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Dokumentenidentifikation DE69318495T2 19.11.1998
EP-Veröffentlichungsnummer 0587541
Titel Verfahren zur Reinigung des Big-Endothelin Proteins
Anmelder Tecnogen S.C.P.A., Piana de Monte Verna, Caserta, IT
Erfinder Fassina, Giorgio, c/o TECNOGEN ScpA, I-81015 Piana di Monte Verna (CE), IT;
Merli, Silvia, c/o TECNOGEN ScpA, I-81015 Piana di Monte Verna (CE), IT
Vertreter v. Bezold & Sozien, 80333 München
DE-Aktenzeichen 69318495
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 03.09.1993
EP-Aktenzeichen 938303617
EP-Offenlegungsdatum 16.03.1994
EP date of grant 13.05.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.11.1998
IPC-Hauptklasse C07K 1/14
IPC-Nebenklasse C07K 1/22   C12N 15/10   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung des Proteins Big-Endothelin (Big-ET) aus Rohextrakten, die proteolytische Aktivität aufweisen, mittels Trypsin-Verdauung und affinitätschromatographischer Verfahren mit einer hohen Ausbeute an Endprodukt, wobei ein Big-ET- spezifischer Peptidligand, der gegenüber Trypsin stabil ist, verwendet wird.

Das Verfahren erlaubt die Gewinnung von hochreinem, rekombinanten Big-ET aus Wirtszellextrakten, wobei kostspielige chemische Syntheseverfahren in flüssiger oder fester Phase vermieden werden.

Es ist in der Technik bekannt, daß Endothelin (ET) ein Peptid mit 21 Aminosäuren ist das eine starke vasokonstriktorische Aktivität aufweist (Yanagisawa et al., Nature 332. 411-415, 1988). ET wird von endothelialen Zellen als eine 200 Aminosäuren-Vorstufe (pre-pro-ET) synthetisiert, dann mittels proteolytischer Verdauung zu Big-ET (38 Aminosäuren) und schließlich zu ET (21 Aminosauren) umgewandelt. Das (Die) Enzym(e), das (die) fur diese Reaktionen verantwortlich ist (sind) ist (sind) noch nicht vollständig charakterisiert und ist (sind) als ECE bekannt. Big-ET is nicht aktiv; es kann jedoch sowohl in vitro als auch in vivo aktiviert werden, auch durch Proteolyse-Enzyme mit breitem Spektrum wie Chymotrypsin und Cathepsin. Daher ist Big-ET nicht nur als ein Zwischenprodukt brauchbar, um pharmakologisch aktives ET zu erhalten, sondern auch als Substrat, um Enzyme zu untersuchen und charakterisieren. die an zellvermittelter ET-Synthese beteiligt sind.

Derzeit ist Big-ET ebenso wie ET im Handel als Produkt direkter chemischer Synthese aus geschützten einzelnen Aminosäureresten erhältlich.

Aufgrund der Komplexität von ET-Molekülen, die zwei Disulfidbrücken an der 1-11- bzw. 3-15-Position aufweisen und der Peptidlänge, die länger ist als die Standardlänge der üblicherweise synthetisierten Peptide, ist die Ausbeute gering und demgemäß entstehen merklich hohe Kosten.

Gentechnische Verfahren erlauben die Gewinnung rekombinanter Peptide aus genetisch modifizierten Mikroorganismen mit hoher Ausbeute und relativ geringen Kosten, vorausgesetzt daß das betreffende Peptid in Wirtszellen effizient exprimiert wird und ein wirksames Reinigungsverfahren zur Verfügung steht.

Sowohl Peptide als auch kleine Proteinmoleküle liegen im allgemeinen in geringer Menge in bakteriellem Zytonplasma vor, da sie einem raschen Abbau unterliegen. Rekombinante Moleküle unterliegen ähnlichen Abbauprozessen. Rekombinante Peptide mit geringem Molekulargewicht können wirksam als Fusionsprodukte von heterologen Proteinen mit hohem Molekulargewicht exprimiert werden, wobei dieses Resultat gegenüber enzymatischem Abbau weniger empfindlich ist. Dann wird das Fusionsprodukt mit spezifischen Enzymen oder geeigneten chemischen Reaktanten behandelt, die in der Lage sind, das Peptid aus dein Protein mit hohem Molekulargewicht freizusetzen.

