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Dokumentenidentifikation DE69413389T2 29.04.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0691982
Titel TRENNUNG VON PROTEINEN
Anmelder Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, DK
Erfinder NILSSON, Birgitte Mahler, DK-3520 Farum, DK;
LAUSTSEN, Mads Aage, DK-2800 Lyngby, DK;
PAHLE, Christine, DK-2880 Bagsvaerd, DK
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Bardehle, Pagenberg, Dost, Altenburg, Geissler, Isenbruck, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69413389
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 29.03.1994
EP-Aktenzeichen 949118566
WO-Anmeldetag 29.03.1994
PCT-Aktenzeichen DK9400132
WO-Veröffentlichungsnummer 9422903
WO-Veröffentlichungsdatum 13.10.1994
EP-Offenlegungsdatum 17.01.1996
EP date of grant 16.09.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.04.1999
IPC-Hauptklasse C07K 1/14
IPC-Nebenklasse C07K 1/30   C12N 9/20   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung eines Enzyms aus einer wäßrigen Lösung, die dieses Enzym im Gemisch mit anderen Proteinen enthält, sowie die Gewinnung des gewünschten Enzyms in kristalliner Form.

Stand der Technik

Enzyme werden üblicherweise für gewerbliche Zwecke als Flüssigkeiten oder amorphe Materialien bereitgestellt. Wenn sie nicht als Flüssigkeit bereitgestellt werden, werden sie üblicherweise als amorphe Materialien bereitgestellt, da die bekannten Verfahren zur Kristallisation von Enzymen üblicherweise als zu teuer angesehen werden, als daß sie im großtechnischen Maßstab eingesetzt würden. Dies ist auf die Annahme zurückzuführen, daß Kristalle nur aus sehr reinen und konzentrierten Lösungen gezüchtet werden können. Tatsächlich wird von Proteinchemikern die Fähigkeit zur Bildung von Kristallen häufig als Anzeichen für die hohe Reinheit einer Proteinlösung angesehen.

Aufgrund der hohen Reinheit von Enzymkristallen stellt die Bereitstellung eines billigen und einfachen Verfahrens zur Kristallisation von Enzymen, das leicht auf einen großtechnischen Maßstab anwendbar ist, in der Industrie ein echtes Bedürfnis dar.

Es gibt umfangreiche Literatur über die Kristallisation von Enzymen. Charakteristische Merkmale der bisher bekannten Kristallisationsverfahren sind relativ reine und konzentrierte Ausgangslösungen, geringe Ausbeuten, sehr lange Kristallisationszeiten, ein hoher Verbrauch an Chemikalien unter Einschluß von organischen Lösungsmitteln und schlechte industrielle Anwendungsmöglichkeiten.

Die Ausnutzung einer geringen Leitfähigkeit und des pH-Werts um den pI-Wert stellt bei weitem kein neues Verfahren zur Kristallisation von Proteinen dar. Diese Technik ist in der Literatur gut beschrieben und wird häufig zur Herstellung von Einkristallen für die Röntgenbeugung aus hochgereinigten Proteinlösungen angewandt. A. McPherson beschreibt in seinem Buch "Preparation and Analysis of Protein Crystals" (Wiley, New York, 1982), wie diese Technik, die auch als "Einsalzen" bekannt ist, bei der Kristallisation angewandt werden kann. Seitdem wurde dieses Verfahren von mehreren anderen Arbeitsgruppen angewandt, jedoch nur für die Kristallisation aus gereinigten Lösungen. Tatsächlich wird häufig berichtet, daß Verunreinigungen und insbesondere andere Proteine als höchst unerwünscht angesehen werden (vergl. A. McPherson in Eur. J. Biochem., Bd. 289 (1990), S. 1-23). Somit ist diese Technik selbst nicht neu, jedoch hat sie niemand bisher als eine Reinigungstechnik zur Reinigung von Enzymen in Gemischen mit anderen Proteinen eingesetzt. Speziell die überraschend gute Anwendbarkeit auf sehr unreine Lösungen macht diese Technik vom wirtschaftlichen Standpunkt aus durchführbar, da sie keine Vorreinigung, beispielsweise durch chromatographische Verfahren, erfordert. Es ist wichtig, zwischen einer Kristallisation und einer Fällung zu unterscheiden, da die letztgenannte Maßnahme zu einer weniger reinen, amorphen Form führt.

