ließ sie unter reduziertem Druck fest werden, und das Trockengewicht davon wurde gemessen. Von jedem gereinigten Polypeptid wurde eine Lungenoberfläche hergestellt und ihre Oberflächenaktivität wurde bestimmt.

Das erhaltene Polypeptid erschien gelblich, wenn es in TFA gelöst war. Die Ausbeute des aktiven Anteils betrug 37 %.

Wirkung der Oberflächenspannungsverringerung:

Maximale Oberflächenspannung 33,8 Dyn/cm

Minimale Oberflächenspannung 4,1 Dyn/cm

Streichbarkeit über eine gas-flüssige Grenzfläche:

Äquilibrierungszeit 60 Sekunden.

Äquilibrierte Oberflächenspannung 4,1 Dyn/cm

Adsorptionsvermögen an eine gas-flüssige Grenzfläche:

Äquilibrierungszeit 90 Sekunden.

Äquilibrierte Oberflächenspannung 32,6 Dyn/cm

(Die Ergebnisse sind die der Fraktionen, die die beste Aktivität zeigten. Das gleich wurde auf das folgende angewendet.)

Beispiel 1

20 mg des Polypeptids der Sequenz Nr. 1 wurden in 1 ml TFA gelöst. Die resultierende Lösung wurde nach dem in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Verfahren behandelt, außer daß TFA-Dichlormethan-Lösung (10:90, V/V), enthaltend 10 mM β-Merkaptoethanol als bewegliche Phase verwendet wurde.

Das erhaltene Polypeptid war farblos, wenn es in TFA gelöst war, und die Ausbeute des aktiven Anteils betrug 66 %.

Die Eigenschaften der Oberflächenaktivität der lungenoberflächenaktiven Substanz, die dieses Polypeptid enthält, war wie folgt.

Wirkung der Oberflächenspannungsverringerung:

Maximale Oberflächenspannung 29,5 Dyn/cm

Minimale Oberflächenspannung 2,7 Dyn/cm

Streichbarkeit über eine gas-flüssige Grenzfläche:

Äquilibrierungszeit 30 Sekunden.

Äquilibrierte Oberflächenspannung 29,4 Dyn/cm

Adsorptionsvermögen an eine gas-flüssige Grenzfläche:

Äquilibrierungszeit 40 Sekunden.

Äquilibrierte Oberflächenspannung 30,1 Dyn/cm

Beispiel 2

20 mg des Polypeptids (hydrophober Aminosäuregehalt: 81,4 %) der Sequenz Nr. 1 wurden in 1 ml TFA gelöst. Die resultierende Lösung wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren behandelt, außer daß TFA- Dichlormethan-Lösung (3:97, V/V) als bewegliche Phase verwendet wurde.

Das erhaltene Polypeptid war farblos, wenn es in TFA gelöst war, und die Ausbeute der aktiven Fraktion betrug 42 %.

Die Eigenschaften der Oberflächenaktivität der lungenoberflächenaktiven Substanz, enthaltend dieses Polypeptid, ist wie folgt.

Reduzierende Wirkung der Oberflächenspannung:

Maximale Oberflächenspannung 28,9 Dyn/cm

Minimale Oberflächenspannung 2,1 Dyn/cm

Streichbarkeit über eine gas-flüssige Grenzfläche:

Äquilibrierungszeit 40 Sekunden.

Äquilibrierte Oberflächenspannung 29,0 Dyn/cm

Adsorptionsvermögen an eine gas-flüssige Grenzfläche

Äquilibrierungszeit 50 Sekunden.

Äquilibrierte Oberflächenspannung 31,4 Dyn/cm

Beispiel 3

Das Polypeptid der Sequenz Nr. 11 wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gereinigt. Es wurde beobachtet, daß TFA-Lösungen des erhaltenen Polypeptids farblos waren.

SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT:

(A) NAME: Tokyo Tanabe Company Limited

(B) STREET: 2-6, Nihonbashi-honcho 2-chome,

(C) CITY: Chuo-ku, Tokyo

(D) STATE:

(E) COUNTRY: Japan

(F) POSTAL CODE (ZIP): 103

(ii) TITLE OF INVENTION: Purification method for hydrophobic polypeptides

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 11

(iv) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Wordperfect Windows 6.0

(v) CURRENT APPLICATION DATA:

APPLICATION NUMBER: EP 94914582.5

(vi) PRIOR APPLICATION DATA

(A) APPLICATION NMMBER: JP 103957/1993

(B) FILING DATE: 30 April 1993

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Anspruch[de]

1. Reinigungsverfahren für hydrophobe Polypeptide unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, gekennzeichnet durch die Verwendung eines halogenierten Kohlenwasserstoffes, enthaltend von 3 bis 10 Vol-% Trifluoressigsäure als bewegliche Phase und einen Säulenfüllstoff auf Polyvinylalkohol-Basis, und dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophobe Polypeptid eines ist, dessen hydrophober Aminsäuregehalt höher ist als 50%.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die bewegliche Phase ebenfalls β-Merkaptoethanol enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das hydrophobe Polypeptid ein oberflächenaktives Peptid ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das hydrophobe Polypeptid definiert ist nach einem der Sequenznummern 1 bis 11 wie unten angegeben:

Sequenznummer: 1
Sequenznummer: 2
Sequenznummer: 3
Sequenznummer: 4
Sequenznummer: 5
Sequenznummer: 6
Sequenznummer: 7
Sequenznummer: 8
Sequenznummer: 9
Sequenznummer: 10
Sequenznummer: 11







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