Es wurde bereits ein Verfahren zur Gewinnung von Big-ET aus gentechnisch veränderten E. coli beschrieben, wobei wie zuvor beschrieben vorgegangen wurde, das einen Reinigungsprozeß umfaßt, wobei herkömmliche chromatographische Trenntechniken verwendet werden (Ohoshi et al., J. Biochem., 110, 628, 1991). Gemäß diesem Verfahren wurde Big-ET als Fusionsprodukt mit β-Galaktosidasefragmenten mit 55, 51 oder 48-Resten, die durch die Sequenz Ile- Glu-Gly-Arg auf Abstand gehalten werden, die die Spaltstelle des Xa-Enzyms darstellt, erhalten (Pierce Chem. Co., USA). Das Fusionsprodukt. das sich als schlecht löslich erweist, wird zunächst von bakteriellen Rohextrakten durch ein Gelfiltrations-Chromatographie-Verfahren unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von 8M Harnstoff gereinigt, dann mit dem Xa-Enzym oder Trypsin behandelt, um Big-ET freizusetzen. Big-ET wird dann durch Reversed-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gereinigt. Das Verfahren, bei dein kein Reiniaungsschritt mittels Affinität verwendet wird, ist zeitaufwendig und kann zur Herstellung von Big-ET in großem Maßstab nicht verwendet werden.

Einer der Autoren der vorliegenden Erfindung hat ein Peptid beschrieben (EP-Anmeldung Nr. 91 830 428.8), das als δ-ET(16-29) bezeichnet wurde, das die folgende Aminosauresequenz in L-Konfiguration aufweist:

die hydropathisch komplementär ist zur 16-32-Sequenz von Big-ET und in der Lage ist, selbige sowohl in flüssiger als auch in kovalenter oder nicht-kovalenter fester Phase zu binden. Es wird ein Syntheseverfahren in einer nichtlinearen Form für dieses Molekül beschrieben, ausgehend von einem Animosäurekern, der mindestens eine Aminosäure umfaßt, die zwei terminale Aminfunktionen aufweist, um sein Blockieren auf der Festphase zur Herstellung von Affinitätssäulen zu erleichtern. Die Verwendung solcher Säulen zum Reinigen von Big-ET aus Bakterienextrakten, die proteolytische Aktivitäten aufweisen, ist jedoch nicht durchführbar, da der immobilisierte Ligand durch in den Zellextrakten enthaltene Enzyme leicht abgebaut wird, wodurch die Kapazität und die Funktionen der Säule herabgesetzt werden.

Demgemäß ist die Verfügbarkeit eines leichten, einfachen und kosteneffektiven Verfahrens mit hoher Ausbeute zur Gewinnung von Big-ET sowohl für Forschungs- als auch für pharmakologische Zwecke gegenwärtig ein tatsächliches Bedürfnis.

Überraschenderweise haben die Autoren gefunden, daß der δ-ET-Ligand. selbst wenn er unter Verwendung von Aminosauren, die eine D-Konfiguration aufweisen, synthetisiert wird, in der Lage ist, mit Big-ET in Wechselwirkung zu treten und dieses zu erkennen. Darüber hinaus ist dieser Ligand, synthetisiert in einer nicht-linearen multimeren Form, vollig stabil, wenn er proteolytischen Aktivitäten wie Trypsin, Chymotrypsin und Thermolysin ausgesetzt wird, und erlaubt auf diese Weise die direkte Reinigung von Big-ET aus Bakterienextrakten, die hohe proteolytische Aktivitäten aufweisen. Rekombinantes Big-ET kann daher direkt aus Bakterienrohextrakten als Fusionsprodukt mit anderen Proteinen und weiterer Verdauung mit geeigneten Enzymen, und zwar durch Affinitätschromatographiesäulen mit δ-ET als spezifischem Liganden erhalten werden. Big-ET wird durch proteolytische Extrakte direkt gewonnen, wodurch Zwischenstufen, die die Ausbeute an Endprodukt verringern könnten, vermieden werden. Das Verfahren erlaubt die Gewinnung von Big-ET mit hoher Ausbeute sowohl von teilweise als auch von vollständig unlöslichen Fusionsprodukten.