Im EP-Patent 193 046 wird ein Verfahren zur Gewinnung eines Enzyms aus einer Lösung beschrieben. Gemäß diesem Verfahren wird die enzymhaltige Lösung bei einem pH-Wert in der Nähe des isoelektrischen Punkts des Enzyms bis zur Übersättigung eingeengt und anschließend wird die Kristallisation eingeleitet. Die Anwesenheit von Salzen oder organischen Lösungsmitteln wird für jegliches Kristallisationsverfahren als wesentlich angesehen. In der vorerwähnten Druckschrift EP-193 046 wird angegeben, daß die Einführung von Salzen oder organischen Lösungsmitteln für das beschriebene Verfahren nicht erforderlich ist, jedoch ist aus den beschriebenen Versuchen ersichtlich, daß die gemäß dieser Patentveröffentlichung untersuchten Enzyme am besten in Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen kristallisieren, d. h. wenn sich an die Ultrafiltration eine Vakuumverdampfung anschließt. Außerdem ist dieses Verfahren nur für Amylasen geeignet, benötigt lange Kristallisationszeiten und führt zu unerwünschten amorphen und mikrokristallinen Ausfällungen.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von kristallinen Enzymen bereitzustellen, bei dem die Zugabe von Salzen oder organischen Lösungsmitteln nicht erforderlich ist, das kurze Kristallisationszeiten und hohe Ausbeuten ermöglicht und das einfach und billig ist und den industriellen Anforderungen genügt.

Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Abtrennung eines Enzyms aus einer wäßrigen Lösung, die dieses Enzym im Gemisch mit anderen Proteinen enthält, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Auslaugen von Salzen aus der Lösung umfaßt, wonach sich die Einstellung des pH-Werts der Lösung auf einen Wert um den pI-Wert des Enzyms anschließt und anschließend das Enzym in kristalliner Form gewonnen wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Bisher wurden konzentrierte Proteinlösungen als wesentlich für die Erzeugung von Proteinkristallen angesehen. Nunmehr wurde jedoch festgestellt, daß eine Sättigung und Übersättigung während der Verfahrensstufen vor der Kristallisationsstufe vermieden werden sollten, da eine Sättigung und insbesondere eine Übersättigung bei unkontrollierten Bedingungen die Bildung der weniger erwünschten amorphen Form des Proteins durch Fällung begünstigen.

Nunmehr wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens Enzyme aus ihren Gemischen mit anderen Proteinen, selbst aus Gemischen, die andere Enzyme enthalten, abgetrennt werden und das gewünschte Enzym in kristalliner Form ausfällt.

Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Abtrennung von Enzymen aus einem wäßrigen Gemisch, das andere Proteine mit unterschiedlichen Kristallisationseigenschaften enthält, bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt das Auslaugen von Salzen und anderen niedermolekularen Verunreinigungen aus der Lösung, wodurch man eine geringe Ionenstärke in der Lösung erzielt, wonach sich die Einstellung des pH-Werts auf einen Bereich um den pI-Wert des gewünschten Proteins anschließt. Dieses Verfahren bewirkt eine Ausfällung des Enzyms in kristalliner Form.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Abtrennung/Kristallisation beliebiger Enzyme herangezogen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auf Lipasen angewandt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf beliebige Gemische, die ein lipolytisches Enzym enthalten, angewandt werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich lipasehaltige Gemische, die die gewünschte Lipase in Konzentrationen von nur 1% (Gew./Gew.) enthalten, in erfolgreicher Weise einer Enzymtrennung durch Kristallisation unterziehen. Ferner können lipasehaltige Gemische, die auch andere Proteine (unter Einschluß von anderen Enzymen) in Konzentrationen von mehr als 50%- (Gew./Gew.) und vorzugsweise unter 50% (Gew./Gew.), bezogen auf den gesamten Proteingehalt, enthalten, in erfolgreicher Weise einer Enzymtrennung durch Kristallisation unterzogen werden.