Demgemäß ist ein Ziel der Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Big-ET aus Rohextrakten, das die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:

- Expression von Big-ET-Protein in Wirtszellen mittels gentechnologischer Verfahren;

- Lyse der Wirtszellen und Behandlung dieser mit einem proteolytischen Enzym, um einen proteolysierten Extrakt zu erhalten;

- Laden des proteolysierten Extraktes auf eine Affinitatschromatographiesäule, die durch Immobilisieren eines Big-ET-spezifischen Liganden hergestellt wurde, wobei der Ligand Peptide umfaßt, die zu Big-ET hydropathisch komplementär sind und aus Aminosäuren mit D- Konfiguration bestehen, wobei die Säule mit einem geeigneten Salzpuffer äquilibriert ist;

- Auswaschen des nicht spezifisch gebundenen Materials aus der Säule durch einen geeigneten Waschpuffer;

- Eluieren des in der Säule spezifisch zurückgehaltenen Materials durch einen geeigneten Elutionspuffer.

Vorzugsweise ist Big-ET an einen Molekülträger kovalent gebunden und weist die Formel auf:

(P)-X-R-(Big-ET)

in der: P der Molekülträger ist; X ein lineares Spacer-Peptid ist, das aus 1 bis 10 Aminosäuren besteht; R Arginin ist und Big-ET die Aminosäuresequenz von Big-Endothelin ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die hydropathisch komplementären Peptide nicht-linear und umfassen einen Aminosäurekern, der die folgende Forinel aufweist:

in der: X eine Aminosaure ist, die mindestens zwei terminale Aminoreste aufweist; Y eine Aminosäure ausgewählt aus Alanin, Glycin oder Arginin ist; m gleich 0 oder 1 ist; n1, n2 und n3 ganze Zahlen von 0 bis 10 sind; und Bindungen Carbamid-Bindungen sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist X Lysin oder Ornithin; bevorzugterweise ist m gleich 1.

Erfindungsgemäß umfassen darüber hinaus die zu Big-ET hydropathisch komplementären Peptide die Aminosäuresequenz in D-Konfiguration wie folgt:

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen diese nicht-linearen hydropathisch komplementären Peptide die folgende Formel auf:

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Lyse durch Zugabe von Harnstoff durchgeführt, so daß die Harnstoffendkonzentration 2 M nicht übersteigt und der pH des Gemisches zwischen 7 und 8,5 liegt. Das proteolytische Enzvm ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Trypsin, Chymotrypsin und Thermolysin.

Die Erfindung wird im folgenden durch einige erläuternde, jedoch nicht beschränkende Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:

- Fig. 1 den Widerstand des Affinitätschromatographie- Liganden D-4-δ-ET gegen proteolytische Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin und Thermolysin zeigt;

- Fig. 2 die Bindungsspezifität von Big-ET an Affinitätschromatographiesäulen zeigt, die durch Immobilisieren des Liganden D-4-δ-ET hergestellt sind;

- Fig. 3 Trypsin-Verdauungsprodukte des MBP-Big-ET- Fusionsprodukts zeigt;

- Fig. 4 die Reinigung des mit Trypsin verdauten MBP-Big-ET-Fusionsprodukts durch ein Affinitätschromatographieverfahren zeigt.

BEISPIEL 1 GST-Big-ET- und MBP-Big-ET-Fusionsprodukte

Gene, die das Maltose-bindende Protein (MBP, 42 KD) (Duplay, P. et al., J. Biol. Chem., 259, 10606, 1984) und die Glutathion-S-Transferase (GST, 27 KD) (Smith, D. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8703, 1986) kodieren, werden zur Konstruktion chimärer codierender Sequenzen mit der Big-ET-codierenden Sequenz verwendet. Die GSI-DNA- codierende Sequenz ist im pGEX-2T-Plasmidvektor, wie bei Smith, D. B. et al., Gene, 67, 31, 1988 beschrieben ist, während die MBP-DNA-codierende Sequenz im pMal-CRI-Vektor ist, wie in Di Guan, Gene, 67, 21, 1988 beschrieben ist. Die Plasmide sind von Pharmacia bzw. New England Biolabs erhältlich. MBP-Big-ET- und GST-Big-ET-Fusionsgene werden mittels Standardverfahren erhalten, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Editor 1989, beschrieben ist.