Das lipolytische Enzym kann mykotischen oder bakteriellen Ursprungs sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf Glycolipasen angewandt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf saure Lipasen angewandt, d. h. Lipasen mit einem pI-Wert im Bereich von 3 bis 7 und insbesondere im Bereich von 3,5 bis 5, 5.

Beispiele für Lipasen mykotischen Ursprungs, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, sind Lipasen, die aus Mitgliedern der Gattungen Aspergillus (z. B. A. niger), Candida (z. B. C. antarctica), Humicola (z. B. H. lanuginosa und H. insolens) und Rhizomucor (z. B. R. miehei) erhältlich sind. Beispiele für Lipasen bakteriellen Ursprungs, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, sind Lipasen, die aus Mitgliedern der Gattung Pseudomonas (z. B. Ps. cepacia) erhältlich sind.

Lipasehaltige Lösungen lassen sich durch Fermentation eines Lipase erzeugenden Mikroorganismus erhalten. In den meisten Fällen handelt es sich bei dem Lipase erzeugenden Mikroorganismus um einen Wirtsorganismus, der ein inseriertes Gen trägt, das für die gewünschte Lipase kodiert, z. B. für eine Humicola-Lipase oder eine Rhizomucor-Lipase, exprimiert in Aspergillus oryzae (vergl. EP-Veröffentlichungen 238 023 und 305 216).

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf die Abtrennung einer Lipase aus einer Kulturbrühe angewandt, wobei die Lipasen entweder intrazellulär oder extrazellulär vorliegen. Nach der Züchtung kann eine Zellysis durchgeführt werden und die Kulturbrühe einer Fest- Flüssig-Trennung durch Zentrifugation unterworfen werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Salze und andere niedermolekulare Verunreinigungen aus der wäßrigen Lösung ausgelaugt, wodurch sich eine geringe Ionenstärke der Lösung ergibt. Diese niedermolekularen Substanzen können durch Diafiltration, Dialyse, Elektrodialyse, Gelfiltration, chromatographische Verfahren oder Fällung entfernt werden. Eine Diafiltration, Dialyse oder Elektrodialyse unter Verwendung einer Membran mit einer Trenngrenze unterhalb des Molekulargewichts der in Frage stehenden Lipase wird bevorzugt.

Die Ionenstärke der Lösung kann in zweckmäßiger Weise mit einem Leitfähigkeitsmeßgerät überwacht werden. Im Rahmen der Erfindung wird die geringe Ionenstärke durch eine Konduktanz von 10 mS/cm oder weniger, vorzugsweise 5 mS/cm oder weniger und insbesondere 2 mS/cm oder weniger repräsentiert.

Im Anschluß an die Entfernung der niedermolekularen Verunreinigungen wird der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf einen pH-Wert im Bereich von ± 3 um den pI-Wert der Lipase, vorzugsweise im Bereich von ±1,5 um den pI- Wert der Lipase, insbesondere im Bereich von ±1 um den pI-Wert der Li pase und ganz besonders im Bereich von ±0,5 um den pI-Wert der Lipase eingestellt.

Der pH-Wert der wäßrigen Lösung kann unter Verwendung praktisch beliebiger Säuren oder Basen eingestellt werden. Die Säure kann organischer oder anorganischer Natur sein. Einige Beispiele hierfür sind Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Citronensäure und Ameisensäure. Bevorzugte Säuren sind Ameisensäure, Citronensäure oder Essigsäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf wäßrige, lipasehaltige Lösungen mit einem Lipasegehalt von nur 1%- (Gew./Gew.) angewandt werden. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren auf wäßrige, lipasehaltige Lösungen mit einem Lipasegehalt von mehr als 5% (Gew./Gew.), insbesondere 5-20% (Gew./Gew.) und ganz besonders 10-20% (Gew./Gew.) angewandt, wobei der Lipasegehalt mehr als 10% der gesamten Trockenmasse und insbesondere mehr als 30%- der gesamten Trockenmasse beträgt.