Die menschliches Big-ET codierende Sequenz wird durch in vitro-Assembling von drei Paaren synthetischer Oligonudeotide erhalten. Jedes Paar, das durch komplementäre Oligonudeotide gebildet wird, ist in der Lage, durch klebrige Enden an das angrenzende Paar zu binden. Daher werden drei Oligonucleotidpaare durch T4-DNA-Ligase kovalent gebunden, wobei das synthetische Gen erzeugt wird, das als Matrizenstrang in einer durch thermostabile DNA-Polymerase kontrollierten Genamplifikationsreaktion (PCR) verwendet werden soll.

Als PCR-spezifische Starter werden zwei Oligonucleotide verwendet, die jeweils eine zum 5'-Ende oder zum 3'-Ende von Big-ET komplementäre Sequenz aufweisen und zum Insertieren von DNA-Restriktionsstellen, die während des Klonierungsschrittes verwendet werden sollen, ausgebildet sind. Darüber hinaus dirigiert das Oligonucleotid des 5'-Endes die Insertion der folgenden vier benachbarten Tripletts ATCGACGGTCGT, die die Erkennungs- und Spaltstelle des Xa-Faktors stromaufwärts von der Big-ET codierenden Sequenz codieren.

Mittels PCR erhaltene DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese auf Agarosegel gereinigt und durch geeignete Restriktionsenzyme zerschnitten. Kompatible Restriktionsenzyme werden verwendet, um pGEX-2T- und pMal-CRI-Vektoren zu schneiden. Der Vektor und das Fragment werden durch Ligationsreaktionen kovalent gebunden, wodurch zwei rekombinante ET-GEX- und ET-Mal2-Plasmide erzeugt werden.

E. coli-Zellen (DH5α-Stamm) werden mit den Plasmiden mittels Standardverfahren transformiert und rekombinante Klone werden mit einem Ampicillin-haltigen Medium selektiert. Rekombinante Klone mit einer korrekten Insertion von Big-ET am 3'-Ende der DNA der Trägerproteine werden mittels Restriktionsanalyse und Sequenzidentifizierung gescreent, wobei das Sanger-Verfahren verwendet wird (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977).

BEISPIEL 2 Expression von GSI-Big-ET- und MBP-Big-ET- Fusionsproteinen

GST-Big-ET-Fusionsprotein wird exprimiert durch Induzieren von ET-GEX-Plasmid mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid, wenn Bakterienkulturen 0,72 Absorptionseinheiten bei 600 nm optischer Dichte aufweisen.

MBP-Big-ET-Fusionsprotein wird exprimiert durch Induzieren von Et-Mal2-Plasmid mit 0,3 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid, wenn Bakterienkulturen 0,45 Absorptionseinheiten bei 600 nm optischer Dichte aufweisen.

Die Expressionszeit unter optimierten Belüftungs- und Temperaturbedingungen (35ºC) dauert in beiden Fällen drei Stunden und wird durch Kühlen der Kultur und Zentrifugieren der Bakterien geblockt. Die Bakterienpellets werden mittels PBS Phosphatpuffer (0,2 g/l KCl; 0,2 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 8 g/l NaCl; 1,15 g/l NH&sub2;PO&sub4;) gewaschen. Das ET-GEX-Pellet wird in einem Fünftel des Anfangsvolumens von PBS mit 1 % TRITON und 1 mM PMSF resuspendiert. Das ET-Mal2-Pellet wird in einem Fünfundzwanzigstel des Anfangsvolumens von PBS, das 0,25 % hydriertes TRITON und 1 mM PMSF enthält, resuspendiert.

Die Extraktion des gesamten Bakterienproteins wird mittels Ultraschall durchgeführt. Teilweise lösliches GSI-Big-ET- Fusionsprotein befindet sich hauptsächlich in den Einschlußkörpern, während MBP-Big-ET-Fusionsnrotein durch bakterielle Lyseprozeße voll ständig aufgelöst ist.

BEISPIEL 3 Bewertung der Peptid-Ausbeute

Das gesamte Bakterienlysat wird unter reduzierenden Bedingungen einer SDS-PAGE unterzogen. Der Extrakt von ET-GEX-induzierten Bakterien enthält annähernd 25 % GSI-Big-ET bezogen auf die Proteingesanitmenge, während der Extrakt von ET-Mal2-induzierten Bakterien annähernd 50% MBP-Big-ET enthält, bezogen auf die Proteingesamtmenge. Standardwerte der Proteinausbeute sind im Kulturbereich 0,1 - 0,6 mg/ml; die Ausbeuten an GST-Big-ET und MBP- Big-ET betragen 0,15 mg/ml bzw. 0,3 mg/ml.

BEISPIEL 4 Herstellung und Charakterisierung des D-4-δ-ET-Peptidliganden

Die Sequenz des zur menschlichen Big-ET-(16-29)-Sequenz hydropathisch komplementären Peptides, definiert als δ-ET-(16-29) ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 91 830 428.8 als NH&sub2;-ArgLysPheLeuAlaGlyLeuArgAlaArgArgLeuLysPhe-COOH beschrieben. δ-ET(16-29)-Peptid wird auf Festphase mittels Fmoc- Standardverfahren synthetisiert, und zwar auf der Basis einzelner Aminosäurekopplungen, die aktive Ester mit DCC/HOBt bildeten. Sämtliche bei der Synthese verwendeten Aminosäurereste weisen eine D-Konfiguration auf, dargestellt mit "D". D-δ-ET-(16-29)-Peptid wird in einer tetrameren Form (D-4-δ-ET), ausgehend von einem zentralen Kern, der aus mit Ornithin konjugiertem Ornithin besteht gemäß dem folgenden Schema synthetisiert:

Das als D-4-δ-ET(16-29) definierte multimere Peptid wird entschützt, von dem Harz mittels Standardverfahren freigesetzt und dann bis zur Homogenität mittels RP-HPLC gereinigt. Das gereinigte Peptid wird auf seinen Aminosäuregehalt sowie auf sein Molekulargewicht mittels Laserdesabsorptionsmassenspektrometrie analysiert, wodurch die Identität des Peptids bestätigt wird.

Das gereinigte Peptid wird zu 100 ug/ml in 500 mM NH&sub4;HCO&sub3; pH 8,0, aufgelöst und mit Trypsin-, α-Chymotrypsin- und Thermolysinlösungen behandelt, wobei ein Verhältnis von Enzym:Substrat von 1:100 verwendet wird und bei 37 ºC inkubiert wird. Zu verschiedenen Zeitintervallen werden Aliquote entnommen und mittels RP-HPLC auf das Vorliegen von Abbauprodukten analysiert. Fig. 1 zeigt Daten der Verdauung mit verschiedenen Enzvmen, die bestätigen, daß das Peptid selbst nach vierstündiger Inkubation durch keines der getesteten Enzyme abgebaut wird.

Das Peptid wird zur Herstellung von Affinitätssäulen verwendet. 5 mg Peptid werden in 10 ml NaHCO&sub3; aufgelöst und mit 1 g Eupergit C30N (Methacryl-präaktivierter Träger mit Epoxid-Gruppen) oder mit 1,2 g WATERS-ACCEL (siliziumdioxid-haltiger Träger, der mit einer Polyacrylamid-Schicht überzogen und mit Epoxidgruppen präaktiviert ist) inkubiert. Nachdem sie 24 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert wurden, werden die Harze mit Kopplungspuffer gewaschen und auf Glassäulen mit einem T.D. von 6,6 x 100 mm gepackt. Dann werden Säulen, die zuvor mit einem HPLC-Svstem verbunden wurden und mit einem variablen Wellenlängendetektor und einem Recorder ausgestattet sind, mit 25 mM TRIS, pH 6,8, bei einer Flußrate von 2 ml/min äquilibriert. Zunächst wird die Bindungskapazität von Big-ET getestet. Zu diesem Zweck werden 50 ml-Aliquote der 100 ug/ml-Lösung von Big-ET in 25 mM TRIS, pH 6,8 (NOVABIOCHEM, Schweiz) in die Säulen eingespritzt und das Eluierungsmittel bzw. Eluat mittels UV-Absorption bei 280 nm aufgezeichnet. Wie in Fig. 2 dargestellt ist, wird die injizierte Big-ET-Probe nach 20 Minuten nicht aus der Säule eluiert, wodurch es notwendig wird, den ursprünglichen Puffer durch einen Essigsäurepuffer zu ersetzen, damit die Probe eluiert werden kann. Die Wechselwirkung zwischen Big-ET und dem blockierten D-4-δ-ET ist spezifisch, da Kontrollsäulen, die durch Immobilisieren nichtverwandter Peptide oder TRIS hergestellt wurden, nicht die Fähigkeit aufweisen, irgendeine Big-ET-Probe zurückzuhalten.