In einer spezielleren Ausführungsform der Erfindung kann eine vorherige Fällung des Ultrafiltratkonzentrats durch herkömmliche Maßnahmen durchgeführt werden, beispielsweise mit Natrium- oder Ammoniumsulfat, wonach sich eine erneute Lösung des Filterkuchens und eine Ultrafiltration der wieder in Lösung gebrachten Lipase und gegebenenfalls eine Entfernung der Salze durch Diafiltration und/oder Verdünnung anschließen. Wenn kristalline Produkte von sehr hoher Reinheit erwünscht sind, z. B. Lipasen für therapeutische Anwendungen, kann das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt werden, d. h. das kristalline Endprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird erneut in Lösung gebracht und einem oder mehreren weiteren Kristallisationsvorgängen unterworfen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und sollen in keiner Weise den Schutzumfang der beanspruchten Erfindung beschränken.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Abtrennung einer Humicola Ianuginosa-Lipase aus einer gemäß der EP-Veröffentlichung 305 216 erhaltenen Kulturbrühe.

Die Kulturbrühe wurde einer Zentrifugation und einer Ultrafiltration/Diafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Trenngrenze von 20 kD unterworfen und bis zu einer Konduktanz von 3 mS/cm diafiltriert. Das Diafiltrat enthielt 13% Lipase (Gew./Gew.) und 20% gesamte Trockenmasse (Gew./Gew.), was bedeutet, daß es sich bei 65% der gesamten Trockenmasse um Lipase handelte. Der pH-Wert wurde mit Citronensäure auf 4,5 eingestellt.

In Tabelle 1 sind die Ergebnisse dieses Beispiels im Vergleich mit einem herkömmlichen Kristallisationsverfahren unter Zugabe von Salzen zusammengestellt. Die Tabelle gibt die Meßwerte für die prozentuale Ausbeute und die Reinheit wieder.

Die Reinheit wird als Lipase-Aktivität angegeben. Eine Lipase-Einheit (LU; 1000 LU = 1 KLU) ist die Enzymmenge, die bei 30,0ºC pro Minute beim pH-Wert 7,0 1 uMol titrierbare Buttersäure freisetzt, wobei Gummi arabicum als Emulgator und Tributyrin als Substrat verwendet werden.

Tabelle 1

(1 1% Na&sub2;SO&sub4; = 13 mS/cm

(2 3% Na&sub2;SO&sub4; = 31 mS/cm

(3 3% Na-formiat = 15 mS/cm

Dieses Beispiel erläutert die überraschenden Wirkungen des erfindungsgemäßen Verfahrens: hohe Ausbeute, hohe Reinheit und kurze Kristallisationszeit.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Abtrennung einer Humicola lanuginosa-Lipase aus einer gemäß EP-Veröffentlichung 305 216 erhaltenen Kulturbrühe.

Die Kulturbrühe wurde einer Zentrifugation und einer Ultrafiltration/Diafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Trenngrenze von 20 kD unterworfen und bis zu einer Leitfähigkeit von 3 mS/cm diafiltriert. Das Diafiltrat enthielt 11% Lipase (Gew./Gew.) und 20% gesamte Trockenmasse (Gew./Gew.). Der pH-Wert wurde mit Citronensäure auf 4,3 eingestellt.

In Tabelle 2 sind die Ergebnisse dieses Beispiels im Vergleich mit einem herkömmlichen Kristallisationsverfahren unter Zugabe von Salzen zusammengestellt. In der Tabelle ist die prozentuale Ausbeute angegeben.

Tabelle 2

(1 8% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; = 92 mS/cm

(2 12% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; = 126 mS/cm

(3 18% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; = 165 mS/cm

(4 95 Na&sub2;SO&sub4; = 71 mS/cm

Dieses Beispiel erläutert die hohe Ausbeute des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 3

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Abtrennung einer Rhizomucor miehei-Lipase aus einer gemäß der EP-Veröffentlichung 238 023 erhaltenen Kulturbrühe.