BEISPIEL 5 Verdauung von Bakterienextrakten, die MBP-Big-ET- und GST-Big-ET-Fusionsprodukte enthalten

Bakterienextrakte, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurden und entweder Maltose-bindendes Protein-Big-ET- oder Gluthation-bindendes Protein-Big-ET-Fusionsprodukte enthalten, werden mit einer 8 mM Harnstofflösung 1:1 verdünnt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gemische werden mit 50 mM NH&sub4;HCO&sub3; , pH 8,5, 1:1 verdünnt und mit 10 ug Trypsin pro ml Gemisch unter Rühren 2 Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt. Extrakte, die anfänglich als unlösliche Materialen erscheinen, ergeben völlig geklärte und klare Produkte.

Das Zerschneiden des Fusionsprodukts durch Trypsin-Verdauung wird mittels RP-HPLC überprüft, indem das Verschwinden des Fusionsausgangsprodukts aufgezeichnet wird, wie in Fig. 3 für MPB-Big-ET dargestellt ist.

Eine Aquapore-ABI-Säule mit 2,1 x 30 mm I. D. wird im chromatographischen Abtrennschritt verwendet, die mit 0,1 % H&sub2;O/CH&sub3;/TFA ausgeglichen bzw. äquilibriert ist, wobei ein linearer Acetonitril-Gradient von 3-60% für 45 Minuten verwendet wird. Das Säulen-Eluat wird mittels UV-Absorption bei 225 nm aufgezeichnet. Das Fusionsprodukt wird bei dem Verfahren vollständig abgebaut, so daß eine hohe Ausbeute an Big-ET erhalten wird.

BEISPIEL 6 Reinigung von Big-ET aus mit Trypsin behandelten Bakterienextrakten, die entweder MBP-Big-ET oder GST-Big-ET enthalten

Bakterienextrakte, die wie in Beispiel 3 behandelt wurden, werden 1:1 mit 10 mM TRIS, pH 6,8 verdünnt und 4 ml-Aliquote werden entweder auf (D-4-δ-ET) Eupergit oder (D-4-δ-ET) Waters-Affinitätssäulen geladen, die äquilibriert wurden mit 10 mM TRIS, pH 6,8 bei 1,0 ml/min Flußrate. Nachdem die Säule vollständig von nicht zurückgehaltenem Material eluiert worden ist, wird das Elutionsmittel zu 0,12 M Essigsäure geändert und das Material aufgesammelt und mittels RP-HPLC analysiert, wie in Fig. im Falle von MBP-Big-ET dargestellt ist.

Es ergibt sich eindeutig, daß sowohl verdaute MBP-Big-ET- als auch GST-Big-ET-Extrakte in der Lage sind, durch lediglich einen Chromatographieschritt Big-ET mit hohem Reinheitsgrad (80 %) freizusetzen. Quantitative Messungen ergeben, daß Big-ET mit 20 ug/ml oder 5 ug/ml erhalten wird, wenn ET-2MAL oder respektive ET-GEX verwendet werden. Die gewonnenen Ausbeuten betragen 85 % bzw. 80 %. Die Struktur- und Sequenzidentität von gereinigtem Material wird auf die Aminosaurezusammensetzung geprüft sowie das Nolekulargewicht durch Massenspektrometrie mittels mittels Atombombardierung bestimmt und die chromatographische Retentionszeit auf Reversed-Phase-Säulen gemessen.