Die Kulturbrühe wurde einer Zentrifugation und einer Ultrafiltration/Diafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Trenngrenze von 20 kD unterworfen und bis zu einer Konduktanz von 2,5 mS/cm diafiltriert. Das Diafiltrat enthielt 10% Lipase (Gew./Gew.) und 16% gesamte Trockenmasse (Gew./Gew.). Der pH-Wert wurde mit Citronensäure auf 5,0 eingestellt.

In Tabelle 3 sind die Ergebnisse dieses Beispiels im Vergleich mit einem herkömmlichen Kristallisationsverfahren unter Zugabe von Salzen zusammengestellt. In der Tabelle ist die prozentuale Ausbeute angegeben.

Tabelle 3

(1 2%(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; = 28 mS/cm

(2 4% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; = 54 mS/cm

(3 7% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; = 83 mS/cm

(4 10% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; = 108 mS/cm

Dieses Beispiel belegt die hohe Ausbeute und die kurze Kristallisationszeit des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf eine Humicola lanuginosa-Lipase, die gemäß der EP-Veröffentlichung 305 216 erhalten worden ist.

Es wurden fünf Versuche durchgeführt. Die vorstehende Kulturbrühe wurde einer Zentrifugation und einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Trenngrenze von 20 kD unterworfen und bis zu einer Konduktanz von 1 mS/cm diafiltriert. Das Diafiltrat enthielt 18% gesamte Trockenmasse. Der pH-Wert wurde mit Ameisensäure auf 4,3 eingestellt. Die Lösung wurde 20 Stunden bei 28ºC gerührt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

Dieses Beispiel zeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hervorragende Ausbeuten erzielt werden, selbst wenn das Verfahren auf geringe Lipasekonzentrationen angewandt wird und wenn andere Enzyme in relativ hohen Konzentrationen vorhanden sind.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Abtrennung eines Enzyms aus einer wäßrigen Lösung, die das Enzym im Gemisch mit anderen Proteinen enthält, wobei das Verfahren das Auslaugen von Salzen aus der Lösung, die anschließende Einstellung des pH-Werts der Lösung auf einen Bereich um den pI-Wert des Enzyms und die anschließende Gewinnung des Enzyms in kristalliner Form umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Salze durch Diafiltration, Dialyse, Elektrodialyse, Gelfiltration, chromatographische Verfahren oder Fällung ausgelaugt werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Salze ausgelaugt werden, bis eine Konduktanz von 10 mS/cm oder weniger, vorzugsweise 5 mS/cm oder weniger und insbesondere 2 mS/cm oder weniger nachweisbar ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf einen Wert im Bereich von ±3 um den pI-Wert des Enzyms, vorzugsweise im Bereich von ±1, 5 um den pI-Wert des Enzyms, insbesondere im Bereich von ± 1 um den pI-Wert des Enzyms und ganz besonders im Bereich von ± 0,5 um den pI-Wert des Enzyms eingestellt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der pH-Wert der wäßrigen Lösung mit Ameisensäure, Citronensäure oder Essigsäure eingestellt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Enzym um eine Lipase handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die wäßrigen, lipasehaltigen Lösungen einen Lipasegehalt von 5% (Gew./Gew.) oder mehr und vorzugsweise von 10-20% (Gew./Gew.) und eine Reinheit entsprechend einem Lipasegehalt von mehr als 10% der gesamten Trockenmasse und vorzugsweise einen Lipasegehalt von mehr als 30% der gesamten Trockenmasse aufweisen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei die Lipasen mykotischen Ursprungs sind und aus einem Stamm von Aspergillus (z. B. A. niger), einem Stamm von Candida (z. B. C. antarctica), einem Stamm von Humicola (z. B. H. Ianuginosa und H. insolens) oder einem Stamm von Rhizomucor (z. B. R. miehei) erhältlich sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei die Lipasen bakteriellen Ursprungs sind und aus einem Stamm von Pseudomonas (z. B. Ps. cepacia) erhältlich sind.







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