Das durch Affinitätschromatographie auf (D-4-δ-ET) Waters-Säulen gereinigte Material wird gefriergetrocknet, in 50 mM NH&sub4;Ac-Puffer, pH 7,5 bei einer Konzentration von 1 mg/ml resuspendiert und mit 20 ug α-Chymotrypsin (SIGMA) durch Inkubieren unter 2-stündigem Rühren bei Raumtemperatur behandelt. Schließlich wird das Reaktionsgemisch mittels RP-HPLC analysiert. Das Gemisch wird gefriergetrocknet und mit 50:50:0,1 H&sub2;O/CH&sub3;CN/TFA bis zu einer Endkonzentration von 5 mg/ml aufgefüllt. Verdauungsprodukte werden durch eine semipräparative RP-HPLC getrennt, wobei eine RP 8 Supelco-Säule, I.D. 250 x 10 mm, verwendet wird, die mit einer Flußrate von 3 ml/min. und einem linearen CH&sub3;CN-Gradienten von 5-65% in 45 Minuten äquilibriert wurde. Unter den zuvor angegebenen Bedingungen eluiert Endothelin nach 28 Minuten, Big-ET nach 32 Minuten und das Fragment 22-38 nach 20 Minuten. Das Material auf Endothelin-Basis wurde gesammelt und für nachfolgende Verwendung gefriergetrocknet.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Reinigung von Big-Endothelin (Big-ET) aus Rohextrakten, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

- Expression von Big-ET-Protein in Wirtszellen mittels gentechnologischer Verfahren;

- Lyse der Wirtszellen und Behandlung derselben mit einem proteolytischen Enzym, um einen proteolysierten Extrakt zu erhalten;

- Laden des proteo]ysierten Extraktes auf eine Affinitätschromatographiesäule, die durch Immobilisieren eines Big-ET-spezifischen Liganden hergestellt wurde, wobei der Ligand zu Big-ET hydropathisch komplementäre Peptide umfaßt, die aus Aminosäuren mit D-Konfiguration bestehen, wobei die Säule mit einem geeigneten Salzpuffer äquilibriert ist;

- Auswaschen des nicht spezifisch gebundenen Materials aus der Säule durch einen geeigneten Waschpuffer;

- Eluieren des in der Säule spezifisch zurückgehaltenen Materials durch einen geeigneten Elutionspuffer.

2. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach Anspruch 1, bei dem das Big-ET an einen Molekülträger kovalent gebunden ist gemäß der Formel:

(P)-X-R-(Big-ET)

in der: P der Molekülträger ist; X ein lineares Spacer-Peptid mit 1 bis 10 Aminosäuren ist; R gleich Arginin ist; und Big-ET die Aminosäuresequenz des Big-Endothelin ist.

3. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach einem der vorhergehenden Ansurüche, bei dem die hydropathisch komplementären Peptide nicht-linear sind und einen Aminosäurekern umfassen der die folgende Formel aufweist:

in der: X eine Aminosäure mit mindestens zwei terminalen Aminosäureresten ist Y eine Aminosäure ausgewählt aus Alanin, Glycin oder Arginin ist; in gleich oder 1 ist: n1, n2 und n3 ganze Zahlen von 1 bis 10 sind und die Bindungen Carbamid-Bindungen sind.

4. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach Anspruch 3, wobei X Lysin oder Ornithin ist.

5. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach Anspruch 3 oder 4, wobei m gleich 1 ist.

6. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach einem der vorhergehenden Ansprüche 3 bis 5, bei dem die hydropathisch komplementären Big-ET-Peptide eine Aminosäuresequenz in D-Konfiguration umfassen wie folgt:

7. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach Anspruch 6, bei dein die nicht-linearen hydropathisch komplementären Peptide die folgende Formel aufweisen:

8. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Lvse durch Zugabe von Harnstoff durchgeführt wird, so daß die Harnstoff-Endkonzentration 2 M nicht überschreitet und der pH des Gemisches zwischen 7 und 8,5 liegt.

9. Verfahren zum Reinigen von Big-ET aus Rohextrakten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das proteolytische Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Trypsin, Chymotrypsin und Thermolysin.







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